ES2247738T3

ES2247738T3 - Mutantes de rantes y sus aplicaciones terapeuticas.

Info

Publication number: ES2247738T3
Application number: ES98966650T
Authority: ES
Inventors: Paolo Lusso; Simona Polo
Original assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Ospedale San Raffaele SRL
Current assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Ospedale San Raffaele SRL
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2018-12-21
Also published as: EP1040191B1; EP1431391B1; CA2316447C; ATE308617T1; DK1040191T3; WO1999033989A3; AU2415599A; JP2002507388A; DE69832197D1; DE69832197T2; WO1999033989A2; JP4323094B2; EP1431391A3; US7164000B2; US6608177B1; ES2247475T3; EP1431391A2; EP1040191A2; CA2316447A1; DK1431391T3

Abstract

Un mutante de RANTES, teniendo dicho mutante la capacidad de actuar competitivamente como antagonista de RANTES, MIP-1 o MIP-1 de tipo silvestre, o de actuar como antagonista de la interacción entre el virus VIH y un receptor de quimioquinas, y llevando una mutación que se selecciona entre: a) Arg 44 sustituida por un aminoácido cargado negativamente o un aminoácido hidrófobo pequeño; b) Lys 45 sustituida por un aminoácido cargado negativamente o un aminoácido hidrófobo pequeño.

Description

Mutantes de rantes y sus aplicaciones terapéuticas.

La presente invención proporciona mutantes de RANTES con actividad proinflamatoria reducida, actividad supresora del VIH incrementada y actividad como antagonistas con respecto a las quimioquinas de tipo silvestre.

Las quimioquinas son pequeñas proteínas implicadas en los mecanismos inflamatorios y en la circulación fisiológica de células hemopoyéticas. Varios estudios han mostrado el importante papel de las quimioquinas en el reclutamiento de linfocitos en enfermedades inflamatorias y autoinmunes, como la artritis reumatoide, o durante las reacciones alérgicas, como en el asma (Schall, T.J. The chemokines. En: The cytokine handbook, A Thompson ed. Academic Press, Nueva York, 1994, p.419-460). Además, se han identificado recientemente algunas quimioquinas como potentes inhibidores naturales de la infección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Science 270, 1811-1815, 1995). La actividad de las quimioquinas se debe a su interacción con receptores que tienen diferente especificidad y que se expresan en la superficie celular. Algunos de estos receptores funcionan como correceptores del virus VIH (Science 272, 872-877, 1996; Science 272, 1955-1958, 1996). El uso diferencial de tales correceptores, particularmente CCR5, el receptor específico para RANTES, MIP-1\alpha y MIP-1\beta, y CXCR4, el receptor específico para SDF-1, representa un determinante importante en la diversidad biológica entre estirpes del VIH. Las estirpes del VIH-1 incapaces de infectar líneas continuas de células T CD4+, normalmente implicadas en la transmisión del virus y predominantes durante la fase asintomática de la infección, utilizan primariamente CCR5 como correceptor y son invariablemente sensibles a la inhibición por quimioquinas que se unen a CCR5 (Nature Med., 3:1259-1265, 1997). La más efectiva de tales quimioquinas, RANTES, está en investigación para el desarrollo de nuevas terapias anti-VIH (Nature, 383: 400, 1996). RANTES es una quimioquina que pertenece a la familia C-C y tiene una longitud de 68 aminoácidos. Su secuencia se ha comunicado en J. Immunol. (1988).

El documento WO 96/17935 describe moléculas de RANTES que están modificadas en el extremo N por la adición de un aminoácido tal como metionina, leucina o glutamina, como antagonistas de RANTES o MIP-1\alpha. En concreto, se describe su uso para el tratamiento de asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, ateroma-aterosclerosis o artritis reumatoide.

Además, Elsner J. et al., en "European Journal of Immunology, Vol. 27, 2892-2898 (1997)", y el documento WO 96/17934, describen la actividad como antagonista del péptido Met-RANTES.

El uso de RANTES de tipo silvestre y otras quimioquinas de la misma familia en el tratamiento de enfermedades alérgicas, ha sido descrito también en los documentos WO 94/07521 y WO 94/21277.

El documento WO 97/25350 describe mutantes desagregados de MIP-1\alpha o LD78 que tienen actividad supresora del VIH, mientras que el documento WO 98/13495 describe mutantes de RANTES humana incapaces de agregarse bajo fuerza iónica fisiológica y que exhiben actividad antiviral. Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que la adición de al menos un aminoácido en el extremo N, y/o la sustitución de uno o más aminoácidos en la región del extremo N comprendida entre los aminoácidos 1 y 11 de la forma madura de la quimioquina RANTES humana y/o la región del "bucle del 40", que se extiende de la Thr 43 a la Asn 46, proporciona una eficacia notablemente mayor frente a diferentes aislados del VIH, tanto en células sanguíneas primarias mononucleadas como en macrófagos, una actividad proinflamatoria reducida y una potente actividad como antagonista, en comparación con la molécula de tipo silvestre. En concreto, los mutantes de la invención actúan competitivamente como antagonistas de RANTES, MIP-1\alpha o MIP-1\beta de tipo silvestre y, con un mecanismo comparable, de la interacción entre el virus VIH y un receptor de quimioquinas. Uno o más de los aminoácidos: Ser 1, Ser 4, Ser 5, Tyr 3, Asp 6, Tyr 14, Arg 17, Arg 44, Lys 33, Lys 45 y Arg 46 están mutados, con respecto a la forma humana de tipo silvestre descrita en J. Immunol. 141:1018-1025, 1988, como molécula de referencia. Los aminoácidos Ser 1, Ser 4, Ser 5, Tyr 3 son reemplazados por aminoácidos neutros o hidrófobos, Asp 6 es reemplazada por un aminoácido cargado positivamente, Tyr 14 por un aminoácido aromático hidrófobo, Arg 17, Lys 33, Arg 44, Lys 45 y Arg 46 por un aminoácido hidrófobo de pequeño
tamaño.

Además están descritas las siguientes mutaciones: Ser 1 por Cys, Ser 4 por Cys, Ser 5 por Cys, Tyr 3 por Ala, Asp 6 por Arg, Tyr 14 por Phe, Arg 17, Lys 33, Arg 44, Lys 45 y Arg 46 por Ala. Un primer grupo de mutantes está caracterizado por una triple mutación seleccionada de a) Ser 1 por Cys; Ser 5 por Cys; Asp 6 por Arg, o b) Ser 1 por Cys; Ser 5 por Cys; Arg 17 por Ala, o c) Ser 1 por Cys; Ser 5 por Cys; Arg 44 o Lys 45 o Arg 46, por Ala. Un segundo grupo está caracterizado por una doble mutación seleccionada entre a) Ser 1 y Ser 5 por Cys, o b) Ser 1 y Ser 4 por Cys, o c) Ser 1 por Cys y Arg 44 por Ala, o d) Asp 6 por Arg y Arg 44 por Ala. Un tercer grupo está caracterizado por una única mutación seleccionada entre a) Ser 1 por Cys, b) Tyr 3 por Ala, c) Asp 6 por Arg, d) Tyr 14 por Phe, e) Arg 17 por Ala, f) Lys 33 por Ala, g) Arg 44 por Ala, h) Lys 45 por Ala, i) Arg 46 por Ala. Además, a los mutantes anteriores se les puede añadir hasta dos aminoácidos en el extremo N, que se seleccionan preferiblemente entre Leu, Ala, Cys o Trp. Por ejemplo, la Ser 4 se puede reemplazar por Cys y simultáneamente se puede añadir una Cys adicional en el extremo N. En concreto, el mutante único Cys 1 o -1, que contiene un grupo -SH libre, puede representar un sustrato óptimo para modificaciones químicas adicionales.

Según otros aspectos, la solicitud proporciona RANTES de tipo silvestre, que no tiene mutaciones en aminoácidos internos pero que lleva un aminoácido adicional en el extremo N, que es preferiblemente Cys, estando dotados dichos derivados de RANTES de actividad anti-VIH y antiinflamatoria, y el uso de RANTES de tipo silvestre a la que se le ha añadido una Leu en el extremo N (Leu(0) RANTES) como agente anti-VIH.

Es posible que las propiedades de algunos mutantes según la invención, en particular los que llevan 1 ó 2 Cys adicionales, estén determinadas por modificaciones estructurales debidas a la formación de un nuevo enlace disulfuro. Considerando la estructura de RANTES (Biochem. 1995, 34:9307-9314) o la estructura de moléculas homólogas como SDF-1 (EMBO J., 16:6996:7007, 1997), es posible también que las regiones del extremo N o del bucle N contribuyan a formar el lugar tridimensional de interacción con el receptor específico de membrana.

Según otro aspecto, la invención proporciona péptidos que corresponden a fragmentos de RANTES de las regiones del extremo N, del bucle N y/o del "bucle del 40", dichos péptidos contienen las mutaciones descritas y actúan competitivamente como antagonistas de RANTES, MIP-1\alpha o MIP-1\beta de tipo silvestre, o de la interacción entre el virus VIH y un receptor de quimioquinas.

Según otros aspectos, la invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican los mutantes descritos, los vectores de expresión que comprenden tales secuencias de nucleótidos, proteínas quiméricas o de fusión que comprenden una secuencia que corresponde a los mutantes de la invención y una secuencia portadora, por ejemplo una secuencia destinada a mejorar las propiedades farmacocinéticas de péptidos activos o proteínas; además, la invención proporciona el uso de tales mutantes de RANTES como agentes anti-VIH así como agentes antiinflamatorios, antialérgicos o antiasmáticos.

Mediante el término RANTES, se quiere aludir a cualquier polipéptido equivalente funcionalmente a la RANTES humana, así como a proteínas equivalente derivadas de especies que dan lugar a reacciones cruzadas, así como a variantes y formas alélicas suyas que pueden diferir de la secuencia convencional que se comunicó en J. lmmunol. 141:1018-1025, 1988.

Los mutantes de la invención se pueden preparar mediante técnicas convencionales de clonación de ADN, recombinación y expresión in vitro, utilizando oligonucleótidos sintéticos adecuados, por ejemplo con técnicas de mutagénesis dirigida o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) sobre ADN. El ADN resultante se inserta luego en un vector de expresión apropiado para hospedadores procarióticos o eucarióticos. Alternativamente, se pueden preparar mutantes según métodos convencionales de síntesis de péptidos.

Para los propósitos terapéuticos previstos, los mutantes de la invención se administrarán en forma de composiciones farmacéuticas adecuadas para la ruta de administración parenteral, sublingual, intranasal, inhalatoria o tópica, preparadas según técnicas convencionales, que son adecuadas para sustancias activas polipeptídicas o protei-
cas.

La cantidad de polipéptido a administrar será suficiente para causar una inhibición significativa de la infección o la replicación del VIH, o una reducción de las respuestas inflamatorias, tales como artritis reumatoide, o en enfermedades degenerativas tales como aterosclerosis, o en enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis y dermatitis. La dosificación específica se determinará en base a estudios clínicos y dependerá de numerosos factores, tales como estado clínico, sexo, edad y peso del paciente y la severidad del estado clínico. Los mutantes de la invención se utilizarán también en la prevención de la infección del VIH en individuos potencialmente expuestos a la infección.

Además, el ADN que codifica tales mutantes, que son producidos en forma de proteínas recombinantes en hospedadores eucarióticos y no requieren ninguna modificación química adicional, se puede insertar en vector para terapia génica (derivados, por ejemplo, de retrovirus de ratón o de seres humanos, como el MuLV o el VIH, o de virus Herpes, como HHV-7, o de Adenovirus) que permiten su producción directamente en el tejido donde se necesita el tratamiento (es decir, nódulos linfáticos, articulaciones, etc.).

Los siguientes ejemplos ilustran la invención con más detalle.

Ejemplo 1 Clonación y mutagénesis de la secuencia de RANTES

Se extrajo ARN total según técnicas convencionales (Maniatis) de linfocitos T CD8+ humanos purificados mediante absorción con el anticuerpo anti-CD8 (Sigma C7423) unido a perlas magnéticas. El ADNc resultante de la transcripción inversa, utilizando un oligo-dT como cebador, se utilizó para un reacción de PCR (Polymerase Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa) con 2 cebadores oligonucleotídicos capaces de amplificar la región completa que codifica RANTES (434 pb):

: P1=5'-ACGAATTCACAGGTACCATGAAGGTCTCCGCG;

: P2=5'-GTGGATCCTTTTTGTAACTGCTGCTCGTCGTGGT

Los cebadores se diseñaron de forma que contuvieran los sitios de restricción subrayados en las secuencias P1 y P2, EcoRI (P1) en 5' y BamHl (P2) en 3', respectivamente. Tras la amplificación, el producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHl, se purificó a partir del gel mediante una columna QIAEX (Promega) y se religó con el vector de ADN pUC18 (Promega), digerido en el conector múltiple (polylinker) con las mismas enzimas.

El ADN religado se utilizó luego para transformar células competentes de E. coli (JM109). Después de la selección de algunos clones resistentes a ampicilina, se secuenció el ADN para confirmar la identidad del inserto. El ADN del plásmido se utilizó para mutagénesis por PCR, según el procedimiento llamado "extensión de solapamientos" (Gene, 1991, 67:70). Tal técnica permitió la producción de mutaciones únicas y múltiples en el mismo gen, mediante el uso de cebadores comunes (que se aparean con la secuencia del vector: A, B, C) y una serie de cebadores específicos para las diversas mutaciones. Las secuencias de los cebadores comunes son las siguientes:

: cebador A: 5'- CAATATGTTGCCGGCATAGTACGCAGC

: cebador B: 5'- GGATCAGATTTGCAGCGGCCG

: cebador C: 5'- GTGGATCCTTTTTGTAACTGCTGCTCGTCGTGGT

Para la construcción del plásmido pVU5, se utilizó el oligonucleótido específico Cys1 (5'- GGGTGTGGTGTCCG
AGGAATATGGGCAGGCAG). Tal cebador contiene una única mutación en una base (C en lugar de G), que determina la sustitución de Ser por Cys en la posición 1.

El oligonucleótido específico Tyr3 se utilizó para la construcción del plásmido pVU14 (5'- GTCCGAGGAAGCTG
GGGAGGCAGATG). Tal cebador introduce una sustitución de dos bases (GC en lugar de TA), que determina la sustitución de Tyr por Ala en la posición 3.

El oligonucleótido Cys1-Cys5 se utilizó para la construcción del plásmido pVU15 (5'-GGGTGTGGTGTCGCAGG
AATATGGGCCAGGCAG), que incorpora una sustitución de dos bases (GC en lugar de CG), además de la sustitución del cebador cys1 (C en lugar de G). Esto determina la sustitución doble de Ser por Cys en las posiciones 1 y 5.

El oligonucleótido específico Arg17

: (5' CACGGGGCAGTGGGGCGGCAATGTAG-GCAAAGC)

se utilizó para la construcción del plásmido pVU24. Tal cebador produce sustituciones de dos bases (GC en lugar de CG) que determinan la sustitución de Arg por Ala en la posición 17.

El oligonucleótido específico Asp6

: (5'-CAGGGTGTGTGGTGCGCGAGGAATATGGGGA)

se utilizó para la construcción del plásmido pVU38. Tal cebador produce sustituciones de dos bases (CG en lugar de TG) que determinan la sustitución de Asp por Arg en la posición 6.

El oligonucleótido específico Arg44

: (5'-GGCGGTTCTTTTCGGTGACAAAGACGAC)

se utilizó para la construcción del plásmido pVU26. Tal cebador produce sustituciones de dos bases (TC en lugar de CG) que determina la sustitución de la Arg 44 por Glu. Se produjo un segundo mutante en esta posición (Arg44-Ala) con un nuevo oligonucleótido que tiene la misma secuencia excepto por la T con subrayado doble, sustituida
por G.

El oligonucleótido específico Lys45

: (5'-CTTGGCGGTTCTCTCGGGTGACAAAGACG)

se utilizó para la construcción del plásmido pVU43. Tal cebador produce una única sustitución en una base (C en lugar de T, subrayada), que determina la sustitución de Lys por Glu en la posición 45. Se produjo un segundo mutante en esta posición (Lys 45-Ala) con un nuevo oligonucleótido que tiene la misma secuencia excepto por la T con subrayado doble, sustituida por G.

El oligonucleótido específico Leu-R se utilizó para la preparación del mutante pVU17 (5'- ATATGGGGATAAGGC
AGATGCAGGAGCGCA). En este cebador se añade una inserción de tres nucleótidos en el 5' de la molécula, antes de un codón que se presenta de forma natural. El triplete antisentido codifica la Leucina adicional N-terminal.

El oligonucleótido específico Tyr14

: (5'-TGGGCGGGCAATGGCGGCAAAGCAGCAGGG)

se utilizó para la construcción del plásmido pVU22. Tal cebador introduce la sustitución de la Tyr14 por Phe en la posición 14. Se produjo también un segundo mutante en esta posición (Tyr 14-Ala).

Se prepararon otros mutantes utilizando los siguientes oligonucleótidos:

Oligonucleótido Cys1-Cys4:

: 5'-GGGTGTGGTGTCCGAGCAATATGGGCAGGCAG;

la sustitución de dos G por dos C (subrayadas) produce la sustitución de dos Ser (en las posiciones 1 y 4) por dos Cys;

Oligonucleótido Cys0-Cys4:

: CCGAGCAATATGGGGAGCAGGCAGATGCAGGAG;

la sustitución de G por C (subrayada) produce la sustitución de Ser (en la posición 4) por Cys, mientras que la inserción de GCA produce la inserción de una Cys adicional en la posición 0;

Oligonucleótido Leu-Ala:

: 5'-ATATGGGGAGGCTAAGGCAGATGCAGGA;

la inserción de 6 nucleótidos (GGCTAA) aguas arriba con respecto al codón de la Ser 1 produce la inserción de Leu y Ala en las posiciones -1 y 0, respectivamente.

Oligonucleótido Tyr 14:

: 5'-TGGGCGGGCAATGTAGGCAAAGCAGCAGGG;

la sustitución de A por T (subrayada) permite la sustitución de la Tyr14 por Phe.

Los productos de PCR se purificaron y clonaron en el sitio BGlII-BamHl del vector pUC18. Los recombinantes se secuenciaron para confirmar su identidad y se comprobó si se habían introducido mutaciones indeseadas durante el proceso de clonación.

Ejemplo 2 Expresión y purificación de las moléculas recombinantes en Baculovirus

El sistema de expresión en Baculovirus se conoce desde hace algunos años. Está basado en la maquinaria de expresión del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV). En este sistema se coloca el gen de interés, mediante recombinación homóloga, bajo el control del promotor del gen de la polihedrina, que es un gen no esencial pero que se expresa a muy altos niveles durante la fase tardía de la infección viral.

La elección de tal sistema implica numerosas ventajas, siendo las principales: 1) altos niveles de expresión; 2) funcionalidad de la proteína recombinante, que se procesa y pliega correctamente (la mayor parte de las modificaciones corresponden a las introducidas por células de mamíferos); 3) secreción extracelular debido al péptido señal (O'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA, "Baculovirus expression vectors - A laboratory manual", Oxford University Press,
1994).

Con el fin de expresar RANTES y sus mutantes en este sistema, los correspondientes ADN se extrajeron cortándolos de pUC18 y se clonaron en el sitio BamHI-EcoRI de la región del conector múltiple del plásmido pVL1392 (Pharmingen), bajo el control del promotor de la polihedrina. Este plásmido contiene también aguas abajo con respecto al inserto clonado, una región de homología con el AcNPV para la recombinación homóloga. Se transfectó, utilizando coprecipitación con fosfato cálcico, una línea celular continua de Autographa californica (SF9, Pharmingen) con el ADN de los plásmidos recombinantes y con el ADN de Baculovirus que contenía una deleción letal (BaculoGoldTM DNA, Pharmingen). Sólo una recombinación homóloga que conduzca a la sustitución del gen de la polihedrina por el ADN de los mutantes de interés proporciona partículas virales con vitalidad (Gruenwald S, Heitz J, "Baculovirus expression vectors: procedures and methods manual", Pharmingen, 1993). Después se recogió al 3^{er} día el sobrenadente de los cultivos transfectados, se diluyó y se utilizó para infectar nuevos cultivos de SF9, obteniendo con ello el linaje viral de una única partícula infectiva (dilución del punto final). Como se esperaba, la proteína RANTES y sus mutantes se secretan y sus niveles de expresión se pueden evaluar mediante un ensayo ELISA comercial (R&D). El ADN viral se extrajo de los recombinantes potenciales, según se detectó por ELISA, y se secuenció mediante PCR (Cycle Sequencing, Amersham) para confirmar que las mutaciones también habían sucedido en el linaje viral. La solución madre viral seleccionada se sometió posteriormente a repetidos ciclos de infección y amplificación en células SF9, para obtener sobrenadantes de alto título. Estos sobrenadantes se utilizaron para la producción de quimioquinas recombinantes a gran escala, infectando una línea celular continua de Trichoplusia (High Five, Invitrogen). Estas células son capaces de crecer en un medio libre de suero, simplificando los procedimientos de purificación de proteínas posteriores. Se infectaron 1,5 x10^{8} células con 1,5 x 10^{9} partículas virales con vitalidad en un volumen final de 200 ml. Al 4º día de infección, se recogió el sobrenadante, se filtró (0,45 \mum) y los mutantes de purificaron en columnas de heparina. Después de repetir el lavado con PBS, se eluyó la columna con PBS + NaCl 1,5 M en 10 ml. Una alícuota del eluato se sometió a electroforesis SDS-PAGE en gel de acrilamida y se tiñó con azul de Coomassie, evaluando así una pureza del 90% de las proteínas recombinantes. El eluato se sometió posteriormente a diafiltración para retirar las sales presentes y se concentró (Centricon, límite de exclusión 3000, Millipore). La cuantificación final de RANTES y sus mutantes se llevó a cabo mediante un kit de ELISA para la determinación cuantitativa de RANTES (R&D) y se confirmó mediante una transferencia tipo Western y electroforesis capilar.

Ejemplo 3 Inhibición de la infección viral

Se midió la capacidad de los mutantes obtenidos como en el Ejemplo 2 para inhibir la infección por la estirpe viral prototípica con tropismo por los macrófagos VIH-1BaL, en cultivos primarios de células mononucleares de sangre periférica (PMBC) activadas. El procedimiento utilizado para infectar PBL y para evaluar la producción del antígeno p24 ha sido ya descrito en la bibliografía (Scarlatti et al., Nature Medicine, 1997). La dosis que inhibía la proliferación viral en un 90% (DI90) fue notablemente más baja para pVU15 en comparación con la RANTES de tipo silvestre, que tiene una DI90 de 96 ng/ml (figura 1). La actividad supresora de pVU5, pVU14, pVU15, pVU24 y pVU38, se confirmó en otra estirpe del VIH, aislada de un paciente con infección asintomática (VIH-1 6366) y se sometió a un único pase en células mononucleares de sangre periférica (figura 2): en lo que se refiere a la estirpe BaL, este aislado era dependiente del uso del correceptor CCR5 (véase la misma figura). La actividad antiviral de los polipéptidos de la invención, expresada como potencia relativa con respecto a la RANTES de tipo silvestre (DI90 de RANTES/DI90 del mutante) se ilustra en la siguiente tabla.

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TABLA Actividad antiviral relativa de mutantes de RANTES (factor de incremento en comparación con RANTES de tipo silvestre)

		PBMC	MDM
Derivados	Mutaciones	VIH-1BaL	VIH-1 6366	VIH-1BaL
PVU 5	S1 \rightarrow C	0,24	0,23	0,25
PVU 14	Y3 \rightarrow A	0,22	0,10	0,23
PVU 15	S1 \rightarrow C	3,07	3,3	4,5
	S5 \rightarrow C
PVU24	R17 \rightarrow A	1,09	1,30	No ensayado
PVU38	D6 \rightarrow R	0,14	0,13	No ensayado
PVU26*	R44 \rightarrow E	3,16	No ensayado	No ensayado
PVU 43*	K45 \rightarrow E	1,44	No ensayado	No ensayado
PVU 22	Y14 \rightarrow F	10,0	2,5	No ensayado
PVU 17	L añadida	4,6	1,9	11,0
* \begin{minipage}[t]{145mm} La actividad antiviral de los mutantes pVU26 y pVU43 se expresa como potencia relativa con respecto a la RANTES de tipo silvestre (DI50 de RANTES/DI50 del mutante).\end{minipage}

Ejemplo 4 Actividad proinflamatoria

Se estudió la capacidad de los mutantes de RANTES para movilizar el calcio intracelular, que es inducido por la activación de receptores acoplados a proteínas G y está conectado con la eficacia de la transducción de la señal de diversos ligandos.

Se cargaron las células con Fura-2 durante una hora y se estimularon con mutantes a diferentes concentraciones. El efecto se midió utilizando un fluorímetro y se calculó como el % de incremento del calcio intracelular. La RANTES de tipo silvestre indujo una movilización de calcio dependiente de dosis en células U87-CD4 que expresaban CCR5 pero no en las células negativas respecto a CCR5 utilizadas como control. De entre los mutantes ensayados pVU5, pVU14, pVU15, pVU24, pVU38, pVU26 y pVU43, sólo pVU38, pVU15 y pVU17 no indujeron movilización de calcio. pVU5, pVU14 y pVU43 tuvieron una eficacia menor que la RANTES de tipo silvestre, como se muestra en la figura 3.

También se midió la capacidad de los polipéptidos de la invención para inducir la quimiotaxis de linfocitos y monocitos primarios humanos, capacidad que puede estar mediada por diferentes receptores de RANTES, especialmente por CCR1.

La migración de monocitos se ensayó utilizando una modificación de la cámara de Boyden (Transwell(TM) de 48 pocillos, Costar). Después de 2 horas de incubación en presencia de mutantes a diversas concentraciones, se retiró el filtro y se contaron las células que habían migrado con un FACS. El índice quimiotáctico representa la relación del número de células que habían migrado en presencia de mutantes con respecto al debido a migración espontánea. Todos los mutantes excepto pVU5 y pVU14, indujeron quimiotaxis de monocitos pero, a concentraciones elevadas, que oscilaban entre 100 y 500 ng/ml, el mutante pVU38 exhibió una eficacia claramente menor que la RANTES de tipo silvestre (figura 4).

Así, mientras que la relación de la dosis mínima quimiotáctica con respecto a la dosis supresora del VIH en un 90% en PBMC estaba entre 8 y 50 en el caso del mutante, estaba entre 1,0 y 2,9 en el caso de la RANTES de tipo silvestre.

Ejemplo 5 Efecto antagonista de RANTES

Se estudió la capacidad de los mutantes pVU15 y pVU17 para actuar como antagonistas de la activación de los receptores CCR3 y CCR5 por la RANTES de tipo silvestre, en términos de la movilización de calcio intracelular.

Cuando se añadió inmediatamente antes de la molécula de tipo silvestre, pVU15 redujo la respuesta a la RANTES de tipo silvestre con un efecto dependiente de dosis. Con respecto al CCR5, una concentración de 500 ng/ml dio lugar a la inhibición más alta de la actividad de la RANTES de tipo silvestre, aunque con respecto al CCR3, la desensibilización del receptor fue incompleta (véanse las figuras 5 y 6).

La señal de fluorescencia, inducida por cambios en el Ca^{++} intracelular, se siguió con un fluorómetro.

Claims

1. Un mutante de RANTES, teniendo dicho mutante la capacidad de actuar competitivamente como antagonista de RANTES, MIP-1\alpha o MIP-1\beta de tipo silvestre, o de actuar como antagonista de la interacción entre el virus VIH y un receptor de quimioquinas, y llevando una mutación que se selecciona entre:

a): Arg 44 sustituida por un aminoácido cargado negativamente o un aminoácido hidrófobo pequeño;

b): Lys 45 sustituida por un aminoácido cargado negativamente o un aminoácido hidrófobo pequeño;

2. Un mutante de RANTES según la reivindicación 1, en el que dicha mutación es la sustitución de la Arg 44 por Glu o Ala.

3. Un mutante de RANTES según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una única mutación seleccionada entre:

a): Tyr 3 por Ala;

b): Ser 1 por Cys;

c): Asp 6 por Arg;

d): Tyr 14 por Phe;

e): Arg 17 por Ala;

f): Lys 45 por Glu o Ala.

4. Un mutante de RANTES según la reivindicación 1, en el que dicha mutación es la sustitución de la Lys45 por Glu o Ala.

5. Un mutante de RANTES según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una única mutación seleccionada entre:

a): Tyr 3 por Ala;

b): Ser 1 por Cys;

c): Asp 6 por Arg;

d): Tyr 14 por Phe;

e): Arg 17 por Ala.

6. Un mutante de RANTES según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además uno o dos aminoácidos adicionales en el extremo N.

7. Un mutante de RANTES según la reivindicación 6, en el que dichos aminoácidos adicionales se seleccionan entre Leu, Ala, Cys, y Trp.

8. Un mutante de RANTES según la reivindicación 7, en el que dicho aminoácido adicional es Leu.

9. Un péptido derivado de la secuencia de RANTES de las regiones del bucle del 40 que comprende la mutación o adición de las reivindicaciones 1-8, que tiene la capacidad de actuar competitivamente como antagonista de RANTES, MIP-1\alpha o MIP-1\beta de tipo silvestre, o de actuar como antagonista de la interacción entre el virus VIH y un receptor de quimioquinas.

10. Una secuencia de nucleótidos que codifica un mutante de RANTES según las reivindicaciones 1-8.

11. Un vector para la expresión en eucariotas o en procariotas que comprende la secuencia de la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica que tiene actividad inhibitoria del VIH, antialérgica, antiasmática o antiinflamatoria, que comprende un mutante de las reivindicaciones 1-8 como el ingrediente activo.

13. Una composición farmacéutica que tiene actividad inhibitoria del VIH, antialérgica, antiasmática o antiinflamatoria, que comprende un péptido de la reivindicación 9 como el ingrediente activo.

14. Un proceso para preparar mutantes de RANTES de las reivindicaciones 1-8 que comprende cultivar células eucarióticas transfectadas con vectores que contienen fragmentos de ADN que codifican dichos mutantes.

15. Un proceso según la reivindicación 14, en el que dicho vector es un vector de expresión en baculovirus.

16. Un proceso según la reivindicación 14, en el que dicho vector es un vector de expresión en E. coli.