ITPD20010031A1 - Procedimento per la preparazione di fosfatidi puri e loro impiego in campo cosmetico, farmaceutico ed alimentare. - Google Patents

Procedimento per la preparazione di fosfatidi puri e loro impiego in campo cosmetico, farmaceutico ed alimentare. Download PDF

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Description

Descrizione di una invenzione industriale dal titolo “Procedimento per la preparazione di fosfatidi puri e loro impiego in campo cosmetico, farmaceutico ed alimentare”
OGGETTO DELLΊNVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un processo per la preparazione di fosfatidi puri a partire da miscele di fosfatidi naturali, o singoli loro componenti, quali la lecitina di soia o di uovo o fosfolipidi animali, o da fosfatidi sintetici facendoli reagire con fosfolipasi D, avente attività di transfosfatidilizzazione, in ambiente acquoso in presenza di definiti substrati contenenti un gruppo alcolico primario.
L’invenzione si riferisce, inoltre, ad un processo per la preparazione di derivati fosfoceramidici a partire da sfingomielina naturale facendola reagire con fosfolipasi D, avente attività di transfosfatidilizzazione, in ambiente idro-organico bifasico in presenza di definiti substrati contenenti un gruppo alcolico primario. Un altro aspetto della presente invenzione riguarda la preparazione, la purificazione e la caratterizzazione della fosfolipasi D utilizzata nel processo.
CAMPO DELL'INVENZIONE
La sintesi, in particolare su scala industriale, di fosfolipidi puri è un problema particolarmente sentito, tanto che esistono numerose pubblicazioni scientifiche e brevetti, anche molto recenti, che descrivono diverse metodologie. In genere questi metodi utilizzano le proprietà di transfosfatidilizzazione della fosfolipasi D per l’ottenimento di fosfatidi otticamente attivi. Uno dei maggiori problemi è il fatto che ognuno di questi metodi è adatto per la preparazione di uno specifico fosfatide e non si presta, invece, in modo universale per la sintesi di tutta la classe di composti. Generalmente il fosfolipide più studiato è la fosfatidilserina (PS) in quanto ampiamente utilizzato nella preparazione di composizioni farmaceutiche, nella preparazioni di formulazioni liposomiali oltre che di integratori alimentari. Relativamente poco o nulla si riporta per quanto riguarda la sintesi degli sfingofosfolipidi.
Una limitazione di tutte le metodiche riportate in letteratura, sia scientifica che brevettuale, consiste nel fatto che la reazione di transfosfatidilizzazione avviene in sistemi bifasici acqua/ solvente organico, il che comporta una serie di problematiche di tipo tecnico per quanto riguarda l'uso di grandi quantità di solventi, specialmente qualora il processo industriale sia di natura chimica e si cerchi la qualità del prodotto finale. Nella domanda di brevetto DE 19917249 Al viene, in realtà, descritto un metodo che utilizza la sola fase acquosa, ma non vengono riportate né le rese né il grado di purezza della PS ottenuta. Inoltre non viene descritto se si possono ottenere altri fosfolipidi, oltre alla PS, mediante la tecnica e a partire dai substrati impiegati o se nelle condizioni descritte altri fosfolipidi possono fungere da substrato di reazione. Anche nel brevetto JP 2130088 viene riportato nel sommario l’uso di sola acqua oltre a quello consolidato di una miscela acqua/ solvente organico come mezzo di reazione, però nella descrizione pratica degli esempi si riportano unicamente processi che utilizzano una miscela bifasica di acqua ed etere etilico.
La genericità o assenza di insegnamenti nelle suddette anteriorità riguardo all’applicabilità della reazione di transfosfatidilizzazione della fosfolipasi D in sola fase acquosa non potevano certo far pensare all’esperto del ramo che questa fosse la via percorribile per la soluzione del problema. Del resto, la consapevolezza dell’importanza di rimuovere impurezze derivanti dall’impiego di solventi organici nei processi di produzione di prodotti destinati ad impieghi in campo alimentare e farmaceutico è un dato degli ultimi anni, anche in seguito alle limitazioni poste daUTJSP e dalle Linee Guida Europee (CPMP/CH/283/95).
Un altro punto critico, che non viene valutato in modo approfondito né nella letteratura scientifica né tanto meno in quella brevettuale, riguarda la perossidazione dei prodotti a causa dell’uso di fasi eterogenee acqua/ solvente in emulsione durante la reazione di transfosfatidilizzazione, delle condizioni di reazione impiegate e della conseguente necessità di procedere attraverso numerosi fasi nel processo (riprecipitazioni, lavaggi ed eventualmente anche cromatografie) necessari per l’ottenimento dei prodotti stessi ad alto grado di purezza. Molti dei solventi utilizzabili per queste reazioni in fase eterogenea non garantiscono l’assenza di precursori radicalici tipici dell’iniziazione della reazione di perossidazione, e le condizioni di agitazione/ miscelazione necessarie per l’esecuzione di una reazione in fase eterogenea aumentano di fatto il possibile contatto con l’ossigeno atmosferico ed il conseguente scatenamento dei fenomeni ossidativi. Questa perossidazione ha, inoltre, il caratteristico comportamento della reazione a catena, per la quale anche fasi di innesco iniziali trascurabili possono dare risultati devastanti nel tempo, nonostante siano state eliminate o minimizzate le condizioni scatenanti. La perossidazione di una sostanza “grassa”, come sono i trigliceridi (oli e grassi) ed anche i fosfolipidi, comporta il cosiddetto irrancidimento degli acidi grassi con conseguente formazione di odore e gusto sgradevoli. L’ottenimento di prodotti di alto grado di palatabilità (odore e gusto) è invece di particolare importanza qualora i prodotti, in particolare la PS, vengano utilizzati per la preparazione di integratori alimentari (nutraceuticals) aventi particolari formulazioni come, per esempio, i granulati, o dei cosiddetti “functional food”, nei quali il prodotto viene aggiunto per arricchire alimenti. Di conseguenza, sarà importante che i prodotti ottenuti, in particolare la PS, siano caratterizzati chimicamente in modo chiaro sia per quanto riguarda la composizione chimica degli acidi grassi, sia per il loro grado di perossidazione e la conseguente palatabilità.
E’ da rilevare, infine, che gli enzimi fosfolipasi D commercialmente disponibili hanno attività di transfosfatidilizzazione solamente sulla frazione fosfatidilcolinica della miscela fosfolipidica, mentre gli altri componenti quali, per esempio, la fosfatidiletanolamina (PE), subiscono la reazione di idrolisi ad acido fosfatidico riducendo sia la resa che il grado di purezza del prodotto finale o, nel caso della sfingomielina, non subiscono reazione di transfosfatidilizzazione .
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Sorprendentemente la richiedente ha scoperto che, utilizzando una frazione purificata di fosfolipasi D da Streptoverticillium hachijoense, è possibile ottenere la reazione di transfosfatidilizzazione con diversi accettori alcolici a partire da una miscela di fosfatidi naturali o loro frazioni purificate in ambiente acquoso con alte rese di prodotto, un alto grado di purezza ed un indice di perossidi (grado di perossidazione), determinato secondo la European Pharmacopoeia - Suppl. 2000, pag. 41 (method A), inferiore a 5 mediante un unico passaggio di reazione ed un’unica precipitazione.
La reazione di transfosfatidilizzazione può essere condotta in varie condizioni di temperatura e di concentrazione dei substrati, variando la prima fra 20 e 60°C, preferibilmente 45°C, e la seconda fra 10 e 500 mg/ml, preferibilmente 150 mg/ml, anche in funzione della disperdibilità/ solubilità dei substrati.
Un secondo aspetto della presente invenzione consiste nel fattq che questa particolare preparazione enzimatica agisce con attività di transfosfatidilizzazione ad alte rese anche su substrati diversi dalla fosfatidilcolina (lecitina), rendendo quindi il processo utilizzabile anche con materie prime non purificate e di basso costo.
Un terzo aspetto consiste nella preparazione di fosfolipidi non naturali, in particolare di derivati della sfingomielina.
Un quarto aspetto della presente invenzione riguarda la preparazione di composizioni farmaceutiche e cosmetiche e di integratori alimentari e dietetici a base di fosfolipidi, ottenuti secondo il processo sopra descritto, aventi un grado di perossidazione inferiore a 5 ed un alto grado di palatabilità, tali da renderli preferibili rispetto a prodotti similari, commercialmente disponibili, ma non aventi le suddette caratteristiche.
Le composizioni farmaceutiche e gli integratori alimentari e dietetici sono particolarmente indicate /i nel trattamento delle condizioni di stress psico-fisico con difficoltà di attenzione, concentrazione e memorizzazione, spesso associate al progredire dell'età, e possono essere preparate, ad esempio, in forma di capsule, compresse e granulati.
Le composizioni cosmetiche trovano maggiore applicazione nel trattamento della pelle alterata nelle sue funzioni fisiologiche e come coadiuvanti nella terapia delle dermatiti di tipo eczematoso e/o infiammatorio e possono essere preparate, ad esempio, in forma di creme o gel. , A scopo puramente illustrativo riportiamo alcuni esempi di preparazione della Fosfolipasi D e di fosfolipidi da essa derivanti secondo la presente invenzione.
Esempio 1 - Preparazione di Fosfolipasi D
Viene utilizzato il ceppo Streptoverticillium hachijoense ATCC 19769.
La preparazione dell’inoculo da utilizzare nella prova di fermentazione inizia con il prelievo di una colonia su terreno solido in capsule di Petri. La composizione del terreno solido è la seguente: 21,0 gr/lt Y.M., 2% agar. Il prelievo dei batteri da capsule di Petri viene usato per iniziare un sistema di “scale up” in beuta secondo la seguente procedura:
- i batteri vengono prelevati dal terreno solido per mezzo di un’ansa di platino sterile ed inoculati in una beuta da 100 ml contenente 20 ml di medio della seguente composizione: 21,0 gr/lt di Y.M. broth;
- la beuta viene posta in incubatore shaker a 30°C, 150 rpm per 48 ore;
- si trasferiscono i 20 ml di coltura in una beuta da 5,0 lt contenente 2,5 lt di medio avente composizione come sopra; - la beuta viene posta in incubatore shaker a 30°C, 150 rpm per 72 ore.
A questo punto la coltura è pronta per essere inoculata nel fermentatore. Questa operazione è resa possibile grazie al fatto che la coltura si trova in una beuta attrezzata di un tubo al silicone con un sistema ad ago. Viene utilizzato un fermentatore di 50 lt (Braun Biostat U). La composizione del medio utilizzato è la seguente: Y.M. broth 21,0 gr/lt, pH 6,5 (il medio viene sterilizzato direttamente in fermentatore) con l’aggiunta di antischiuma); i parametri di fermentazione sono i seguenti: agitazione 200 rpm, temperatura 30°C, flusso d’aria 0,5 vvm.
Dopo 72 ore la fermentazione viene interrotta, la produzione massima di enzima raggiunta è di 5.000 U/lt e l’attività enzimatica viene determinata con il metodo descritto in letteratura di Kato et al. Modificato (K. Shimbo et al., Agric. Biol. Chem. 54(5), 1189-93, 1990).
Il brodo di coltura viene filtrato per eliminare la biomassa, il sunatante viene concentrato utilizzando una cartuccia a spirale in acetato di cellulosa con cut-off di 10.000 D e dializzato contro tampone Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Il campione ottenuto viene caricato su colonna cromatografica (i.d. = 10 cm, h = 50 cm) impaccata con 500 gr di resina a scambio anionico DE-52 Whatman pre-equilibrata con lo stesso tampone utilizzato per la dialisi. L’enzima non viene adsorbito, eluisce dalla colonna, viene dializzato contro tampone Na- fosfato 20 mM, pH 5,4 e quindi caricato su una colonna cromatografica (i.d. = 10 cm, h = 50 cm) impaccata con 50 gr di resina a scambio cationico CM-Sephadex C-50 Pharmacia pre-equilibrata con lo stesso tampone dell’enzima. L’enzima viene eluito con un gradiente di pH da 5,4 a 7,0 utilizzando un tampone Na-fosfato 20 mM, pH 7,0. La frazione che eluisce a pH 6,2 viene raccolta, concentrata e dializzata contro tampone Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 fino ad una concentrazione di 100 U/ml e quindi liofilizzata.
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Esempio 2 - Preparazione di PS da PC
In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono sciolti in 10 lt di acqua 272 gr di sodio acetato triidrato e 59 gr di calcio cloruro triidrato; si porta il pH a 5,6 (tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6) indi si aggiungono 5,0 kg di L-serina che viene portata in soluzione riscaldando a 45°C. Tutto il processo viene effettuato sotto azoto. A solubilizzazione avvenuta si aggiungono 1,5 kg di lecitina purificata di soia avente la seguente composizione: PC 95%, PA 4%, liso-PC 1%; dopo 10 mln si aggiungono 16.100 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C. Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 10 lt di una miscela di n-esano/isopropanolo/ acqua (60/80/ 15); si lascia in agitazione fino a dissoluzione della massa nel reattore indi si ferma l'agitazione e si lasciano separare le due fasi.
La fase inferiore viene raccolta ed avviata al recupero della L-, serina non reagita mediante cristallizzazione per raffreddamento. La fase superiore viene lavata con 6.950 ml di HCl 1 N e 1.113 mi di isopropanolo a 5°C.
La fase acida viene controestratta con 10 lt di una miscela di nesano/ isopropanolo /acqua (60/80/ 15), indi le due fasi organiche vengono lavate a cascata con miscela di 7 lt di acqua e 6 lt di isopropanolo.
Le fasi organiche vengono concentrate sotto vuoto e precipitate per aggiunta lenta ad una soluzione di 450 ml di sodio acetato 4,5 M in acqua in 33,2 lt di etanolo.
Si filtra e si secca.
Si ottengono 1,14 kg di fosfatidilserina con titolo superiore al 95% con contenuto di acido fosfatidico inferiore al 5% e indice di perossidi inferiore a 5.
Dopo cristallizzazione ed essiccamento vengono recuperati 3,25 kg di L-serina.
Esempio 3 - Preparazione di PS da lecitina di uovo
In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono introdotti 180 ml di tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6, indi si aggiungono 90 gr di L-serina che viene portata in soluzione riscaldando a 45°C. Tutto il processo viene effettuato sotto azoto.
A solubilizzazione avvenuta si aggiungono 27 gr di lecitina purificata di uovo (contenuto in PC > 95%); dopo 10 min si aggiungono 290 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C.
Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 200 ml di una miscela di n-esano/isopropanolo/ acqua (60/80/ 15); si lascia in agitazione fino a dissoluzione della massa nel reattore, indi si ferma l'agitazione e si lasciano separare le due fasi.
La fase inferiore viene scartata.
La fase superiore viene lavata con 150 ml di HCl 1 N e 30 ml di isopropanolo a 5°C.
La fase acida viene controestratta con 180 ml di una miscela di nesano/ isopropanolo /acqua (60/80/ 15), indi le due fasi organiche vengono lavate a cascata con miscela di 100 ml di acqua e 130 ml di isopropanolo.
Le fasi organiche vengono concentrate sotto vuoto e precipitate per aggiunta lenta ad una soluzione di 8 mi di sodio acetato 4,5 M in acqua in 600 ml di etanolo.
Si filtra e si secca.
Si ottengono 20,8 gr di fosfatidilserina con titolo superiore al 95% con contenuto di acido fosfatidico inferiore al 5% e indice di perossidi inferiore a 5.
Esempio 4 - Preparazione di fosfatidilserina da lecitina grezza di soia
In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono introdotti 180 ml di tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6, indi si aggiungono 90 gr di L-serina che viene portata in soluzione riscaldando a 45°C. Tutto il processo viene effettuato sotto azoto.
A solubilizzazione avvenuta si aggiungono 27 gr di lecitina grezza di soia avente la seguente composizione percentuale: PC 60,6 / PE 29,5 / PA 3,4 / liso-PC 2,5 / altri 3,9. Dopo 10 min si aggiungono 290 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C.
Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 200 ml di una miscela di n-esano/isopropanolo/acqua (60/80/ 15); si lascia in agitazione fino a dissoluzione della massa nel reattore indi si ferma l'agitazione e si lasciano separare le due fasi.
La fase inferiore viene scartata.
La fase superiore viene lavata con 150 ml di HCl 1 N e 30 ml di isopropanolo a 5°C.
La fase acida viene controestratta con 180 ml di una miscela di nesano/ isopropanolo /acqua (60/80/ 15), indi le due fasi organiche vengono lavate a cascata con miscela di 100 ml di acqua e 130 ml di isopropanolo.
Le fasi organiche vengono concentrate sotto vuoto e precipitate per aggiunta lenta ad una soluzione di 8 mi di sodio acetato 4,5 M in acqua in 6000 mi di etanolo.
Si filtra e si secca.
Si ottengono 19 gr di fosfatidilserina con titolo 83,5% (PA 7,7%, liso-PS 2,3%, PE 1,0%, altri 4,5%) e indice di perossidi inferiore a 5.
Esempio 5 - Preparazione fosfatidil-D-serina
In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono introdotti 180 ml di tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6, indi si aggiungono 90 gr di D-serina che viene portata in soluzione riscaldando a 45°C. Tutto il processo viene effettuato sotto azoto.
A solubilizzazione avvenuta si aggiungono 27 gr di lecitina purificata di soia come descritta nell’esempio 2; dopo 10 min si aggiungono 290 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C.
Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 200 ml di una miscela di n-esano/isopropanolo/acqua (60/80/ 15); si lascia in agitazione fino a dissoluzione della massa nel reattore indi si ferma l'agitazione e si lasciano separare le due fasi.
La fase inferiore viene scartata.
La fase superiore viene lavata con 150 ml di HCl 1 N e 30 ml di isopropanolo a 5°C.
La fase acida viene controestratta con 180 ml di una miscela di nesano/ isopropanolo /acqua (60/80/ 15), indi le due fasi organiche vengono lavate a cascata con miscela di 100 ml di acqua e 130 ml di isopropanolo.
Le fasi organiche vengono concentrate sotto vuoto e precipitate per aggiunta lenta ad una soluzione di 8 mi di sodio acetato 4,5 M in acqua in 600 ml di etanolo.
Si filtra e si secca.
Si ottengono 18,7 gr di fosfatidil-D-serina con titolo superiore al 95 % con contenuto di acido fosfatidico inferiore al 5 % e indice di perossidi inferiore a 5.
Esempio 6 - Preparazione di fosfatiriiletanolamima (PEI da PC In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono introdotti 200 ml di tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6. Tutto il processo viene effettuato sotto azoto.
Si aggiungono 58 gr di etanolamina e si regola il pH a 5,6 con acido acetico glaciale termostatando a 30°C.
Al termine dell'operazione si scalda a 45 °C, si aggiungono 30 gr di di lecitina purificata di soia come descritta nell’esempio 2; dopo 10min aggiungono 325 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C.
Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 400 ml di una miscela di n-esano/isopropanolo/ acqua (60/80/ 15); si ferma l'agitazione e si lasciano separare le due fasi.
La fase inferiore viene scartata.
La fase superiore viene lavata con 150 ml di HCl 1 N e 30 ml di isopropanolo a 5°C.
La fase acida viene controestratta con 180 ml di una miscela di nesano/isopropanolo/ acqua (60/80/ 15), indi le due fasi organiche vengono lavate a cascata con miscela di 100 ml di acqua e 130 ml di isopropanolo, poi con 100 ml di sodio acetato 1 N e 130 ml di isopropanolo.
Le fasi organiche vengono concentrate sotto vuoto.
Si purifica mediante cromatografia su gel di silice usando un cromatografo a pressione assiale con una colonna da 1 lt condizionata con cloroformio /metanolo (80/20); si eluisce a gradiente fino a cloroformio /metanolo /acqua (70/30/3).
Si evaporano le frazioni pure, si sciolgono in 250 ml di cicloesano e si liofilizza ottenendo 24 gr di prodotto solido giallo pallido esente da acido fosfatidico e lisoderivati con purezza superiore al 99%.
Esempio 7 - Preparazione di fosfatidil-omoserina da PC
In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono introdotti 180 ml di tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6, indi si aggiungono 102 gr di omoserina che viene portata in soluzione riscaldando a 45°C. Tutto il processo viene effettuato sotto azoto.
A solubilizzazione avvenuta si aggiungono 27 gr di di lecitina purificata di soia come descritta nell’esempio 2; dopo 10 min ggiungono 290 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C.
Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 200 ml di una miscela di n-esano/ isopropanolo/ acqua (60/80/ 15); si lascia in agitazione fino a dissoluzione della massa nel reattore, indi si ferma l'agitazione e si lasciano separare le due fasi.
La fase inferiore viene scartata.
La fase superiore viene lavata con 150 ml di HCl 1 N e 30 ml di isopropanolo a 5°C.
La fase acida viene controestratta con 180 ml di una miscela di nesano/isopropanolo/ acqua (60/80/ 15), indi le due fasi organiche vengono lavate a cascata con miscela di 100 ml di acqua e 130 ml di isopropanolo.
Le fasi organiche vengono concentrate sotto vuoto e precipitate per aggiunta lenta ad una soluzione di 8 mi di sodio acetato 4,5 M in acqua in 600 ml di etanolo.
Si filtra e si secca.
Si ottengono 22,6 gr di fosfatidil-omoserina con titolo superiore al 95% con contenuto di acido fosfatidico inferiore al 5 % e indice di perossidi inferiore a 5.
Esempio 8 - Preparazione di fosfatidil-idrossiprolina da PC
In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono introdotti 180 ml di tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6, indi si aggiungono 112 gr di idrossiprolina che viene portata in soluzione riscaldando a 45°C. Tutto il processo viene effettuato sotto azoto.
A solubilizzazione avvenuta si aggiungono 27 gr di di lecitina purificata di soia come descritta nell’esempio 2; dopo 10 min si aggiungono 290 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C.
Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 200 ml di una miscela di n-esano/isopropanolo/ acqua (60/80/ 15); si lascia in agitazione fino a dissoluzione della massa nel reattore indi si ferma l'agitazione e si lasciano separare le due fasi.
La fase inferiore viene scartata.
La fase superiore viene lavata con 150 ml di HCl 1 N e 30 ml di isopropanolo a 5°C.
La fase acida viene controestratta con 180 ml di una miscela di nesano/ isopropanolo/ acqua (60/80/ 15), indi le due fasi organiche vengono lavate a cascata con miscela di 100 ml di acqua e 130 ml di isopropanolo.
Le fasi organiche vengono concentrate sotto vuoto e precipitate per aggiunta lenta ad una soluzione di 8 mi di sodio acetato 4,5 M in acqua in 600 ml di etanolo.
Si filtra e si secca.
Si ottengono 18,4 gr di fosfatidil-idrossiprolina con titolo superiore al 95% con contenuto di acido fosfatidico inferiore al 5% e indice di perossidi inferiore a 5.
Esempio 9 - Preparazione di fosfatidilglicerolo da PC
In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono introdotti 200 ml di tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6. Tutto il processo viene effettuato sotto azoto.
Si aggiungono 80 gr di glicerolo; si scalda a 45°C e si aggiungono 30 gr di di lecitina purificata di soia come descritta nell’esempio 2; dopo 10' min si aggiungono 325 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C.
Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 400 ml di una miscela di n-esano/isopropanolo/acqua (60/80/ 15); si ferma l'agitazione e si lasciano separare le due fasi.
La fase inferiore viene scartata.
La fase superiore viene lavata con 150 ml di HCl 1 N e 30 ml di isopropanolo a 5°C.
La fase acida viene controestratta con 180 ml di una miscela di nesano/isopropanolo/acqua (60/80/ 15), indi le due fasi organiche vengono lavate a cascata con miscela di 100 ml di acqua e 130 ml di isopropanolo, poi con 100 ml di sodio acetato 1 N e 130 ml di isopropanolo.
Le fasi organiche vengono concentrate sotto vuoto.
Si purifica mediante cromatografia su gel di silice usando un cromatografo a pressione assiale con una colonna da 1 lt condizionata con cloroformio/metanolo (80/20); si eluisce a gradiente fino a cloroformio /metanolo /acqua (70/30/3).
Si evaporano le frazioni pure, si sciolgono in 250 ml di cicloesano e si liofilizza ottenendo 22,2 gr di prodotto solido bianco esente da acido fosfatidico e liso derivati con purezza superiore al 95%.
Esempio 10 - Preparazione di ceramido-fosfo-L-serina da sfingomielina
In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono introdotti 33 mi di tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6 e 33 mi di etile acetato, indi si aggiungono 16,7 gr di L-serina che viene portata in soluzione riscaldando a 45°C.
A solubilizzazione avvenuta si aggiungono 2,0 gr di sfingomielina pura; dopo 10 min si aggiungono 20 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C.
Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 200 ml di miscela 1/ 1 di cloroformio /metanolo e 50 ml di HCl 1 N.
Si lava con HCl 1 N fino ad eliminazione della serina residua indi si evapora il solvente, si riprende in 500 ml di etanolo e si aggiungono 3 mi di sodio acetato 4,5 M in acqua.
Si filtra e si secca.
Si ottengono 1,7 gr di ceramido-fosfo-L-serina con titolo superiore al 95% senza impurezze fosforopositive.
Esempio 11 - Preparazione di ceramido-fosfo-D-serina da sfingomielina
In un reattore con camicia dotato di agitazione e condensatore di riflusso vengono introdotti 33 mi di tampone acetato 0,2 M calcio cloruro 0,04 M pH 5,6 e 33 mi di etile acetato indi si aggiungono 16,7 gr di D-serina che viene portata in soluzione riscaldando a 45°C.
A solubilizzazione avvenuta si aggiungono 2,0 gr di sfingomielina pura; dopo 10 min si aggiungono 20 U di fosfolipasi D dell’esempio 1 e si lascia reagire per 24 ore a 45°C.
Terminata la reazione si scarica aggiungendo nel reattore 200 ml di miscela 1/ 1 di cloroformio /metanolo e 50 ml di HCl 1 N.
Si lava con HCl 1 N fino ad eliminazione della serina residua indi si evapora il solvente, si riprende in 500 ml di etanolo e si aggiungono 3 mi di sodio acetato 4,5 M in acqua.
Si filtra e si secca.
Si ottengono 1,7 gr di ceramido-fosfo-D-serina con titolo superiore al 95% senza impurezze fosforopositive.
Esempio 12 - Recupero e riciclo di L-serina
Le acque madri provenienti dal primo partizionamento della reazione enzimatica dell'esempio 2 vengono raffreddate a 0°C per 24 ore, indi si filtra il cristallizzato. Si lava con etanolo e si secca ottenendo aghi bianchi di prodotto puro identico all'originale.
Si reintegra la quantità mancante (circa 20 %) e si riutilizza normalmente.
Essendo l’invenzione così descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell’invenzione e tutte le modifiche che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell’ambito delle seguenti rivendicazioni .

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI 1 . Processo per la preparazioni di fosfatidi di formula generale
    in cui R1 è diacilglicerolo o ceramide ed R2 un gruppo alcolico e secondo il quale si fa reagire un fosfatide di formula generale
    in cui R1 ha il significato di cui sopra ed R3 è CH2 - CH2 - NH2 o CH2 - CH2 - N(CH3)3 nel caso in cui R1 è diacilglicerolo ed è CH2 - CH2 - N(CH3)3 quando R1 è ceramide, con un alcool primario avente lunghezza di catena da C2 a C3 eventualmente sostituito da uno o più gruppi polari quali il gruppo amminico eventualmente sostituito, il gruppo alcolico o il gruppo carbossilico in presenza di fosfolipasi D avente attività di transfosfatidilizzazione 2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui il diacilglicerolo è costituito da due acidi grassi uguali o distinti, saturi o insaturi, avente lunghezza compresa fra C12 e C24 ed il ceramide è costituito da sfingosine sature od insature avente lunghezza di catena di C18 o C20 e da un acido grasso avente lunghezza compresa fra C12 e C24. 3. Processo secondo le rivendicazioni 1 e 2 in cui il processo viene condotto in una unica fase acquosa quando R1 è un gruppo diacilglicerolico . 4. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui il processo viene condotto in soluzione bifasica idro-organica quando R1 è un gruppo ceramidico. 5. Processo secondo le rivendicazioni da 1 a 4 in cui la temperatura di reazione è di 45°C 5°C. 6. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui la fosfolipasi D è prodotta dal ceppo Streptoverticillium hachijoense ATCC 19769 e la stessa è purificata su resina a scambio anionico e cationico. 7. Processo secondo la rivendicazione 6 in cui la frazione di fosfolipasi D utilizzata viene eluita a pH 6.2 dalla resina a scambio cationico. 8. Processo secondo la rivendicazione 3 in cui il fosfatide ottenuto è la fosfatidil-L-serina ed il fosfatide originario è la lecitina purificata di soia. 9. Processo secondo la rivendicazione 3 in cui il fosfatide ottenuto è la fosfatidil-L-serina ed il fosfatide originario è la lecitina grezza di soia. 10. Processo secondo la rivendicazione 3 in cui il fosfatide ottenuto è la fosfatidil-L-serina ed il fosfatide originario è la lecitina di uovo. 11. Processo secondo le rivendicazioni 6 e 7 in cui la fosfatidil-L-serina ha composizione in acidi grassi identica a quella della lecitina di soia e grado di perossidazione inferiore a 5. 12. Processo secondo le rivendicazioni 6 e 7 in cui la fosfatidil-L-serina ha composizione in acidi grassi identica a quella della lecitina di uovo e grado di perossidazione inferiore a 5. 13. Processo 1econdo la rivendicazione 6 in cui il fosfatide ottenuto è costituito dalla fosfatidil-D-serina o dalla fosfatidiletanolamina o dalla fosfatidil-omoserina o dalla fosfatidilidrossiprolina o dal fosfatidilglicerolo. 14. Processo secondo la rivendicazione 4 in cui il fosfatide ottenuto è la ceramido-fosfo-L-serina ed il fosfatide originario è la sfmgomielina. 15. Composizioni farmaceutiche contenenti fosfolipidi ottenuti mediante il processo secondo le rivendicazione da 1 a 4. 16. Composizioni cosmetiche contenenti fosfolipidi ottenuti mediante il processo secondo le rivendicazione da 1 a 4. 17. Integratori alimentari e dietetici contenenti fosfolipidi ottenuti mediante il processo secondo le rivendicazione da 1 a 4. 18. Integratori alimentari e dietetici contenenti fosfatidil-L-serina ottenuta mediante il processo secondo le rivendicazione da 8 a 10. 19. Composizioni farmaceutiche contenenti fosfatidil-L-serina aventi le caratteristiche di cui alle rivendicazioni 11-12, in grado di conferire un alto grado di palatabilità in termini di odore e gusto e da somministrarsi per via orale. 20. Composizioni cosmetiche contenenti fosfatidil-L-serina aventi le caratteristiche di cui alle rivendicazioni 11-12, da somministrarsi per via topica. 2 1.Integratori alimentari e dietetici contenenti fosfatidil-L-serina aventi le caratteristiche di cui alle rivendicazioni 11-12, in grado di conferire un alto grado di palatabilità in termini di odore e gusto e da somministrarsi per via orale. 22. Uso di composizioni farmaceutiche di cui alle rivendicazioni precedenti nel trattamento delle condizioni di stress psico-fisico con difficoltà di attenzione, concentrazione e memorizzazione, spesso associate al progredire dell'età. 23. Uso di composizioni cosmetiche di cui alle rivendicazioni precedenti nel trattamento della pelle alterata nelle sue funzioni fisiologiche e come coadiuvanti nella terapia delle dermatiti di tipo eczematoso e/o infiammatorio. 24. Uso di integratori dietetici ed alimentari di cui alle rivendicazioni precedenti nel trattamento delle condizioni di stress psico-fisico con difficoltà di attenzione, concentrazione e memorizzazione, spesso associate al progredire dell'età. 25. Composizioni farmaceutiche di cui alle rivendicazioni 18 e 22 in forma di capsule, compresse e granulati. 26. Composizioni cosmetiche di cui alle rivendicazioni 20 e 23 in forma di creme e gel. 27. Integratori alimentari e dietetici di cui alle rivendicazioni 21 e 24 in forma di capsule, compresse e granula
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