ITMI972865A1 - Mutanti di rantes e loro applicazioni terapeutiche - Google Patents

Description

"MUTANTI DI RANTES E LORO APPLICAZIONI TERAPEUTICHE"

La presente invenzione ha per oggetto mutanti di RANTES con ridotta attività pro-infiammatoria ed aumentata attività soppressiva di HIV.

Le chemiochine sono piccole proteine implicate nei meccanismi dell'infiammazione. Inoltre, sono state recentemente identificate come potenti inibitori naturali dell'infezione da virus dell'immunodeficienza umana (HIV) {Science 270, 1811-1815,1995). L'attività delle chemiochine è dovuta alla loro interazione con co-recettori virali critici espressi sulla membrana della superficie cellulare {Science 272, 872-877, 1996; Science 272, 1955-1958, 1996).L'uso differenziale di tali co-recettori, in particolare di CCR5, il recettore di RANTES, ΜΙΡ-1<λ e MIP-l^, e di CXCR4, il recettore di SDF-1, è un importante determinante della diversità biologica fra i ceppi di HIV. Le varianti di HIV-1 che sono incapaci di infettare linee continue di linfociti T CD4+, comunemente implicati nella trasmissione virale e predominanti durante la fase asintomatica dell'infezione, usano per lo più CCR5 come co-recettore e sono invariabilmente sensibili all'inibizione da parte delle chemiochine che si legano a CCR5 {Nature Med., 3: 1259-1265, 1997). Fra queste, RANTES è la più efficace ed è pertanto studiata per lo sviluppo di nuove terapie anti-HIV {Nature, 383: 400, 1996). RANTES è una chemiochina appartenente alla famiglia C-C costituita da 68 amminoacidi, la cui sequenza è stata riportata in J. Immunol. (1988).

WO 96/17935 descrive RANTES modificati all'estremità N-terminale per aggiunta di un amminoacido quale metionina, leucina o glutammina, come antagonisti di RANTES o MIP-lcα. In particolare, ne viene descritto l'uso per il trattamento di asma, rinite allergica, dermatite atopica, ateroma-aterosclerosi,o artrite reumatoide.

Inoltre, Elsner J. Et al. in "European Journal of Immunology, Voi.

27, 2892-2898 (1997)", e WO 96/17934 descrivono l'attività antagonista del peptide Met-RANTES.

L'uso di RANTES non modificato e di altre chemiochine della stessa famiglia nel trattamento delle malattie allergiche, è stato inoltre descritto in WO 94/07521 e WO 94/21277.

WO 97/25350 descrive mutanti disaggregati di ΜΙΡ-1«^ o LD78 dotati di attività HIV soppressiva.

Si è ora sorprendentemente trovato che una singola sostituzione amminoacidica all'interno della regione del "N-loop" della chemiochina RANTES nativa conporta una efficacia notevolmente aumentata contro diversi isolati di HIV-1, sia in cellule primarie mononucleate sia in macrofagi, oltre a una ridotta attività prò-infiammatoria e ad una potente attività antagonistica rispetto alla molecola nativa.

Lo stesso effetto è stato notato per uno dei derivati di RANTES modificati all'estremità N-terminale con l'aggiunta di un amminoacido idrofobico,descritti in WO 96/17935.

Pertanto, un primo oggetto dell'invenzione è costituito da mutanti di RANTES caratterizzati dalla sostituzione dell'istidina in posizione 23 con un diverso amminoacido ed eventualmente dall'aggiunta di un amminoacido idrofobico all'estremità N-terminale della sequenza nativa di RANTES.

L'invenzione ha inoltre per oggetto l'uso di derivati di RANTES modificati all'estremità N-terminale con aggiunta di amminoacidi idrofobici, in particolare leucina (Leu-RANTES), come agenti anti-HIV o come agenti anti-infiammatori antagonisti di RANTES.

Con il termine RANTES si intende un qualsiasi polipeptide che sia funzionalmente equivalente a RANTES umano o di specie cross-reattive, sue varianti e forme alleliche.

La mutazione dell'istidina in posizione 23, in accordo con l'invenzione, è preferibilmente di tipo non conservativo, in cui cioè un amminoacido di tipo basico (istidina) viene sostituito con amminoacidi neutri o acidi. Preferibilmente, l'istidina viene sostituita da un amminoacido neutro e idrofobico,ancora più preferibilmente alanina.

I mutanti dell'invenzione possono eventualmente essere modificati all'estremità N-terminale con l'aggiunta di un amminoacido idrofobico, in particolare leucina.

L'invenzione riguarda anche frammenti dei mutanti, che mantengano le proprietà biologiche dei mutanti interi e proteine chimeriche o di fusione comprendenti una sequenza corrispondente ai mutanti dell'invenzione e una sequenza "carrier" in grado di migliorare ad esempio le caratteristiche farmacocinetiche delle molecole.

I mutanti dell'invenzione possono essere preparati con metodi convenzionali di DNA ricombinante,ad esempio con tecniche di mutagenesi sito-specifica utilizzando oligonucleotidi sintetici opportuni. Il DNA ottenuto viene poi inserito in un opportuno vettore di espressione per un ospite procariota o eucariota. Alternativamente, i mutanti possono essere preparati con metodi convenzionali di sintesi peptidica.

Per i previsti impieghi terapeutici, i mutanti secondo la presente invenzione saranno somministrati sotto forma di adatte composizioni farmaceutiche per via parenterale, sublinguale, intranasale, inalatoria o topica, preparate secondo tecniche convenzionali, comunque idonee per principi attivi di natura polipeptidica o proteica.

La quantità di polipeptide da somministrare sarà tale da provocare una significativa inibizione di HIV o di processi infiammatori e allergie quali artrite reumatoide, malattie degenerative quali aterosclerosi o malattie allergiche quali asma, rinite e dermatiti. Il dosaggio in particolare sarà determinato sulla base di prove cliniche e dipenderà da vari fattori quali condizioni, sesso, età e peso del paziente e della gravità della patologia. I mutanti dell'invenzione sono inoltre utilizzabili anche per la prevenzione dell'infezione da HIV in individui a rischio.

I seguenti esempi illustrano l'invenzione in maggior dettaglio. Esempio 1:

Clonaggio e mutagenesi della sequenza di RANTES

E' stato estratto l'RNA totale secondo metodologie classiche (Maniatis), da linfociti T CD8+ umani purificati mediante adsorbimento con l'anticorpo anti CD8 (Sigma C7423) legato a biglie magnetiche. Il cDNA, prodotto attraverso trascrizione inversa, utilizzando come primer un oligo-dT, e' stato utilizzato per una reazione di PCR (Polymerase Chain Reaction) con 2 primers oligonucleotidici in grado di amplificare l'intera regione codificante per RANTES (434 paia di basi):

PI = 5'ACGAATTCACAGGTACCATGAAGGTCTCCGCG;

P2 = 5'GTGGATCCTTTTTGTAACTGCTGCTCGTCGTGGT

I primers sono stati disegnati in modo da contenere i siti di restrizione sottolineati nelle sequenze PI e P2, rispettivamente EcoRI (PI) e BamHI (P2). Dopo amplificazione,,il prodotto di PCR è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e BamHI, purificato da gel mediante colonnina QIAEX (Promega) e rilegato al DNA del vettore pUC18 (PROMEGA),digerito nel polilinker con gli stessi enzimi.

II DNA rilegato è stato quindi usato per trasformare cellule competenti di Escherichia coli (JM109).

Dopo selezione di alcuni cloni resistenti all'ampicillina, il DNA è stato sequenziato per confermare l'identità della sequenza clonata.

Il DNA così controllato e' stato utilizzato per la mutagenesi mediante PCR, secondo una modificazione della metodica riportata in letteratura (Gene, 1991, 67:70), e definita di "overlap extension". Questa tecnica permette di creare diverse mutazioni in uno stesso gene a partire da tre primers comuni (che si appaiano alla sequenza del vettore: A, B, C) ed una serie di primer specifici per le varie mutazioni. Le sequenze dei primers comuni utilizzati nella metodica descritta sono le seguenti:

Primer A:5'-CAATATGTTGCCGGCATAGTACGCAGC

Primer B: 5’-GGATCAGATTTGCAGCGGCCG

Primer C: 5'-CrTGGATCCTTTTTGTAACTGCTGCTCGTCGTGGT

Per la costruzione del plasmide pVU15 e' stato usato l'oligo specifico His23 (5' ATACTCCTTGATGGCGGCACGGGGCAG). Tale primer porta una doppia sostituzione di base (GC al posto di TG), che determina la modificazione di His in Ala, in posizione 23.

Per la costruzione del plasmide pVU17 e' stato usato l'oligo Leu-R (5' ATATGGGGATAAGGCAGATGCAGGAGCGCA), che crea un'inserzione di tre nucleotidi (TAA) che codificano per una Leucina addizionale all'estremità N3⁄4 terminale della proteina.

Di nuovo, i prodotti di PCR sono stati purificati e clonati nei siti BglII-BamHI del vettore pUC18. Alcuni ricombinanti sono stati sequenziati per controllare che non vi fossero mutazioni indesiderate dovute ad errori introdotti accidentalmente dall'enzima Taq polimerasi.

Esempio 2:

Espressione e purificazione delle molecole ricombinanti in Baculovirus

Il sistema di espressione di Baculovirus e' noto da diversi anni e sfrutta la possibilità di sostituire il gene di interesse a quello codificante per la poliedrina, gene non essenziale del virus, ma espresso a livelli molto alti durante la fase tardiva dell'infezione da AcNPV ( Autographa californica nuclear polyhedrosis virus). La scelta di questo sistema comporta diversi vantaggi tra cui i principali sono: 1) alto livello di espressione; 2) funzionalità della proteina ricombinante che viene correttamente processata e prodotta (la maggior parte dei sistemi di modificazione, processo e trasporto corrispondono a quelli della cellula umana); 3) secrezione extracellulare della proteina di interesse dovuta al peptide segnale (O'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA, " Baculovirus expressìon vectors- A laboratory manual", Oxford University Press,1994).

Al fine di esprimere RANTES e i suoi mutanti in questo sistema, i DNA corrispondenti sono stati clonati nei siti BamHI-EcoRI della regione del polylinker del plasmide pVL1392 (Pharmingen), sotto il controllo del promotore per la poliedrina. Questo plasmide contiene inoltre a valle della sequenza clonata una regione di omologia ad AcNPV.

Una linea cellulare continua di Autographa californica (SF9, Pharmingen) e' stata trasfettata, secondo il metodo della precipitazione calcio-fosfato, contemporaneamente con il DNA dei plasmidi cosi' prodotti e con il DNA di Baculovirus contenente una delezione letale (BaculoGold™ DNA, Pharmingen). Solo una ricombinazione omologa che porti alla sostituzione del gene della poliedrina con il DNA dei mutanti di interesse permette la produzione di particelle virali vitali (Gruenwald S., Heitz, J., "Baculovirus expressìon vectors: procedures and methods manual", Pharmingen. 1993). Il sopranatante delle colture trasfettate e' stato quindi raccolto al 3° giorno, diluito e utilizzato per infettare nuove colture di SF9, in modo da ottenere la progenie virale da singole particelle infettanti (end-point dilution). La proteina RANTES ed i vari mutanti vengono secreti come atteso ed il loro livello di espressione può essere valutato utilizzando un test ELISA commerciale (R&D).Dai potenziali ricombinanti, identificati con il test ELISA, è stato estratto il DNA virale, che è stato sottoposto a sequenziamento mediante PCR (Cycle Sequencing, Amersham) per confermare la presenza delle mutazioni anche nella progenie virale.

Lo stock virale prescelto e’ stato successivamente sottoposto a diversi cicli di infezione e amplificazione in cellule SF9, in modo da ottenere supematante ad alto titolo virale.

Il supematante così preparato è stato quindi utilizzato per la produzione su larga scala delle chemiochine ricombinanti, infettando una linea cellulare continua di Trichoplusia ni (High Five, Invitrogen). Queste cellule sono in grado di crescere in terreno senza siero e questo facilita la successiva purificazione delle proteine secreta di interesse. 1,5 x 10^ cellule sono state infettate con 1,5 x 10^ particelle virali vitali in un volume finale di 200 mi di terreno. Al 4" giorno di infezione il supematante e' stato raccolto, sottoposto a filtrazione (0,45 μ) e passato su colonne di eparina. Dopo alcuni lavaggi con PBS la colonna è stata eluita con PBS NaCl 1,5 M in 10 ml.

Una aliquota dell'eluato e' stata sottoposta ad elettroforesi su gel di acrilammide SDS-PAGE e successiva colorazione con Coomassie blue. Questo ha permesso di valutare il grado di purezza delle proteine ricombinanti al 90%. L'eluato è stato successivamente diafiltrato per eliminare i sali presenti e concentrato (Centricon, cut-off 3000, Millipore). La quantificazione finale di RANTES e dei due mutanti R15 e R17 presenti in soluzione è stata fatta mediante un kit ELISA per la determinazione quantitativa di RANTES (R&D)ed è risultata essere di circa 25

Esempio 3

L'abilità dei mutanti R15 e R17, ottenuti nell'Esempio 2 dai plasmidi pVU15 e pVUl7, di inibire l'infezione da parte del ceppo prototipico macrofago-tropico, HIV-lbal, è stata misurata in culture primarie di cellule mononucleari attivate da sangue periferico. La metodica utilizzata per infettare PBL e per valutare la produzione di antigene P24 è stata descritta in letteratura (Scarlatti et al. Nature Medicine, 1997). Le dosi capaci di inibire del 90% la proliferazione virale (ID90) erano rispettivamente di 21 e 12 ng/ml per R15 e R17 mentre RANTES nativo aveva una ID90 di 96 ng/mi. Lo stesso effetto soppressivo nei confronti di HIV-lbal da parte di RI5 e RI7 era confermato anche in culture di macrofagi umani con ID90 di 2,4 e 12,0 ng/ml/ rispettivamente, mentre RANTES nativo mostrava una ID90 di 137 μ g/ml' questo esperimento è stato condotto secondo quanto descritto in letteratura (Verani et al.,Journal Experimental Medicine,1997).

L'attività dei polipeptidi dell'invenzione è stata inoltre valutata su 4 ceppi di HIV-1 isolati da pazienti e precedentemente passati solo una volta in cellule mononucleari da sangue periferico (Scarlatti et al., Nature Medicine). Tre di tali isolati (No. 4200, 6363, 6366), derivati da bambini con infezione asintomatica da HIV-1 erano CCR5-dipendenti; un altro ceppo (No.6195), derivato da un bambino con segni clinici e immunologie! di progressione della malattia era promiscuo, essendo in grado di utilizzare contemporaneamente CCR3, CCR5 e CXCR4. Come visto in precedenza, si osservò un certo grado di variabilità nell'attività specifica di RANTES nativa nei confronti di diversi isolati CCR5-dipendenti, con una ID90 variabile da 35 a 96 ng/ml in culture di PBMC. L 'attività antivirale dei polipeptidi dell'invenzione, espressa come potenza relativa rispetto a RANTES nativo (ID90 RANTES / ID90 di mutante)è riportata nella Tabella.

Attività antivirale dei derivati di RANTES

Gli analoghi R15 e R17 in particolare hanno dimostrato una attività 39,7 e 25,8 volte maggiore di RANTES nativo, rispettivamente. Un'attività antivirale è stata osservata in culture di macrofagi primari (6,8 e 2,4 volte, rispettivamente). Sul ceppo No. 4200 cresciuto in PEMC, l'effetto soppressivo relativo di R15 e R17 era 4,7 e 2,9 volte più alto del RANTES nativo, rispettivamente; sul ceppo 6363, R15 era 4,7 volte più efficace di RANTES nativo,mentre R17 aveva un'attività doppia rispetto a RANTES nativo. Come atteso, non è stato osservato effetto inibitorio sia con RANTES nativo sia con i polipeptidi dell'invenzione sul ceppo promiscuo di HIV-1 No.6195.

Esempio 4:

Attività prò-infiammatoria

E' stata studiata la capacità dei mutanti di RANTES di mobilizzare il calcio intracellulare, che è direttamente legata alla attivazione del recettore accoppiato alla proteina G. RANTES nativo ha indotto una mobilizzazione del calcio dose-dipendente in U87-CD4 esprimenti CCR5 ma non in cellule CCR5 negative usate come controlli. I mutanti R15 e R17 non sono stati in grado di indurre mobilizzazione del calcio nell'intervallo di concentrazioni considerato {da 4 a 500 ng/ml).

La misurazione del flusso intracellulare di calcio in cellule U87/CCR5 è riportato in Figura la.

Le cellule sono state caricate con Fura-2 per un'ora e stimolate con i mutanti a diverse concentrazioni. La risposta è stata misurata al fluorimentro e calcolata come % di aumento del calcio intracellulare.

Si è inoltre misurata la capacità dei polipeptidi dell'invenzione di indurre chemotassi di linfociti e monociti umani primari, capacità che può essere mediata da diversi recettori di RANTES. R15 e R17 sono risultati in grado di indurre la chemotassi di linfociti e monociti ma a concentrazioni elevate comprese tra 100 e 500 ng/ml·

La migrazione di monociti è stata saggiata utilizzando una modificazione della camera di Boyden (48-well TRANSWELL<T>M Costar). Dopo 2h di incubazione in presenza dei mutanti a diverse concentrazione, il filtro è stato rimosso e le cellule migrate sono state contate al FACS. L'indice di chemiotassi rappresenta il rapporto tra il No. di cellule migrate in presenza di mutanti e quello dovuto alla migrazione spontanea (Figura lb).

Pertanto, il rapporto fra la minima dose chemotattica e la dose HIV-soppressiva 90% in PEMC era compresa tra 8 e 50 per R15 e fra 3,5 e 25 per R17;per RANTES nativa, il rapporto era fra 1,0 e 2,9.

Nell'infezione dei macrofagi, i rapporti fra minima dose chemotattica e dose HIV-soppressiva era compresa tra 33 e 43 per RI5 e tra 8 e 30 per R17; per RANTES nativa, il rapporto era fra 0,7 e 6.

Effetto antagonista nei confronti di RANTES

E' stata studiata la capacità dei mutanti R15 e R17 di antagonizzare la molecola nativa nell'attivazione del recettore, misurata come mobilizzazione del calcio intracellulare.

Quando venivano aggiunte immediatamente prima della molecola nativa, ambedue i mutanti riducevano la risposta al RANTES nativo con effetto dose-dipendente, e già ad una concentrazione di 500 ng/ml si otteneva la massima inibizione dell'attività del RANTES nativo.

La Figura 2 illustra la cross-desensibilizzazione del recettore CCR5 da parte di R15 e R17. Le cellule (U87/CCR5) sono state caricate con Fura-2 e stimolate con diverse concentrazioni R15 e R17.

60 secondi dopo sono state stimolate nuovamente con 500 ng/ml di R wt. Il segnale di fluorescenza, indotto dai cambiamenti di Ca intracellulare,è stato monitorato al fluorimetro.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Mutanti di RANTES caratterizzati dalla sostituzione dell'istidina in posizione 23 della sequenza nativa con altri amminoacidi ed eventualmente dall'aggiunta di un amminoacido idrofobico all'estremità N-terminale della sequenza nativa di RANTES. 2.. Mutanti secondo la rivendicazione 1 in cui l'istidina in posizione 23 è costituita da un amminoacido neutro idrofobico. 3. Mutanti secondo la rivendicazione 2 in cui l'amminoacido neutro idrofobico è alanina. 4. Mutanti secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui 1'amminoacido idrofobico è leucina. 5. Come mutante secondo una delle rivendicazioni precedenti, RANTES [Hys23 — Ala]. 6. RANTES modificati all'estremità N-terminale con amminoacidi idrofobici come agenti anti-HIV. 7. Leu(o)RANTES come agente antivirale. 8. Conposizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo una dose HIV-inibente di un derivato di RANTES delle rivendicazioni 1-7. 9. Procedimento per la preparazione dei derivati di RANTES delle rivendicazioni 1-7 che comprende la coltura di cellule eucariote trasfettate con vettori di espressione di baculovirus contenenti porzioni di DNA codificanti per detti derivati. 10. Derivati di RANTES delle rivendicazioni 1-6, per il trattamento dell'infezione da HIV e di malattie allergiche, degenerative o infiammatorie quali artrite reumatoide, aterosclerosi, asma, rinite dermatiti.