ITMI20090923A1 - Produzione biotecnologica di condroitina - Google Patents
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PRODUZIONE BIOTECNOLOGICA DI CONDROITINA.
STATO DELL’ARTE
La condroitina à ̈ un polisaccaride naturale lineare formato dall’alternanza di residui di N-acetil-D-galattosammina β 1:4 e D-glucuronato β 1:3. Nei vertebrati la condroitina à ̈ presente in forma variamente solfatata, i residui coinvolti nella solfatazione sono gli ossidrili 4 e 6 della N-acetil-D-galattosammina ed in alcuni casi quelli 2 e 3 dell’acido glucuronico (Sugahara K et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 26745-54). Il peso molecolare della condroitina e l’entità ed i siti della solfatazione dipendono dalla specie, dall’età e dalla tipologia del tessuto (Kuettner KE et al., Eds., in Articular cartilage and osteoarthritis, NY, Raven Press, 1992; Volpi N Ed., in Chondroitin sulfate: structure, role and pharmacological activity, S. Diego, California Academic Press - Elsevier Ine, 2006). La condroitina solfato appartiene alla più ampia famiglia dei glicosamminoglicani, detti GAGs (Beaty NB, and Mello RJ, J. Chromatography and Biomedicai Applications, 1987, 418, 187-222). Questi polisaccaridi, legati covalentemente a proteine, come proteoglicani, sono componenti ubiquitari della matrice extracellulare di tutti i tessuti connettivi, in cui assolvono a numerose funzioni. (Ruoslathi E, Ann. Rev. Celi. Biol., 1988, 4, 229-255; Kjellen L and Lindahl U, Ann. Rev. Biochem., 1991, 60, 443-76).
Alcuni batteri patogeni producono una struttura capsulare che serve come fattore di virulenza. In alcuni casi la capsula à ̈ formata da GAG o strutture correlate in modo da ingannare le difese immunitarie nella fase di infezione. Esempi di questi patogeni sono la Pasteurella multocida (DeAngelis PL, et al., Carbohydrate Res.
2002, 337(17), 1547-52; Harper M, et al., FEMS Microbiol. Lett., 2006, 265(1), 1-10; Leonov AV, et al., Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2006, Nov-Dec (7), 94-7), i ceppi capsulati K4 e K5 E. coli (Roberts IS, Ann. Rev. Microbiol. 1996, 50, 285-31; Bronner D, et al., J Bacteriol. 1993 Sep;175(18):5984-92; Jann B and Jann K In Escherichia coli: Mechanisms of virulence. Cambridge Univ. Press.
1997; Whitfield C, Annu. Rev. Biochem. 2006, 75:39-68. Stevens MP, et al., Mol. Microbiol. 1997, 24(5), 1001-12; Whitfield C and Roberts IS, Mol. Microbiol. 1999, 31, 1307-20; Ninomiya T, et al., J. Biol. Chem. 2002, 277(24), 21567-75) e alcuni ceppi capsulati di Streptococci (Wessels MR, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 19, 8317-21; Tlapak-Simmons VL et al., J. Biol. Chem., 2005, 280, 13, 13012-18).
La condroitina solfato à ̈ utilizzata come farmaco condroprotettivo e antireumatico, con applicazioni nella terapia di osteoartriti tibiofibulari del ginocchio e nelle osteoartriti della cartilagine articolare (Kuettner KE et al., Eds., in Articular cartilage and osteoarthritis, NY, Raven Press, 1992; Simà nek V et al., 2005, 149, 51-56; Goerres GW et al., J. Clinical Desitometry 2005, 8, 484-487; Altman RD et al., OsteoArthritis and Cartilage 2005, 13, 13-19; Chan PS, et al., OsteoArthritis and Cartilage 2005, 13, 387-394; Chou MM, et al., Exp. Biol. Med. 2005, 230, 255-262; Clegg DO, et al., New England J. of Medicine, 2006, 23, 795-808; Roman-Blas et al., OsteoArthritis and Cartilage, 2006, 14, 839-848; Maheu E et al., OsteoArthritis and Cartilage, 2006, 14, 303-322; Fotinì N et al., Biomed. Chromatogr. 2006, 20, 539-550; Lagnaoui R et al., Thérapie 2006, 61, 341-346; Volpi N Ed. in Chondroitin sulfate: structure, role and pharmacological activity, S. Diego, California Academic Press - Elsevier Ine, 2006; Zhang W et al., Ann. Rheum. Dis. 2007, 66, 377-388).
Attualmente la condroitina solfato si ottiene con tecniche estrattive da varie fonti animali, come cartilagini di maiale, pinne di pescecane e cartilagini di teleostei. La scarsità della materia prima e la complessità del downstream di purificazione limitano a livello mondiale la disponibilità di questo principio attivo, il cui mercato à ̈ pertanto controllato dalla impossibiltà di soddisfare una domanda attualmente in crescita. Inoltre le sempre più severe normative in materia di sicurezza di farmaci di derivazione animale, che di continuo sono emanate, potrebbero in prospettiva escludere dal mercato farmaceutico la condroitina solfato estrattiva.
Esiste pertanto un crescente interesse allo sviluppo di strategie produttive alternative di tipo biotecnologico per ottenere, mediante fermentazione da opportuni microrganismi, questo tipo di polisaccaridi o loro precursori.
E’ riportata, nella letteratura scientifica (Rodriguez ML et al., Eur. J. Biochem., 1988, 177, 117-24; Manzoni M et al., Biotechnology Lettere, 1996, 18, 383-6) e brevettale (WO 01/02597 A1) la possibilità di produrre per via fermentativa, utilizzando un ceppo di E. coli K4, che produce un derivato della condroitina, il polisaccaride K4, il cui scheletro carbonioso à ̈ identico alla condroitina, fatta eccezione per l’innesto a livello del C3 dell’acido glucuronico di residui di βfruttofuranosio. Dal polisaccaride K4 può essere ottenuta la condroitina con una idrolisi acida controllata dei residui di fruttosio (US 6,288,044; US 6,777,398). La produzione di condroitina dal precursore K4 non ha trovato però un reale sviluppo industriale, per le basse rese fermentative del polisaccaride precursore, che nel caso migliore (W001/02597) non supera i 0,42g L<'1>.
La US 2005266460 ed una serie di documenti brevettali antecedenti relazionati (WO 0180810, EP 1282684, EP 1832662, US 20030104601, US 20050164984) descrivono l’uso della condroitina sintetasi da Pasteurella multocida, un enzima che catalizza la sintesi di condroitina a partire dai corrispondenti UDP zuccheri. In particolare in questi documenti si rivendicano la sequenza del segmento nucleotidico che codifica per l’enzima, la costruzione e l’uso di ricombinanti (in sistemi di espressione sia procarioti che eucarioti) che lo esprimono e la produzione con questi ricombinanti di condroitina modificata e di varie dimensioni. In tutti questi documenti mancano evidenze sperimentali sui processi produttivi rivendicati, in particolare non sono mai riportati dati di dettaglio sulle modalità fermentative per produrre gli enzimi e sulle rese in condroitina del processo biotecnologico. A circa 10 anni dalla prima priorità non risulta sviluppato nessun processo industriale ricollegabile a quanto rivendicato.
La US 20070015249 ed il documento brevettale antecedente relazionato US 20030109693 descrivono la produzione di una condroitina sintetasi da E. coli K4 ed il suo impiego per la produzione in vitro di condroitina. La produzione dell’enzima, codificato dal gene kfoC della regione II del cluster di E. coli K4 responsabile della biosintesi dell’antigene capsulare, à ̈ caratterizzata dalle seguenti fasi: amplificazione di kfoC, clonaggio del gene nel vettore pTrcHis e sua espressione nel ceppo commerciale di E . coli TOP. I due documenti rivendicano anche proteine che abbiano mutazioni, naturali o artificiali, che possono indurre leggere modifiche strutturali della condroitina sintetasi senza alterarne la funzione catalitica. Anche in questi documenti mancano dati in relazione alle rese dei processi produttivi rivendicati, quello della produzione della condroitina sintetasi e quello della produzione in vitro della condroitina a partire dai corrispondenti UDP-zuccheri. La EP 1950308 ed una serie di documenti brevettali antecedenti relazionati (WO 2007145197, WO 2007069693, WO 2007058252, WO 2007058252, WO 2007023867) descrivono metodi di sintesi in vitro di condroitina e derivati che utilizzano la condroitina sintetasi da E. coli K4 e suoi mutanti, che presentano una sola delle due attività trasferasiche.
La US 7,273,729 ed una serie di documenti brevettali antecedenti relazionati (JP 2004024208, US 20060052335, US 20060057697, US 7,232,676) descrivono l'uso della condroitina sintetasi umana, un enzima che catalizza la sintesi di condroitina a partire dai corrispondenti UDP zuccheri. I documenti rivendicano la struttura della condroitina sintetasi umana, un vettore di espressione che comprenda la sequenza dell’enzima, l’espressione di tale vettore in cellule eucariotiche e un metodo per sintetizzare la catena polisaccaridica della condroitina.
La US 20070059805 rivendica, la struttura della condroitina sintetasi umana, un vettore di espressione che comprenda la sequenza dell’enzima, l’espressione di tale vettore in cellule eucariotiche e un metodo per sintetizzare la catena polisaccaridica della condroitina.
Tutti i documenti precedentemente citati non risolvono il problema della produzione di condroitina a costi competitivi rispetto alla condroitina solfato ottenuta per estrazione da fonti animali. In particolare la produzione per via fermentativa, utilizzando E. coli K4, Pasteurella multocida o loro mutanti a livello della condroitina sintetasi, à ̈ caratterizzata da rese che non superano nei brodi di fermentazione 0,5g-L<'1>. Analogamente i processi biotecnologici che utilizzano la condroitina sintetasi da E. coli K4, da Pasteurella multocida o umana e loro mutanti hanno costi elevati legati alla produzione dell’enzima ed all’impiego di UDP zuccheri come substrati.
Rimane pertanto senza soluzioni pratiche la problematica di produrre condroitina a costi che siano compatibili con le esigenze del mercato di riferimento.
SOMMARIO
Sorprendentemente à ̈ stato trovato che à ̈ possibile produrre condroitina con rese fermentative > 8gL<"1>, con una strategia integrata basata sulla ottimizzazione di un processo fermentativo trifasico (batch - fed batch - in regime di microfiltrazione) e sull’impiego di batteri geneticamente modificati, preferibilmente di ceppi geneticamente mutati di E. coli K4, in cui il processo di ingegnerizzazìone à ̈ finalizzato a migliorare la processivita dell’intero complesso enzimatico responsabile della sintesi del polisaccaride K4, mediante inserimento di più copie del gene autologo RfaH, che funziona da regolatore positivo delle trascrizione del cluster di geni responsabili della sintesi del materiale capsulare.
Le alte rese produttive, la semplicità del downstream di purificazione sviluppato, i bassi costi complessivi del processo, il suo ridotto impatto ambientale rendono quanto trovato superiore alle strategie biotecnologiche precedentemente descritte (Rodriguez ML et al., Eur. J. Biochem., 1988, 177, 117-124; Manzoni M et al., Biotechnology Letters, 1996, 18, 383-386; WO 01/02597 A1; US 6,288,044; US 6,777,398; US 2005266460; WO 01/80810; EP 1282684; EP 1832662; US 20030104601; US 20050164984; US 20070015249; US 20030109693; EP 1950308; WO 2007145197; WO 2007069693; WO 2007058252; WO 2007058252; WO 2007023867; US 7,273,729; JP 2004024208; US 20060052335; US 20060057697; US 7,232,676; US 20070059805).
Il processo fermentativo sviluppato, integrato con una strategia di solfatazione chimica regioselettiva della condroitina, rende la via biotecnologica rivendicata competitiva nei riguardi dei processi estrattivi convenzionali della condroitina solfato da materie prime di origine animale, che le recenti evoluzioni normative in materia di sicurezza di prodotto potrebbero eliminare dal mercato farmaceutico. DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione descrive un processo fermentativo che, utilizzando microrganismi batterici modificati geneticamente, quali E. coli, preferibilmente K4 e particolari condizioni di crescita, consente di produrre i polisaccaridi capsulari, precursori della condroitina (nel caso del polisaccaride K4 condroitina fruttosilata sulla posizione 3 dell’acido glucuronico) con rese superiori a 8g-L<'1>, un valore circa 20 volte superiore a quanto fino ad ora descritto.
Questa strategia à ̈ caratterizzata dalle seguenti fasi: un processo fermentativo multifasico (batch, fed-batch, in regime di microfiltrazione), che impiega un ceppo ricombinante di E. coli K4 caratterizzato dalla presenza di più copie del gene autologo RfaH (Santangelo T. and Roberts J, Mol Celi. 2002 Apr;9 (4) :698-700) regolatore positivo delle trascrizione del cluster di geni responsabili della sintesi del materiale capsulare; un trattamento idrolitico realizzato direttamente sul brodo di fermentazione esausto privato della biomassa, che consente la conversione del polisaccaride K4 in condroitina e fruttosio e contemporaneamente la detossificazione del surnatante di fermentazione mediante scissione del lipopolisaccaride (LPS), prodotto in alte quantità dal microrganismo, in O-chain e lipide A, che immediatamente precipita, consentendo così una facile rimozione; da un innovativo downstream di purificazione basato su processi di membrana che separano dalla condroitina la O-chain e gli altri contaminanti presenti nel brodo di coltura. Il processo rivendicato à ̈ inventivo ed innovativo rispetto alla prior art, perché à ̈ l’unico a consentire la realizzazione di processi su scala industriale per l’ottenimento di condroitina, un polisaccaride di grandi potenzialità per il mercato farmaceutico, per il quale fino ad oggi non risultano realizzati processi produttivi, estrattivi o biotecnologici. Inoltre, il processo rivendicato, integrato da una strategia di solfatazione regio-selettiva della condroitina, consente oggi di rispondere anche alla crescente domanda di condroitina solfato che viene dal mercato, aggirando le problematiche delle attuali strategie di produzione estrattiva connesse con l’impiego di fonti animali.
Ingegnerizzazione dei ceppi batterici
E. coli K4 wild type (EcK4wt) - Si conoscono numerosi ceppi di E. coli, tutti capsulati, classificati in quattro gruppi serologie! diversi, sulla base dei determinanti antigenici presenti sulla capsula (se ne annoverano ad oggi circa 80) e di criteri fisici, biochimici e genetici. Le capsule del gruppo 1 e 4 appartengono a ceppi di E. coli che causano infezioni intestinali tra cui gli enteropatogenici (EPEC), gli enterotossigenici (ETEC) e gli enteroemorragici (EHEC). Le capsule del gruppo 1 sono formate da polisaccaridi acidi, per la presenza di acidi uranici con strutture piuttosto simili. Le strutture capsulari del gruppo 4 invece, sono molto diverse e si distinguono per la presenza di zuccheri ammidici acetilati nelle loro unità ripetute. Le capsule inserite nei gruppi 2 e 3 appartengono a ceppi di E. coli che causano infezioni extraintestinali (ExPEC). EcK4wt, il microrganismo sottoposto a modificazione genica per over-produrre il polisaccaride K4, appartiene al gruppo serologico 2 ed à ̈ reperibile con codici diversi presso importanti banche di microrganismi come l’American Type Culture Collection-USA (ceppo ATCC 23502), l’International Escherichia Centre- Danimarca (ceppo Bi 8337/41), la National Collection of Type Cultures-Gran Bretagna (ceppo NCTC 9005) e la Freiburg collection (ceppo U1-41 2616).
Sorprendentemente à ̈ stato trovato che EcK4wt possiede un plasmide endogeno, da ora in poi identificato con la sigla pK4, la cui presenza in E. coli K4 non à ̈ descritta in letteratura. pK4 à ̈ formato da circa 93.000 basi, à ̈ costitutivo, ed à ̈ caratterizzato dal fatto di comprendere alcune sequenze utili per l'inserimento di sequenze geniche eterologhe, di sequenza IDNO:1 e/o IDNO:6. Di esso vi sono mediamente 1-5 copie/cellula e modificazioni genetiche su esso realizzate sono stabilmente conservate.
RfaH, il regolatore delle trascrizione del cluster di geni responsabili della sintesi del materiale capsulare - La trascrizione di lunghi operoni policistronici nei batteri spesso à ̈ basata su proteine accessorie, i cui meccanismi molecolari restano sconosciuti. Ad esempio la trascrizione in un’unica molecola di mRNA delle regioni 2 e 3 del cluster di geni responsabili della sintesi delle componenti molecolari della capsula à ̈ controllata da una proteina codificata dal gene antiterminatore rfaH, che funziona pertanto come regolatore positivo della trascrizione, impedendo l’arresto prematuro dei trascritti. La proteina codificata dal gene RfaH, incrementando la processività dell’RNA polimerasi, attiva la trascrizione di vari geni responsabili della virulenza e della fertilità nei batteri enterici (Stevens MP et al., Mol. Microbiol., 1997, 24, 1001-12). In generale la proteina codificata dal gene RfaH à ̈ richiesta per la biosintesi del core lipopolisaccaridico in E. coli e S. typhimurium (Pradel E and Schnaitman CA, J. Bacteriol., 1991, 173, 6428-31; Brazas R, et al., J. Bacteriol. 1991, 173, 6168-73), per la sintesi e secrezione dell’ α-emolisina (Bailey MJA et al., Mol. Microbiol. 1992, 6, 1003-10) e per la produzione del fattore sessuale-F (Beutin L and Achtman MJ, Bacteriol. 1979, 139, 730-37). Inoltre Zhang e collaboratori (Zhang L et al., Infect. Immun. 2004, 72, 7282-93.) riportano che in generale l’espressione degli antigeni capsulari del gruppo serologico 2 richiede la proteina codificata dal gene rfaH e dimostrano che in E. coli K5 questa à ̈ richiesto per la trascrizione della regione 2 del cluster genico responsabile della sintesi del polisaccaride capsulare. Rahn e Whitfield (Rahn A and Whitfield C, Mol. Microbiol.
2003, 47, 1045-60) dimostrano che in E. coli K30, appartenente al gruppo serologico I, la trascrizione del cluster per la sintesi della capsula à ̈ modulata da un meccanismo di antiterminazione esercitato dal gene RfaH.
Il ruolo essenziale del gene RfaH e della corrispondente proteina nel processo di sintesi delle componenti capsulari à ̈ indirettamente dimostrato da studi di delezione o alterazione di questo gene. In particolare Nagy e collaboratori (Nagy G, et al., Infect. Immun. 2002, 70, 4406-13) riportano che, la delezione del gene rfaH dal genoma del ceppo uropatogenico E. coli 536 ne riduce drasticamente la virulenza nel topo, passando da una mortalità del 100% indotta dal ceppo wild type ad una del 18% con il mutante. La eliminazione del gene RfaH determina anche un’alterazione del fenotipo dell’LPS e una riduzione nella produzione di capsula K15 e α-emolisina. Stevens e collaboratori (Stevens MP et al., FEMS Microbiol. Lett., 1994, 124, 93-8) dimostrano che l’introduzione di mutazioni nella sequenza genica di rfaH rende le cellule di E. coli K5, incapaci di produrre capsula a 37°C.
Nessun dato à ̈ reperibile, invece, in letteratura sull’effetto dell’over-espressione di rfaH.
Nel ceppo EcK4wt il gene rfaH Ã ̈ posto sotto il controllo di un promotore regolato, che ne determina una espressione massima durante la fase stazionaria di crescita (Stevens MP, et al., Mol. Microbiol., 1997, 24, 1001-12; Stevens M. P., et al., FEMS Microbiol. Lett., 1994, 124, 93-98).
Sorprendentemente à ̈ stato trovato che l’integrazione di una o più copie del gene rfaH nel materiale genetico di batteri quali E. coli, in particolare EcK4wt, migliora notevolmente la produzione del polisaccaride K4. Per rendere più efficace la trascrizione del gene rfaH integrato, lo si può mettere sotto il controllo di un promotore, meglio se efficiente in tutte le fasi di crescita, come ad esempio pGap, promotore costitutivo del gene GapA codificante la gliceraldeide-3-P-deidrogenasi (GAPDH), enzima chiave e sempre necessario nel metabolismo di E. coli. In particolare il promotore pGap à ̈ organizzato in una regione multi-promotore, composta dai promotori P1, P2, P3 e P4. Tra questi, il promotore P1 à ̈ il più forte, ma l’azione sinergica dei quattro promotori assicura la trascrizione del gene in condizioni diverse, rendendola più versatile ed efficiente. Altri promotori costitutivi, attivi in E. coli, possono comunque essere utilizzati.
Pertanto rappresenta un ulteriore oggetto di questa invenzione un ceppo batterico dotato quale polisaccaride capsulare di un precursore della condroitina, preferibilmente un Escherichia coli, in cui tale polisaccaride à ̈ preferibilmente K4, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno una copia di una sequenza codificante per la proteina rfaH o suoi frammenti funzionalmente equivalenti, ingegnerizzato.
Esso può essere ingegnerizzato mediante inserimento di copie geniche multiple comprese, alternativamente o in combinazione, su DNA cromosomiale, elementi plasmidici o elementi trasponibili.
Secondo una realizzazione preferita, la sequenza codificante per la proteina rfaH Ã ̈ posta sotto il controllo di un promotore costitutivo o comprende almeno una delle sequenze selezionate nel gruppo costituito da: SEQIDNO:1 SEQIDNO:6, SEQIDNO:9, SEQIDNO:11, SEQIDNO:12, SEQIDNO:13, SEQIDNO:20.
Sorprendentemente à ̈ stato trovato che à ̈ possibile ottenere con alte rese il polisaccaride K4 con i presenti batteri ingegnerizzati, ricorrendo ad un processo fermentativo articolato in tre fasi sequenziali: batch, fed-batch e in regime di microfiltrazione.
La prima fase batch dura fino a quando l’esaurimento dei nutrienti non determina una diminuzione della velocità di crescita del microrganismo (Î1⁄4), e contemporaneamente un’aumento della p02.
La seconda fase fed-batch, à ̈ caratterizzata in maniera critica da un profilo di alimentazione con una soluzione concentrata di nutrienti che permette di mantenere la velocità di crescita del microrganismo ad un valore inferiore a quello massimo. In particolare la strategia fermentativa rivendicata prevede la possibilità che l’addizione dei nutrienti sia automaticamente ottimizzata facendo pilotare il feed dalle variazioni di parametri fermentativi tipicamente correlati alla condizione di disponibilità dei nutrienti, come ad esempio la pressione parziale di 02disciolto o il pH del mezzo di coltura. Questo tipo di strategia si realizza creando dei loop di controllo con un software ad hoc che, in base ad una ottimizzazione dei parametri dei controllori PID, garantisce in tempo reale di soddisfare le richieste nutrizionali del microrganismo in crescita, prolungando la fase di crescita ed evitando fenomeni di overflow metabolism, che porterebbero alla produzione di acidi organici, il cui accumulo nel mezzo inibisce la crescita (per EcK4 una concentrazione di acido acetico > 5 g-L<'1>inibisce la crescita).
La terza fase, detta in regime di microfiltrazione, si attiva quando l’accumulo dei cataboliti tossici rallenta o arresta la crescita, anche in presenza di nutrienti disponibili. Questo processo prevede la microfiltrazione del mezzo di coltura utilizzando moduli microfiltranti collocati all’interno o all’esterno del bioreattore. Nella fase di microfiltrazione il volume del fermentato à ̈ mantenuto costante da un controllore di livello, che automaticamente reintegra il volume del microfiltrato rimosso, con aggiunte di una soluzione salina di composizione compatibile a quella utilizzata nella preparazione del terreno. Alla fine del processo fermentativo il polisaccaride K4 à ̈ presente in parte nel microfiltrato e in parte nel fermentatore.
Crescita batch - Il rilascio del polisaccaride K4 nel mezzo di coltura à ̈ una caratteristica costitutiva di EcK4r e EcK4wt, mentre la resa in biomassa e la produttività (polisaccaride K4/biomassa) dipendono dalla composizione del mezzo di coltura e dalle condizioni di fermentazione.
I nutrienti - Nella crescita di EcK4r e EcK4wt finalizzata alla produzione di polisaccaride K4 possono essere impiegati senza criticità terreni di differente composizione; ad esempio si possono utilizzare come fonte carboniosa glucosio, destrine, amido, glicerolo, corn steep liquor o melassa e come fonte di azoto organico e nutrienti complessi fonti non di derivazione animale come peptone, estratto di lievito, idrolizzati di caseina, triptone e farine di soia, di cotone o di piselli. Condiziona, invece, in maniera critica l’efficienza produttiva (polisaccaride K4/biomassa) il rapporto tra fonte carboniosa e fonte di azoto organico nel mezzo di coltura. In particolare, diminuendo la quantità di azoto organico nel terreno di coltura, si ha una minore capacità di crescita del microrganismo, che si accompagna ad una maggiore capacità di produrre il polisaccaride K4. Poiché questo secondo effetto à ̈ prevalente rispetto al primo, in terreni semidefiniti poveri in fonti complesse si osserva una maggiore produttività (polisaccaride K4/L fermentato).
L’ossigenazione - L’ossigenazione del mezzo di coltura non ha effetti critici sulla crescita del microrganismo e sulla produzione del polisaccaride K4, purché vengano evitate condizioni di stretta anossia, garantendo almeno una p02> 5% della saturazione in ossigeno puro.
II pH - Tra pH 3 e 10 si ha crescita, ma l'intervallo di pH 6-8 à ̈ quello ottimale sia per la crescita del microrganismo che per la produzione del polisaccaride K4. Pertanto il pH del mezzo di coltura à ̈ mantenuto automaticamente in questo intervallo con un sistema pH-stat.
La temperatura - Nell’intervallo 25-40°C si ha crescita del microrganismo e produzione del polisaccaride K4, con un massimo di resa a 37°C.
La fase di crescita - Il polisaccaride K4 Ã ̈ rilasciato dal microrganismo nel mezzo di coltura, parzialmente nella fase di crescita esponenziale e completamente nella fase stazionaria.
Crescita in beuta ed in fermentatore - A parità di condizioni la crescita in fermentatore rispetto a quella in beuta, consente di avere rese (polisaccaride K4/L di fermentato) fino a 4 volte più elevate.
Crescita fed-batch - Sorprendentemente à ̈ stato trovato che strategie di feed che evitano overflow metabolism, ottenute mantenendo l’addizione di nutriente fresco al di sotto della velocità critica di uptake del substrato migliorano sia la resa di biomassa che quella del polisaccaride K4. Ad esempio questo può essere ottenuto con una strategia di fermentazione che mette il feed dei nutrienti sotto il controllo della concentrazione di ossigeno disciolto all’interno del reattore, che deve essere mantenuta ad un valore di p02del 30%. Questo à ̈ realizzato in modo veloce e riproducibile, attraverso un controllore PID collegato alla pompa di alimentazione della soluzione concentrata di nutrienti (es. glicerolo-soia o glucosio-estratto di lievito). L’adduzione di una fonte di carbonio all’interno del bioreattore comporta, infatti, un decremento della DOT (Dissolved Oxygen Tension). Pertanto al termine della fase batch di fermentazione, ed in particolare quando il valore di p02inizia ad aumentare, si parte con la fase di feed di alimentazione concentrata, fino a riportare il valore di p02a quello settato, con basse derive (-20% del p02set). Una volta che il valore di p02raggiunge quello di set-point, la pompa di alimentazione si arresta automaticamente interrompendo l’alimentazione, fino all’esaurimento della fonte carboniosa nel brodo di fermentazione che determina un repentino innalzamento del valore di p02, innescando così di nuovo il ciclo descritto in precedenza. La fase di feed procede quindi in maniera automatica e sequenziale seguendo le richieste nutrizionali della coltura sotto controllo metabolico. Un’analoga strategia di pilotaggio del feed può essere attivata operando sulla variazione di pH, in questo caso occorre escludere il sistema di correzione del pH con il pH-stat, l’alimentazione verrà inserita tramite uno switch in on della pompa deputata all’adduzione quando il pH aumenterà al di sopra di una soglia predefinita in base alla fisiologia del microorganismo (es. pH 7.8).
Crescita in regime di microfiltrazione - E’ possibile prolungare la fase di crescita del microrganismo e la produzione del polisaccaride K4 rimuovendo mediante un processo di microfiltrazione le componenti tossiche che si accumulano nel mezzo di fermentazione. Il processo di microfiltrazione à ̈ realizzato con una unità esterna, di preferenza a fibre cave, operando in regime di microfiltrazione tangenziale, che riduce lo sporcamento delle membrane filtranti e mantiene un elevato flusso transmembrana. Il volume del microfiltrato à ̈ ripristinato automaticamente con una soluzione salina di composizione identica a quella del mezzo di coltura, utilizzando un controllo di livello. Durante il processo di microfiltrazione i nutrienti vengono addizionati sotto forma di una soluzione concentrata secondo un profilo di alimentazione limitante per la velocità di crescita. Questo consente sia di evitare indesiderati fenomeni di overflow metabolico sia di perdere nutrienti nella corrente di uscita del terreno microfiltrato (eluato).
Operando in queste condizioni si ottiene una continua diluizione delle componenti solubili del mezzo di fermentazione, pertanto nel permeato si ritrova parte della condroitina prodotta. Grazie alla resistenza della membrana (Rm) e alla resistenza del cake (Rc) che su di essa si forma, il permeato ottenuto nella terza fase del processo fermentativo in regime di microfiltrazione contiene bassi livelli di contaminanti macromolecolari (es. proteine, LPS, etc.). Pertanto esiste la possibilità di trattare questo permeato direttamente su membrane di ultrafiltrazione (UF), evitando la fase di pre-trattamento con proteasi a cui si deve, invece, sottoporre il brodo esausto dopo la rimozione della componente cellulare. Alternativamente il permeato della microfiltrazione viene aggiunto al brodo esausto privato della componente cellulare.
Purificazione di condroitina dal brodo di coltura fermentato
Separazione della biomassa - Al termine del processo fermentativo la rimozione della biomassa può essere realizzata o mediante microfiltrazione o per centrifugazione o con l’ausilio di terra filtrante mediante filtri a piatti tipo Funda.
Allontanamento della biomassa mediante microfiltrazione - AI termine del processo fermentativo si continua il processo di microfiltrazione, interrompendo l'aggiunta della soluzione salina. Quando la quantità di biomassa nel microfiltrato raggiunge il massimo valore compatibile con il processo 300-400g biomassa umidaL<'1>; corrispondenti ad una concentrazione di 3-5 volte rispetto al volume del brodo di fine fermentazione) si aggiunge un volume di acqua deionizzata e si continua a microfiltrare, questa fase di lavaggio à ̈ ripetuta almeno 3 volte. Tutti i permeati, quelli ottenuti durante la fermentazione e quelli connessi con l’allontanamento della biomassa, (terreno acellulare) sono riuniti e sottoposti alle fasi successive del downstream.
In alternativa il brodo di coltura può essere raccolto in un recipiente sanitizzato e trattato su di un sistema automatico specifico per microfiltrazione cross-flow, utilizzando cassette o, preferibilmente fibre cave con cut-off compreso tra 0,22 e 0,6Dm. In tal caso si opera a T compresa tra 15°C e 40°C, con una pressione transmembrana tra 0,8 e 1,2atm e una portata di ricircolo per il flusso tangenziale 40-100L-(min-m<2>)<'1>. Imponendo un Î”Ï superiore (> 0,5 atm) il flusso transmembrana cresce e i tempi di trattamento divengono più brevi, ma questo causa la formazione di un cake più spesso che impedisce il totale recupero nell’eluato del polisaccaride K4.
Allontanamento della biomassa mediante centrifugazione - Al termine della fermentazione la biomassa à ̈ separata da brodo di coltura mediante centrifugazione in continuo. Al brodo di coltura recuperato si addiziona il permeato della microfiltrazione nel caso non sia già stato in precedenza ultrafiltrato e si procede alle successive fasi del downstream.
Allontanamento della biomassa con filtrazione su terra
Ad ogni litro di brodo viene aggiunta una quantità di terra filtrante (preferibilmente celite) pari a 4-8 volte il peso di biomassa umida nel brodo, questa sospensione viene poi alimentata ad un filtro a piatti tipo FUNDA, e filtrata sottopressione (3-6 bar). Il brodo chiarificato (OD600<0,1) può essere trattato per la degradazione delle proteine eventualmente dopo microfiltrazione su apposite capsule asimmetriche microfiltranti (es.GE 0,6-0,2pm).
Degradazione idrolitica delle proteine - Per deproteinizzare il mezzo di coltura contenente il polisaccaride K4 si addizionano uno o più enzimi proteolitici, di preferenza proteasi fungine, ( Aspergillus oryzae 2-6UL<'1>), che si lasciano agire per un tempo dipendente dalla temperatura utilizzata (1-3h a 25-37°C, 8-20h a 4°C).
Ultrafiltrazione-diafiltrazione - Il fermentato, privato della componente cellulare e deproteinizzato, à ̈ ultrafiltrato utilizzando sistemi per ultrafiltrazione tangenziale (UF), manuali o automatici, equipaggiati con membrane assemblate a cassette o con moduli a fibre cave, in materiale compatibile con il processo, di preferenza polietersulfone o polipropilene, aventi un cut-off tra 50-300KDa, di preferenza 100KDa ed un’area compresa tra 0,02 e 0,05m<2>per litro da trattare. Esempi di range operativi dei parametri del processo di UF sono: portata di ricircolo per il flusso tangenziale 4 - lOL-min<'1>; pressione trans-membrana 0,5-1 ,4 atm; temperatura 20-40°C; pH 4-8. Il brodo di coltura privato delle cellule e deproteinizzato, eventualmente addizionato del permeato della fase di fermentazione, se non già separatamente trattato, à ̈ concentrato fino a 10-20 volte il volume iniziale, per eliminare i contaminanti a basso peso molecolare (sali, peptidi, nutrienti residui). Successivamente il concentrato à ̈ diafiltrato con acqua deionizzata o ultrapura (HPW 2-5 volumi), per completare la rimozione delle componenti a basso peso molecolare.
Trattamento con acidi - Il concentrato à ̈ sottoposto ad idrolisi acida con il duplice obiettivo di defruttosilare il polisaccaride K4, formando condroitina e fruttaSio, e detossificare il lipopolisaccaride LPS, separando la componente polisaccaridica (O-chain) da quella lipidica (lipide A), che precipita. Esempi non esaustivi di condizioni idrolitiche utilizzabili sono: acido acetico 0, 5-3,0% (v/v), pH 2-4, temperatura 60-100°C, tempo di idrolisi 1-3h. Dopo l’allontanamento della componente lipidica dell’LPS per centrifugazione, filtrazione o microfiltrazione, la soluzione, portata a neutralità ed addizionata di un volume uguale di una soluzione 0.1 -0.2 M di NaCI, à ̈ nuovamente concentrata-diafiltrata.
In alternativa l’idrolisi acida (4-5% acido acetico pH<3, 1-3h 100°C), può essere effettuata a valle della deproteinizzazione, sul brodo chiarificato non concentrato. Anche seguendo questo percorso sperimentale si ottiene l’idrolisi del lipopolisaccaride con conseguente rilascio del lipide A e la sua precipitazione, nonché la defruttosilazione del polisaccaride K4, generando condroitina.
Dopo l'idrolisi il brodo viene raffreddato e centrifugato, ed il surnatante viene portato a pH 7, addizionato di NaCI e quindi concentrato e diafiltrato per allontanare O-chain e componenti residui del terreno.
Le membrane utilizzate (cassette o moduli a fibre cave) sono in materiale compatibile con il processo, di preferenza polietersulfone o polipropilene, e hanno un cut-off di 10-100 KDa, di preferenza 50KDa, e un’area filtrante di 0.010-0.005m<2>per litro da trattare. Le dimensioni della membrana sono ridotte in quanto la defruttosilazione comporta una differenza di circa il 30% tra il peso molecolare del polisaccaride K4 e quello della condroitina, quindi il range di tagli molecolari scelti permette un buon recupero, mantenendo l’effetto di purificazione da contaminanti a basso peso (acetato di sodio, altri sali, peptidi residui, O-chain). Esempi di intervalli operativi dei parametri del processo di UF sono: portata di ricircolo per il flusso tangenziale 4-10L-min<'1>; pressione trans-membrana 0.8-1.4atm; temperatura 20-40°C; pH 5-8. Il surnatante concentrato fino a 3-5 volte il volume iniziale, per eliminare la maggior parte dei contaminanti a basso peso molecolare (fruttaSio, O-chain, sali), à ̈ successivamente diafiltrato con acqua deionizzata (2-5 volumi), per completare la rimozione della componente a basso peso molecolare, e spingere la separazione dell’O-chain (10-15KDa) dalla condroitina defruttosilata (30-50KDa).
Recupero della condroitina - La condroitina presente nel retentato può essere alternativamente recuperata: a) per precipitazione con solventi organici (2-5 volumi di etanolo 95% v/v o acetone, in presenza di cloruro di sodio 0.1-0.3M) e successiva essiccazione a caldo sotto vuoto; b) per liofilizzazione; c) mediante spray-drier.
Il processo di downstream rivendicato consente recuperi >80% del valore teorico e porta ad una condroitina con una purezza >95%, con un contenuto endotossico abbattuto di un fattore >10<4>, un contenuto di proteine < 0.05% e un MW di 30-50KD.
Di seguito, senza intenti limitativi si riportano esempi che descrivono la costruzione dei ricombinanti over-produttori del polisaccaride K4, la strategia fermentativa e il PARTE SPERIMENTALE
ESEMPIO 1 . Costruzione del ricombinante EcK4r1.
La strategia adottata per la costruzione del ricombinante EcK4r1 (E. coli K4 ricombinante 1), prevede l'integrazione nelle copie multiple (1-5) del plasmide endogeno pK4 di EcK4wt (E. coli K4 wild type), di una cassetta di espressione contenente il gene rfaH sotto il controllo di pGapPI (promotore costitutivo parziale P1 del gene codificante la gliceraldeide-3-P-deidrogenasi, GAPDH) con l'obiettivo di ottenere una trascrizione costante del gene rfaH nel corso dell’intera crescita. A) Costruzione della cassetta di inserzione.
1) Estrazione del DNA qenomico da EcK4wt - Per l’estrazione del DNA genomico da EcK4wt si utilizza il DNeasy Blood & Tissue kit fornito dalla Quiagen seguendo il protocollo fornito dalla casa produttrice.
2) Adattamento della cassetta di integrazione - In tutte le reazioni di POR si usa una DNA polimerasi ad alta fedeltà per limitare il tasso di errori nel corso deH’amplificazione (Expand High Fidelity PCR System, Roche). Tutti gli step di amplificazione sono condotti con lo stesso protocollo che prevede: materiale di partenza 50-1 OOng; Primer Up concentrazione finale 200mM; Primer Dw concentrazione finale 200mM; Buffer per Taq 1X; Taq 1U; H20 ultrapura milliQ fino a un volume finale di 50Î1⁄4Ι. Nella tabella 1 sono riportati tutti i primers utilizzati negli esperimenti di amplificazione.
3) Amplificazione della cassetta funzionale (frammento I) - La cassetta fornita dal kit à ̈ amplificata usando la coppia di primer pK4_up e FRT_dw (tabella 1). L’oligo pK4_up contiene la regione di 50bp analoga alla porzione 5’ del plasmide pK4, dove si vuole guidare l’evento di ricombinazione. Il profilo di PCR utilizzato à ̈: 94°C per 2’; 25 cicli di 94°C per 1’, 56°C per 1’, 72°C per 2’; 72°C per 30†.
4) Amplificazione del promotore Pqap(P1) (frammento II) - Il DNA cromosomico di EcK4wt à ̈ usato come stampo per l’amplificazione del promotore della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. I primer pGap_up e pGap_dw (tabella 1 ) sono utilizzati per la reazione di PCR secondo il seguente profilo: 94°C per 2’; 25 cicli di 94°C per 30†, 52°C per 30†, 72°C per 30†.
Tabella 1. Primer utilizzati per la costruzione della cassetta e per lo screening dei cloni positivi nel mutante EcK4r1.
Primer Sequenza
P1 = pK4_up 5’ CAG CAC AGC AGA GCG AAG TGC ARC ATA
TCC TTC CAG ATT TAA ATT CTT CAA ATT AAC
CCT CAC TAA AGG GCG 3’ (SEQIDNO:1)
P2 = FRT_dw: 5’ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC T3’
(SEQIDNO:2)
P3 = pGap_up 5TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TC 3’
(SEQIDNO:3)
P4 = pGap_dw 5’ CGG GAT CCC GAT ATT CCA CCA GCT ATT
TGT TAG 3’ (SEQIDNO:4)
P5 = rfaH_up 5’ CGG GAT CCC GAT GCA ATC CTG GAT TTT ACT
GTA C 3’ (SEQIDNO:5)
P6 = pk4_dw 5’AAA CTG TGA TCG GGC GTA GGA ACC CGC GTA
GTC ATC GTC GGC GCA GAA GTT TAG AGT TTG
CGG AAC TCG GTA T 3’, (SEQIDNO:6)
Controllo 5’ GCC ATT AAG AAA TAC ACG ATT CC 3’ pK4_up (SEQIDNO:7)
Controllo 5’ ATC TTT ATT CTC ATG GCT GAA CG 3’ pK4_dw (SEQIDNO:8)
Amplificazione del gene rfaH (frammento III) - L’amplificazione del gene rfaH à ̈ condotta utilizzando come stampo il DNA cromosomico di EcK4wt e come primer rfaH_up e pK4_dw (tabella 1). Quest’ultimo presenta 50bp omologhe alla porzione 3’ del plasmide pK4 dove si vuole dirigere l’evento di ricombinazione. Il profilo di PCR utilizzato à ̈: 94°C per 2’; 25 cicli di 94°C per 1’, 56°C per 1’, 72°C per 30"; 72°C per 7’.
6) Purificazione e digestione dei prodotti PCR - I tre prodotti ottenuti dalle reazioni di PCR sono separati su gel di agarosio all’1%. Le bande corrispondenti al peso molecolare atteso sono successivamente escisse e purificate secondo le istruzioni del Gel extraction kit (Quiagen). I frammenti ottenuti sono sottoposti a digestione enzimatica per 3h a 37°C rispettivamente con Xhol per i frammenti I e II e BamHI per i frammenti li e III (New England Biolabs) ed i loro prodotti sono nuovamente purificati. Protocollo di digestione: frammento l/ll/lll 1000ng; enzima BamHI/Xhol 20U; BSA 1X; Buffer 1 X; H20 fino a un volume finale di 30Î1⁄4Ι.
7) Reazioni liqasiche - Tutte le reazioni sono condotte impostando un rapporto di 3:1 tra il frammento di lunghezza minore (Lm) e quello di lunghezza maggiore (LM) secondo la seguente relazione: ng LM- Kb Lm/Kb LM- 3/1 =ng Lm. La quantità di DNA di LM in base a cui si à ̈ calcolata la quantità di Lm da aggiungere alla reazione à ̈ 100ng. 5U di T4 DNA ligase sono aggiunte alla mix di reazione insieme al buffer specifico dell’enzima (concentrazione finale 1X). La reazione à ̈ incubata 12h a 16°C.
Prima reazione ligasica - La prima reazione ligasica à ̈ condotta tra i frammenti I e II. Il prodotto ottenuto à ̈ corso su gel di agarosio aH’1%, tagliato e purificato, come indicato in precedenza.
Seconda reazione ligasica - La seconda reazione ligasica à ̈ effettuata tra la sequenza ottenuta dalla prima reazione ligasica (framm. I+II) e il frammento III (rfaH), riproducendo le condizioni precedenti. La cassetta completa (frammento l+ll+lll, circa 2.500bp) à ̈ purificata e concentrata fino a 25ngpL<"1>.
8) Clonaqqio in XL-Vector - L’intera cassetta di integrazione à ̈ inserita nel vettore di clonaggio XL (Invitrogen), che presenta estremità T-protruding. La Taq polimerasi catalizza l'aggiunta di una A extra all’estremità 3’ del trascritto (TA cloning). Seguendo il protocollo fornito dai produttori, 1pL di vettore à ̈ miscelato con 4pL di prodotto PCR ed incubato a temperatura ambiente per 5min. il campione à ̈ agitato per qualche secondo e posto in ghiaccio.
9) Trasformazione mediante elettroporazione di E. coli TOP1Q - Cellule elettrocompetenti di E. coli Top10 (Invitrogen) sono trasformate mediante elettroporazione per consentire l’ingresso del vettore XL-PgaprfaH. Un’aliquota di 40pL di sospensione cellulare à ̈ trasferita in cuvette da 0.2cm a cui si aggiunge la miscela vettore-inserto. Il campione à ̈ messo in ghiaccio per circa 1min e successivamente posizionato nella cella dell’elettroporatore (Bio-Rad Gene Pulser), dove le cellule ricevono uno shock elettrico (2.5 kV, 200Ω, 25pF). Subito dopo la scarica si aggiunge 1mL di terreno SOC (composizione in gL<'1>; bactotriptone 20,000; glucosio 3,604; estratto di lievito 0,584; KCI 0,186; MgCÃŒ22,030; MgS042,465 ) e si trasferisce rapidamente la sospensione cellulare in un tubo di polipropilene 17x100mm, incubandolo in agitazione a 37°C per 1h. Per la selezione dei cloni ricombinanti, aliquote di diversi volumi sono piastrate sul terreno selettivo LB (composizione in gL<"1>; triptone 10; NaCI 10; yeast extract 5; agar1,5% p/v per la preparazione del terreno solido) con kanamicina 50pgmL<'1>a 37°C per 12h.
10) Screening dei cloni ricombinanti - Per individuare i cloni contenti il vettore con la cassetta di integrazione, si esegue una colony PCR sulle colonie cresciute dopo la trasformazione. Una parte della colonia à ̈ risospesa in 10pL di acqua sterile ed incubata a 94°C per 5min, in modo da ottenere la lisi delle cellule e l'inattivazione delle nucleasi. Successivamente i campioni sono bloccati in ghiaccio. Per la reazione di amplificazione si utilizzano i primers M13 Fw e M13 Rw ( Invitrogen). 11 ) Sequenziamento dei cloni positivi - 1 cloni positivi selezionati sono sottoposti ad estrazione del DNA plasmidico (QIAprep miniprep kit - Qiagen) e sequenziati dal sequencing core (310 Applied Biosystems) del centro universitario di Pavia (BMR Genornics, Cribi). I vettori contenenti la cassetta priva di errori sono utilizzati come template nelle fasi successive.
B) Trasformazione delle cellule di EcK4wt.
Le cellule di EcK4wt cresciute in terreno LB per circa 2h (OD di circa 0,4) sono sottoposte a lavaggi con acqua distillata e risospese in 50pL di una soluzione acquosa di glicerolo 10% v/v. Applicando le istruzioni del kit di integrazione, le cellule elettrocompetenti sono state trasformate con 800ng di frammento di DNA lineare contenente la cassetta completa. Quest’ultima à ̈ ottenuta usando come stampo XL-pGaprfaH e come primer pK4_up e rfah_dw. Alla fine del processo si ottengono cloni batterici isolati contenenti copie multiple del costrutto pGapRfaH prive del marker di selezione. In tabella 2 à ̈ riportata la sequenza cassettapromotore pgapP1-rfaH.
Tabella 2 - Sequenza cassetta-promotore pgapP1-rfaH (SEQIDNO:9).
CAG CAC AGC AGA GCG AAG TGC ARC ATA TCC TTC CAG ATT TAA ATT CTT CAA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGC GGC CGC GAA GTT CCT ATT CTC TAG AAA GTA TAG GAA CTT CCT CGA GGG CCT TTA AAA TTC GGG GCG CCG ACC CCA TGT GGT CTC AAG CCC AAA GGA AGA GTG AGG CGA GTC AGT CGC GTA ATG CTT AGG CAC AGG ATT GAT TTG TCG CAA TGA TTG ACA CGA TTC CGC TTG ACG CTG CGT AAG GTT TTT GTA ATT TTA CAG GCA ACC TTT TAT TCA CTA ACA AAT AGC TGG TGG AAT ATC GGG ATC CCG ATG CAA TCC TGG TAT TTA CTG TAC TGC AAG CGC GGG CAA CTT CAA CGT GCC CAG GAA CAC CTC GAA AGA CAG GCT GTG AAT TGC CTG GCA CCG ATG ATC ACC CTG GAA AAA ATC GTG CGT GGA AAA CGT ACT GCA GTC AGT GAG CCA TTG TTT CCC AAC TAC CTG TTT GTC GAA TTT GAT CCA GAA GTG ATT CAT ACC ACG ACT ATC AAC GCG ACC CGC GGT GTC AGT CAC TTC GTG CGC TTT GGC GCG TCG CCA GCG ATA GTC CCA TCG GCG GTG ATT CAT CAG CTA TCG GTA TAT AAA CCG AAA GAC ATT GTC GAT CCG GCA ACC CCT TAT CCG GGA GAT AAG GTG ATT ATT ACC GAA GGC GCG TTC GAA GGC TTT CAG GCC ATT TTC ACC GAA CCC GAT GGT GAG GCT CGC TCC ATG CTA TTG CTT AAT CTT ATT AAT AAA GAG ATT AAG CAC AGT GTG AAG AAT ACC GAG TTC CGC AAA CTC TA ESEMPIO 2. Costruzione del ricombinante EcK4r2.
La strategia adottata per la costruzione del ricombinante EcK4r2 (E. coli K4 ricombinante 2), prevede l'integrazione nelle copie multiple (1-5) del plasmide endogeno pK4 di EcK4wt, di una cassetta di espressione contenente il gene rfaH sotto il controllo di pGapP1-P4 (sistema dei quattro promotori P1-P2-P3-P4 del gene codificante la gliceraldeide-3-P-deidrogenasi, GAPDH), con l'obiettivo di ottenere una trascrizione costante di rfaH nel corso dell’intera crescita. Si procede come descritto nell’esempio 1, però la costruzione della cassetta da integrare in pK4, in questo caso prevede l’amplificazione di tutto il promotore pGapP1-P4 dal genoma di EcK4wt. Il sito di integrazione individuato in pK4 à ̈ lo stesso usato per l’esempio 1. Pertanto nelle operazioni di adattamento della cassetta di integrazione si opera come descritto nell’esempio 1, utilizzando negli esperimenti di amplificazione i primer riportati in tabella 3.
Tabella 3 - Primer utilizzati per la costruzione della cassetta e per lo screening dei cloni positivi nel mutante EcK4r3.
Primer Sequenza
P1 = PK4_up Come in esempio 1 , tabella 2
P2 = FRT_dw: Come in esempio 1 , tabella 2
P3 = pGaptutto_up 5’GCC TCG AGG CGA TCA AAC AGT GAT
ATA CGC 3’ (SEQIDNO:10)
P4 = pGapnew_dw Come in esempio 1 , tabella 2
P5 = rfaH_up Come in esempio 1, tabella 2
P6 = PK4_dw Come in esempio 1 , tabella 2
ESEMPIO 3. Costruzione del ricombinante EcK4r3
La strategia adottata per la costruzione del ricombinante EcK4r3 (E. coli K4 ricombinante 3), prevede l’integrazione nel genoma di EcK4wt di una cassetta di espressione contenente il gene rfaH sotto il controllo di pGapPI, con l’obiettivo di ottenere una trascrizione costante del gene rfaH nel corso dell’intera crescita.
A) Costruzione della cassetta di inserzione
1 ) Estrazione del DNA genomico da EcK4wt - Si opera come descritto nell’esempio 1.
2) Adattamento della cassetta di integrazione - Si opera come descritto nell’esempio 1, utilizzando negli esperimenti di amplificazione i primer riportati in tabella 4.
3) Amplificazione della cassetta funzionale (frammento 0 - La cassetta fornita dal kit à ̈ stata amplificata usando la coppia di primer Lacz_up e FRT_dw (tabella 1). L’oligo LacZ up contiene la regione di 100bp analoga alla porzione 5’ del gene LacZ dove si vuole guidare l’evento di ricombinazione. Il profilo di PCR utilizzato à ̈ riportato di seguito: 94°C per 2’; 25 cicli di 94°C per 1', 56°C per 1’, 72°C per 2’; 72°C per 7’.
4) Amplificazione del promotore Pgap(P1) (frammento IO - Si procede come nell’esempio 1.
5) Amplificazione del gene rfaH (frammento III) - L’amplificazione del gene rfaH à ̈ condotta utilizzando come stampo il DNA cromosomico di EcK4wt e come primer rfaH_up e LacZ_dw. Quest’ultimo presenta 100bp omologhe alla porzione 3’ del segmento che si trova a valle del gene LacZ nel genoma di EcK4wt, dove si vuole dirigere l’evento di ricombinazione. Il profilo di PCR seguito à ̈: 94°C per 2’; 25 cicli di 94°C per 1’, 56°C per 1’, 72°C per 30†; 72°C per 7’.
Tabella 4. Primer utilizzati per la costruzione della cassetta e per lo screening dei cloni positivi nel mutante EcK4r3.
Primer Sequenza
P1 = LacZ_up 5’ CAC CCT GGC GCC CAA TAC GCA AAC
CGC CTC TCC CCG CGC GTT GGC CGA TTC ATT AAT GCA GCT GGC ACG ACA GGT TTC CCG ACT GGA AAG CGG GCA GTG AAA TTA ACC CTC ACT AAA GGG CGG 3’ (SEQIDNO:11)
P2 = FRT_dw: Come in esempio 1, tabella 2
P3 = pGap_up Come in esempio 1 , tabella 2
P4 = pGap_dw Come in esempio 1, tabella 2
P5 = rfaH_up Come in esempio 1 , tabella 2
P6 = LacZ_dw 5’AAA AGA ATA AAC CGA ACA TCC AAA AGT
TTG TGT TTT TTA AAT AGT ACA TAA TGG ATT TCC TTA CGC GAA ATA CGG GCA GAC ATG GCC TGC CCG GTT ATT TAG AGT TTG
CGG AAC TCG GTA TTC 3’ (SEQIDNO:12)
6) Purificazione e digestione dei prodotti PCR - Si procede come nell’esempio 1. 7) Reazioni liqasiche - Si procede come nell’esempio 1.
8) Clonaqqio in XL-Vector - Si procede come nell’esempio 1.
9) Trasformazione mediante elettroporazione di E.coli TOP1Q - Si procede come nell’esempio 1.
10) Screening dei cloni ricombinanti - Si procede come nell’esempio 1.
11 ) Sequenziamento dei cloni positivi - Si procede come nell’esempio 1.
B) Trasformazione delle cellule di EcK4wt.
Si procede come nell’esempio 1 con la sola differenza che nel frammento di DNA lineare contenente la cassetta completa, quest’ultima à ̈ ottenuta usando come stampo XL-pGaprfaH e come primer LacZJJp e LacZ_Dw. In tabella 5 à ̈ riportata la sequenza cassetta-promotore pgapP1-rfaH.
Tabella 5. Sequenza cassetta-promotore pgapP1-rfaH (SEQIDNO:13).
CAC CCT GGC GCC CAA TAC GCA AAC CGC CTC TCC CCG CGC GTT GGC CGA TTC ATT AAT GCA GCT GGC ACG ACA GGT TTC CCG ACT GGA AAG CGG GCA GTG AAA TTA ACC CTC ACT AAA GGG CGG CCG CGA AGT TCC TAT TCT CTA GAA AGT ATA GGA ACT TCC TCG AGG GCC TTT AAA ATT CGG GGC GCC GAC CCC ATG TGG TCT CAA GCC CAA AGG AAG AGT GAG GCG AGT CAG TCG CGT AAT GCT TAG GCA CAG GAT TGA TTT GTC GCA ATG ATT GAC ACG ATT CCG CTT GAC GCT GCG TAA GGT TTT TGT AAT TTT ACA GGC AAC CTT TTA TTC ACT AAC AAA TAG CTG GTG GAA TAT CGG GAT CCC GAT GCA ATC CTG GTA TTT ACT GTA CTG CAA GCG CGG GCA ACT TCA ACG TGC CCA GGA ACA CCT CGA AAG ACA GGC TGT GAA TTG CCT GGC ACC GAT GAT CAC CCT GGA AAA AAT CGT GCG TGG AAA ACG TAC TGC AGT CAG TGA GCC ATT GTT TCC CAA CTA CCT GTTTGT CGA ATT TGA TCC AGA AGT GAT TCA TAC CAC GAC TAT CAA CGC GAC CCG CGG TGT CAG TCA CTT CGT GCG CTT TGG CGC GTC GCC AGC GAT AGT CCC ATC GGC GGT GAT TCA TCA GCT ATC GGT ATA TAA ACC GAA AGA CAT TGT CGA TCC GGC AAC CCC TTA TCC GGG AGA TAA GGT GAT TAT TAC CGA AGG CGC GTT CGA AGG CTT TCA GGC CAT TTT CAC CGA ACC CGA TGG TGA GGC TCG CTC CAT GCT ATT GCT TAA TCT TAT TAA TAA AGA GAT TAA GCA CAG TGT GAA GAA TAC CGA GTT CCG CAA ACT CTA TAA TAA CCG GGC AGG CCA TGT CTG CCC GTA TTT CGC GTA AGG AAA TCC ATT ATG TAC TAT TTA AAA AAC ACA AAC TTT TGG ATG TTC GGT TTA TTC TTT T ESEMPIO 4. Costruzione del ricombinante EcK4r4
La strategia adottata per la costruzione del ricombinante EcK4r4 (E. coli K4 ricombinante 4), prevede l’ingrgnerizzazione di EcK4wt utilizzando una mutagenesi inserzionale basata sull’utilizzo di elementi trasponibili. A tal fine sono state sfruttate le caratteristiche del cluster genico di E. coli, ovvero la presenza della sequenza di inserzione IS2 e l’evidenza sperimentale che l’overespressione di rfaH à ̈ capace di influenzare la produzione del polisaccaride K4.
Tabella 6 - Primer per la costruzione della cassetta IS2-rfaH
Primer Sequenza
rfaHIS2_Up 5’- CGG GAT CCG AAT GCA ATC CTG GTA TTT ACT G -3’ (SEQIDNO:14)
rfaHIS2_Dw 5’ - CGG AGC TCT TAG AGT TTG CGG AAC TCG GT - 3’
(SEQIDNO:15)
RIR 5’ - TGG ATT TGC CCC TAT GTT TCC AGA TAC CTG
TTA TCA CTT AAA GCT - 3’ (SEQIDNO:16)
ANTIRIR 5’ - TTA AGT GAT AAC AGG TAT CTG GAA ACA TAG
GGG CAA ATC CA - 3’ (SEQIDNO:17)
IRLJJp 5 -TAG ACT GGC CCC CTG AAT CTC C- 3 '
(SEQ1DN0:18)
IRL_Dw 5’- CGG GAT CCT CCA ATG ACT AGT CTA AAA ACT AG-3' (SEQIDNO:19)
Generalmente la sequenza IS2 contiene un promotore seguito da un gene codificante per una trasposasi, questi geni hanno sequenze fiancheggianti denominate come IRL (LIR) e RIR. La strategia à ̈ basata sulla costruzione di un elemento IS2 modificato contenente il gene rfaH al posto di quello codificante per la trasposasi. IRL, RIR ed rfaH sono stati amplificati da DNA genomico di E. coli K4 con i primer riportati in tabella 6 e successivamente digeriti con enzimi di restrizione appropriati in modo da creare frammenti con estremità compatibili e pronti per essere sottoposti ad una reazione di ligazione. Il frammento risultante (IRL-rfaH-RIR) à ̈ stato amplificato ed inserito nel vettore di clonaggio XL (Invitrogen) successivamente utilizzato per trasformare le cellule di E. coli K4. Un evento/i di integrazione random ha avuto luogo autonomamente (a valle di cicli di evoluzione per l’espulsione del vettore e la definizione di un mutante stabile, es. 3 cicli di crescita successiva in beuta per 24h) restituendo un mutante con almeno una copia del gene rfaH overproduttore del polisaccaride K4.
Tabella 7 - Sequenza IS2-rfaH (SEQ1DNO:20) -TAG ACT GGC CCC CTG AAT CTC CAG ACA ACC AAT ATC ACT TAA ATA AGT GAT AGT CTT AAT ACT AGT TTT TAG ACT AGT CAT TGG AGG ATC CGA ATG CAA TCC TGG TAT TTA CTG TAC TGC AAG CGC GGG CAA CTT CAA CGT GCC CAG GAA CAC CTC GAA AGA CAG GCT GTG AAT TGC CTG GCA CCG ATG ATC ACC CTG GAA AAA ATC GTG CGT GGA AAA CGT ACT GCA GTC AGT GAG CCA TTG TTT CCC AAC TAC CTG TTT GTC GAA TTT GAT CCA GAA GTG ATT CAT ACC ACG ACT ATC AAC GCG ACC CGC GGT GTC AGT CAC TTC GTG CGC TTT GGC GCG TCG CCA GCG ATA GTC CCA TCG GCG GTG ATT CAT CAG CTA TCG GTA TAT AAA CCG AAA GAC ATT GTC GAT CCG GCA ACC CCT TAT CCG GGA GAT AAG GTG ATT ATT ACC GAA GGC GCG TTC GAA GGC TTT CAG GCC ATT TTC ACC GAA CCC GAT GGT GAG GCT CGC TCC ATG CTA TTG CTT AAT CTT ATT AAT AAA GAG ATT AAG CAC AGT GTG AAG AAT ACC GAG TTC CGC AAA CTC TAA GAG CTC TTA AGT GAT AAC AGG TAT CTG GAA ACA TAG GGG CAA ATC CA. Esempio 5. Produzione in beuta del polisaccaride capsulare K4 utilizzando i mutanti EcK4r1, EcK4r2 e EcK4r3 ed il ceppo wild type EcK4wt.
Al fine di valutare in maniera comparativa l'efficienza produttiva del polisaccaride capsulare K4 i ceppi mutanti EcK4r1, EcK4r2 e EcK4r3 ed il ceppo wild type EcK4wt sono cresciuti in beuta, variando le fonti nutrizionali: terreno 1, 10g-L<'1>di glicerolo 1g-L<"1>di soia; terreno 2, 10g-L<'1>di glicerolo 2g-L<'1>di casamminoacidi; terreno 3, glucosio 10g-L<"1>+ estratto di lievito 1g-L<'1>; terreno 4, glucosio 10g-L<'1>+ estratto di lievito 2g-L<'1>. Tutti i terreni hanno un pH di 7.5 e contengono la stessa soluzione di sali: Κ2ΗΡ0410g-L<-1>; KH2PO42g-L<"1>; MgCI20.1g-L<'1>; citrato di sodio 0.5g-L<'1>(NH4)2S041g-L<'1>.
Le beute sono incubate in un agitatore orbitante operante a 200rpm. Al valore di assorbanza di circa 5.0 OD6oo (12-16 h di incubazione) i ceppi ricombinanti hanno una produzione media di polisaccaride capsulare K4 che à ̈ 1, 8-3,0 volte superiore a quella del ceppo wild type (tabella 8). La stabilità genetica dei ricombinanti à ̈ valutata mediante crescite successive in beuta, che confermano il mantenimento dei livelli di produttività osservati. Le analisi di PCR effettuate al termine di ogni ciclo di crescita dimostrano che i costrutti sono ancora presenti nel materiale genetico dei ricombinanti dopo 10 giorni di coltura.
Tabella 8. Produzione del polisaccaride capsulare K4 in beuta su differenti terreni di coltura.
Terreno 1 2 3 4
ceppo Polisaccaride K4 (mgL<'1>)
EcK4wt 95±10 80±10 90±10 100±15
EcK4r1 170±18 150±20 165±15 180±18
EcK4r2 280±20 250±20 270±25 300±25
EcK4r3 210±20 190±15 200±15 230±20
EcK4r4 190±20 180±15 200±15 210±30
Esempio 6. Produzione del polisaccaride K4 mediante fermentazione in batch, utilizzando i mutanti EcK4r1, EcK4r2 e EcK4r3 ed il ceppo wild type EcK4wt.
Le crescite dei ceppi mutanti EcK4r1, EcK4r2 e EcK4r3 e del ceppo wild type EcK4wt sono effettuate in un bioreattore da 2.5 L (Biostat C Plus della B. Biotech International, Melsungen, Germania), dotato di una unità di controllo digitale (DCU) per la misura continua dei parametri fermentativi (pH, p02, velocità di agitazione, aerazione, temperatura). La crescita à ̈ effettuata utilizzando i terreni di coltura 1 e 4 della tabella 8 dell’esempio 5. La registrazione e il controllo dei parametri della fermentazione sono gestiti attraverso il programma di acquisizione dati per Windows NT, Multi Fermenter Control System (MFCS/win software B. Braun Biotech International). Come inoculo si utilizza un volume variabile di coltura in beuta, calcolato in modo da ottenere una OD6oo di partenza compresa tra 0.08 e 0.10. Le condizioni fermentative utilizzate sono: temperatura 37°C; pH 7.5 controllato mediante aggiunta di NH4OH (50% v/v) 0 H2S04(30% v/v); concentrazione iniziale di glicerolo 10 gl<"1>; agitazione valore, iniziale 500 rpm; portata d’aria, valore iniziale 2-3 Lmin<'1>(durante la fermentazione agitazione e aerazione sono automaticamente modificati in modo da assicurare una p02sempre superiore 20%. Il decorso della crescita à ̈ monitorato misurando la densità ottica a 600nm, la cinetica di consumo del glicerolo e di formazione di acidi organici e la produzione di polisaccaride capsulare K4. La crescita à ̈ in genere interrotta all’inizio della fase stazionaria di crescita dopo 20-24h dall'inizio della fermentazione. Come riportato nella tabella 9 la produttività dei ceppi ricombinanti per il terreno migliore à ̈ 1 ,3-1 ,8 volte superiore a quella del ceppo wild type.
Tabella 9. Produzione del polisaccaride capsulare K4 mediante fermentazione batch su differenti terreni di coltura.
Terreno 1 4
ceppo Polisaccaride K4 (mgL<'1>)
EcK4wt 300±20 310±25
EcK4r1 420±30 470±40
EcK4r2 450±25 490±35
EcK4r3 475±35 525±25
EcK4r4 445±25 480±25
Esempio 7. Produzione del polisaccaride capsulare K4 mediante fermentazione fed batch, utilizzando i mutanti EcK4r1, EcK4r2 e EcK4r3 ed il ceppo wild type EcK4wt.
Si procede come riportato nelle fermentazioni batch dell’esempio 5, utilizzando gli stessi terreni di coltura, ma dopo 5-7h, quando il valore di p02ed il valore di pH aumentano, si parte con la fase di fed che dura mediamente 25 h. L’addizione di nutrienti à ̈ mantenuta al di sotto della velocità di uptake del substrato, in modo da evitare il fenomeno dell’ove/f/ow metabolism. Questo à ̈ ottenuto in maniera metabolicamente controllata pilotando l’addizione dei nutrienti in funzione della p02del terreno di coltura, che deve essere mantenuta a circa 30%. La DOT (Dissolved Oxygen Tension), infatti, aumenta rapidamente quando tutto il substrato all’interno del fermentatore à ̈ consumato, invece l'adduzione della fonte di carbonio all’interno del reattore comporta un decremento della DOT. Sul piano pratico l’adduzione controllata della soluzione concentrata di nutrienti à ̈ realizzata con un controllore PID collegato alla pompa di alimentazione dei nutrienti. Quando per la mancanza di nutrienti si ha un incremento della DOT si attiva automaticamente l’alimentazione fino a raggiungere il valore di set point della p02. A questo punto la pompa di alimentazione si blocca fino all'esaurimento della fonte carboniosa che determina nuovamente un repentino innalzamento del valore di p02, attivando un nuovo ciclo di alimentazione.
Le soluzioni concentrate di nutrienti utilizzate sono: terreno 1 400g-L<"1>di glicerolo 40g-L<'1>di farina di soia p/v; terreno 2 400g-L<"1>di glucosio 80g-L<'1>di estratto di lievito.
Al termine del processo i ceppi ricombinanti utilizzano: nel caso del terreno 1 circa 60g-L<'1>di glicerolo e 5.8g-L<'1>soia con una produzione del polisaccaride capsulare K4 che à ̈ di 1.4-1.8 volte superiore a quella del wild type (tabella 10) che però consuma il 38% in più di nutrienti; nel caso del terreno 4 68g.L<"1>di glucosio e 13.6g-L<"1>YE, con una produzione del polisaccaride capsulare K4 che à ̈ di 1.5-1.9 volte superiore a quella del wild type (tabella 9) che però consuma il 40% in più di nutrienti.
Tabella 10. Produzione del polisaccaride capsulare K4 mediante fermentazione fed batch su differenti terreni di coltura.
Terreno 1 4
ceppo Polisaccaride K4 (mg-L<-1>)
EcK4wt 1.400±150 1500±200
EcK4r1 2.000±100 2.350±150
EcK4r2 2.150±130 2.500±230
EcK4r3 4.000±100 5.100±250
EcK4r3 3.000±100 3.500±250
Esempio 8 - Produzione del polisaccaride capsulare K4 mediante fermentazione in regime di microfiltrazione, utilizzando i mutanti EcK4r1, EcK4r2 e EcK4r3 ed il ceppo wild type EcK4wt.
Si procede come riportato nelle fermentazioni dell'esempio 6, utilizzando gli stessi terreni di coltura ma, dopo una prima fase batch (7h) e una seguente fase fedbatch (5h), sono attivati i moduli di microfiltrazione per il ricambio del terreno esausto. La fase di microfiltrazione dura mediamente 35h. In questo caso il processo di microfiltrazione à ̈ realizzato mediante un modulo a fibre cave in polietersulfone aventi un cut-offd\ 0.22pm, ed un’area compresa tra 0.02 e 0.1m<2>. Esempi di range operativi dei parametri del processo di MF sono: portata di ricircolo per il flusso tangenziale 6-10Lmin<'1>; pressione trans-membrana 0.8-1.2 atm; temperatura ambiente. In queste condizioni si otteneva il ricambio di 1 volume di coltura in 2-4 h circa.
Sia nella fase di feed che in quella di microfiltrazione la velocità di addizione di nutrienti à ̈ controllata in maniera da mantenere la p02del terreno di coltura a circa 30%, utilizzando un controllore PID collegato alla pompa di alimentazione dei nutrienti. Quando per la mancanza di nutrienti si ha un incremento della DOT si attiva automaticamente l’alimentazione fino a raggiungere il valore di set point della p02. A questo punto la pompa di alimentazione si stabilizza ad un minimo di giri/minuto in modo, diversamente però dagli esperimenti fed-batch, da assicurare il mantenimento di una concentrazione minima di carbonio nel vessel di fermentazione, nonostante il continuo ricambio di terreno. L’esaurimento della fonte carboniosa, determina nuovamente un repentino innalzamento del valore di p02, attivando un nuovo ciclo di alimentazione a velocità di giri della pompa peristaltica superiore a quello minimo impostato di default. Durante la fase di microfiltrazione il volume della coltura batterica à ̈ mantenuto costante da un apposito loop di controllo (controllore di livello) aggiungendo una soluzione di sali minerali identica a quella utilizzata nel terreno di crescita. Durante la microfiltrazione per diminuire gli effetti del fouling sono effettuati backflushing ogni ora utilizzando la stessa soluzione salina.
Durante gli esperimenti l’agitazione e l’aerazione sono state variate da 250 a I.OOOrpm e da 1 a 1.6Lmin<"1>, rispettivamente, in modo da mantenere la percentuale di ossigeno disciolto prossima al 20% di saturazione.
Al termine del processo i ceppi ricombinanti utilizzano: nel caso del terreno 1 circa 130gL<"1>di glicerolo e 13gL<'1>soia con una produzione del polisaccaride capsulare K4 che à ̈ di 2, 2-2, 6 volte superiore a quella del wild type (tabella 10) che però consuma il 30% in più di nutrienti; nel caso del terreno 4 90-100g.L<'1>di glucosio e 18-20g-L<'1>YE, con una produzione del polisaccaride capsulare K4 che à ̈ di 2, 3-2, 7 volte superiore a quella del wild type (tabella 11) che però consuma il 25% in più di nutrienti. In entrambi i casi il volume di microfiltrato à ̈ circa 10-12L e la quantità di polisaccaride capsulare K4 che si ritrova nel microfiltrato à ̈ il 25-30% del totale prodotto.
Tabella 11. Produzione del polisaccaride capsulare K4 mediante fermentazione in regime di microfiltrazione su differenti terreni di coltura.
Terreno 1 4
ceppo Polisaccaride K4 (mgL<'1>)
EcK4wt 3.500±100 3.750±150
EcK4r1 7.800±185 8.600±160
EcK4r2 8.200±150 8.900±180
EcK4r3 8.400±190 9.200±150
Esempio 9. Produzione del polisaccaride capsulare K4 sulla scala di 1m<3>. Si impiega il ceppo ricombinante EcK4r3, utilizzando il terreno di coltura 1 dell’esempio 4. Come inoculo si impiegano 40-60L di fermentato ottenuto con un processo batch come descritto nell’esempio 5, utilizzando un fermentatore da 75L. L’inoculo à ̈ incubato in fermentatore 6-8h per arrivare ad una densità cellulare di OD600 =5±1.
Nella produzione sulla scala del m<3>si impiega un fermentatore da 1,2m<3>contenente 1 m<3>di terreno di coltura. La fermentazione à ̈ realizzata con la stessa strategia descritta nell’esempio 7, ma in questo caso si impiega una unità di microfiltrazione esterna costituita un modulo a fibre cave con una superficie filtrante di 8-1 Om<2>operante con un flusso tangenziale di 10Lmin<'1>. La fase batch e fedbatch durano rispettivamente 5-7h e 4-6h. Nella fase fed-batch si addizionano complessivamente 40L di soluzione concentrata di nutrienti, per un totale di 12,5 Kg di glucosio e 2,5Kg di estratto di lievito. La fase in regime di microfiltrazione dura 24-36h e il volume del microfiltrato à ̈ di 6-7m<3>.
Complessivamente si ottengono 9Kg di polisaccaride capsulare K4, di cui il 30% si ritrova nel microfiltrato.
Esempio 10. Ottenimento di condroitina mediante processo 1.
L’esempio descrive il downstream di un brodo di fermentazione ottenuto come riportato nell’esempio 9. Al termine del processo fermentativo la componente cellulare à ̈ rimossa dal brodo di coltura (1.0Q0L) per centrifugazione in continuo, utilizzando una centrifuga alpha-laval (Clara80) operante a 6.000rpm a 15-25°C. Al surnatante limpido si addiziona prima il microfiltrato proveniente dall’ultima fase del processo fermentativo (7.000L) e poi una proteasi (flavourzyme) di Aspergillus oryzae (10pLL<'1>, 500 Ug<'1>, 2-5 UL<'1>finali), incubando sotto agitazione per 2h a temperatura ambiente o per 12-16h a 4°C, per idrolizzare le proteine presenti. Successivamente la soluzione à ̈ ultrafiltrata su un sistema per micro/ultra/diafiltrazione tangenziale Millipore, montato su apposito skid con serbatoio della capacità di 1m<3>, equipaggiato con moduli a fibre cave o a cassette (cut-off 100 KDa, superficie filtrante 40m<2>). Quando il volume si à ̈ ridotto a 90-100L à ̈ effettuata una diafiltrazione con acqua ultrapura (HPW) a volume costante, fino ad ottenere una conducibilità residua inferiore a 500pSi-cm (5 volumi). Si addiziona quindi 1% v/v di acido acetico, riscaldando la soluzione a 100°C per 1.25h. In queste condizioni si ottiene contemporaneamente la defruttosilazione del polisaccaride capsulare K4 e l’idrolisi dell’LPS, che separa la componente oligosaccaridica (o-chain) da quella lipidica (lipide A) che precipita. La sospensione à ̈ chiarificata per centrifugazione in continuo a 6.000rpm (1h) o per sedimentazione a 4°C (16-18h). La soluzione limpida (70-80L), riportata a pH 7 per addizione di NaOH, addizionata di NaCI fino a 0.2M, à ̈ sottoposta a ultrafiltrazione-diafiltrazione utilizzando la stessa apparecchiatura Millipore equipaggiata cassette/moduli a fibre cave (10m<2>) di polietersulfone o polipropilene da 30-100KDa. La soluzione à ̈ inizialmente concentrata (2-5x) e poi diafiltrata fino a quando la conducibilità à ̈ minore di 80-100pSicm<"1>. La soluzione à ̈ successivamente essiccata per liofilizzazione. La resa complessiva del processo di purificazione à ̈ 75%. Si ottengono 4.790g di condroitinato sale sodico con le seguenti specifiche: polvere bianca, contenuto residuo di H20 12%, purezza >95%, MW 38±2 KDa.
Esempio 11. Ottenimento di condroitina mediante processo 2.
L’esempio descrive il downstream di un brodo di fermentazione ottenuto come riportato nell’esempio 8. Al termine del processo fermentativo la componente cellulare à ̈ rimossa dal brodo di coltura (1.000 L) per centrifugazione in continuo, utilizzando una centrifuga alpha-laval (Clara80) operante a 6.000rpm a 15-25°C. Al surnatante limpido si addiziona prima il microfiltrato proveniente dall’ultima fase del processo fermentativo (7.000L) e poi acido acetico 4% v/v fino ad un pH compreso tra 2.8 e 3, riscaldando la soluzione a 100°C per 1h. In queste condizioni si ottiene la defruttosilazione del polisaccaride capsulare K4 e la scissione del lipideA dall’LPS, che precipita come solido ceroso. Quest’ultimo à ̈ separato per sedimentazione a 4°C (10-16h) e successiva centrifugazione in continuo a 6.000 rpm (circa 2h) o per sedimentazione. La soluzione limpida (circa 7.500L), riportata a pH 7 per addizione di NaOH, addizionata di NaCI fino a 0.1 M, à ̈ sottoposta a ultrafiltrazione-diafiltrazione utilizzando l’apparecchiatura prima descritta equipaggiata cassette/moduli a fibre cave (10m<2>) di polietersulfone da 50 KDa. La soluzione viene concentrata (40 x) e poi diafiltrata fino a quando la conducibilità à ̈ minore di 80-100pSicm<'1>. La soluzione, circa 200L, à ̈ addizionata di NaCI 0,1 M finale, e quindi di 2 volumi di etanolo 95%, per ottenere la precipitazione della condroitina sodica. Il precipitato umido raccolto dopo sedimentazione (circa 6.500 g) viene successivamente lavato con etanolo anidro (15L), ed essiccato sotto vuoto a 30°C. La resa complessiva del processo di purificazione à ̈ dell’85%. Si ottengono 5.430g di condroitina sale sodico con le seguenti specifiche: polvere bianca, contenuto residuo di H20 12%, purezza >94%, MW 35±2 KDa.
Esempio 12. Ottenimento di condroitina mediante processo 3.
L’esempio descrive il downstream di un brodo di fermentazione ottenuto come riportato nell’esempio 8 che utilizza esclusivamente processi di membrana. Al termine del processo fermentativo la componente cellulare à ̈ rimossa dal brodo di coltura presente nel fermentatore (1.000L) prolungando la fase di microfiltrazione senza aggiunta di soluzione salina. Dopo una concentrazione del brodo fino ad 300L, si addiziona un volume di acqua ultrapura e si concentra per microfiltrazione nuovamente a 300L per aumentare il recupero del polisaccaride capsulare, questa fase di lavaggio à ̈ ripetuta 2 volte. Il brodo di fermentazione privo di cellule (circa 1200L) dopo addizione del microfiltrato ottenuto durante la fermentazione (6.000L) à ̈ trattato come riportato nell’esempio 9, prima con proteasi, viene quindi sottoposto ad idrolisi con acido acetico e, infine, u Itraf i ltrato-d iaf i Itrato . Il concentrato così ottenuto à ̈ essiccato per spray-drier. La resa complessiva del processo di purificazione à ̈ 90%. Si ottengono 5.750g di condroitina sale sodico con le seguenti specifiche: polvere bianca, contenuto residuo di H20 10%, purezza>93%, MW 38±2 KDa.
Esempio 13. Ottenimento di condroitina mediante processo 4.
L’esempio descrive il downstream di un brodo di fermentazione ottenuto come riportato nell’esempio 8. Al termine del processo fermentativo il brodo di coltura (1.000L) viene addizionato di acido tricloroacetico (TCA 50%v/v), al 5% del volume di brodo, fino ad un pH<4. Questo brodo viene quindi filtrato su terra di diatomee o celite, con l'ausilio di un filtro a piatti tipo FUNDA. Il brodo chiarificato à ̈ microfiltrato con l’ausilio di un dispositivo capsulare asimmetrico (0,2-0, 6 Dm; GE) in modalità dead-end e neutralizzato con aggiunta di NaOH. A questo vengono aggiunti circa 7.000L di microfiltrato e successivamente il brodo chiarificato à ̈ concentrato per ultrafiltrazione e diafiltrato, quando il volume si à ̈ ridotto a 200L viene effettuata una diafiltrazione con acqua ultrapura (HPW) a volume costante, fino ad ottenere una conducibilità residua inferiore a 500pSicm<"1>(5 volumi). Si addiziona quindi 1% v/v di acido acetico, riscaldando la soluzione a 100°C per 1h. Dopo centrifugazione, il surnatante limpido (160L), riportato a pH 7 per addizione di NaOH, addizionato di NaCI fino a 0.2M, à ̈ sottoposto a ultrafiltrazione-diafiltrazione utilizzando la stessa apparecchiatura Millipore equipaggiata con cassette/moduli a fibre cave (10m<2>) di polietersulfone o polipropilene da 50KDa. La soluzione à ̈ inizialmente concentrata (3x) e poi diafiltrata fino a quando la conducibilità à ̈ minore di 100pSicm<'1>. Successivamente la soluzione resa 0,125M in NaCI à ̈ addizionata di 2 volumi di acetone per precipitare la condroitìna. Il precipitato, raccolto su filtri, o sedimentato viene essiccato in stufa a 40°C. La resa complessiva del processo di purificazione à ̈ 70%. Si ottengono 4.480g di condroitìna con le seguenti specifiche: polvere bianca, contenuto residuo di H20 12%, purezza >92%, MW 35±2 KDa.
Claims (35)
- RIVENDICAZIONI 1. Processo per preparare condroitina da un precursore polisaccaridico batterico capsulare di un ceppo di un mutante del batterio Escherichia coli K4 comprendente almeno una sequenza ingenierizzata codificante per la proteina rfaH.
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1 , comprendente le fasi: a. fase batch di crescita di un ceppo del batterio Escherichia coli K4, comprendente almeno una copia della sequenza ingenierizzata codificante per la proteina rfaH; b. fase fed-batch; e c. fase in regime di microfiltrazione.
- 3. Processo secondo la rivendicazione 2 dove la sequenza codificante per la proteina rfaH à ̈ selezionata tra: a. sequenze codificanti per la proteina rfaH in batteri compresi all’interno delle cassette di espressione di sequenza SEQIDNO:9, SEQIDNO:13, SEQIDNO:20„ e b. sequenze in grado di ibridarsi in condizioni stringenti (ad es. 1.2-1.8 x HPB a temperatura compresa tra 40-50°C) alla sequenza rfaH di E. coli.
- 4. Processo secondo le rivendicazioni 1-3 dove tale batterio à ̈ Escherichia coli K4, avente quale precursore polisaccaridico il polisaccaride capsulare K4.
- 5. Processo secondo le rivendicazioni 1-4 in cui tale ceppo à ̈ il ceppo di Escherichia coli EcK4, avente quale polisaccaride capsulare, condroitina fruttosilata sulla posizione 3 dei residui di acido glucuronico.
- 6. Processo secondo la rivendicazione 5, dove il ceppo di E. coli K4 Ã ̈ selezionato nel gruppo di: ATCC 23502I (American Type Culture Collection-USA), ceppo Bi 8337/41 (International Escherichia Centre- Danimarca), ceppo NCTC 9005 (National Collection of Type Cultures-Gran Bretagna, ceppo U1-41 2616 (Freiburg collection).
- 7. Processo secondo le rivendicazioni 1-6 dove la sequenza codificante per la proteina rfaH Ã ̈ ingeg ne rizzata mediante inserimento di copie geniche multiple.
- 8. Processo secondo la rivendicazione 7 dove tali copie geniche multiple sono comprese su DNA cromosomiale, elementi plasmidici o elementi trasponibili.
- 9. Processo secondo le rivendicazioni dove tale elemento plasmidico à ̈ un plasmide endogeno di K4, caratterizzato dal fatto di comprendente almeno le sequenze IDNO: 1 e IDNO: 6.
- 10. Processo secondo le rivendicazioni 1-9 dove la sequenza codificante per la proteina rfaH Ã ̈ ingegnerizzata mediante inserimento di un promotore costitutivo.
- 11. Processo secondo la rivendicazione 10 dove tale promotore costitutivo à ̈ selezionato nel gruppo costituito da: mu Iti-pro moto re del gene codificante per la gliceraldeide 3 P- deidrogenasi e promotore di altre proteine costitutive di E. coli, e loro frammenti funzionalmente equivalenti.
- 12. Processo secondo le rivendicazioni 1-11 in cui per la fase batch di crescita (a.) viene utilizzato un terreno di coltura complesso, contenente almeno una fonte di azoto organico, una fonte di carbonio e sali minerali.
- 13. Processo secondo la rivendicazione 12, in cui la fonte di azoto organico à ̈ selezionata tra uno o più dei seguenti composti: estratto di lievito, bacto casitone, triptone, farine di soia, farine di cotone, farine di piselli; la fonte di carbonio à ̈ selezionata tra uno o più dei seguenti composti: glucosio, saccarosio, lattosio, destrine, amido, com steep liquor, glicerolo; i sali minerali sono selezionati nel gruppo di uno o più dei seguenti sali: fosfato, monoidrogeno fosfato, diidrogeno fosfato, cloruro, solfato, citrato, sodio, potassio, magnesio, calcio, ammonio, manganese, ferro, rame.
- 14. Processo secondo le rivendicazioni da 12 - 13 in cui la fonte di azoto organico varia tra 0,1 e 10%, di preferenza tra 0,1 e 3%, la fonte di carbonio varia tra 0,1 e 20 %, di preferenza tra 0,5 e 5% e i sali minerali variano tra 1 e 5%, di preferenza tra 1,5 e 2,5% del terreno di coltura.
- 15. Processo secondo le rivendicazioni da 1 a 14 in cui la fase batch di crescita (a.) Ã ̈ realizzata in condizioni di fermentazione batch.
- 16. Processo secondo la rivendicazioni 15 in cui al termine della fase batch, al diminuire dei nutrienti, la fermentazione à ̈ continuata in regime fed-batch (b.), aggiungendo una soluzione di nutrienti concentrata.
- 17. Processo secondo la rivendicazione 16 in cui la soluzione di nutrienti concentrata comprende una fonte di carbonio, quale ad esempio glicerolo, glucosio, destrine, amido, corn steep liquor o loro combinazioni e da una fonte di azoto quale ad esempio yeast extract, peptone di soia, idrolizzati di proteine vegetali o loro combinazioni.
- 18. Processo secondo le rivendicazioni 12-17 in cui il rapporto in peso tra la fonte di carbonio e quella di azoto varia da 1 a 20, di preferenza da 5 a 10.
- 19. Processo secondo le rivendicazioni 16-18 in cui l’aggiunta della soluzione concentrata di nutrienti à ̈ effettuata dopo controllo della p02 del fermentato, e dove tale p02 à ̈ mantenuta compresa tra 10 e 50%, di preferenza tra 25 e 35% della saturazione in aria.
- 20. Processo secondo la rivendicazione 19 in cui l'aggiunta della soluzione concentrata dei nutrienti à ̈ effettuata mettendo la pompa di alimentazione dei nutrienti sotto il controllo del pH del fermentato, ed in cui tale pH à ̈ mantenuto tra 6 e 7,5, di preferenza tra 7,2 e 7,5.
- 21. Processo secondo le rivendicazioni 15-20 dove : a) la fase batch à ̈ effettuata per un tempo compreso tra 6 e 8 ore e la concentrazione di biomassa espressa come peso umido varia da 0.6 a 1 %; b) la fase fed batch, attivata quando la crescita microbica tende a rallentare per carenza di nutrienti, in genere dopo 7-8h dall’Inizio della fermentazione, à ̈ effettuata per un tempo compreso tra 6 e 12 ore e la concentrazione di biomassa espressa come peso umido à ̈ compresa tra 15 a 40gL<’1>; dove opzionalmente la fase di fed batch b), à ̈ integrata da una microfiltrazione del brodo di fermentazione, attivabile alla diminuzione della velocità di crescita del microorganismo dovuta all’accumulo di cataboliti tossici, effettuata dopo 12 - 48 ore di crescita del microorganismo ed in cui il volume del fermentato à ̈ mantenuto costante con aggiunte di soluzione salina delle stessa composizione di quella impiegata nel terreno di coltura avente una concentrazione di biomassa espressa come peso umido compresa tra 40 a 160gL<'1>;
- 22. Processo secondo la rivendicazione 21 , in cui la fase di microfiltrazione (c.) à ̈ realizzata con membrane in configurazione piana o a fibre cave, con cut off tra 0,1 e Ο,Î ́Î1⁄4ηι di preferenza tra 0,1 e 0Ï 2Î1⁄4Î ÎŽÎ , operando con un flusso tangenziale di 80-120L(min m<2>)·<1>di preferenza 90-100 L(min m<2>)<"1>.
- 23. Processo secondo le rivendicazioni da 1 a 22 in cui al termine della fermentazione la biomassa à ̈ separata dal brodo di coltura per centrifugazione in continuo, filtrazione, preferibilmente effettuata su terra filtrante, o microfiltrazione ed il brodo di coltura acellulare à ̈ recuperato.
- 24. Processo secondo la rivendicazionie 23, in cui il brodo di coltura comprendente il polisaccaride capsulare precursore della condroitina à ̈ trattato mediante digestione con proteasi e trattamento con acidi a caldo, in combinazione con almeno uno dei seguenti ulteriori passaggi: ultrafiltrazione/d iafiltrazione, precipitazione con solventi, filtrazioneessiccazione sotto vuoto, spray dry, al fine deirottenimento di condroitina.
- 25. Processo secondo la rivendicazione 24 in cui la digestione con proteasi à ̈ effettuata incubando il brodo di coltura acellulare con 2-5 U/L di proteasi, preferibilmente sotto agitazione per 1-5 ore a temperatura ambiente o per 10-24 ore a 4°C,
- 26. Processo secondo le rivendicazioni 24-25 in cui il trattamento con acidi a caldo à ̈ effettuato mediante trattamento con acido acetico diluito 0.5%-2%, ad una temperatura compresa tra 60 e 110°C, per un tempo compreso tra 0.5-2 ore al fine di: defruttosilare il polisaccaride capsulare K4 in condroitina; scindere l’LPS in una componente oligosaccaridica (o-chain) ed in una lipidica (lipide A), dove la componenete lipidica à ̈ successivamente precipitata e rimossa, ad es. mediante centrifugazione.
- 27. Processo secondo le rivendicazioni 23-26 dove la concentrazione della condroitina mediante ultrafiltrazione/diafiltrazione, Ã ̈ effettuata su membrane in configurazione piana o a fibre cave con un taglio di esclusione molecolare compreso tra 50KDa e 300KDa di preferenza 100KDa, ad un gradiente di pressione di transmembrana (TMP) compreso tra 0,8 e 1 ,4 atm e un flusso tangenziale di 400-800L(h m<2>)<'1>.
- 28. Processo secondo le rivendicazione 23-27 dove tale precipitazione con solventi à ̈ effettuata mediante aggiunta al brodo di coltura acellulare di 2-4 volumi di un solvente organico miscibile selezionato nel gruppo consistente di: metanolo, etanolo, isopropanolo, acetone, seguito da precipitazione di condroitina.
- 29. Processo secondo le rivendicazioni 23-28 in cui il trattamento con acido acetico à ̈ effettuato dopo concentrazione mediante ultrafiltrazione/diafiltrazione.
- 30. Processo secondo le rivendicazioni 23-29 comprendente inoltre un passaggio di ultrafiltrazione ed essiccazione mediante spray-drier, al fine di recuperare la condroitina in forma di precipitato opzionalmente essiccato.
- 31. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-30 e comprendente una solfatazione chimica regioselettiva della condroitina.
- 32. Ceppo Escherichia coli K4, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno una copia di un gene rfaH ingegnerizzato.
- 33. Ceppo secondo la rivendicazione 32 dove la sequenza codificante per la proteina rfaH Ã ̈ ingegnerizzata mediante presenza di copie geniche multiple comprese, alternativamente o in combinazione, su DNA cromosomiale, elementi plasmidici o elementi trasponibili.
- 34. Ceppo ingegnerizzato di Escherichia coli K4, secondo ie rivendicazioni 32-33 in cui la sequenza codificate per la proteina rfaH Ã ̈ posta sotto il controllo di un promotore costitutivo.
- 35. Ceppo secondo la rivendicazione 32 caratterizzato dal fatto di comprendere almeno una delle sequenze selezionate nel gruppo costituito da: SEQIDNO:1 SEQIDNO:6, SEQIDNO:9, SEQIDNO:11 , SEQIDNO:12, SEQIDNO:13, SEQIDNO:20.
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