ITRM940073A1 - Muteine della ribonucleasi pancreatica e loro usi. - Google Patents

Abstract

Sono descritte muteine dimeriche della ribonucleasi pancreatica ad attività antitumorale, da utilizzarsi in terapia e diagnostica.

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione dal titolo:

"Muteine della ribonucleasi pancreatica e loro usi"

La presente invenzione concerne muteine della ribonucleasi pancreatica e loro usi.

Più in particolare l’invenzione concerne muteine stabili dimeriche della ribonucleasi pancreatica ad attività antitumorale, da utilizzarsi per la preparazione di composizioni farmaceutiche.

La ribonucleasi A pancreatica bovina (RNasi A) appartiene alla famiglia delle RNasi. La sequenza e le caratteristiche biochimiche di questo enzima sono descritte nei riferimenti bibliografici 1 e 2, qui incorporati. La RNasi A, una delle proteine maggiormente studiate, è una proteina monomerica, come tutti gli altri membri di questa famiglia, ad eccezione della ribonucleasi seminale bovina (BS-RNasi, 3) che è una proteina omodimerica. Tuttavia, le subunità della BS-RNasi mostrano una identità di sequenza maggiore dell'80% con la RNasi A. La RNasi seminale è una ribonucleasi con attività biologiche peculiari (4), comprensive di un' attività antitumorale molto efficace (5, 6).

Sono stati preparati dei dimeri della RNasi A da Crestfield, Stein and Moore (7) per liofilizzazione da acido acetico; tali dimeri sono piuttosto instabili e sembrano derivare da uno scambio dei segmenti N-terminali (8), che avviene anche nella RNasi seminali dimerica (9). E’ stato anche dimostrato che la dimerizzazione non porta ad un'unica struttura quaternaria: infatti la proteina può esistere in due forme, in equilibrio tra loro: una (forma MxM) in cui avviene lo scambio tra le subunità; l'altra (M=M) con nessuno scambio (10). L' equilibrio è raggiunto quando si arriva ad un rapporto di 2/1 di MxM / M=M (10).

Bartholeyins and Moore hanno preparato derivati stabili dimerici della RNasi A a mezzo di legami tra i monomeri con reagenti bifunzionali (11). Queste preparazioni dimeriche sono delle miscele di diversi derivati dimerici, generati per legami casuali tra differenti residui di lisine, e hanno una attività antitumorale, sebbene minore di quella deN'enzima seminale (12).

Gli stessi autori della presente invenzione hanno precedentemente dimostrato che molecole proteiche chimeriche, costruite attraverso manipolazione del DNA e costituite di residui da 1 a 40 della sequenza della BS-RNasi e di residui da 41 a 124 della sequenza della RNasi A bovina, aggregano per formare dimeri attivi stabili (13). Tuttavia tali molecole chimeriche non hanno alcuna attività antitumorale.

Gli autori dell' invenzione hanno ora identificato quali sono i residui amminoacidici, e la loro posizione nella sequenza della RNasi pancreatica, che, opportunamente mutati, sono in grado di produrre muteine che dimerizzano spontaneamente per formare composti dimerici stabili, chimicamente definiti. Tali derivati della ribonucleasi pancreatica sono vantaggiosamente utilizzabili in quanto hanno una attività antitumorale.

Tra le possibili sostituzioni puntiformi gli autori hanno selezionato quattro residui minimi che rendono la muteina dimerica e con una efficace attività antitumorale. Inoltre le muteine sono stabili, chimicamente definite e producibili in elevate quantità in un sistema controllato come E. coli, senza rischi di contaminanti, come avviene per proteine ricombinanti da organismi superiori. Inoltre le molecole si prestano a essere sottoposte a ulteriori derivatizzazioni chimiche.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione una muteina dimerica ad attività antitumorale della RNasi pancreatica. Per RNasi pancreatica si intende RNasi pancreatica di origine bovina, umana, ovina, di topo, di ratto o di coniglio. Preferibilmente detta muteina dimerica comprende, all'equilibrio, almeno il 25% di una forma MxM in cui ciascuno dei monomeri di detta muteina ha scambiato il proprio N terminale con l’altro monomero, per formare un dimero covalente. Preferibilmente detta muteina dimerica comprende almeno i seguenti residui di amminoacidi nelle posizioni indicate: prò 19; leu 28; cys 31; cys 32 (PLCC RNasi A).

Rientra nell'ambito della presente invenzione una composizione farmacologica ad attività anti-tumorale comprendente in dosi farmacologicamente accettabili la muteina dell'invenzione.

Costituisce un oggetto dell’invenzione un coniugato anticorpo anti-cellule tumorali-muteina per la preparazione di immunotossine ad attività anti-tumorale, veicolate in maniera specifica e selettiva al sito di azione. Tali immunotossine possono essere preparate per via chimica, collegando l'immunoglobulina con la muteina dell'invenzione, a mezzo di reagenti bifunzionaii e con metodiche note agii esperti de! settore, ad esempio come mostrato con un anticorpo anti-trasferrina da Newton et al. (14). Alternativamente le immunotossine possono essere preparate per formazione di ponti disolfurici tra la subunità monomerica della muteina e un frammento FAB di anticorpi monoclonali diretti contro epitopi specifici delle cellule tumorali, entrambi dotati di gruppi SH.

Costituisce ulteriore oggetto dell'invenzione un coniugato anticorpo anti-cellule tumorali-muteina per la preparazione di corredi diagnostici immunologia.

La presente invenzione verrà ora descritta in sue forme di realizzazione facendo riferimento alle seguenti figure, in cui:

la figura 1 rappresenta un'elettroforesi su gel di poliacrilammide 15% (SDS-PAGE) in condizioni non riducenti (colonne 1, 2 e 4) e riducenti (colonna 3). Colonna 1: RNasi A, sigma tipo XllA; Colonna 2: BS-RNasi purificata da vescicole seminali, secondo 20; Colonne 3 e 4: PLCC RNasi A;

la figura 2 rappresenta una cromatografia per gel filtrazione su una colonna di Sephadex™ G75 (0.9 x 47.5) di PLCC RNasi A dopo incubazione (24 μΜ) in 0.1 M Tris-HC! pH 8.4 con DTT (240 μΜ) per 30 min. A: PLCC RNasi A; B: PLCC RNasi A dopo incubazione a 37°C per 60 ore a pH 7.0;

la figura 3 rappresenta curve di sopravvivenza di fibroblasti SVT2 (ATCC, Richmond USA) coltivati in presenza di PLCC RNasi A O, RNasi A ·, e BS-RNasi □. A: sopravvivenza delle cellule cresciute in presenza di 30 μΜ di ciascuna RNasi; B: curva doserisposta dopo 72 ora di crescita in presenza di ciascuna RNasi. I valori sono ottenuti per confronto con cellule di controllo, coltivate in assenza di RNasi, prese come 100%. Le cellule sono piastrate in piastre a 24 pozzetti a 5 x 104 cellule /mi in terreno DMEM con glutammina, penicillina, streptomicina e 10% FCS. La RNasi è aggiunta al terreno prima del piastramento.

Il cDNA codificante per la RNasi A è preparato come descritto in 15 e viene mutato a mezzo di mutagenesi con PCR ai terminali 5’ e 3' per permettere il suo inserimento nei siti Eco RI e Sai I del plasmide pUC118. Il plasmide è poi mutato secondo il metodo di Kunkel et al. (16). Il cDNA mutante è espresso in Escherichia coli come già descritto per il cDNA codificante per la RNasi seminale (17). In breve il DNA è inserito nel vettore di espressione pT7-7, descritto in 16, dopo un’ulteriore mutagenesi mediata da PCR al 5' per permettere l'inserzione polare nel vettore ai siti Nde I e Sai I. Il plasmide risultante è espresso nel ceppo di E. coli JM109 (DE3) pLysS.

La proteina mutante, inclusa in corpi di inclusione, è denaturata, purificata e rinaturata in una proteina cataliticamente attiva in presenza di un tampone ossido riducente con glutatione come descritto per la RNasi seminale espressa nello stesso sistema di espressione (15). La proteina purificata è omogenea, come risulta da un'analisi con SDS-PAGE, con una attività specifica nei confronti di RNA di lievito identica a quella della RNasi pancreatica nativa (100 ± 9 K unità per mg). Un’analisi di sequenza, utilizzando un sequenziatore Applied Biosystem 473A, dei primi 35 residui della proteina ricombinante identifica che il residuo N terminale è metionina, seguito dai primi 34 residui di RNasi A, eccetto che per i residui 19, 28, 31 e 32, che risultano essere rispettivamente Pro, Leu, Cys e Cys.

Da un campione della proteina sottoposto a spettrometria di massa elettrospray (15), si ottengono ioni caricati in maniera multipla, da cui la massa molecolare media della proteina è calcolata in circa 14,425±2.35 Da, corrispondente esattamente al valore atteso.

Quando le componenti protettive del glutatione sono rimosse dalla muteina di RNasi per riduzione in condizioni non stringenti (15), i monomeri liberi formano facilmente dei dimeri. La struttura dimerica della RNasi A e la presenza di ponti disolfurici è indicata da un'analisi per SDS-PAGE, come mostrato nella figura 1. In condizioni non riducenti la RNasi migra come la RNasi seminale, in condizioni riducenti migra come la RNasi A naturale.

Per evidenziare se sia presente la forma dimerica MxM, come nei dimeri di RNasi seminale e neH'RNasi A quando aggregata da soluzioni di acido acetico, si sottopone un campione di muteina di RNasi PLCC a taglio selettivo dei ponti disolfurici, seguito da un’analisi dei prodotti per filtrazione su gel. Quando la RNasi seminale viene esposta a questo procedimento, i dimeri M=M (con nessuno scambio) si dissociano in monomeri a seguito di riduzione dei ponti disolfurici, ed eluiscono come monomeri dalla colonna di gel filtrazione; l'evidenziazione nella filtrazione su gel di un pattern di specie dimeriche (dimeri non covalenti) è indicativa della presenza di dimeri MxM, in quanto lo scambio dei segmenti N terminali impedisce la dissociazione (10). La figura 2 A mostra che circa il 25% della muteina di RNasi selettivamente ridotta si separa come dimeri non covalenti, mentre la restante parte eluisce come monomeri liberi. Questo risultato, confermato da diversi esperimenti indipendenti, indica che circa 1/4 della muteina di RNasi è in forma MxM.

Gli esperimenti sono ripetuti con la muteina di RNasi incubata per 60 ore a pH 7 a 37°C, cioè in condizioni che inducono la trasformazione della forma M=M della RNasi seminale in forma MxM e favoriscono lo stabilirsi di un equilibrio tra le due forme (10). La figura 2 B mostra che dopo tale incubazione i dimeri non covalenti costituiscono circa 2/3 della proteina ridotta. Il risultato non è modificato a seguito di una incubazione prolungata della proteina. Ciò dimostra che anche la muteina RNasi A, come la RNasi seminale, esiste in due forme dimeriche e che, all'equilibrio, la forma MxM è in un rapporto 2:1 con la forma M=M.

Quando fibroblasti SVT2 trasformati (cellule BalbC 3T3 trasformate con virus SV40) sono cresciuti in presenza di 30 pg/ml di muteina di RNasi A, si osserva una inibizione della crescita cellulare (figura 3A). Mentre la RNasi A selvatica non ha alcun effetto, la muteina dimerica di RNasi mostra, dopo 72 ore di incubazione, un effetto inibitorio della crescita cellulare maggiore del 50%. Una curva dose risposta, mostrata in figura 3B, conferma che l’effetto citotossico della muteina di RNasi A sulle cellule maligne, è selettivo e conferma anche la inefficacia della RNasi A selvatica. Inoltre, isolando la forma MxM della muteina, come descritto in 10, si osserva che solo questa è attiva come inibitrice della proliferazione delle cellule tumorali. L'azione citotossica della muteina di RNasi è selettiva verso le cellule tumorali, in quanto la proteina non ha alcun effetto sulla linea parentale non maligna dei fibroblasti 3T3. Inoltre, separando le forme M=M e MxM, come descritto in 10 per la BS-RNasi, solo la forma MxM mostra un'attività anti-tumorale.

Come mostrato nella figura 3, l'effetto inibitorio della muteina di RNasi A sulla crescita dei fibroblasti trasformati è meno potente di quello della RNasi seminale. Possibilmente, mentre la struttura dimerica è un prerequisito essenziale per la ribonucleasi antitumorale, può non essere sufficiente per esercitare una piena attività citotossica della proteina, potendo essere coinvolti altri determinanti proteici.

Bibliografia

1. Richards F.M. and Wyckoff H.W. in The Enzymes (3rd ed.) 4, 647 (1971).

2. P. Blackburn and S. Moore in The Enzymes (3rd ed.), 15, 417 (1982).

3. G. D'Alessio, A. Di Donato, A. Parente, R. Piccoli, Trends Biochem. Sci 16 104 (1991).

4. G. D'Alessio, Trends Celi Biol. 3, 106 (1993).

5. S. Vescia, D. Tramontano, G. Augusti-Tocco, G. D'Alessio Cancer Res. 40, 3740 (1980).

6. P. Laccetti, G. Portella, M.R. Mastronicola, A. Russo, R. Piccoli, G.

D'Alessio, G. Vecchio, Cancer Res. 524582 (1992).

Claims (6)

1. RIVENDICAZIONI 1. Muteina dimerica della RNasi pancreatica ad attività antitumorale.
2. 2. Muteina dimerica della RNasi pancreatica secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto di comprendere, all equilibrio, almeno il 25% di una forma MxM in cui ciascuno dei monomeri di detta muteina ha scambiato il proprio N terminale con l'altro monomero, per formare un dimero covalente.
3. 3. Muteina dimerica della RNasi pancreatica secondo la rivendicazione 2 comprendente almeno i seguenti residui amminoacidici nelle posizioni indicate: prò 19; leu 28; cys 31; cys 32.
4. 4. Composizione farmacologica ad attività anti-tumorale comprendente in dosi farmacologicamente accettabili la muteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
5. 5. Coniugato anticorpo anti-cellule tumorali-muteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, per la preparazione di immunotossine ad attività anti-tumorale.
6. 6. Coniugato anticorpo anti-cellule tumorali-muteina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, per la preparazione di corredi diagnostici immunologici.