ITMI20090831A1 - Ialuronidasi extracellulare da streptomyces koganeiensis - Google Patents

Description

Titolo: “IALURONIDASI EXTRACELLULARE DA STREPTOMYCES KOGANEIENSISâ€

Descrizione

Stato della tecnica

La ialuronidasi à ̈ un enzima idrolitico che scinde l’acido ialuronico in acido D-glucuronico ed N-acetil glucosammina; in maniera variabile, à ̈ anche capace di degradare altri mucopolisaccaridi acidi del tessuto connettivo. Alte concentrazioni di ialuronidasi si trovano, ad esempio, nell’apparato boccale delle sanguisughe, nei veleni dei serpenti, delle api, degli scorpioni e nel surnatante di coltura di batteri patogeni come pneumococchi, streptococchi b-emolitici e Staphylococcus aureus. Nell’organismo umano la ialuronidasi si trova nella cornea, nel corpo ciliare, nella milza, nella pelle e nei testicoli. Elevate quantità di ialuronidasi si trovano anche negli spermatozoi, ai quali l’enzima permette di superare la barriera di acido ialuronico che protegge l’ovulo.

La ialuronidasi viene utilizzata in medicina nella cura di edemi, stati infiammatori locali, emorroidi e geloni e per facilitare la somministrazione sottocutanea di alcuni principi attivi. È stato anche riportato che alcune ialuronidasi sono in grado di determinare una riduzione significativa delle dimensioni dell’infarto del miocardio [1]. In campo veterinario à ̈ utilizzata in soluzioni antibiotiche per il trattamento di malattie animali, come la mastite bovina. Inoltre, la ialuronidasi può essere utilizzata come reagente analitico in alcuni saggi biologici, ad esempio nella determinazione quali/quantitativa dell’acido ialuronico.

La produzione e la purificazione di ialuronidasi batterica o animale su scala industriale sono difficoltose per il fatto che l’enzima diventa instabile in soluzione acquosa e perde attività a seguito della purificazione.

US 4,258,134 [2] descrive una ialuronidasi ottenuta mediante dialisi e cromatografia a scambio ionico su DEAE-cellulosa del surnatante di coltura di Streptomyces koganeiensis ATCC 31394.

Si à ̈ ora trovato che tale frazione proteica à ̈ in realtà costituita da numerose componenti proteiche (circa 68 all’elettroforesi bidimensionale), ma che una sola di esse à ̈ dotata di elevata attività ialuronidasica e notevole stabilità.

Descrizione dettagliata dell’invenzione L’invenzione riguarda ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 comprendente la sequenza amminoacidica N-terminale mostrata in SEQ ID no. 1.

L’enzima à ̈ inoltre caratterizzato da un peso molecolare di 21,6 kDa, da un punto isoelettrico (pI) compreso fra 4.4-4.8 e da un’attività enzimatica pari a 40,000 U.I./mg.

La ialuronidasi secondo l’invenzione può essere ottenuta con un procedimento comprendente i seguenti passaggi:

a) sottoporre il surnatante ottenuto dalla fermentazione di Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 a cromatografia a scambio cationico debole ed isolare la frazione proteica ad attività ialuronidasica;

b) sottoporre la frazione proteica ad attività ialuronidasica ottenuta al passaggio a) a diafiltrazione e a cromatografia a scambio anionico forte ed isolare la frazione proteica ad attività ialuronidasica;

c) sottoporre la frazione proteica ad attività ialuronidasica ottenuta al passaggio b) a cromatografia a scambio cationico forte ed isolare la frazione proteica ad attività ialuronidasica;

d) sottoporre la frazione proteica ad attività ialuronidasica ottenuta al passaggio c) a cromatografia a scambio anionico forte ed isolare la frazione proteica ad attività ialuronidasica.

La fermentazione del microorganismo può essere condotta con metodi noti, in particolare con il metodo descritto in US 4,258,134. Il surnatante ottenuto dopo la fermentazione viene quindi raccolto, centrifugato e filtrato. Inoltre, prima di essere sottoposto ai passaggi cromatografici secondo l’invenzione, il surnatante può essere sottoposto ad ulteriori trattamenti finalizzati alla rimozione di particolato residuo dalla coltura, con metodi e tecniche note all’esperto. Solitamente, il surnatante centrifugato e filtrato viene sottoposto a concentrazione e dialisi. Tipicamente, la concentrazione viene effettuata mediante ultrafiltrazione su appositi filtri in polietersulfone con cut-off compreso fra 5 e 15 kDA, preferibilmente di 10 kDa; solitamente il surnatante viene concentrato da 8 a 12 volte, preferibilmente 10 volte. Una volta verificata la presenza di attività ialuronidasica con un opportuno saggio, ad esempio il saggio di Dorfman [3] modificato, il surnatante concentrato viene dializzato con una soluzione tampone scelta a seconda della resina a scambio cationico debole utilizzata al passaggio a), in modo tale che la ialuronidasi si trovi in condizioni di pH tali da potersi legare alla resina; quest’ultima contiene gruppi scambiatori carbossialchile, preferibilmente gruppi carbossimetile, come la resina “CM-Sepharose<®>Fast Flow†. Dopo aver opportunamente equilibrato la resina con la stessa soluzione tampone in cui à ̈ stata effettuata la dialisi, si carica il campione e si procede all’eluizione con la medesima soluzione per rimuovere le proteine non legate, dopodiché si aumenta il pH per eluire le proteine legate. Quando si utilizza la resina “CM-Sepharose<®>Fast Flow†, dialisi, equilibrazione della resina ed eluizione delle proteine non legate vengono effettuate con una soluzione di acetato di sodio 50 mM a pH 4.0, mentre l’eluizione delle proteine legate viene effettuata con una soluzione di acetato di sodio 50 mM a pH 4.5. Le proteine legate che presentano elevata attività ialuronidasica vengono riunite in un’unica frazione e sottoposte alla cromatografia a scambio anionico forte [passaggio b)]. Prima di procedere, le frazioni riunite vengono chiarificate mediante diafiltrazione, condotta con mezzi e metodi noti all’esperto, utilizzando una soluzione tampone che permetta alla ialuronidasi di legarsi alla resina a scambio anionico forte utilizzata al passaggio b). Tale resina contiene gruppi trialchilammonio, tipicamente gruppi trimetilammonio, come la resina HiTrap® Q XL (colonna da 5 ml). Dopo aver equilibrato la resina con la stessa soluzione utilizzata per la diafiltrazione, si carica la frazione ottenuta al passaggio a) e si procede all’eluizione con la medesima soluzione per rimuovere le proteine non legate, poi si aumenta progressivamente forza ionica dell’eluente per eluire le proteine legate. Secondo una realizzazione preferita, si utilizza la resina HiTrap® Q XL e diafiltrazione, equilibrazione della colonna ed eluizione delle proteine non legate vengono effettuate con una soluzione tampone Tris-HCl 50 mM a pH 8, mentre l’eluizione delle proteine legate viene effettuata aggiungendo all’eluente NaCl a concentrazione crescente. Eluendo prima con una soluzione Tris-HCl 50 mM, NaCl 35 mM a pH 8 e poi con una soluzione Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM a pH 8 si ottengono così due frazioni, di cui solo la seconda, eluita con la soluzione che contiene NaCl 200 mM, presenta attività ialuronidasica. Tale frazione viene diluita 8 – 12 volte, preferibilmente 10 volte, con una soluzione tampone che consenta alla ialuronidasi di legarsi alla resina a scambio cationico forte utilizzata per il passaggio c). Detta resina contiene gruppi solfonici, preferibilmente gruppi solfonilalchile, ancor più preferibilmente gruppi solfonilpropile; secondo una realizzazione particolarmente preferita dell’invenzione, si utilizza la resina “HiTrap® SP FF†. In pratica, dopo aver equilibrato la resina con la stessa soluzione tampone in cui à ̈ stata diluita la frazione ialuronidasica ottenuta al passaggio b) ed aver caricato il campione, si effettua un lavaggio con la stessa soluzione tampone (circa 20 volumi di letto), dopodiché si procede all’eluizione delle proteine legate, aumentando progressivamente il pH dell’eluente. Tipicamente, per la resina HiTrap® SP FF, diluizione, equilibrazione e lavaggio della colonna sono effettuati con una soluzione tampone fosfato di sodio 20 mM a pH 4, mentre l’eluizione viene effettuata con tampone fosfato di sodio 50 mM a pH 4.8; le frazioni ad elevata attività ialuronidasica vengono riunite in un’unica frazione, che viene sottoposta alla cromatografia a scambio anionico forte [passaggio d)]. Solitamente, prima della cromatografia, tale frazione viene diluita 8 -12 volte, preferibilmente 10 volte, in un opportuno tampone di equilibrazione, che permetta alla ialuronidasi di legarsi alla resina scelta. La resina per il passaggio d) à ̈ una resina a scambio anionico forte contenente gruppi ammonio quaternari; preferibilmente, si utilizza una colonna Resource Q<®>. Dopo caricamento del campione, si esegue un lavaggio con lo stesso tampone di equilibrazione e si procede all’eluizione delle proteine legate diminuendo progressivamente il pH di 0,5 unità, fino a pH 4. Quando si utilizza una colonna Resource Q<®>, diluizione della frazione ialuronidasica, equilibrazione e lavaggio della colonna dopo caricamento del campione vengono effettuati con acetato di sodio 20 mM a pH 5,5; diminuendo progressivamente il pH come spiegato sopra, si ottengono una prima frazione di proteine a pH 5 e due frazioni di proteine a pH 4; la seconda frazione eluita a pH 4 possiede assorbanza a 280 nm ed attività enzimatica superiori rispetto alle altre due frazioni, come si evince dalla Figura 2. Sottoponendo tale frazione a cromatografia SDS-PAGE 12% e silver staining (figura 6) si osserva una sola banda proteica con un peso molecolare apparente di circa 25 kDa. In particolare, il 99% della ialuronidasi purificata con il procedimento sopra descritto ha un peso molecolare apparente di circa 25 kDa. Tale proteina costituisce solo il 5% circa della ialuronidasi presente nel surnatante ottenuto dopo la fermentazione; pertanto, il procedimento consente di ottenere un arricchimento di circa 20 volte con una resa del 30% circa.

Rispetto ad altre ialuronidasi finora note, quella dell’invenzione à ̈ altamente stabile in soluzione acquosa, non à ̈ suscettibile nei confronti dell’azione di enzimi proteolitici e ha purezza HPLC superiore al 98% (Fig. 5), che à ̈ necessaria per uso terapeutico; pertanto, essa può trovare impiego, da sola o in associazione con altri principi attivi, nella preparazione di composizioni farmaceutiche o veterinarie destinate al trattamento di patologie in cui sia necessario o vantaggioso degradare l’acido ialuronico presente nell’organo o tessuto affetto dalla patologia.

Grazie all’elevata stabilità in soluzione acquosa, la ialuronidasi dell’invenzione può essere formulata anche in forma di composizioni a base acquosa, come soluzioni, creme idrofile, idrogeli, oltre che in forma di prodotti lipofili come unguenti o creme oleose.

Per quanto riguarda l’uso umano, la ialuronidasi dell’invenzione può essere utilizzata per la preparazione di composizioni farmaceutiche destinate al trattamento di edemi, in particolare di edemi su base traumatica, o di stati infiammatori, come la sindrome emorroidaria; inoltre, può essere utilizzata per la preparazione di composizioni destinate al trattamento di geloni. La ialuronidasi dell’invenzione può essere utilizzata anche in associazione con altri farmaci dei quali sia necessario o vantaggioso aumentare la biodisponibilità.

Ad esempio, per il trattamento di edemi su base traumatica, sono particolarmente vantaggiose associazioni della ialuronidasi secondo l’invenzione con agenti anticoagulanti e/o fibrinolitici. Tali associazioni potranno inoltre contenere eventualmente uno o più agenti antinfiammatori steroidei o non steroidei. Inoltre, a queste composizioni potrà essere vantaggiosamente associato acido ialuronico solfatato, che à ̈ noto possedere, oltre a proprietà antinfiammatorie, anche proprietà antitrombotiche ed anticoagulanti. Un esempio di acido ialuronico solfatato utilizzabile a questo scopo à ̈ descritto,ad esempio, in EP 0702699.

Associazioni della ialuronidasi secondo l’invenzione con altri principi attivi sono vantaggiose anche nel caso di preparazioni iniettabili contenenti principi attivi a peso molecolare particolarmente elevato, ad esempio anticorpi monoclonali, citochine o enzimi, che sono solitamente somministrati per via endovenosa; la ialuronidasi permette la somministrazione degli stessi per via sottocutanea, secondo la cosiddetta procedura EASI (Enzymatically-Augmented Subcutaneous Infusion), che viene impiegata soprattutto per il ricambio di fluidi in pazienti terminali, in modo tale da limitare o evitare l’assistenza infermieristica. La ialuronidasi secondo l’invenzione può anche essere impiegata per la preparazione di composizioni farmaceutiche destinate al trattamento di tumori solidi resistenti; essa infatti, degradando l’acido ialuronico, abbassa la pressione dei fluidi interstiziali nella massa tumorale, rallentandone o inibendone la crescita. Per lo stesso motivo, essa aumenta anche l’efficacia di principi attivi antitumorali ad essa eventualmente associati. Pertanto, un ulteriore aspetto dell’invenzione riguarda composizioni farmaceutiche contenenti ialuronidasi in associazione con uno o più principi attivi antitumorali, come alcaloidi della Vinca (Vinblastina, Vincristina, Vinorelbina) e tassani (Paclitaxel).

Un ulteriore impiego terapeutico della ialuronidasi secondo l’invenzione riguarda il trattamento di forme allergiche mediate da IgE tramite desensibilizzazione con enzima potenziato (EPD = Enzyme Potentiated Desensitization), che consiste nella somministrazione di dosi estremamente basse di allergeni per desensibilizzare soggetti ad essi sensibili. Associando la ialuronidasi ad un allergene à ̈ possibile aumentare l’efficacia del trattamento, poiché l’allergene raggiunge più facilmente il sito d’azione. Pertanto, un ulteriore oggetto dell’invenzione consiste in composizioni farmaceutiche contenenti ialuronidasi in associazione con uno o più allergeni che inducono reazioni allergiche mediate da IgE. La ialuronidasi trova inoltre impiego come fattore di diffusione di farmaci per uso odontoiatrico nel trattamento di patologie del cavo orale, ad esempio anestetici locali ed antibiotici; pertanto, secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione riguarda composizioni farmaceutiche contenenti la ialuronidasi secondo l’invenzione in associazione con uno o più anestetici locali o antibiotici.

In oftalmologia, la ialuronidasi permette di accelerare notevolmente il trattamento di emorragie vitreali spontanee e può essere utilizzata, da sola o in associazione con altri principi attivi, nella preparazione di forme farmaceutiche per uso oftalmico, quali soluzioni, sospensioni, gel, creme e unguenti, destinate al trattamento di dette emorragie.

Per quanto riguarda invece l’uso veterinario, una patologia che può essere efficacemente trattata con la ialuronidasi dell’invenzione à ̈ la mastite bovina; in tal caso, la ialuronidasi potrà essere somministrata in associazione con antibiotici, come Penicillina G, cefalosporine di I-IV generazione ed amminopenicilline potenziate.

Le composizioni farmaceutiche possono essere preparate con tecniche ed eccipienti noti all’esperto, ad esempio secondo quanto descritto in Remington, “The Science and the Practice of Pharmacy†, 21<st>ed. (Lippincott, Williams & Wilkins); tali composizioni comprendono, in particolare, preparazioni iniettabili e preparazioni topiche per applicazione dermica, transdermica e oftalmica. In particolare, le preparazioni topiche per applicazione epidermica possono essere scelte fra creme, gel, unguenti e soluzioni per nebulizzazione, mentre le preparazioni topiche per applicazione oftalmica possono essere scelte fra creme, gel, unguenti soluzioni e sospensioni. Come precedentemente indicato, grazie alla sua stabilità in soluzione acquosa, la ialuronidasi secondo l’invenzione può essere formulata in prodotti a base acquosa; la scelta fra una formulazione a base acquosa ed una formulazione a base oleosa potrà essere effettuata da un tecnico esperto sulla base delle conoscenze comuni nel settore della tecnologia farmaceutica, a seconda degli altri ingredienti presenti nella composizione.

Infine, la ialuronidasi secondo l’invenzione può essere utilizzata come reagente in saggi biochimici per la determinazione quali/quantitativa dell’acido ialuronico.

Descrizione delle figure

FIG. 1: elettroforesi 2D della frazione DEAE positiva all’attività ialuronidasica proveniente da surnatante di coltura di Streptomyces koganeiensis ATCC 31394.

FIG. 2: cromatogramma della ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ottenuta dopo cromatografia su colonna Resource Q<®>(passaggio d).

FIG. 3: profilo proteico in SDS-PAGE al 12% delle frazioni ottenute al termine di ogni passaggio di purificazione secondo l’invenzione rispetto al profilo proteico del surnatante.

FIG. 4: analisi della purezza della ialuronidasi mediante HPLC su colonna a gel filtrazione Bio-Sil SEC [passaggio d)].

FIG. 5: analisi in SDS-PAGE e spettri di assorbimento del sequenziamento N-terminale della ialuronidasi ottenuta al passaggio d).

FIG. 6: analisi SDS-PAGE non denaturante per la determinazione dell’attività ialuronidasica; confronto fra la ialuronidasi ottenuta al passaggio d) e la ialuronidasi ottenuta secondo US 4,258,134.

FIG. 7: determinazione del peso molecolare mediante spettrometria di massa della ialuronidasi ottenuta al passaggio d).

FIG. 8: determinazione del punto isoelettrico della ialuronidasi ottenuta al passaggio d).

FIG. 9: confronto fra l’attività enzimatica di alcune ialuronidasi presenti in commercio e la ialuronidasi secondo l’invenzione.

PARTE SPERIMENTALE

L’invenzione verrà ora descritta in maggior dettaglio nella seguente parte sperimentale, che illustra il modo migliore per attuare l’invenzione, che non deve essere inteso in senso limitativo.

MATERIALI E METODI

Coltivazione del microrganismo

S. koganeiensis à ̈ stato ottenuto da American Type Culture Collection (ATCC 31394) e coltivato come descritto in [2]. Brevemente, il microorganismo à ̈ stato fatto crescere in 1 litro di terreno di coltura [(20 g/l di estratto di lievito (Organotechnie) e 5 g/l di peptone di soia (Solabia), a pH 6.9)] a 30 °C, agitando a 150 rpm e per circa 16 ore. Dopo la crescita, la coltura à ̈ stata utilizzata per inoculare un fermentatore da 50 litri (Biostat U, B.BRAUN) contenente 30 litri di apposito terreno [(10 g/l di estratto di lievito (Organotechnie), 5 g/l di peptone di soia (Solabia), 3 g/l di estratto di malto (Costantino), 3 g/l di destrina tipo I (Sigma), 0,2 g/l di antischiuma (Sigma)]. Prima di effettuare l’inoculo, il pH à ̈ stato portato a 7.0 con NaOH; durante la fermentazione il pH à ̈ stato monitorato, ma non controllato, e la temperatura à ̈ stata mantenuta a 30°C durante tutta la fermentazione, mentre l’agitazione à ̈ stata mantenuta a 300 rpm, con un’aerazione di 1,6 VVM (litri aria/ litri terreno di fermentazione/min). La fermentazione ha avuto una durata di 48h, tempo che coincideva con la massima produzione di attività enzimatica ialuronidasica (1x10<5>-1,3x10<5>U.I./litro) nel surnatante di coltura.

Al termine della fermentazione la coltura à ̈ stata centrifugata a 5000 rpm per 30 minuti a 4°C (SORVALL Evolution RC) e filtrata con filtri a flusso tangenziale in polietersulfone di 0.2 µm, in modo tale da eliminare la biomassa di Streptomyces koganeiensis (che si presentava sotto forma di aggregati ifali rotondeggianti di 1-4 mm di diametro) ed ottenere un surnatante chiarificato contenente ialuronidasi.

Determinazione dell’attività ialuronidasica L’attività ialuronidasica à ̈ stata misurata con il metodo Dorfman [3] modificato. Brevemente, il prodotto ottenuto dalla cromatografia su cellulosa DEAE à ̈ stato diluito in tampone fosfato 0,03 M, NaCl 0,82%, pH 6.3 e 1 ml della soluzione così ottenuta à ̈ stato miscelato con 1 ml di tampone substrato (tampone fosfato 0,03 M, NaC l0,82%, pH 6.3) contenente 0,5 mg di acido ialuronico. La digestione enzimatica à ̈ stata effettuata a 37°C per 30 minuti e alla fine del processo di incubazione à ̈ stata generata torbidità aggiungendo 4 ml di soluzione acida a base di siero di cavallo (SIGMA). La densità ottica a 640 nm à ̈ stata misurata esattamente 30 minuti dopo l’aggiunta della soluzione acida a base di siero di cavallo. Uno standard di ialuronidasi da testicolo di mammifero (EDQM, FIP Ialuronidasi, H1115000) contenente 328 U.I./mg à ̈ stato utilizzato per costruire una curva standard e l’attività (in unità) dei campioni à ̈ stata calcolata utilizzando questa curva.

Cromatografie

Le resine e le colonne cromatografiche sono state acquistate da GE Helthcare Life Sciences e mantenute secondo le specifiche fornite dal fornitore. Le fasi di equilibrazione ed eluizione sono state effettuate con un sistema Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC; AKTA explorer 100, GE Healthcare) ad un flusso di 40-50 ml/min per la prima cromatografia e di 5 ml/min per le cromatografie seguenti. Al termine di ogni passaggio cromatografico l’attività ialuronidasica à ̈ stata controllata con il saggio di Dorfman modificato descritto al passaggio precedente.

Per le analisi di purezza mediante gel filtrazione à ̈ stato utilizzato lo strumento HPLC LC-10AD (SHIMADZU) con una colonna Bio-Sil SEC (BIO-RAD), eluendo con NaH2PO40,05M, Na2HPO40,05M, 0,15 M NaCl, pH 6.6, a 1 ml/min. La lunghezza d’onda d’assorbimento utilizzata era di 214 nm (SPD-10A, SHIMADZU). La purezza della proteina à ̈ stata determinata utilizzando il software LC solution 1.21 SP1.

Elettroforesi SDS-PAGE

Le analisi elettroforetiche su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) sono state effettuate utilizzando il metodo di Laemmli [4] su gel di poliacrilammide al 12%, utilizzando un Mini-PROTEAN 3 (BIO-RAD) secondo le istruzioni del fornitore. Il peso molecolare della proteina purificata à ̈ stato stimato mediante confronto con le proteine standard a basso peso molecolare (BIO-RAD).

Elettroforesi bidimensionale ed isoelettrofocalizzazione

La frazione proteica da analizzare viene miscelata in un opportuno tampone di caricamento e caricata su strisce IPG a pH 3-10 (ReadyStrips 7 cm, BIO-RAD); si incuba a 25°C fino ad assorbimento del campione e si carica la striscia sul PROTEAN IEF Cell (BIO-RAD) per l’isoelettrofocalizzazione (IEF).

Al termine della corsa di isoelettrofocalizzazione (prima dimensione) la striscia viene equilibrata in un opportuno tampone di caricamento e di corsa, quindi à ̈ stata caricata in seconda dimensione su SDS-PAGE al 12%, utilizzando celle Mini-PROTEAN 3 (BIO-RAD).

Analisi densitometriche

I gel di poliacrilammide opportunamente colorati con Silver Stain Plus (BIO-RAD) o Coomassie (BIO-RAD), sono stati acquisiti con un acquisitore di immagine da laboratorio ImageQuant 300 TL (GE Healthcare), mentre le analisi (quantitative e qualitative) sono state effettuate impiegando il software di analisi dell’immagine ImageQuant TL (GE Healthcare). Le analisi d’immagine su gel di poliacrilammide 2D SDS-PAGE sono state effettuate invece impiegando il software ImageMaster 2D Platinum 6.0 (GE Healthcare).

Spettrometria di massa

Le analisi di spettrometria di massa per la determinazione del peso molecolare sono state effettuate utilizzando lo spettrometro di massa Ultraflex III TOF/TOF (BRUKER) ed i markers Bruker Protein Mix 1, mentre l’identificazione della proteina viene effettuata utilizzando i valori di massa accurati dei peptidi determinati mediante il sistema MALDI-MS Voyager DE-PRO (Applied Biosystems).

Sequenziamento dell’estremità N-terminale

Il sequenziamento amminoacidico N-terminale à ̈ stato effettuato secondo il metodo degradazione di Edman utilizzando un sequenziatore automatico di proteine in fase liquida pulsata (ABI-Perkin Elmer Mod. 477A). Il software BLAST [5] à ̈ stato utilizzato per condurre ricerche di omologia sulla banca dati GenBank e su quella del progetto genoma delle specie Streptomyces disponibili sul web.

Confronto fra l’attività enzimatica di diverse specie di ialuronidasi

Il potenziale enzimatico della ialuronidasi secondo l’invenzione à ̈ stato valutato mediante confronto con l’attività enzimatica di alcune fra le ialuronidasi commerciali più utilizzate (Standard di ialuronidasi FIP, ialuronidasi da testicolo bovino tipo I-S (SIGMA), ialuronidasi da testicolo bovino tipo VI-S (SIGMA), ialuronidasi da testicolo di pecora di tipo V (SIGMA), ialuronidasi da Streptomyces hyalurolyticus (SIGMA)), utilizzando il saggio enzimatico descritto sopra ed il valore di attività à ̈ stato riportato graficamente in figura 9 come U.I./mg (la concentrazione proteica à ̈ stata determinata mediante BCA Protein Assay Reagent Kit, PIERCE).

ESEMPIO 1 (ESEMPIO DI RIFERIMENTO) – OTTENIMENTO,

PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI IALURONIDASI DA STREPTOMYCES

KOGANEIENSIS SECONDO US 4,258,134

S. koganeiensis 31394 ATCC à ̈ stato coltivato come descritto in Materiali e Metodi; il surnatante ottenuto dalla centrifugazione, opportunamente filtrato con filtri a flusso tangenziale, à ̈ stato sottoposto a cromatografia a scambio anionico debole su DEAE-cellulosa. Brevemente, 1,2 kg di DEAE-cellulosa à ̈ stata equilibrata con tampone sodio fosfato 25 mM a pH 7.0 ed impaccata, quindi il surnatante chiarificato à ̈ stato caricato ed eluito con lo stesso tampone; la frazione raccolta dopo cromatografia à ̈ stata concentrata mediante ultrafiltrazione e dializzata con 10 volumi di acqua distillata (MilliQ, Millipore). Il prodotto così ottenuto à ̈ stato filtrato su filtri in polietersulfone da 0.2 µm e sottoposto a saggio per la determinazione dell’attività ialuronidasica, ad SDS-PAGE, ad elettroforesi bidimensionale e ad analisi densitometrica.

Per quanto riguarda l’elettroforesi bidimensionale, il cui risultato à ̈ riportato in figura 1, un’aliquota da 600 ml della frazione ad attività ialuronidasica ottenuta dalla cromatografia à ̈ stata concentrata utilizzando colonne BIOMAX 5k (Millipore) fino ad un volume di circa 20 ml (circa 864U di ialuronidasi). L’aliquota concentrata à ̈ stata miscelata con 125 ml di tampone di caricamento (urea 8M, CHAPS 2%, ditiotreitolo (DTT) 50mM, 0,2% (w/v) anfoliti Bio-Lyte 2/10 e blu di bromofenolo) e caricata su strisce IPG a pH 3-10 (ReadyStrips 7 cm, BIO-RAD), incubando il campione sulla striscia a 25°C per 11 ore. Dopo 11 ore di assorbimento del campione, la striscia à ̈ stata caricata sul PROTEAN IEF Cell (BIO-RAD) per l’isoelettrofocalizzazione (IEF).

Al termine della corsa di isoelettrofocalizzazione (prima dimensione) la striscia à ̈ stata prima equilibrata per 15 minuti con un primo tampone [(urea 6M, SDS 2%, Tris-HCl 0,375 M (pH 8.8), glicerolo 20%, e DTT 2% (w/v)], poi con un secondo tampone [6M urea, 2% SDS, 0,375 M Tris-HCl (pH 8.8), 20% glicerolo]. Dopo l’ equilibrazione, la striscia à ̈ stata caricata in seconda dimensione su SDS-PAGE al 12%, utilizzando celle Mini-PROTEAN 3 (BIO-RAD). Dopo la corsa elettroforetica, il gel à ̈ stato colorato con Coomassie PhastGel Blue R ed analizzato, dopo scansione, mediante software d’ immagine come descritto in materiali e metodi (Figura 1).

ESEMPIO 2 – OTTENIMENTO, PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE

DELLA IALURONIDASI DA STREPTOMYCES KOGANEIENSIS SECONDO

L’INVENZIONE

2a) Ottenimento e purificazione

Preparazione del campione

Il surnatante chiarificato (circa 30 litri), ottenuto dalla fermentazione di Streptomyces koganeiensis ATCC31394, come descritto in Materiali e Metodi, à ̈ stato concentrato 10 volte mediante ultrafiltrazione attraverso filtri in polietersulfone con 10kDa di cut-off e ne à ̈ stata misurata l’attività ialuronidasica. Il surnatante concentrato à ̈ stato quindi dializzato (10 volumi) con una soluzione di acetato di sodio 50 mM a pH 4.0 e sottoposto al passaggio a).

Passaggio a) Cromatografia a scambio cationico debole

Il surnatante concentrato e dializzato à ̈ stato caricato su 200 ml di resina CM-Sepharose® Fast Flow (GE Healthcare), impaccata in una colonna XK-50 (GE Healthcare) ed equilibrata con 10 volumi di letto (bed volumes, BV) di tampone acetato di sodio 50 mM a pH 4.0.

Dopo il caricamento, la colonna à ̈ stata lavata con 3 BV del medesimo tampone, quindi le proteine legate sono state eluite con 3 BV di una soluzione tampone acetato di sodio 50 mM a pH 4.5. Le proteine eluite sono state raccolte in un’unica frazione avente volume di circa 200 ml e sottoposte a saggio di attività ialuronidasica.

Passaggio b) Diafiltrazione e cromatografia a scambio anionico forte

La frazione enzimaticamente attiva ottenuta al passaggio a) à ̈ stata sottoposta a diafiltrazione per 10 volte con un tampone di equilibrazione Tris-HCl 50 mM, pH 8, dopodiché à ̈ stata caricata su una colonna HiTrap® Q XL (5ml), precedentemente equilibrata con 20 BV del medesimo tampone. Dopo caricamento del campione, à ̈ stato effettuato un lavaggio con 20 BV di tampone, quindi le proteine legate sono state eluite prima con 12 BV di tampone Tris-HCl 50 mM, NaCl 35 mM a pH 8 per rimuovere le impurezze costituite da proteine non attive, dopodiché la frazione enzimaticamente attiva à ̈ stata eluita con 14 BV di tampone Tris-HCl 50mM, NaCl 200 mM a pH 8 e raccolta in un volume finale di circa 50 ml. Equilibrazione, lavaggio ed eluizione sono stati effettuati al flusso di 5 ml/min.

Passaggio c) Cromatografia a scambio cationico forte

La frazione proveniente dal passaggio b) à ̈ stata diluita 10 volte con un tampone acetato di sodio 20 mM a pH 4 e caricata su colonna HiTrap® SP FF, precedentemente equilibrata con 20 BV della medesima soluzione. Dopo un primo lavaggio con 20 BV della medesima soluzione, le proteine legate sono state eluite con 10 BV di un tampone fosfato di sodio 50 mM a pH 4. Le proteine eluite sono state raccolte in una frazione avente volume di circa 45 ml e sottoposte a saggio di attività enzimatica ialuronidasica. Equilibrazione, lavaggio ed eluizione sono stati effettuati al flusso di 5ml/min.

Passaggio d) Cromatografia a scambio anionico forte

La frazione enzimaticamente attiva ottenuta al passaggio c) à ̈ stata diluita 10 volte in un tampone acetato di sodio 20mM a pH 5,5 e caricata su una colonna Resource Q®, precedentemente equilibrata con 20 BV del medesimo tampone. Dopo il caricamento del campione à ̈ stato effettuato un lavaggio con 20 BV del medesimo tampone, quindi il pH à ̈ stato abbassato a 5 ed à ̈ stata effettuata un’eluizione con 10 BV di soluzione in modo tale da rimuovere le impurezze costituite da proteine non attive. Il pH à ̈ stato poi ulteriormente abbassato a 4 ed à ̈ stata effettuata un’eluizione con 15 BV di tampone. Il secondo picco eluito a questo valore di pH, avente assorbanza maggiore, à ̈ stato raccolto in un volume finale di circa 10-15 ml e sottoposto ad ultrafiltrazione e a dialisi con 10 volumi di acqua MilliQ (Millipore). Equilibrazione, lavaggio ed eluizione sono sati effettuati ad un flusso di 5 ml/min.

Tutte le frazioni proteiche eluite, sia quelle enzimaticamente attive che quelle non attive o poco attive, sono state quindi analizzate mediante SDS-PAGE al 12% come descritto in Materiali e Metodi e poi colorate con silver stain secondo le istruzioni fornite dal fornitore; in tutte le frazioni con la più alta attività ialuronidasica era presente una banda proteica più marcata a circa 25 kDa (Figura 3).

2b) Analisi e caratterizzazione

Analisi HPLC mediante gel filtrazione

La frazione ottenuta al passaggio d) à ̈ stata sottoposta ad HPLC su colonna a gel filtrazione come descritto in Materiali e Metodi. Il risultato dell’analisi à ̈ riportato in figura 4.

Spettrometria di massa

La frazione ottenuta al passaggio d) à ̈ stata sottoposta ad elettroforesi su SDS-PAGE al 12%. Al termine della corsa il gel à ̈ stato colorato con Coomassie Brillant Blue G-250 (BIO-RAD) e la proteina scissa dal gel à ̈ stata digerita con tripsina (BIO-RAD). Un profilo di masse peptidiche à ̈ stato ottenuto utilizzando il sistema MALDI-MS Voyager DE-PRO (Applied Biosystems). Le masse peptidiche ottenute sono state utilizzate per le ricerche in banca dati per l’identificazione della proteina.

Sequenziamento N-terminale

La frazione ottenuta al passaggio d) à ̈ stata sottoposta ad elettroforesi SDS-PAGE su gel al 12%, come descritto sopra, quindi a blotting su membrana di poliviniliden difluoruro (BIO-RAD) e colorata secondo le istruzioni fornite dal fornitore. La banda à ̈ stata scissa con un bisturi, cercando di ottenere un pezzetto con le più piccole dimensioni possibili (3 mm x 10 mm) ed à ̈ stata caricata nella camera di reazione del sequenziatore.

Determinazione dell’attività ialuronidasica mediante SDS-PAGE non denaturante

I campioni proteici da analizzare per l’attività enzimatica ialuronidasica [ialuronidasi e proteine non legate ottenute al passaggio d) e ialuronidasi ottenuta dalla cromatografia su DEAE-cellulosa] sono stati frazionati in doppio su un gel nativo di poliacrilammide all’8% impregnato con 0,17 mg/ml di acido ialuronico. Dopo corsa elettroforetica, il gel à ̈ stato lavato tre volte con formiato di sodio 0,1 M, NaCl 0,05M, pH 4.0, ed incubato durante la notte nella stessa soluzione a 37 °C. Il gel à ̈ stato lavato tre volte in acido acetico al 3% e colorato per 2h a temperatura ambiente in una soluzione di Alcian blue allo 0,5% (w/v) (SIGMA) ed acido acetico al 3%. Il gel à ̈ stato poi decolorato in una soluzione di sodio acetato al 7% per almeno 1h.

Le proteine che mostravano attività ialuronidasica sono state rilevate come bande chiare su sfondo blu del gel [6]. Un Native-PAGE preparato allo stesso modo, ma colorato con Coomassie Brillant Blue G-250 (BIO-RAD) à ̈ stato utilizzato come controllo (Figura 6).

Eluizione passiva della proteina da gel nativo di poliacrilammide

La banda proteica ad attività ialuronidasica à ̈ stata scissa dal gel nativo di poliacrilammide colorato con Coomassie Brillant Blue G-250 e posta all’interno di una provetta sterile da 1,5 ml. 0,5 ml di tampone di eluizione (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, e 0,1 mM EDTA; pH 7.5) sono stati aggiunti al pezzo di gel scisso, in modo tale che venisse immerso completamente. Il pezzo di gel à ̈ stato omogenato con un pestello sterile ed incubato in uno shaker orbitante a 30°C durante la notte. Dopo incubazione, il gel omogenato à ̈ stato centrifugato a 5,000-10,000 x g (centrifuga 5402, eppendorf) per 10 minuti e, con molta attenzione, il surnatante à ̈ stato prelevato e trasferito in una nuova provetta da 1,5 ml. Dopo essere stato concentrato 10 volte con colonna BIOMAX 5k (Millipore), il surnatante à ̈ stato controllato per la presenza della proteina eluita mediante SDS-PAGE, ed in seguito à ̈ stato sottoposto a saggio di attività ialuronidasica e, per conferma, a sequenziamento N-terminale (Figura 5).

Determinazione del peso molecolare della proteina mediante spettrometria di massa

1 ml di ialuronidasi (circa 0,5 mg) à ̈ stato miscelato con 1 ml di una soluzione costituita da 20 mg/ml di acido sinapinico (SA) in acetonitrile al 50% con lo 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA). La miscela ottenuta à ̈ stata trasferita su piastra MALDI e sottoposta ad analisi come indicato in Materiali e Metodi. Il risultato dell’analisi à ̈ riportato in figura 7.

Isoelettrofocalizzazione

Un’aliquota da 20 ml (20 mg) di ialuronidasi ottenuta al passaggio d), à ̈ stata miscelata con 125 ml di tampone di caricamento [urea 8 M, CHAPS 2%, 50mM ditiotreitolo (DTT), 0,2% (w/v) di anfoliti Bio-Lyte 2/10 e blue di bromofenolo] e caricata su striscia IPG a pH 3-10 (ReadyStrips 7 cm, BIO-RAD), incubando il campione sulla striscia a 25°C per 11 ore. Dopo 11 ore di assorbimento del campione, la striscia à ̈ stata caricata per l’isoelettrofocalizzazione (IEF) sul PROTEAN IEF Cell (BIO-RAD). Al termine della corsa di isoelettrofocalizzazione, la striscia à ̈ stata asciugata con carta da filtro (Whatman), inumidita con acqua MilliQ, e colorata per 45 minuti utilizzando la soluzione IEF Gel Staining (BIO-RAD). La striscia à ̈ stata decolorata per 1 ora o più con la soluzione decolorante (Destain solution, Coomassie R-250, BIO-RAD). Il punto isoelettrico del campione à ̈ stato determinato mediante confronto con i punti isoelettrici degli standard di riferimento (IEF Marker pH 3-10, SERVA). Il risultato dell’analisi à ̈ riportato in figura 8.

Confronto fra l’attività enzimatica di diverse specie di ialuronidasi

Il risultato di questo saggio dimostra che la ialuronidasi secondo l’invenzione possiede un’attività circa tre volte superiore a quella più attiva fra quelle utilizzate per il confronto (Figura 9).

Sequenziamento

Il sequenziamento dell’estremità N-terminale, condotto come descritto in materiali e metodi, ha permesso di stabilire che essa contiene la seguente sequenza amminoacidica:

Ala-Gly-Glu-Asn-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Phe-Asp-Gly-Pro-Val-Ala (SEQ ID No. 1)

ESEMPIO 3 – PREPARAZIONI FARMACEUTICHE

Preparazione 1 – gel idrofilo

Quantità (U.I o mg/1g di Componenti idrogel) Ialuronidasi 150 U.I Carbomer 974P 15 mg Glicerolo 100 mg Glicole propilenico 66,75 mg Trietanolammina (TEA) 13,25 mg Glicole polietilenico 400 66,75 mg Metil p-idrossibenzoato 2 mg Propil p-idrossibenzoato 0,2 mg Acqua purificata q.b. a 1g

Metil- e propil- parabene sono stati sciolti in acqua purificata a 80°C. Dopo raffreddamento della soluzione a temperatura ambiente, à ̈ stata aggiunta la ialuronidasi, agitando fino a completa dissoluzione, dopodiché à ̈ stato aggiunto PEG 400, continuando ad agitare fino a dissoluzione. A questa soluzione à ̈ stato aggiunto Carbomer<®>974P, mantenendo l’agitazione fino a dispersione omogenea e a completa idratazione di quest’ultimo, quindi à ̈ stata aggiunta TEA per ottenere la gelificazione della fase acquosa. Infine, sempre sotto agitazione, sono stati aggiunti glicerolo e glicole propilenico.

Preparazione 2 – Crema idrofila (emulsione o/a)

Quantità Componenti (U.I o mg/1g di crema) Ialuronidasi 150 U.I Tefose 1500 110 mg Glicerolo 80 mg

Acido stearico 33 mg Paraffina Liquida 40 mg

Metil p-idrossibenzoato 1 mg

Acqua purificata q.b. a 1g

Per la preparazione della fase oleosa, paraffina liquida, acido stearico e Tefose<®>1500 sono stati fusi sotto agitazione a 50°C. Separatamente à ̈ stata preparata la fase acquosa mediante iniziale solubilizzazione a 80°C di metil-parabene, successivo raffreddamento a temperatura ambiente ed incorporazione di glicerolo e ialuronidasi sotto agitazione fino a completa dissoluzione.

La fase acquosa à ̈ stata aggiunta a quella

oleosa, procedendo all’emulsionamento, dopodiché

l’emulsione O/A ottenuta à ̈ stata raffreddata sotto

agitazione a temperatura ambiente.

Preparazione 3 - Unguento

Quantità Componenti (U.I o mg/1g di unguento) Ialuronidasi 150 U.I Paraffina liquida leggera 200 mg Vaselina bianca q.b. a 1g

L’unguento base à ̈ stato preparato per fusione

sotto agitazione a 70°C di paraffina liquida leggera

e vaselina bianca. Dopo raffreddamento a temperatura

ambiente, Ã ̈ stata incorporata la ialuronidasi,

miscelando fino ad ottenimento di una sospensione

omogenea.

Preparazione 4 - Lipogel

Quantità Componenti U.I o mg/1g di lipogel) Ialuronidasi 150 U.I

Olio di ricino idrogenato 10 mg

Alcol cetostearilico 50 mg Vaselina bianca 365mg Paraffina liquida leggera q.b. a 1g

Paraffina liquida leggera, vaselina bianca e

l’alcool cetilstearilico sono stati fusi sotto

agitazione a 90°C, dopodiché, sotto agitazione, à ̈

stato aggiunto olio di ricino idrogenato (agente

lipogelificante) fino a soluzione omogenea. Dopo aver

raffreddato lentamente fino a temperatura ambiente, Ã ̈ stata incorporata la ialuronidasi, miscelando fino ad

ottenimento di una sospensione omogenea.

Preparazione 5 - Soluzioni iniettabili per uso

intramuscolare o sottocutaneo

Quantità (U.I o mg/ml Componenti di sol.) Ialuronidasi 200 U.I Lattosio 0,93 mg Potassio Fosfato Dibasico 0,36 Potassio Fosfato Monobasico 0,23 Cloruro di sodio 9

Lattosio e ialuronidasi sono stati sciolti,

sotto agitazione, in una soluzione fisiologica

tamponata a pH 6.4 – 7.2, preparata a temperatura

ambiente e la soluzione così ottenuta à ̈ stata

filtrata su filtri da 0.22 micron.

Bibliografia

[1] Maclean, D., Fishbein, MC., Maroko, PR. & E Braunwald E. 1976. Science, 194: 99-200.

[2] Yoshida, K., Fujii, T., Kikuchi, H. 1981. US Patent: 4258134.

[3] Dorfman, A. 1955. Methods in Enzymology, 1: 166-173.

[4] Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. Nature (London) 227:680-685.

[5] Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

[6] Guntenhoener, M.W., Pogrel, M.A.,and Stern, R.1992. Matrix 12, 388-396.

[7] Lachmann S, Rommeleare J, NÃ1⁄4esch JP. 2003. Novel PKCeta is required to activate replicative functions of the major nonstructural protein NS1 of minute virus of mice. J Virol 2003;77(14):8048-60.

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1) Ialuronidasi da Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 comprendente la sequenza amminoacidica N-terminale mostrata in SEQ. ID. No. 1.
2. 2) Ialuronidasi secondo la rivendicazione 1 caratterizzata da un peso molecolare di 21,6 kDa, da un punto isoelettrico(pI) compreso fra 4.4-4.8 e da un’attività enzimatica di 40,000 U.I./mg.
3. 3) Procedimento per la preparazione della ialuronidasi secondo la rivendicazione 1 o 2 comprendente i seguenti passaggi: a) sottoporre il surnatante ottenuto dalla fermentazione di Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 a cromatografia a scambio cationico debole ed isolare la frazione proteica ad attività ialuronidasica; b) sottoporre la frazione proteica ad attività ialuronidasica ottenuta al passaggio a) a diafiltrazione e a cromatografia a scambio anionico forte ed isolare la frazione proteica ad attività ialuronidasica; c) sottoporre la frazione proteica ad attività ialuronidasica ottenuta al passaggio b) a cromatografia a scambio cationico forte ed isolare la frazione proteica ad attività ialuronidasica; d) sottoporre la frazione proteica ad attività ialuronidasica ottenuta al passaggio c) a cromatografia a scambio anionico forte ed isolare la frazione proteica ad attività ialuronidasica.
4. 4) Ialuronidasi secondo la rivendicazione 1 o 2 come medicamento.
5. 5) Uso della ialuronidasi secondo la rivendicazione 1 o 2 per la preparazione di composizioni farmaceutiche o veterinarie destinate al trattamento di patologie in cui sia necessario o vantaggioso degradare l’acido ialuronico presente nei tessuti o organi affetti da dette patologie.
6. 6) Uso secondo la rivendicazione 5 in cui la composizione à ̈ una composizione farmaceutica e la patologia à ̈ scelta fra edemi, stati infiammatori, geloni, tumori solidi, malattie allergiche mediate da IgE, patologie del cavo orale ed emorragie vitreali spontanee.
7. 7) Uso secondo la rivendicazione 5 in cui la composizione à ̈ una composizione veterinaria e la malattia à ̈ mastite bovina.
8. 8) Composizioni farmaceutiche o veterinarie contenenti la ialuronidasi della rivendicazione 1 o 2 in miscela con opportuni eccipienti e/o veicoli.
9. 9) Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 8 in forma di preparazioni iniettabili o di preparazioni topiche per applicazione epidermica, transdermica o oftalmica.
10. 10) Composizioni secondo la rivendicazione 8 o 9 contenenti inoltre uno o più principi attivi scelti fra: antinfiammatori steroidei e non-steroidei, antitumorali, allergeni, anestetici locali, antibiotici, anticorpi monoclonali, citochine, enzimi ed acido ialuronico solfatato.
11. 11) Composizioni secondo la rivendicazione 10) in cui il principio attivo à ̈ acido ialuronico solfatato e la composizione topica per applicazione dermica à ̈ in forma di crema, gel, unguento o soluzione per nebulizzazione.
12. 12) Uso della ialuronidasi secondo la rivendicazione 1 o 2 come reagente in saggi biochimici per la determinazione quali/quantitativa dell’acido ialuronico.