ITPD20090135A1 - Nuovi agenti regolatori dell'attivita' citochinica - Google Patents

Description

<“>Nuovi agenti regolatori dell<'>attività citochinica

CAMPO DELL'INVENZIONE, E DESCRIZIONE

La letteratura scientifico/brevettuale. da molti armi ormai studia e descrive acido ialuronico solfatato che si ottiene partendo dall’acido ialuranico (HA) opportunamente solfatalo secondo quanto descritto allo stato del Parte (EP094041 ODI e EP0702699B1 ). al quale si ascrivono soprattutto effetti anticoagulanti. L<'>J IAS si può anche ottenere tramite de-acelilazione c successiva solfatazione della glucosammina delPHA (definito come HA- MS) (EP0971961 B1), per la produzione di articoli chirurgici c composizioni farmaceutiche. Risultano inoltre noti i brevetti EP0754460B1 c RP 1785492 B 1 in cui si descrive Putilizzo dell’HAS in patologie come, ad esempio, l<'>ARDS, il reumatismo articolare, artrite reumatoide e la dermatite.

Oggetto della presente invenzione à ̈ il nuovo e sorprendente utilizzo dcll’HAS come agente regolatore dell’attività citochinica. poiché la Richiedente ha scoperto l’esclusiva capacità delPHAS di modulare fattività di particolari citochine (sia prò- infiammato ri e che antì-infiammaloric). ne ha studiato il meccanismo d’azione ed evidenziato la sostanziale differenza tra i due tipi di sol fatato, (1IAS e HA-NS). ma soprattutto la Richiedente ha sorprendentemente scoperto un<'>inaspettata altissima attività vs diversi tipi c ceppi di Herpes virus, di HIV, del Cytomegalovirus c del virus della stomatite vescicolare.

Dal 1970 gli scienziati hanno capilo che selezionate popolazioni di cellule linfoidi possono produrre e liberare nel letto circolatorio molecole di natura proteica non assimilabili agli anticorpi, definite col termine di<">citochine<'7>. Rapprcsentano una nuova tipologia di "ormone<">, capace di agire su target cellulari diversi in molteplici distretti corporei.

l.a progressione del bagaglio di conoscenze scientifiche relative alla sintesi c alle funzioni biologiche/biochimiche di queste proteine, ha alterato la "vecchia<">visione di sistema immunitario (S.I.) propria del mondo scientifico, ed ha aperto nuovi orizzonti nella comprensione delle sue molteplici funzioni, creando cosi nuove prospettive per la cura di differenti patologie, topiche e/o sistemiche, comprendenti anche nuove possibilità terapeutiche relative aH'immunoterapia del cancro.

L a cellula centrale del S.I. Ã ̈ il linfocita, costituisce circa il 20% di tutti i globuli bianchi e. sulla base delle sue varie funzioni, fonna 3 classi: il linfocita B, il linfocita T e il linfocita "killer<">. Molte citochinc sono proteine solubili prodotte da linfociti e/o monoeiti. capaci d<'>agire vs altre cellule tessuti situati anche mollo lontano dal luogo di loro produzione. Possiedono infatti funzioni immunitarie e funzioni di regolazione nella sintesi di altre citochinc da parte di diverse cellule del S.I. o di cellule bersaglio coinvolte nella cascata di reazioni iniziata dal S.I.

Fino ad oggi sono stale studiate molteplici differenti citochinc, aventi anche diverse molteplici sigle, ma quelle studiale in particolare dalla Richiedente sono: Interleuchina 1 c 2. Interleuehina 6. 7 e 12, di seguito definite come 1L-L Π,-2. IL-6, 1L-7 e IL- 12 che. con il TNF. sono definite citochine a carattere prò -in fi ammalo rio. mentre Γ Interleuehina I O (1I.-10) al contrario à ̈ una cìtochina con proprietà fortemente ami-infiammatorie. La prima cìtochina ad essere studiata à ̈ stala sicuramente IL- 1 : presente in due forme a e β. à ̈ un potente induttore dei processi infiammatori, sia locali che sistemici. Viene prodotta principalmente dai linfociti B. T c dai macrofagi dopo stimolo batterico o stimolazione da parte di altri agenti comprese altre citochine: viene anche secreta dai macrofagi alveolari, peritoneali, dalle Kupfter cells, dai neutrofìli periferici, dalle cellule cn dote li ali, epiteliali c muscolari lisce, dai fibroblasti. dalle cellule del Langerhans della pelle, dagli osteoclasti, dai sinoviociti e dal molti altri tipi di cellula. Risulta presente anche nel liquido cerebro-spinale dove viene sia prodotta che trasportata. Entrambe le forme legano lo stesso recettore c posseggono attività biologiche, se non identiche, mollo simili. Molte delle loro funzioni pro-infiammatorie sono legale alla stimolazione di altre citochine. come IL-6 e 11.-8, e la loro stessa sintesi può essere indotta da citochinc come il TNF. 1<'>Inlerfcronc. le endolossine batteriche, i virus c differenti tipi di allei antigeni. È coinvolta nello shock settico ma à ̈ anche da sollolineare come studi recenti abbiano dimostralo come IL-1 sia in grado d<'>attivare l’espressione di alcune oncogeni e. quindi, di partecipare alla patogenesi delle neoplasie. Inoltre, per questa citochina à ̈ stato suggerito un sistema autocrino di controllo della crescita di cellule b 1 asto i di della serie bianca che sono presenti nel letto circolatorio dei pazienli con patologia leucemica: questi blasti infatti producono in modo incontrollato l l .-l che a sua volta stimola la sintesi di quei fattori di crescita che aumentano la proliferazione dei blasti stessi. In combinazione con altre citochinc, IL-1 rappresenta quindi uno dei maggiori mediatori dei processi infiammatori: stimola infatti le T-eells a produrre IL-2 e le B-cells a produrre immunoglobuline. Risulta così coinvolta in molte patologie come, ad esempio, l’astrogliosi e la demielinizzazione delle libre neuronali, à ̈ citotossica per ie cellule pancreatiche del T.angerhans che producono Γ insulina, ed à ̈ coinvolta anche nei processi litici delle ossa sia attivando gli ostcoclasti che sopprimendo la formazione di nuovo osso. F capace di funzionare come pirogeno endogeno poiché, aumentando il rilascio di prostaglandine nel centro ipotalamico, determina l<'>aumento della temperatura corporea. Risulta inoltre coinvolta nella patogenesi deirartrite reumatoide e del artrosi: infalli, elevate quantità di IL-1 sono state trovate nel liquido sinovialc di pazienti affetti da artrite reumatoide e/o osteoartrosi. infine, partecipa all<'>istaurarsi del danno vascolare come la trombosi venosa cd à ̈ presente in tutti i vasi con patologie di tipo arterio/atcrosclcrotiche. Attualmente, per questa citochitia sono in sperimentazione antagonisti rccettorìali in quanto il blocco del recettore si sta rivelando un efficace modo per curare quelle patologie in cui IL-1 à ̈ tra i protagonisti.

TNF: Il fattore di necrosi fa parte di quel gruppo di citochinc che promuove la reazionedi fase acuta dell<'>infiammazione sistemica. Il TNL Ã ̈ quindi coinvolto in numerosissimi processi come la proliferazione, il differenziamento e l'apoplosi cellulare, la cancerogenesi c la replicazione virale.

li' prodotto in massima parte dai macrofagi e da una serie di altri tipi cellulari inclusi mastociti, cellule linfoidi, cellule muscolari e cndoteliali. fibroblasti e cellule nervose. La sua sintesi può essere slimolata dalle cndotossine batteriche, da altre cilochine come il .-2, Interferone e IL- 1 , ed essere inibita dagli steroidi.

Agendo su numerosi organi e sistemi, generalmente assieme ad altre citochine. partecipa all<’>instaurazione e alla regolazione di molli processi patogeneliei :

-modula l<'>espressione di molte proteine cd importanti cilochine. come IL- 1 e IL-6; -stimola Lasse ipotalamo-ipofisi-surrrene aumentando il rilascio di alcuni tipi di ormoni;

-sopprime l<'>appetito;

-induce la febbre (funziona da pirogeno endogeno ìnducendo f potalamo a produrre prostaglandine);

-stimola la sintesi di collagenasi nei sinoviociti e, per questo motivo, grandi quantità di TNF sono state riscontrate nei liquidi sinoviali di pazienti sofferenti di artrosi e di artrite reumatoide;

-attiva gli osteoclasli c quindi induce il riassorbimento dell<'>osso;

-risulta coinvolto anche in patologie del Sistema Nervoso, come Lastrocitosi e la demielinizzazione;

-attrae potentemente i neutrofili c li aiuta ad agganciarsi alle cellule endoleliali per ex travasare;

-stimola la produzione macrolàgica di molecole ad azione ossidante;

-Ã ̈ coinvolto in particolari patologie del Sistema Cardiocircolatorio partecipando alla formazione di trombi venosi, alla patogenesi dell<'>arteriosclerosi e delle vasculili;

-aumenta la resistenza all'insulina, aumenta il catabolismo proteico nel muscolo mentre sopprime il metabolismo lipogcnico nel tessuto adiposo.

Alte concentrazioni di TNF possono indurre sintomi shock-simili, mentre la prolungata esposizione a basse concentrazioni può portate a cachessia, sindrome che porta alla deplezione del patrimonio proteico e lipidico dei tessuti (in particolare muscolare e adiposo). Π TNF à ̈ capace di legarsi a due recettori, il TNF-R1 (recettore per il I NF di tipo 1 ) e il TNF-R2 (recettore per il TNF di tipo 2). che sono espressi in tutte le cellule somatiche esclusi gli eritrociti. Riassumendo, il TNF promuove la risposta infiammatoria che a sua volta accende molte patologie anche a carattere auto immune, come l'artrite reumaloidc. il morbo di Crohn. la psoriasi e l<'>asma. La ricerca scientifica ad oggi ha quindi cercato di perfezionare farmaci<">biologici" (come, ad esempio, anticorpi monoclonali) che inibiscano la simesi del TNF c/o ne blocchino il recettore.

IL-2: à ̈ una citochina altamente prò- infiammaloria. aterogenica, principalmente prodotta da linfociti T, la cui sintesi viene inibita da steroidi e cìclosporine. Cellule leucemiche sintetizzano la suddetta choc-bina e. contemporaneamente, ne esprimono il recettore, creando quindi un sistema autocrino nella stimolazione della loro crescita che determina un peggioramento della patologia leucemica. IL-2 ha un ruolo centrale nella regolazione della risposta immunitaria: stimola infatti la sintesi di JFN nei leucociti periferici ed induce la produzione di IL-1 e TN F. IL-2, inoltre, può danneggiare la barriera ematoencefalica e l’integrità delFendotelio dei vasi cerebrali, causando disordini neuropsichiatrici come disorientamento e depressione.

Quindi, molte sono le patologie che sono state messe in relazione con una produzione aberrante di IL- 2. come il linfoma di Flodgkin, il rigetto nei trapianti d<'>organo, la sclerosi multipla. Fartrile rcumatoide, il Lupus critematoso. il diabete e l’AIDS,

1L-6: prodotto da molti tipi cellulari soprattutto del S.I., con il TNF c tra i più importanti membri del gruppo dei mediatori chimici della fase acuta del processo infiammatorio, ed à ̈ perciò coinvolto in patologie con una forte componente infiammatoria, come l<'>asma (dove partecipa alla nascita e al mantenimento del processo infiammatorio), l'infiammazione cronica intestinale ( Crohn<'>s (liseuse ). l<'>artrite reumaloidc e l'artrosi. Infatti, come precedentemente affermato, citochine come il TNF.

1L-1 e IL-6 sono risultate essere pesantemente coinvolte nel processo degenerativo di osteoarlrosi articolare poiché svolgono un ruolo primario nella regolazione delFcspressione delle metal loproteasi (responsabili della degradazione cartilaginea) nella produzione di prostaglandine e nell<'>attivazione osteoclastica e. per questo motivo, alti livelli citochinici sono stati registrati nei liquidi sinoviali dei pazienti artrosici e sofferenti di artrite reumatoide (R.A.). Queste scoperte sono state da stimolo nell 'utilizzo di inibitori delle suddette interleuchine e/o di antagonisti recettoriali come nuova strategia di cura della patologia artrosica.

rilevate concentrazioni di IL-6 sono state anche riscontrale nelle urine di pazienti sottoposti a trapianto e la sua presenza rappresenta uno dei primi segnali della reazione di rigetto d<’>organo. Il livello serico di questa citochina risulta drasticamente aumentato anche in molti pazienti sofferenti di tumore (come, ad esempio, il mieloma. le leucemie, i mixomi cardiaci, o in patologie come le linfoadcnopatie e la cirrosi epatica) e può essere usato anche come indicatore nel monitoraggio della grandezza della massa tumorale. Inlinc. recenti studi hanno messo in relazione il cancro con la longevità ed evidenziato come alcuni tumori sono inlluenzati dalla situazione quali/quantilaliva delle proteine citochiniche proprie del paziente: nella sostanza, recenti evidenze hanno legato un profilo di bassa produzione di IL- 10 e alla secrezione di 1L-6 ad un peggioramento della sopravvivenza clinica del paziente affetto da patologia tumorale, mentre un genotipo capace di produrre e mantenere alti livelli di IL— 10 può facilitare la sopravvivenza. Quindi, persone con alti livelli di citochine anti infiammatorie e basse concentrazione di citochine infiammatorie sono geneticamente predisposte per essere più longeve (Caruso C. et al.. Ann N.Y. Acad. SCI., 2004. 1028: 1-13 ).

IL-7: eitochina principalmente prodotta dalle cellule stromali del midollo osseo, à ̈ secreta anche dal limo e dai cheralinociti. 11,-7 induce la sintesi di citochinc infiammatorie come 1L- 1 , IL-6 c I NF. partecipando così alla patogenesi di alcune malattie della pelle (come la psorìasi s e il linfoma cutaneo) e del sistema osteoarlieolarc. Infatti, alti livelli di li, -7 sono stali rilevati in pazienti sofferenti di R.A. poiché 11 ,- 1 e TNF (citochinc pesanlerncntc coinvolte nella suddetta patologia) possono aumentare la produzione stremale di 1L-7 che a sua volta stimola la sintesi macrofagica di I NF. Infine, II .-7 può indurre la maturazione degli osteoclasti e quindi aumentare il riassorbimento osseo contribuendo così alla degenerazione delle articolazioni

IL- 12: anche questa proteina gioca un ruolo centrale nella regolazione della funzioni del S.l. Agisce infuni sul differenziamento dei linfociti, induce la sintesi di Interferone e I NF. e la sua produzione può essere inibita da IL-10. L<'>over-produzione di questa proteina entra nella patogenesi di malattie a carattere autoimmune come la colite. Γ artrite, il diabete insulino-dipendenlc, rencefalomielilc. la psoriasi e la sclerosi multipla (Brahmachari S. et al., Minerva Med.. 2008. 99(2): 105-118).

IL-10: prodotta principalmente dai linfociti, à ̈ una citochina a carattere antiinfiammatorio, capace d<'>inibire la sintesi di IL-2 e dell’Interferone prodotti dai linfociti T. L<'>azione antì- infiammatori a di IL-10 si manifesta anche nella capacità d<'>inibire la sintesi di IL-1. 1L-6. IL-8. IL-12 e TNF nei macrofagi stimolati con cndotossìne batteriche. Deficit di IL-10 sono associali a patologie come il diabete mellito cd infiammazioni intestinali croniche, come il morbo di Crohn. Recenti evidenze hanno portato a sperimentare Κ,-IO anche come nuovo approccio terapeutico per il trattamento del Lupus critemaloso. È da sottolineare come sia i corticosteroidi che la ciclosporìna aumentino la produzione e/o il rilascio di questa interleuchina dalle relative cellule competenti durante le convenzionali terapie di immunosoppressione per il trattamento delle infiammazioni e del rigetto d<'>organo (Zhou X. Et al.. Currcnt Drug Targets-Imrnune, Endocrine & Mctabolic Disordcrs, 2005, 5(465475). Dati sperimentali hanno inoltre dimostrato la sua efficacia nella riduzione del rilascio di proslaglandine c di cicloossigcnasi indotti in vitro da TNF su sinoviociti umani, dimostrando cosi la capacità di IL-10 di ridurre i processi infiammatori che coinvolgono le articolazioni affette da degenerazione osleoarlrosica (Alaacddine N. et al., Arthritis & Rheumalisrn.

1999. 42:710-718). Studi recenti hanno confermato la sua efficacia terapeutica verso la patologia asmatica in modelli sperimentali animali di iper-rcattività bronchiale, dimostrando come questa citochina possegga elevale potenzialità terapeutiche nel diminuire Finfiammazione che caratterizza le vie aeree dei pazienti asmatici, nei quali alte concentrazioni di TNF. IL-1 , IL-5. 1I.-6 e IL-8 sono state rilevate nel liquido di broncolavaggio c/o a livello serico c/o a livello lissutale (Stankicwicz W. et al.. Mcdiators of Inflammation. 2002. 1 1 :307-312). Per questa interleuchina à ̈ stato quindi ipotizzalo l'importante ruolo di citochina regolatrice del mantenimento del omeostasi immunologica.

L<'>asma può essere una malattia fortemente invalidante di cui circa 200 milioni di persone nel mondo soffrono, con più di 5000 morti all’anno. K una patologia che si basa su un’alterata risposta del S.l. ai fattori ambientali, legala quindi ad una esacerbata produzione di ci lodi ine pro-infìammalorie per la crescita e il differenziamento di masi ccUs ed eosinofi con altri tipi di cellule proprie del S.l. Non sono ancora del lutto note le cause di questo out-of-balance d’attività del sistema immunitario, tuttavia esistono motivazioni genetiche, ambientali, virali ed infine anche nutrizionali, che partecipano in modo diverso all<'>instaurarsi della suddetta patologia. Trovare quindi una sua efficace terapia di prevenzione c/o cura che permetta la sospensione o la riduzione dell’uso di steroidi (terapia di cura convenzionale), potrebbe rappresentare una valida soluzione sia per le forme più gravi (in quanto permetterebbe comunque la riduzione degli steroidi) che per quelle meno gravi, poiché la sospensione della terapia stero idea, potrebbe essere totale.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL' INVENZIONE

Oggetto della presente invenzione à ̈ il nuovo e sorprendente utilizzo dclf l lAS come agente regolatore delfattivilà citochinica. poiché la Richiedente ha scoperto la sua esclusiva capacità nel modulare fatti vita, di particolari citochine. ne ha studiato il meccanismo d’azione ed evidenziato la sostanziale differenza tra i diversi tipi di solfalato noti allo stato dell<’>arte, ma soprattutto la Richiedente ha scoperto un<'>inaspettata attività vs diversi tipi e ceppi di Herpes virus, di HIV. del Cytomegalovirus e del virus della stomatite vescicolare. L’acido ìaluronico solfatalo adatto agli scopi della presente invenzione viene preparato secondo il processo descritto in LP 702699 HI : la sol lutazione viene effettuata mediante il complesso SOq-piridina e coinvolge gli ossidrili alcolici presenti nella catena polisaccaridica a partire da un HA derivato da qualsiasi fonte, ad esempio, per estrazione da creste di gallo, per via fermentativa o per via tecnologica, ed avere un peso molecolare compreso tra i 400 c 3xl0<6>l)a, in particolare tra I x 10<l>Da e lx 10<6>Da ancor più in particolare tra 10 000 e 50.000 Da. i 150.000 e i 250.000 Da e i 500.000 c 750.000 Da.

Il derivato che si ottiene mantiene inalterate tulle le caratteristiche fisiche del polimero di partenza, in modo particolare il peso molecolare dclfl lA di partenza non viene alterato dal procedimento di solfatazione permettendo, quindi, il mantenimento di lullc le caratteristiche chimico/fisiche del polisaccaride di partenza. La solfata/ione coinvolge i diversi gruppi ossidrilici dell<'>unità disaccaridica ed c quindi possibile ottenere diversi gradi di solfatazione. da 0,5 a 3.5, (inteso come numero di gruppi solfato per unità disaccaridica), variando la quantità di SCVpiridina introdotta come noto allo stato delfarte.

U derivato utilizzalo in tutte le sperimentazioni eseguite, possiede mediamente grado 1 o grado 3 di solfatazione e di seguito à ̈ delinilo come HAS1 e HAS3. Tutti i gruppi carbossilici liberi dell’ HA possono essere salificati con cationi di origine organica e/o inorganica.

Entrambi i gradi di HAS sono solubili in acqua ed. inoltre, si possono sterilizzare con le normali tecniche note all<'>esperto del ramo, tuttavia, Ã ̈ preferibile una sterilizzazione mediante autoclave.

La Richiedente, nelle sperimentazioni di seguito riportate, ha dimostralo come:

• l<'>HAS sia capace sia di stimolare la produzione di nuovo mRNA che la sintesi proteica di citochinc anti-infìammaloric (come, ad esempio, IL- 10). aumentando cosi la capacità di difesa immunitaria delle cellule e, quindi, di tutto l<'>organismo. L<'>azione ariti- infiammatoria delle suddette citochinc si manifesta nella capacità d<'>inibire la sintesi di 1L-1 , TL-6. IL- 8. IL- 12 c TNF. tutte proteine a carattere pro-infiammalorio.

* l’HAS sia efficace sia nel diminuire la sintesi di nuovo mRNA che nel diminuire in modo significativo la sintesi proteica di TL-2. IL— 7 e IL- 12 da parte dei sino vinciti (per IL- 12) e dei componenti cellulari del S.I., sia in quelle situazioni in cui non viene sollecitata una risposta immunitaria, che in quei particolari eventi di stress infiammatorio in cui la cellula immunitaria risponde producendo una cascata citochinica e, soprattutto in questo caso, i dati presentati evidenziano il maggior effetto inibitorio dell'HAS. ;• PIIAS sia efficace nel P inibire il bindins del TNF, di li -1 e di 1L-6 al loro recettore. Questi risultali sono di fondamentale importanza poiché provano che il comportamento del solfatalo à ̈ del tutto simile a quello di anticorpi ino noe lonali specifici per i recettori delle suddette proteine pro-in fiammato rie. capace quindi di bloccarne la funzione non possedendo, tuttavia, questa specificità. Questo blocco rccettorialc rappresenta il modo più efficace per antagonizzare gli effetti pro-infiammatori e tumorali del fattore TNF. di 1L-1 e di li. -6 aprendo così nuove frontiere alla sperimentazione clinica, permettendo il perfezionamento di nuovi approcci terapeutici nella cura c/o prevenzione di un numero elevatissimo di patologie consideralo il ruolo che il TNF. IL-1 e IL-6 svolgono nel F insorgenza c nella progressione di molteplici malattie. ;La Richiedente quindi descrìve e rivendica il nuovo uso di HAS per la preparazione di un medicamento : ;o per la prevenzione c/o il trattamento delle patologie associate al deficit delle difese immunitarie e, in modo particolare, al deficit di IL- 10. stimolando la sintesi di ci toc hi ne a nti -infiammatorie; ;o per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie associate all<'>aumcrito/attivazionc di IL-1 , 11 -2. IL-6, IL-7, 1L-8, IL— 12 e del TNF; o per la prevenzione e/o il trattamento dell<’>asma, dell' artrite reumatoide, e dell<">artrosi associate all<’>attivazione dell’lL-1 , 1L-6 e del TNF; ;o per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie associate al danneggiamento dell<'>endotelio dei vasi sanguinei; ;o per la prevenzione do il trattamento delle malattie della pelle eurne. ad esempio, la dermatite c il linfoma cutaneo; ;o per la prevenzione c/o il trattamento delle malattie a carattere autoimmune come Fartrite reumatoide, il morbo di Crohn (c lutto le infiammazioni intestinali croniche) la psoriasi e l<’>asma il diabete mellito, Γ ened aloni i elite, la Sclerosi Multipla, il Lupus erilematoso e per il trattamento del rigetto nei trapianti d'organo; ;o per la prevenzione c/o il trattamento di neoplasie come, ad esempio, la leucemia e il linfoma di Hodgkin; ;o per la prevenzione e/o il trattamento dell<'>astrogli osi. Γ astrae itosi e la demielinizzazione delle fibre neuronali; ;n per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie associate airallivazione degli osteoelasti; ;o per la prevenzione e/o il trattamento di patologie vascolari di tipo arterio/atcrosc Ieratiche, la trombosi venosa e le vasculiti, associate all<'>attivazione del l<’>NF. di IL- 1 e 1L-6; ;o per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie febbrili. ;La Richiedente ha inoltre dimostrato, nelle sperimentazioni di seguilo riportate, la potente azione antivirale dcll<'>HAS vs differenti tipi di virus: ;• i risultati ottenuti dimostrano l’efficacia dell<'>HAS (<">sia di grado 1 che di grado 3) nel F inibire la replicazione virale del virus HIV 1 e 2. La sperimentazione ha inoltre dimostrato che non tutti gli acidi ial uranici solfatali noti allo stalo del l’arte agiscono efficacemente vs la replicazione virale, poiché solo l<'>HAS in cui la so 11 stazione à ̈ avvenuta relativamente ai soli gruppi idros silici si dimostra attivo, mentre ΠΙΛ-NS non risulta efficace nel bloccare la citopatogcnicilà virale. ;• 1 dati sperimentali confermano Fazione antivirale sia di HAS1 che HAS3 vs F Herpes Simplex virus- 1 c 2 e vs il virus della stomatite vescicolare (VSV). La prima forma, notevolmente diffusa, à ̈ responsabile della comparsa dì vescicole febbrili caratteristiche che di nonna interessano la cute facciale (labbra, narici); à ̈ dello anche herpes simplex labiale. L'iniezione provocata dalfhcrpcs labiale può ricomparire con facilità poiché il virus sopravvive all'interno delle cellule c non viene eliminato neppure con l'impiego di farmaci efficaci. La seconda forma à ̈ un'infezione genitale, nota anch h ìl li L t b i contraggono col contatto tisico e sessuale. Data la collocazione dei vinoni nei gangli nervosi, dove possono rimanere quiescenti per molto tempo,<[>'infezione erpetica ha caratteristiche recidivanti in corrispondenza di eventi stressanti del sistema immunitario e solitamente ricompare nella sede primaria. 11 virus della stomatite vescicolare e un ΚΠΛ-virus, colpisce i mammiferi (in maggioranza animali) e viene usato in laboratorio per studiare lo sviluppo del cielo di vita degli RNA-virus. Il confronto tra 1IA-NS1 e HAS1 dimostra ancora una volta come non tutti gli acidi i al uranici solfatati siano equivalenti, poiché ΓΗΑ-NSI non si à ̈ rivelato attivo in alcun caso, mentre l’HAS sia 1 che 3 dimostra una potentissima allività antivirale sia vs l’Herpes Simplex che vs il VSV. Tulli i campioni testati non risultano citotossici verso la cellula ospite, infatti, la minima concentrazione citotossica ottenuta à ̈ uguale a quella dei farmaci dì riferimento normalmente usati nella pratica clinica per la cura dell<'>Herpes, ed à ̈ risultata essere mediamente 100 volte supcriore a quella dimostratasi attiva ncirinibizionc della replicazione virale. ;• I dati sperimentali ottenuti sia per 1IAS1 che H AS3 hanno evidenziato un chiaro c significativo risultato antivirale vs il (ivtomcgalo virus: à ̈ un particolare tipo di virus che entra in alcuni tipi di cellule del nostro organismo dentro le quali si replica in modo parassitario determinandone la morte. Appartiene alla stessa famiglia dell'herpes labiale e genitale, della varicella e della mononucleosi infettiva. Sono sede di iniezione primaria multipla le cellule epiteliali, le mucose, i linfonodi. Permane in forma latente per tutta la vita nel sangue periferico, nell'epitelio dei tubuli renali e nell'epitelio delle ghiandole salivari. Si riscontrano forme gravi negli irnrnunocompromcssi (come gli affetti da AIDS c i soggetti trapiantali in terapia immunosopprcssiva) con co in volgi menni di vari organi: polmoniti, epatiti, coliti, esofagiti, nefriti. La terapia di cura consiste nella somministrazione di farmaci quali ganciclovir. valganciclovir c foscarneL (inibitori della sintesi di DNA virale). Anche in questo caso ΓΠΑ-NSl non si c rivelato attivo nell<'>inibizione della proliferazione del virus confermando Γ assoluta diversità, come capacità antivirale, tra i due tipi di solfatalo. ;La Richiedente quindi descrive e rivendica il nuovo uso di HAS per la preparazione di un medicamento ; ;• per la prevenzione e/o il trattamento dell<'>HIV; ;• per la prevenzione e/o il trattamento deirherpes simplex labiale c dell’herpes geni tal is, ;• per la prevenzione e/Ï… il trattamento del virus della stomatite vescieolarc: • per la prevenzione e/o il trattamento del Cytnm e gaio virus. ;Infine, la Richiedente descrive la preparazione di diverse<(>orni illazioni. /composi zio ni farmaceutiche contenerli i l<'>HAS come unico principio attivo, oppure in associazione con altri agenti farmacologicamente e/o biologicamente attivi quali, ad esempio, steroidi, ormoni, proteine, fattori trofici, vitamine, làrinaci antinfiammatori non steroidei (1<;>ANS), chemioterapici, calcio-antagonisti, antibiotici. antivirali, anticoagulanti c o librino! itici, anestetici locali, enzimi come, ad esempio, la collagcnasi e/o la ialuronidasi e/o altre proteasi; può essere formulato con polimeri come l’acido ial uranico c i suoi derivati, la carbossimctilccllulosa e/o altri polimeri di origine naturale (come il collagene) o sintetica. ;La composizione farmaceutica in oggetto può essere somministrato in modo sistemico (per via endovenosa o arteriosa, intramuscolare, intrapcritoneale. sottocutanea oppure orale), può essere utilizzata per una applicazione topica per un assorbimento dermico e/o transdermico, essere somministrata mediante inalazionc/aerosol (soprattutto per il trattamento delle patologie asmatiche), per via intra-articolare oppure essere somministrato direttamente nel silo da trattare per iniezione diretta. ;La composizione farmaceutica in oggetto può essere formulata come unguento, (ipogei, idrogcl. lipstiek. crema, ovulo e candelette vaginali, schiuma, gel niucosalc, preparazioni oftalmiche, lavande vaginali, co 11 littorio, patch per un assorbimento dermico e/o iransdennico. soprattutto di HANS ed ormoni, soluzione per uso inalatorio. ;Λ scopo puramente descrittivo c non limitativo vengono riportati alcuni esempi di preparazione di HAS di grado 1 e 3. di i<'>o rmul azioni farmaceutiche che lo contengono, assieme ai risultali ottenuti dalla sperimentazione in vitro. ;Esempio 1 ;Preparazione del sale di tetrabutilammonio dell’acido ialuronico (HA) di peso molecolare medio pari a 200KD (compreso tra 150.000 e i 250.000 Da) ;5.00 g di acido ialuronico di origine fermentativa sale sodico (200 KD) sono disciolti in 250 mi di acqua e la soluzione risultante à ̈ fatta percolare attraverso una colonna di vetro preriempita con 100 cm’ di resina Dowex in l<'>orma di tetrabutilammonio (TBA). La soluzione di HA sale di TUA eluita viene raccolta e liolilizzata. Si ottengono 7.50 g di prodotto. ;Esempio 2 ;Sintesi di I IA sol fatato a partire da HA di peso molecolare medio di 200K.D e grado di solfalazionc pari a 3 gruppi solfato per unità ripetitiva. ;Metodo A ;10.0 g del sale TBA di acido ialuronico di peso molecolare medio 200K.D preparati secondo Esempio L vengono sol ubi li zzati in 300rnl di dimetilsollossido (l )MSO); 26. Og del complesso SOq-piridina (triossido di zolfo e piridina, di seguito abbreviato come PySOO vengono dispersi in 150 mi di DMSO, quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 21°C la reazione viene interrotta addizionando 0.1 volumi di acqua; il grezzo di reazione si isola per precipitazione dopo aggiunta di 2 volumi di etanolo. Il solido ottenuto viene disperso in 150 mi di acqua, ed il pH portato a neutralità con NaOH 1 M. Si dializza esausti v amento contro acqua attraverso membrana con cutoff 12- 14000 Da. Il dializzato viene sottoposto a liofilizzazione. Si ottengono 9.7g di prodotto con grado di sol lutazione pari a 3 gruppi solfalo per unità ripetitiva (resa=88%). ;Metodo B ;32.0 g del sale di TBA di acido ialuronico di peso molecolare medio 200KT) preparalo secondo Esempio 1. vengono solubilizzati in 900ml di N-Melil-Pirrolidonc (NMP); l OOg di PySCh sono dispersi in 600 mi di NMP, quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 2.0 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 21 i /- 1<n>C la reazione viene interrotta addizionando 0.5 volumi di acqua. 11 pii. inizialmente inferiore a 2.5. viene portato a neutralità per aggiunta di una mole di NaOII (in soluzione). 11 grezzo di reazione e isoiato per precipitazione tramite aggiunta di 2.5 volumi di metanolo e lavato con 2 volumi di miscela mctanolo/acqua 8/2. 11 solido à ̈ ridissolto e dializzato esauslivamcnte contro acqua utilizzando membrana con cuioff 12-14000 Da. Si ottengono 30.4 g di prodotto con grado di solfatazionc pari a 3 gruppi solfato per unità ripetitiva (rcsa<~>'86%). ;Esempio 3 ;Sintesi di HA solfatato a partire da HA di peso molecolare medio 200KD e «rado di solfatazionc pari a 1 crup no so 1 fato per unità ripetitiva. ;Utilizzando la procedura illustrata nell<'>esempio 1 si preparano 10.0 g del sale di TBA di HA, che vengono disciolti in 350ml di DMSO. 10. Og del complesso PySOj vengono dispersi in 100 mi di DMSO, quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 21 °C la reazione viene interrotta addizionando 0.1 volumi di acqua: il grezzo di reazione si isola per precipitazione dopo aggiunta di 2.5 volumi di etanolo. Il solido ottenuto viene disperso in 150 mi di acqua ed il pii portato a neutralità con NaOH 1 moli/l. Si dializza esaustivamenlc contro acqua attraverso membrana con cuioff 12-14000 Da. 11 dializzato viene sottoposto a liofilizzazione. Si ottengono 7.54g di prodotto con grado di solfatazionc pari a 1.0 gruppo solfato per unità ripetitiva (rcsa<rT>93%). ;Esempio 4 ;Sintesi di HA sol fatato a partire da HA a basso peso molecolare (PM medio di 10K.D. compreso tra 10.000 e 50.000 D) e urado di so datazione pari a 3 eruppi solfalo per unità ripetitiva. ;Utilizzando la procedura illustrala nell<'>esempio 1. si preparano 12.4 g del sale di TBA di acido ialuronico a basso peso molecolare che vengono solubilizzati in 300ml di NMP: 40g di PySO; sono dispersi in 100 mi di NMP quindi aggiunti alla soluzione di HA. I )opo 20 ore sono agitazioni; meccanica alla temperatura di 21 °C. la reazione viene interrotta addizionando 0.5 volumi di acqua. Π pii, inizialmente inferiore a 2.5, viene portalo a neutralità per aggiunta di una mole NaOH 4M. Il grezzo di reazione à ̈ isolato per precipitazione tramite aggiunta di 2.5 volumi di metanolo e lavato con 2 volumi di miscela rnctanolo/acqua 8/2. 11 solido à ̈ ridissolto e dializzato esaustivamenle contro acqua utilizzando membrana con cutoff ì 500 Da. Si ottengono 12.0 g di prodotto con grado di solfatazionc pari a 3.0 gruppi solfato per unità ripetitiva (resa<~>85%). ;Esempio 5 ;Sintesi di HA sol fatato a partire da HA di basso peso molecolare medio e grado d[ so Mutazione pari a 1 gruppo solfato per unità ripetitiva. ;Utilizzando la procedura illustrata nell<'>esempio 1 si preparano 12.4 g del sale di TBA di HA che vengono discuoili in 300ml di DMSO. 16.0g di PySO;, vengono dispersi in 100 mi di DMSO quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 21<G>C la reazione viene interrotta addizionando 0.1 volumi di acqua; il grezzo di reazione si isola per precipitazione dopo aggiunta di 2.5 volumi di etanolo. Il solido ottenuto viene disperso in 150 mi di acqua, ed il pH portalo a neutralità con NaOH 1 moli/l. Si di al izza esaustivamenle contro acqua attraverso membrana con cutoff 3500 Da. Il dializzaLo viene sottoposto a liofilizzazione. Si ottengono 9.04g di prodotto con grado di solfata/ione pari a 1.0 gruppo solfato per unità ripetitiva (resa<->90%). ;Esempio 6 ;Sintesi di HA solfatato a partire da HA di peso molecolare compreso tra 500-730K.D e grado di solfatazione pari a 3 gruppi solfato per unità ripetitiva. ;2 l .0g g di acido ialuronico di origine estrattiva sale sodico (500-730 KD) sono disciolti in 1.5 1 di acqua e la soluzione risultante à ̈ fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 450 cm<1>di resina Dowex in forma di i HA. fa soluzione di HA sale dì TRA eluila, viene raccolta e Ho li lizzata. Si ottengono 32.0 g di prodotto che vengono solubilizzati in 1.35 1 di NMP; lOOg di PySO,* sono dispersi in 650 mi di NMP e quindi aggiunti alla soluzione di HA. :o agitazione meccanica a temperai ura di 23 i /- 1 °C. la reazione viene interrotta addizionando 0.5 volumi di acqua. 11 pii. inizialmente interiore a 2.5, viene porlalo a neutrali là per aggiunta di NaOII (in soluzione a concentrazione 4 moli/l). 11 grezzo di reazione à ̈ isolato per precipitazione tramite aggiunta di 2.5 volumi di metanolo e lavato con 3.5 volumi di miscela metanolo/acqua 8/2. Il solido à ̈ ridissolto e dializzalo csaustivamente contro acqua utilizzando membrana con cut off 12-14000 Da. Si ottengono 30.3 g di prodollo con grado di so datazione pari a 3 gruppi solfato per unità ripetitiva (resa=83%).

Esempio 7

Sintesi di HA sollàtato a partire da HA di peso molecolare 500-730K1<)>e grado di solfa! azione pari a 1 gruppo solfalo per unità ripetitiva.

21.0g g di acido ialuronico di origine estrattiva sale sodico (500-730 KD) sono disciolti in 1.5 1 di acqua e la soluzione risultante à ̈ falla percolare attraverso una colonna di vetro prc-riempita con 450 cm<1>di resina Dowex in forma diTBA. La soluzione di HA sale di TUA, cluita viene raccolta e liofilizzata. Si ottengono 32.0 g di prodotto che vengono solubilizzali in 1.05 1 di NMP; 40g di PySO;; sono dispersi in 350 mi di NMP quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a leni pera tura di 25 /- 1 °C. la reazione viene interrotta addizionando 0.5 volumi di acqua. Il pi i, inizialmente inferiore a 2.5, viene portato a neutralità per aggiunta di NaOI I (in soluzione a concentrazione 4moli/l). 11 grezzo di reazione à ̈ isolalo per precipitazione tramite aggiunta di 3.5 volumi di metanolo e lavato con 3.5 volumi di miscela melanolo/acqua 8/2. 11 solido à ̈ ridissolto e dializzalo csaustivamente contro acqua utilizzando membrana con cuioff 4 2-14000 Da. Si ottengono 22.5 g di prodotto con grado di solfatazione pari a 1 .0 gruppo solfato per unità ripetitiva (rcsa<~>87%).

Esempio 8

Valutazione dcireffetto regolatone di HAS di grado 1 e grado 3 sulPcspressione genica di H.-10 c 1L-12 in sinoviociti umani

Sinoviociti umani precedentemente espansi in vitro e mantenuti in coltura a 37°C con terreno DMLM contenente il 10% di PCS, sono stati seminati ad una concentrazione di 20.000 cellule per pozzetto. Al medium di coltura à ̈ stato quindi aggiunto ΓΗΑ solfatalo di grado 1 (HAS1 ) e di grado 3 (1IAS3) preparati come descritto in Lscmpi 1 -3. alle concentrazioni di Od c 0,5 mg/inl (per entrambi i campioni), mentre il trattamento di controllo à ̈ rappresentato da HA non sol fatato con peso molecolare (PM) medio di 200KD. Dopo 3 giorni di trattamento, c stala eseguita la PCR Rea l<'>lime per valutare l<'>espressione genica di II.- 10 e IL- 12: l<'>RNA cellulare à ̈ stato estratto utilizzando il metodo “Trizol<'>’, seguendo le indicazioni del fornitore (TRIZOL rcagenl. LTFK Tecbonologies. GIBCO RRL). Brevemente, le cellule sono state lisate mediante raggiunta di 1 .0 mi di Trizol e si à ̈ proceduto a quantificare l'RNA totale misurandone Fassorbanza a 260nm. Per ogni gene da amplificare sono stati scelti gli opportuni prìmer utilizzando il software Primcr3 (Roche Molecular Diagnostics. Plcasanton. CA. USA). L<'>espressione genica à ̈ stata valutata mediante la PCR Rea/ Time condotta con Rotor-gene TM5500 (Corbett rescarch. Sydeny. Australia). Le reazioni di PCR sono stale condotte utilizzando primer a 300nm e SYBR Green (lnvitroge. Carlsbad, CA. USA) a 40 cicli di 15 s a 95°C. c 1 min a 60°C. Il valore di "hluorescence thresholds (Ct)<">à ̈ slato determinalo automaticamente dal software valutando un coefficiente di amplificazione per ι geni studiali tra il 92 e 1 10%. Per ogni campione di cDNA il valore di espressione genica e stato espresso in termini di rapporto tra il ct del gene house keeping (cioà ̈ il gene per la proteina beta actina che rappresenta il gene di controllo poiché presente in ogni cellula c non assoggettato alLinfluenza di IIAS) e il et del gene di interesse (cioà ̈ il gene per IL- 10 e IL- 12). quindi nell’asse delle ordinate viene riportato il valore di ct house keepine/ct gene, che conscguentemente indica la quantità di mRNA espresso dal gene che si sta studiando. 1 risultati ottenuti sono espressi in Figura 1 e 2:

Fig. 1 : il trattamento dei sinoviociti umani con H AS 1 e I IAS3 ha determinato l<'>aumento significativo dell<'>espressione genica della citochìna IL- 10 vs il controllo trattato con HA non solfatato.

Anche in questo esperimento, entrambi i gradi di solfaLazione (grado 1 e grado 3) dclLHAS si sono dimostrati capaci di diminuire in modo altamente significativo ['espressione genica di IL- 12 dimezzando la simesi del suo mKNA vs il co litro Ilo trattato con ΗΛ non solfatato. Quindi, l<'>acido ialuronieo sol fatato si à ̈ dimostrato:

• capace di stimolare la produzione di nuovo mRNA per la sintesi di eitochine anti-iniiainmatorie, aumentando così la capacità di difesa della cellula e, quindi, di tutto l<'>organismo, vs quelle patologie precedentemente descritte in cui LIL-I O à ̈ risultata essere di fondamentale importanza per la risoluzione e/o il miglioramento di malattie come Tastila. Γ artrite rcumaloidc, l<'>artrosi e tulle quelle infiammazioni in cui IL— 10 risulta coinvolta.

• efficace nel diminuire la sintesi di nuovo mKNA della citochina li.- 12 altamente pro-inliammatoria, dimostrandosi valido agente anti-infiammatorio capace di intervenire sull<'>espressione di proteine coinvolte nella patogenesi di malattie invalidanti come la psoriasi, Lartrile c tutte quelle precedentemente descritte.

Esempio 9

Inibizione del hindi ne del TNF al suo recettore espresso in lince monocitarie: valutazione dell<’>efficacia di HAS di grado 1 e grado 3 a diversi PM

Questi esperimenti sono stati effettuati per valutare Lefficacia dei campioni testati (preparati secondo Iisempi 1 -4) sulla capacità d’inibire il binding del TNF al suo recettore espresso da cellule del S.l. normalmente utilizzate in vino per questo tipo d<'>esperimenti, eseguiti con componenti citochinici iodinati per una valutazione in Rcuiioligand li indi ng ussays.

La procedura sperimcnLalc à ̈ stata eseguita come descritto in Daglioni C. et al., .1 Biol Chem. 1985. 260: 13395- 13397.

Brevemente, à ̈ stata utilizzata la linea di isti oc iti umani di linlorna LI 937. con caratteristiche dì monociti sensibili alLattività citotossica del TNF in quanto esprimenti il relativo suo recettore. Le cellule sono stale inizialmente incubate con di †̃"Ί-TNF 0,028nM (veicolato in acqua) contemporaneamente con i campioni da analizzare (alla concentrazione di 1 mg/ml che si à ̈ dimostrala essere la più bassa concentrazione che determina la massima inibizione), in tampone di incubazione<(>ormato da 50 mM Ί<'>ris-i le L pH 7,4. 0,5 mM LDTA, a 4°C per 3 ore,.

Al termine del P incubazione le cellule sono state centri lunate con di bLiti I ftalato/dinoni 1 i<'>talto 2/i e il pellet ottenuto à ̈ stato contato in un γ-coiuner.

1 risultati ottenuti sono espressi in Figura 3;.

i risultati ottenuti dimostrano Pefficaeia dell’HAS nell<'>inibire al 100% il binding del ΤΠΓ al suo recettore, sia per il grado 1 che per il grado 3. a medio c basso PM. Questi risultati sono di fondamentale importanza poiché provano che il comportamento del sol fatato c del Lutto simile a quello di un anticorpo monoclonale specifico per il recettore del I NF. capace quindi di bloccarne la funzione. Questo blocco rccetlorialc rappresenta quindi il modo più efficace per antagonizzarc gli effetti pro-infìammatori e tumorali del fattore TNF.

Esempio 10

Inibizione del bindimi della citochina IL-l al suo recettore espresso in lince fibrohlastichc: valutazione delPcfilcacia di HAS di urado 3 a diversi PM

Questi esperimenti sono stati effettuati per valutare l<'>efficacia dei campioni Leslati (preparati secondo Esempi 1-3 e 4) sulla capacità d<'>inibire il binding di 11,-1 al suo recettore espresso da cellule 313 di topo, normalmente utilizzale in vitro per questo tipo d<'>esperimenti, eseguili con componenti citochinìci iodinati per una valutazione in Radioligund Binding assays.

La procedura sperimentale à ̈ stata eseguila come descritto in Chin .1 et al., J Hxp Med.

1987, 165:70-86.

Brevemente, à ̈ stala utilizzata la linea di fìbroblasti murini 3 13 sensibili alPattività citotossica di 11,- 1 in quanto esprimenti il relativo suo recettore. Le cellule sono state inizialmente incubate con di '<^>l-IL-l 10 pM (veicolato in acqua) contemporaneamente con i campioni da analizzare (alla concentrazione di I mg/ml che si à ̈ dimostrata essere la più bassa concentrazione che determina la massima inibizione), in tampone di incubazione formato da RPM1 1640 contenente 20 mM T1F1PES pi i 7,2 c 1% BSA, a 37°C per 2 ore. Al termine dell<'>incubazione le cellule sono state lavale con lampone fosfato, quindi sol ubili zzate in 2,5 M NaOII e contate in un γ-counlcr.

1 risultali ottenuti sono espressi in Figura 4:

i risultati ottenuti dimostrano Γ efficacia delFUAS (sia a medio che basso PM) nelFinibirc per il 30% il bimJing dì IL-1 al suo recettore. Questi risultali sono estremamente signilicativi poiché provano che il comportamento del solfalato à ̈ del tutto simile a quello di un anticorpo monoclonale specifico per il recettore della citochina in oggetto,capace quindi di bloccarne la funzione e questo blocco recettorialc rappresenta il modo più efficace per antagonizzare gli effetti pro-intì animatori e tumorali di IL- 1 . come precedentemente descritto.

Kscmpio 11

Inibizione del bindimi della citochina 1L-6 al suo recettore espresso in cellule di mieloma umano: valutazione dcircfficacia di 1IAS di grado 3 a diversi PM

Questi esperimenti sono stati effettuati per valutare Γ efficacia dei campioni testati (preparati secondo Esempi 1-3 e 4) sulla capacità d<'>inibire il hindi ng di 11,-6 al suo recettore espresso in mieloma umano U266, normalmente utilizzate in vitro per questo tipo d<'>esperimenti, eseguiti con componenti citochinici iodinati per una valutazione in Radioligand Bm<'>ding assays.

5. a procedura sperimentale à ̈ stata eseguila come descritto in Tuga T. et al., J Exp Med, 1987, 166:967-981.

Brevemente, à ̈ stala utilizzata la linea di mieloma umano U266 sensibili all<'>attività citotossica di 11,-6 in quanto esprimenti il relativo suo recettore. Le cellule sono state inizialmente incubate con di<1 '>I-II.-l 0.0 8 n VI (veicolato in acqua) contemporaneamente con i campioni da analizzare (alla concentrazione di lmg/ml che si à ̈ dimostrata essere la più bassa concentrazione che determina la massima inibizione), in lampone di incubazione formato da RPMI 1640 contenente 25 mM 11F.PES pH 7,1 e 10% BSA, a 4°C per 16 ore. Al termine dell<'>incubazione le cellule sono stale lavate con tampone fosfato, centrifugate a 9.000 rprn ed il pellet, contato in un γ-countcr.

I risultati ottenuti sono espressi in Figura 5:

i risultati ottenuti dimostrano l'efficacia dell’ HAS. sia a medio che basso PM. nell' inibire fino a! 100% il binding di IL-6 al suo recettore. Questi risultali quindi provano che il comportamento del sol fatato, anche in questo caso, à ̈ del tutto simile a quello di un anticorpo monoclonale specifico per il recettore della citochina in oggetto, capace di bloccarne la funzione, e questo blocco recettoriale rappresenta il modo più efficace per bloccare gli effetti prò -in fiammato ri di IT, -6.

Esempio 12

Valutazione dell<'>effetto inibitorio di HAS di arado 1 e prado 3 sulla sintesi proteica delle citochine IL-2, IL-7, II·- 10 e IL- 12 in PBMC umani

Per queste sperimentazioni sono state utilizzale cellule mononucleatc di sangue periferico umano (PBMC) derivanti da diversi donatori per valutare l'effetto di HAS sulla produzione delle citochine sopra elencate, utilizzando:

HA non solfatalo (PM medio: 200KD).

1 IAS1 e HAS3 preparati come descritto in Esempi 1 -3 (PM medio : 200KD). La separazione dei PBMC (Boyum A.. Se and J (din Lab Invest 2! Suppl. 1968, 97:77-89) à ̈ stata effettuata utilizzando il prodotto Ficoll-Paquc PLUS (GL Healthcare) e seguendo il protocollo indicato da! fornitore. Al giorno zero sono state piastrate 100.000 cellule per pozzetto (utilizzando piastre da 96 pozzetti) in 200 Î1⁄4Î di terreno RPMI 1640 addizionalo di 10% di siero fetale bovino. I1LPES lOmM. Glutammina 2mM, 1% Penicillina-Streptomicina 100 U/ml. L'elTclto di tutti i campioni à ̈ stato valutato su PBMC non trattati con agenti che stimolano la sintesi di citochine, oppure stimolati con Lipopolisaccardidc LPS ( 10 gg/ml) (altamente pro-inliammatorio) o con Phyloemoagglutinina PILA (10 pg/ml) (sostanza capace di stimolare i linfociti a dividersi), entrambi agenti capaci di stimolare la sintesi di citochine. Le cellule sono state trattale separatamente con i tre composti alla concentrazione di 0.1 mg/ml o 1 mg/ml. Dopo 24 ore di incubazione a 37°C (5% CO?), da ciascun pozzetto sono siati prelevati 100 Î1⁄4Î di surnatante allo scopo di analizzare la produzione II, -2. 1I.-7. IL.- 10 e IL- 12,

La quantificazione dei mediatori de D'infiammazione à ̈ stata effettuata mediante tecnologia Se.archLighr , utilizzando una piastra Custnm Human 9 -Pi ex Array seguendo il protocollo indicato dal fornitore nella scheda tecnica.

1 risultati ottenuti sono espressi in Figura 6- 9:

questi grafici evidenziano chiaramente come l’HAS sia di grado 1 che di grado 3 siano in grado di diminuire in modo significativo la sintesi di 11,-2, IL-7 e IL- 12 da parte dei monociti. sia quando le cellule non sono stimolante che quando, al contrario, vengono sollecitati da specifici e potenti fattori infiammatori c/o mitogeni. L<'>IIAS quindi si dimostra molecola con precise caratteristiche farmacologiche, capace di modulare/regolare la sintesi di c Lochine con spiccata attività anli-infi animatori a, sia in quelle situazioni in cui non viene sollecitata una risposta immunitaria, che in quei particolari eventi di stress infiammatorio in cui la cellula immunitaria risponde producendo una cascata citochinica e, soprattutto in questo caso, i dati presentati evidenziano il maggior effetto modulatorio dcll<'>HAS.

Figura 9 conferma invece il chiaro stimolo alla produzione di IL-10 anche per cellule come i monociti umani (oltreché per i sinoviociti) appartenenti al Sistema Immunitario. Viene quindi nuovamente confermato come Fl IAS sia in grado di modulare la sintesi delle citochine stimolando quelle anti-infiammatorie e inibendo la sintesi di quelle proinfiammaloric.

Esempio Ì3

Valutazione deli<b>azione antivirale di HAS di grado 1 e grado 3 vs ΙΙΛ-NS :

HIV-1 ( Miri c HlV-2 (RODI virus

L<’>attività dei campioni testati à ̈ stata determinata valutando Linibizionc della citopatogenicilà determinata dal virus H1V-1 (ottenuto da linfociti T infettati dal virus di tipo Uhi) c dal virus I1IV-2 (ottenuto da linfociti T iniettati dal virus di tipo 1101) ) in cellule MT-4. La procedura sperimentale à ̈ stata eseguita come descritto in Fiaba M. et al.. ANTIMK 'ROB. AGENTS CHKMOTHER.. 1988, 32:1742-1745.

Brevemente, per questo saggio sono stale utilizzati linfociti umani T denominati MT-4 infettati dal virus I 1IV- 1 di strabi IH» c H lV-2 di strain ΚΟΌ. Per questo test sono stale utilizzale diverse concentrazioni dei campioni testati utilizzando come controllo positivo il dextrano-solfato. polisaccaride noto per la sua capacità d<'>inibizione di differenti tipi di virus. 1 campioni testati sono stali :

1. HS-NS1 : acido ialuronico solfatato preparato per solfatazione della glucosainmina previa de-acctilazione. di grado 1 (FP0971961 ), per confrontarlo con

2. I IAS 1 : acido ialuronico solfatato solo nei suoi gruppi idrossilici, di grado 1 . e 3. 14AS3 : acido ialuronico sol fatato solo nei suoi gruppi idrossilici, di grado 3 preparati come da Esempi 1-3 (tutti i campioni con PM medio: 200K.D).

I.<'>attivila antivirale dei campioni testati à ̈ espressa come la minima concentrazione richiesta per inibire per il 50% la eitopatogenicità del virus: JC50. Le cellule sono stale trattate con varie concentrazioni dei suddetti campioni aggiunti immediatamente dopo Linfezione con dosi infettive di HIV. Dopo 5 giorni a 37°C, il numero di cellule vitali viene determinato con il test MTT : sale di Letrazolio sottoposto a reazione di ossidoriduzione solo dagli enzimi mitocondriali di cellule vitali. Le cellule iniettate e non trattale perdono la progressiva capacità di trasformare il sale di tretrazolio in fbrmazano. quindi, se queste cellule mantengono intatta questa capacità dopo infezione e trattamento, significa che questo trattamento Ha inibito l<'>azione virale bloccando così la patogenicità del virus. (De/inot F. et al.. J Immunol Mcthods, 1986, 22(89): 271 -277) 1 risultali ottenuti sono espressi in Figura 10:

i risultati ottenuti dimostrano Eeftìcaeia dclFHAS (sia di grado 1 che di grado 3) nelFinibirc in modo del lutto comparabile al controllo positivo (rappresentato da! polisaccaride destrano-solfato) la replicazione virale del virus J 11 V 1 e 2. La sperimentazione ha inoltre dimostralo che non tutti gli acidi ialuronici solfatati noti allo stato dell<'>arte agiscono efficacemente vs la replicazione del virus studiato, poiché la Richiedente ha provato che solo F11AS la cui sol fa razione à ̈ avvenuta relativamente ai suoi gruppi idrossilici si dimostra attivo nella sua potente azione antivirale in quanto ΓΠΛ-NS non risulta efficace nel bloccare la eitopatogenicità virale.

Herpes Simplex virus- 1 . Herpes Simplex virus-2, Vesicular stomatiti s virus

1/ alti vita dei campioni testati e stata determinata valutando Γ inibizione della citopatogenicità determinata dal virus delFHerpes Simplex Virus- 1. ( 11 S V - 1 : KOS. F e Mclntyre si r ain) e dal virus del Γ Herpes Simplex Virus- 2, (HSV-2: G, 196 e Lyons strain) in cellule fibroblastiche E6SM che derivano da tessuto museolare'cute embrionale. Inoltre. Γ attività anti -virale à ̈ stata testata sempre vs cellule l<'>v.SM infettate dal virus della stomatite vescicolare {Vcsicular stornatiti s virus: VSV). I/HSV-1 à ̈ il virus che preferenzialmente infetta la mucosa orale, mentre l<'>HSV-2 attacca le mucose genitali. La procedura sperimentale à ̈ stata eseguita come descritto in Baba M. et al.. ANTIM TCROB. AGENTS CHEMOT1 1ER... 1988, 32:1742-1745.

in breve, colture cellulari conducati sono state esposte a dosi infettive dei virus sopra elencati in presenza dei campioni IIS-NS 1 (EP0971961 ). IIASl c HAS3 preparati come descritto in Esempio 1 e 2 (Lutti i campioni con PM medio: 200KD). Dopo un periodo di incubazione di I h a 37<U>C, il terreno di coltura à ̈ stato sostituito con terreno fresco contenente solamente i campioni da testare. La citopatogenicità dei virus à ̈ stata testata al 2° giorno di incubazione. La misurazione dell<'>inibizione della citopatogenicità virale à ̈ stala valutala determinando l<'>inibizione della sintesi di DNA c RNA nelle cellule “infettate" e sottoposte a trattamento come sopra scritto: le cellule sono state seminate in micro pozzetti in terreno di coltura contenente diverse concentrazioni dei campioni da testare con 2,5Î1⁄4(Îœ di 311-limidina e 3H-uridina per mi. Dopo 16h a 37<G>C, le cellule sono state trattale con acido Tri-cloroacelico, lavate in etanolo, lasciate asciugare c contate in 7.5 mi di liquido per scintillazione. 1/ attività antivirale dei campioni testali à ̈ espressa come la minima concentrazione richiesta per inibire per il 50% la citopatogenicità del virus: IC50. Inoltre, per valutare anche la citotossicilà dei campioni testati, sono state determinate le minime concentrazioni necessarie per causare uri danno morfologico (osservabile al microscopio ottico) alle cellule utilizzate. 11 confronto à ̈ stato effettuato vs il dcstrano-solfato e il farmaco Acyclovir. (entrambi molecole con nota efficacia antivirale, utilizzate quindi come controllo positivo).

I risultali ottenuti sono espressi in Fi aura 1 1 :

i dati sperimentali confermano quanto visto per l<'>HIV, cioà ̈ la polente azione antivirale sia di I IAS1 che 11 Λ S 3 : il confronto tra IIA-NS1 e HAS1 dimostra come non tutti gli acidi ialuronici solfatati siano equivalenti poiché PIIA-NS1 non si à ̈ rivelato attivo, c questa diversità d'efficacia non dipende dal peso molecolare né dal grado di solfatazione delfacido ialuronico, quindi, risiede nella struttura stessa di HA-NS 1 vs 11AS 1. cioà ̈ sulla solfatazione. Infatti, l'IIAS dimostra un’efficacia pari a quella del destrano-solfato c comparabile a quella dell’acyclovjr, farmaco di riferimento per la cura dell<'>Herpes Simplex. Inoltre, à ̈ da sottolineare come facyclovir sia inattivo vs l’VSV, mentre f flAS sia 1 che 3 dimostra una potentissima attività antivirale vs il vsv.

Tutti i campioni testati non risultano citotossici verso la cellula ospite, infatti, la minima concentrazione citotossica ottenuta à ̈ uguale a quella dei farmaci di riferimento normalmente usali nella pratica clinica per la cura dcll’l lerpes. cd à ̈ risultata essere mediamente 100 volte superiore a quella dimostratasi attiva nell’inibizione della replicazione virale.

Cvtomcualovirus

L<'>attività dei campioni testati à ̈ stala determinata valutando l<'>inibizione della citopatogenicità determinata dal C yt o m ega I o v i r u.s (C<'>MV: AD- 169 c Davis slrain) utilizzando il protocollo precedente. L<’>attività anli-virale à ̈ stata testata vs HLL ceììs (cellule embrionali polmonari) ed c stata espressa come la concentrazione richiesta per inibire del 50% il numero di placche formale dal suddetto virus.

I risultali ottenuti sono espressi in Figura 12:

la tabella evidenzia il chiaro e significativo risultato positivo ottenuto sia per HAS1 che IIAS3 che li conferma nuovamente come efficaci agenti antivirali. Anche in questo caso F11A-NS 1 non si à ̈ rivelato attivo nell<'>inibizione della proliferazione del virus, confermando l<'>assoluta diversità tra i due tipi di solfatalo di grado 1 come capacità antivirale.

Esempio 14

Preparazione di una formulazione in Torma di soluzione per inalazioni contenente acido ia linoni co sol l<'>alalo di rivado 1

In un flacone in vetro da 50 mi vengono introdotti 40 mg (o 20 mg se PHAS ha PM di 500-73 OKD) di acido ialuronico solfatato di grado 1 di basso o medio PM, dopodiché vengono aggiunti 15 mi di PBS 0.2M a pii 7.4 sterile. T.a miscela viene sottoposta ad agitazione per circa 30 minuti, sino a completa dissoluzione della polvere. A solubilizzazione oLLenuta, vengono aggiunti 2 mi di glicole propilcnico e altra PBS 0.2M a pi 1 7.4 sterile sino al raggiungimento del volume totale di 20 mi. La soluzione viene mantenuta in agitazione per pochi minuti.

Esempio 15

Preparazione di una formulazione in forma di SOLUZIONE per inalazioni contenente acido ialuronico solfatato di grado 3

In un flacone in vetro da 50 mi vengono introdotti 100 mg di acido ialuronico solfatalo grado 3 ottenuto da HA 200 KD. dopodiché vengono aggiunti 15 mi di PBS 0.2M a pH 7.4 sterile. La miscela viene sottoposta ad agitazione per circa 30 minuti, sino a completa dissoluzione della polvere. A solubilizzazione ottenuta, vengono aggiunti 2 mi di glicole propilenico e altra PBS 0.2M a pi i 7.4 sterile sino al raggiungimento del volume totale di 20 mi. La soluzione viene mantenuta in agitazione per pochi minuti. Esempio 16

Preparazione di una formulaz ione in forma di SOLU Z I ΟΠΠ iniettabile per uso in trarli colare contenente acido ialuronico solfatato di urado 1

In un flacone in vetro da 50 mi vengono introdotti 500 mg di acido ialuronico sol fatato di grado 1 ottenuto da HA con PM di 500-730 K.D, e viene poi aggiunta PBS 0.2M a pH 7.4 sterile sino al raggiungimento del volume di 20 mi. La miscela viene sottoposta ad agitazione per circa 60 minuti, sino a completa dissoluzione della polvere.

Esempio 17

Preparazione di una formulazione in forma di GKL IDROFILO contenente HAS. HA e CMC

Si solubilizzano metil- c propi l-parabenc in acqua purificata a 80°C.Dopo raffreddamento della soluzione a temperatura ambiente, si introduce sotto agitazione sodio ialuronato lino a dissoluzione e quindi IIASl (o HAS3) mantenendo l’agitazione lino a completa dissoluzione. Si aggiunge quindi glicerolo, glicole propilenico sotto agitazione fino a completa dissoluzione. Si incorpora infine carbossimetìlcellulosa (CMC) sodica e si miscela lino ad ottenimento di soluzione geliiìcata.

Esempio 1S

Preparazione di una formulazione in l<'>orma di GEL IDROFILO ad uso muco sai e (senza conservanti) contenente HAS c HA

Si solubilizza sotto agitazione sodio ialuronato c quindi IIASl (o HAS3) in una quantità d<’>acqua circa il 90% del previsto in formula. Sì aggiunge glicole propilenico, Symdiol 68 e quindi MP L)iol Cilicol miscelando fino a completa dissoluzione dei vari componenti. Si introduce quindi il carbomer 974P mantenendo l<'>agitazione fino a dispersione omogenea di quest<’>ultimo. Si discioglie sodio idrossido perle nel resLanle 10% di acqua e si aggiunge tale soluzione a quella precedentemente ottenuta, ad ottenere la gelificazìonc della fase acquosa.

Esempio 19

Preparazione di una formulazione in forma di LIPSTTCK contenente IIAS e HA Si carica in apposito contenitore la quantità corretta di paraffina liquida indicata nella formula di fabbricazione.

Si scalda a 88 - 92°C. quindi si aggiungono sotto agitazione whitc soft paraffini, paraffin hard, whitc beeswax. ccrcsin. arlacel. mantenendo l<'>agitazione fimo a fusione completa dei vari componenti. Si incorpora quindi all-rac-a-locophcryl acctate, allantoina. butvlhydroxytoluene, propyljvhydroxybenzoatc e si miscela lino a completa solubilizzazionc. mantenendo la massa a 88 - 92°C.

Si carica separatamente in apposito contenitore la quantità di acqua purificala prevista in formula, si aggiunge sotto agitazione sodio ialuronato. I IASl (o HAS3) fino a completa dissoluzione, quindi Disodium F.delate mantenendo l<'>agitazione fimo solubilizzazionc.

Si trasferisce sotto agitazione la fase acquosa nel contenitore contenente la massa fusa, mantenendo il sistema a 88 - 92<C>C e l<'>agitazione fino a ottenimento di soluzione limpida. Si aggiungono quindi sotto agitazione i due aromatizzanti e si miscela per pochi mimiti, per 10’. Si cola la massa fusa negli stampi e si procedere immediatamente al raffreddamento a T < 0°C lino all<'>ottenimento di stick solidi.

Esempio 20

Preparazione di una formulazione in forma di OVLìLF VAGINALI contenente 11AS c HA

Si lascia rigonfiare la gelatina nel 7U% dell<’>acqua purificata a 85°C; si scioglie sodio ialuronato e HAS 1 (o IIAS3) nella restante quantità d<'>acqua e tale soluzione viene miscelata alla glicerina portata alla medesima temperatura. Si aggiunge la soluzione di glicerina alla soluzione rigonfiata di gelatina e si mantiene l<'>agiLazionc fino a completa dissoluzione della gelatina. Si cola la massa negli stampi c si procede al raffreddamento T < 0<C>C fino all’ottenimento di ovuli solidi.

Esempio 21

Preparazione di una formulazione in forma di CREMA IDROFILA contenente 11AS e HA

Si prepara la fase oleosa per fusione sotto agitazione a 50°C di paraffina liquida, acido stearico e Tefose 1500. Separatamente si prepara la fase acquosa mediante iniziale solubilizzazione a 80°C di mctil-parabene, successivo raffreddamento a temperatura ambiente c incorporazione di glicerolo, sodio ialuronato e quindi di 1 IAS1 (o 1 IAS3) sotto agitazione fino a completa dissoluzione dei vari componenti.

Si unisce la fase acquosa a quella oleosa e si procede all<'>cmulsionamento, quindi si raffredda [<'>emulsione O/A ottenuta sotto agitazione a temperatura ambiente.

Esempio 22

Preparazione di una formulazione in l<'>orma di UNGUENTO contenente HAS

Si prepara l<'>unguento base per fusione sotto agitazione a 70°C di paraffina liquida leggera e vaselina bianca. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente si incorpora sotto agitazione Γ HAS1 (o 11AS3) e si miscela fino ad ottenimento di sospensione omogenea.

Esempio 23

Preparazione di una formulazione in forma di CAPSULE (gelatina rigida) contenente I IAS

Si miscela 1 IAS 1 (HAS3) con calcio fosfato, magnesio stearato e silice per diluizione progressiva. Si procede al riempimento delle capsule.

Esempio 24

Preparazione di una formulazione in forma di COMPRESSE contenente HAS HAS 1 (o 1 IAS3) viene sottoposto a granulazione ad umido in letto fluido con una soluzione legante costituita da acqua e circa il 70% della quantità totale di CMC sodica. Il granulato ottenuto viene sottoposto a setacci atura su rete da 0.8mm.

Si miscelano i restanti ingredienti (calcio fosfato, cellulosa microeri stallina, CMC sodica e silice) e si setacciano su rete da 0.8mm.

Si miscela il granulato precedentemente ottenuto con la miscela preeosliluita dei restanti ingredienti (extragranuli), si miscela infine con magnesio stearato (precedentemente setacciato su rete da 0.8rnm) c si procede alla compressione.

Esempio 25

Preparazione di una formulazione in forma di SOLUZIONE INI ETTARI L-E contenente IIAS

Dopo preparazione (a temperatura ambiente) di soluzione fisiologica tamponata a pH 6.4 - 7.2. si solubilizza sotto agitazione lattosio e infine HASl o HAS3. Si filtra su 0.22 micron la soluzione cosi ottenuta.

GEL IDROFILO (Esempio 17)

Componenti Quantità (mg/lg di idrobi)

H/\S 1 (I ÃŒAS3) 40 mg ( 10 mg)

CMC 20 mg

I G I yccrol _ 100

I Pmpylene Glycol _ _ 66,75 mg

<1>Sodium I lyaluronatc 2 mg Melhyl p-h ydroxy benzoli le 2 mg Propyl p-hydruxyhenzoate 0,2 mgjPuri fi ed Water _ q.s loj g

GEL IDROFILO ad uso mucosalc (Esempio 1 8)

Componenti _

HAS I (1 IAS3) 10 ma Carbonici' 974 P _ 15 mg Propilene Glycol 100 mg

Sud inni Hydroxydc 0,33 mg Sndium Hya laro naie me

MP-Diol Glycol 37.5 mg SymPiol 68 90 mg Purificd Water q.s lo I g

LIPSTICK (Esempio 19)

Componenti _ Q u antità (mg/lg lipstkk) HAS 1 (HAS3) _ _ 30 mg ( 10 mg) Liquid Paraffin _ 253,2 ma VVhilu Solì Paraf<'>iin _ 326.2 me

11 aid Para ffin _ 144.3 ma BcesvvÃŒix Vvhjle _ 96 ma Cercai n _ _ 28,3 mg Arlacel 582 _ 95,8 mg Sodium 11 vai moliate 2 ma

A llautoi n _ I . I mg all-rac-a l ocophcry I Acetato 1 , 1 mg Propyl p - h y J ro \ vb e n zo ate 0,4 mg

1 ì utylliy dioxy toluene 0.4 mg Puntied Water _ 19.2 ma Disodi u m bdctate _ 1 , 1 ma Vunilla Flavour _ 0.5 mg Svveet 1 lavour 0,5 mg

OVULI VAGINALI (Esempio 20)

Componenti Quantità (m3⁄4/lg di ovulo) 11 A S 1 (HAS3) 10 ma Olyccrin 580 Celatili 200 Sodium 1 lyaluronate

Puritied Water q s io lg<1>CREMA IDROFILA (Emulsione O/A) (Esempio 21 )

L _ -i ■ Coni ponenti Quantità mg/lg ti trema) l uASl (HA Sì) 10 mg

i Tefnsc 1500 1 10 mg

| Cllyeciol 80 mg

Stearic Aeid _ 33 mg

Sodium ! lyaltironale _ 2 mg

Liqu id l-'a radi n _ 40 mg

Methyl p-hydroxybenztiiiÃŒc 1 mg

Purilied Water q.S to l g

UNGUENTO (Esempio 22)

Coni ponenti _ Quantità (mg/lg di unguento) HA S I (HASLV) _ 20 mg

) .iglit I .icjuid Paraflìn 200 ITUÌ

White Pelrolatum q.s to I g

[CAPSULE (Gelatina Rigida) (Esempio 23)

I Compo n e irti _ Quantità (m ipsula)

| HAS- 1 (HAS3) _ 80 mg (40mg)

I Calcio l-<'>osfato _ 256 mg

. M agne s io Stea rato 7

Siliee 7 me

COMPRESSE (Esempio 24)

Componenti Quantità (mg/co in pressa) HAS-1 (HAS-3) _ 120 mg _

Calcio fosfato _ 200 _ Cellulosa ITI icroc ri sta 11 in a __ I 85_

Cai bossimetileclkdosa sodica 10

_ Magnesio _ Stearato _ KJ_ _

Silice 15

FORMULAZIONI 1NI ETTIVE (Esempio 25)

Co m pimenti _ _ _ Quantità mi di sol)

HAS-3 _ __ 50 mg

Caciose _ _ 0,93 mg

1 Aitassium Ph o sp h aie Dib asie 0,36

Potassinm Phospliaie Monobasici 0,23

Sodium Chloride

Insaldo Γ invenzione così descritta, à ̈ chiaro che questi metodi possono essere modificali in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalie prospetti ve dell "invenzione c tutte le muditi che che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell<'>ambito delle seguenti rivendicazioni.

Claims (19)

1. RI VKN DILAZIONI 1. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie associate al deficit delle difese immunitarie.
2. 2. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie associate alFattivazionc di IL- 1 , IL-2. IL-6, II.-7. IL-8. IU-12 c del TNF.
3. 3. Uso di acido ialuronico sol fatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento dclfasma, dell<'>artrite reumatoide, e dell<'>artrosi associate all<'>attivazione del 1<'>II..- 1 , 1L-6 e del I NF.
4. 4. Uso di acido ialuronico sol fatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione c/o il trattamento delle patologie associate al danneggiamento delfendotelio dei vasi sanguinei.
5. 5. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento delle malattie della pelle come, ad esempio, la dermatite e il linfoma cutaneo.
6. 6. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento delle malattie a carattere autoimmune come Γ artrite reumatoide. il morbo di Crohn, tutte le infiammazioni intestinali croniche, la psoriasi c l<'>asma, il diabete mellito. Fencefalomielite. la Sclerosi Multipla, il Lupus eritematoso c per il trattamento del rigetto nei trapianti d<'>organo.
7. 7. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento di neoplasie come, ad esempio, la leucemia e il linfoma di Hodgkin.
8. 8. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento dell<'>astrogliosi. l<'>astrocitosi e la demielinizzazione delle fibre neuronali.
9. 9. Uso di acido ialuronico solfatalo per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie associate all<'>attivazione degli osteoclasti.
10. 10. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento di patologie vascolari di tipo artcrio/aterosclerotiche, la trombosi venosa e le vaseuliti. associate all<'>attivazione del TNF. di IL-1 e IL-6.
11. 11. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie febbrili.
12. 12. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento del Γ HIV.
13. 13. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento dclTherpes simplex labiale e dell<'>herpes genitalis.
14. 14. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento del virus della stomatite vescicolare.
15. 15. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento del Cvtomegalovirus.
16. 16. Uso di acido ialuronico sollatato secondo tutte le rivendicazioni precedenti con grado di solfatazione 1 .
17. 17. Uso di acido ialuronico solfatato secondo le rivendicazioni 1 -15 con grado di solfatazione 3.
18. 18. Uso di acido ialuronico solfatato secondo tutte le rivendicazioni precedenti per una somministrazione sistemica.
19. 19. Uso di acido ialuronico sol fatato secondo le rivendicazioni 1-17 per una somministrazione topica o inalatoria.