JPS6178799A - 蛋白質の相互分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は蛋白質の相互分離方法に関する。

従来の技術 サイド力イノやペブチドポルモンなど匝々の生理活性蛋
白質の存在が明らかにされ、また近年の遺伝子工学技術
の進歩は、これら生理活性蛋白質の大量生産、臨床への
適用の途を開きつつある。

このような技術は、Ｃでにインターフェロン。

イノターロイキン−１Ｂ細胞増殖因子（ＢＧＦ）、Ｂ細
胞分化因子（Ｂ　Ｄ　Ｆ　）、マクロファーノ活性化因
子（ＭＡＦ）、リンホトキノン（ＬＴ）、腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）などのサイト力イノ、トランスホーミンググ
ロースファクター（ＴＧＦ−α）：エリスロボエチン、
上皮細胞増殖因子、イノスリノ、ヒト成長ホルモンなど
ペプチド蛋白質ホルモン、　Ｂ型肝炎ウィルス抗原、イ
ンフルエンザ抗原１ロ蹄疫ウイルス抗原、マラリア原虫
抗原などのワクチンの開発に有用な病原性微生物抗原蛋
白質：　ペプチダーゼ（例、ティツユプラスミノーゲン
　アクナベ−ター。ウロキナーゼ、セラチオペプチダー
ゼなど）やリゾチームなどの酵素：ヒト血清アルブミン
（Ｈ５Ａ）などの血中蛋白成分など各種生理活性蛋白質
の製造に応用されている。

ｊ、かじ、これらの蛋白質は遺伝子工学手法により製造
されろため、しばしば、昆合物中の他の物質から、最終
的に必要な生産物を分離せねばならないという問題が生
じている。特に問題になるのは、必要な蛋白質をコード
する遺伝子の発現により産生ずる遺伝子産物が、しばし
ば必要な蛋白質とそのアミノ末端にメチオニンが付加し
た第二番目の蛋白質との混合物であることである。付加
されたメチオニン（Ｎｅｔ）は、所望の遺伝子の発現の
開始を指示する翻訳開始コドンＡＴＧの発現と、発現産
物から付加したＮｅｔ基を除く宿主細胞の発現系の不首
尾に由来するものである。この問題は、原核性宿主およ
び真核性宿主の両者で生ずるが、とりわけ原核性宿主に
おける遺伝子の発現においてしばしば生ずる。発現用宿
主として大腸菌を用いた発現系において特に問題となる
。

真核細胞および原核細胞の両者における蛋白質合成は、
アミノ酸であるメチオニンをコードするｍ１ＮＡのコド
ンＡＵＧから開始するので、とりわけ発現用宿主が大ｍ
菌の場合、蛋白質の発現が必要とする蛋白質をさらにア
ミノ末端にメチオニンが付加した類似体（Ｎ−ＭｅｔＩ
！ｉ似体）との分子種の混合物であるかどうか予想でき
ない。

事実、大腸菌のイニソエーノヨン・ファクターＩＦ−３
においてアミノ末端にメチオニン残基を持つ分子種と持
たない分子種の両者が存在すること［ホッペ・ザイラー
ズ・ツァインユリフト・フェア・フィノオリノエ・ヘミ
−（Ｈｏｐｐｅ　５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、３５４．１４１５（１
９７３）］や、大腸菌においては、その全蛋白のアミノ
末端が主としてメチオニンであること（コーン・スタン
プ。

アウトライノズ・オブ・バイオケミストリー（ＯｕＬｌ
ｉｎｅｓ　ｏｆ　［３１ｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ）４版
、ノヨンーウィリー・アンド・サンズ、１９７６年）な
どが知られている。組換えＤＮＡ技術を用いて製造され
た蛋白としては、アミノ末端へのメチオニン残基の付加
率がヒト成長ホルモンにおいて約１００％［ネイチ＋−
（Ｎａｔｕｒｅ）、２９３．４０８（１９８１）］にも
達する例が知られている。遺伝子工学技術によると、必
要とする蛋白質に比へそのＭｅｔｌｉＱ似体が高比率に
産生ずるという問題が知られている。

ネイチｗ−（ＮａＬｕｒｅ）、２９３，４０８（１９８
１）においては、ヒト成長ホルモノの製造において、実
際に必要とずろ蛋白質に比べてそのＭｅｔ類似体か多量
に得られるということを示している。

必要とする蛋白質とそのＮ−ＭｅＬＭ似体とが混合物と
して産生する場合、二つの分子種の物理化学的性状にお
ける相違は、あるとしても非常に小さいものであるため
、相互に分離することは、極めて困難なことである。

メチオニン残基は分子量約１３１で、中程度に疎水性を
有し、かつ解離基を持たないため電気的に中性のアミノ
酸残基である。従って蛋白質のようなそれ自体多数の解
離基や疎水性居および親水性基を有する巨大分子［例え
ば＋３３ｆＡのアミノ酸残基からなるインターロイキン
−２ポリペプチド（［１但しＸは水素原子）の分子量は
約１５．４２０である］のアミノ末端にメチオニン残基
が１残基付加してら蛋白質全体の物理化学的性質には通
常大きな影響を及ぼさないと予想され、アミノ末端にメ
チオニン残基が付加した分子種と付加していない分子種
とを相互に分離することはきわめて困難であると考えら
れる。

この難しい問題は、多くの蛋白質において存在し、とり
わけ発現用の宿主として大腸菌を用いて発現する蛋白質
、特に遺伝子工学技術により製造されるインターロイキ
ン−２やインターフェロンを、これらのＮ　−Ｍ　ｅｔ
類似体から分離する場合において、厳しいものがある。

イノターロイキン−２は、マイトーゲンや坑原によって
活性化されたＴ細・胞によって産生されるリンホカイン
の１つであり、細胞障害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細
胞の増殖および分化に必須の因子であってこれらの細胞
を介した免疫反応系において重要な働きをしている。

また、インターフェロン−αは、ウィルスや核酸によっ
て活性化された白血球によって産生されるリンホカイン
の１つであり、細胞に作用してその細胞を抗ウイルス状
態にするという生物活性をもち、感染防禦系や腫瘍免疫
系において重要な働きをしている。

イノターロイキン−２やインターフェロン−αはその生
物活性から各種免疫不全症、Ｉ＠染症、悪性腫瘍などの
治療薬として効果的に使用し得ることか期待されている
。現在までにヒト末梢面リンパ球やヒトＴ細胞白穐病株
（ＪＵＲＫＡＴ株）の培養上清から単離された天然型の
インターロイキン−２は、分子ｍ的に異なる幾つかの分
子種から成るが、いずれもそのポリペプチド鎖に関して
は互いにきわめて良く以ており、アミノ末端は例外なく
アラニン残基から始まることが知られている［特願昭５
９−１’４９２４８号（昭和５９年７月１９日出願）明
細書（ＥＰＣ公開東０１３２３５９号公報に対応する）
、プロノージノグ・オブ・ナノヨナル・アカデミ−・才
ブ・サイエンス（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　８１．２５４３（
１９８４）］。

一方、現在までにヒト白血球の培養上ｔｎから単離され
た天然型のインターフェロン−αは、ｌＯ数種のサブタ
イプからなるが、いずれもそのポリペプチド鎖に関して
は、互いにきわめて良く似ており、アミノ末端は例外な
くノスティン残基から始まることが知られている［アチ
ーフ・フェア・ビオヘミ−・ランド・ビオフィノッシェ
（ＡｒｃｈＢ　Ｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、
）、　２　２　１　　、　　監　、（１９８３）　。

本発明音らは、ヒトリンパ球のインターロイキン−２遺
伝子を組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌内で発現させる
ことにより非グリコシル化ヒトインターロイキン−２を
製造することに成功した［特願昭５８−２２５０７９号
（昭和５８年１１月２８日出願）明細書参照Ｊ：ＰＣ公
開第０１４５３９０号公報に対応する］。該インターロ
イキン−２は第１図に示すアミノ酸配列（該図中、Ｘは
水素原子またはメチオニン残基を示す）からなるポリペ
プチド（１）を含有するしのであり、アミノ末端アミノ
酸としてヒト天然型と同じくアラニン残基から始まる分
子種（すなわち、Ｘは水素原子）とともに、アミノ末端
にメチオニン残基の付加したメチオニル−アラニン残基
から始まる分子Ｎ（すなわち、Ｘはメチオニン残基）を
有する。

また、づ°でに報告されているように［ツヤ−ナル・オ
ブ・インターフェロン・リサーチ（、ＩＩｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ　Ｒｅｓ、　）、　１．３８１（１９８１）：　
ツヤ−ナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｃ　）、２５６．９７５０
（１９８１）］、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて大
腸菌内で発現させたインターフェロン−αＡは第２図に
示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する。ア
ミノ末端アミノ酸としては、ヒト天然型と同じくノステ
ィン残基から始まる分子種（すなわち、Ｘは水素原子）
ととらに、アミノ末端にメチオニン残基の付加したメチ
オニルーンスティン残基から始まる分子種（すなわち、
Ｘはメチオニン残基）を有する。

発明が解決しようとする問題点 同じ蛋白質であってもアミノ末端にメチオニン残基の付
加した分子種とそうでない分子種とは蛋白質の高次構造
が相互に異なる可能性があり、両者の間でｉｎ　ｖｉｖ
ｏおよびｉｎ　ｖｉＬｒｏでの生物活性や生物学的安定
性に差のある可能性もある。また、メチオニンｒＩ５．
基のアミノ末端への付加か抗り；Ｌ性の増加あるいは減
少をもたらす可能性らあり得よう。

従って、生理学上および産業利用上の観点からアミノ末
端にメチオニン残基の付加した分子種とそうでない分子
種とを分離して両者をそれぞれ実質的に純粋な形で取り
出すことはきわめて意義のあることである。

アミン末端へのメチオニン残基の付加率は、培養条件や
蛋白質の発現レヘルによって左右される可能性がある［
ジャーナル・オブ・インターフェロノ・リサーチ（Ｊ、
１ｎｔｅｒ４ｅｒｏｎ　Ｒｅｓ；）、上、３８１（１９
８１）］が、メメチオニン基の付加率を制御し得た例は
今までのところ報告されていない。さらに蛋白質の精製
過程においてもアミノ末端にメチオニン残基が付加した
分子種と付加していない分子種とを相互に分離した例は
今までのところ全く報告されていない。

本発明者らは（ａ）インターロイキン−２とさらにその
アミノ末端にメチオニン残基を有するインターロイキン
−２および（ｂ）インターフェロン−αΔとさらにその
アミノ末端にメチオニン残基を有するインターフェロノ
ーαＡとの相互分離法として、塩析や溶媒沈澱法などの
溶解度の差を利用する方法、透析法、限外ろ適法、ゲル
ろ適法および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などの主として分子量の差を利用する方法、抗体との
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法などを試みた
が、それらを相互に分離することは全く出来なかった。

問題を解決するための手段 本発明者らは、蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチオ
ニン残基を有する蛋白質（Ｎ−Ｍｅｔ類似体）とを相互
に分離することを目的として鋭意研究を行った結果、そ
れらが意外に乙相互に異なる等電点を有する事実を発見
した。メチオニンは電気的に中性のアミノ酸であるため
蛋白質のアミノ末端に付加してもその蛋白質全体の電荷
には全く影響を及ぼさないと考えられ、　従ってインタ
ーロイキン−２のような蛋白質とそのアミノ末端にさら
にメチオニン残基を有する蛋白質とか穴なる等電点を有
することは全く予想外の発見であった。

すなわち、本発明は蛋白質および該蛋白質にメチオニン
残基が付加し、該蛋白質と同様の生理活性を佇する蛋白
質（Ｍｅｔ−蛋白質）の混合物を等電点の差異に基づく
分離手段に付すことを特徴とする蛋白質と該蛋白質にメ
チオニン残基が付加した蛋白質（Ｍ　ｅＬ−蛋白質）と
の相互分離方法を提供するものである。

本願明細書において「蛋白質」とは、糖鎖を宵するもの
らしくは有さないもののいずれをも含み、また、例えば
化学反応もしくは酵素反応により、化学的または構造的
に修飾されたポリペプチドを包含する、アミノ酸の１欠
構造からなる高分子物質を意味する。

また１７Ｍｅｔ−蛋白質Ｊとは、上記「蛋白質」にさら
にメチオニン基が付加したものを意味する。本発明は、
とりわけ、所望の蛋白質およびそれと同一らしくは同様
の生理活性を有するＭｅｔ−蛋白質に係るしのである。

本発明における好ましいＭｅＬ−蛋白質は、所望の蛋白
質の生理活性を奏するに十分な、該蛋白質とのアミノ酸
配列上の類似性を何才ろものである。本発明は、所望の
蛋白質のそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を付加
した蛋白質（Ｎ−Ｍｅｔ類似体）を包含するＭｅｔ−蛋
白質から蛋白質を分離する方法およびその生産物に関す
るらのである。とりわけ、本発明は、そのＮ−Ｍｅｔ類
似体からインターロイキン−２蛋白質の分離、およびそ
のＮ−Ｍｅｔ類似体からインターフェロノーαの分離に
関するものである。

本願明細書において「生理活性」とは、生理学的および
免疫学的活性および効果を含むイノヒポらしくはイノビ
トロで生存していてもいなくてもよい細胞１細胞の一部
、細胞らしくは池の生理学的作用に基づく生産物および
生物学的物質を含む生体および（または）生理物質への
活性または効果を色味する。

上記蛋白質およびそれにメチオニン残基が付加した蛋白
質（Ｍｅｔ−蛋白質）の混合物は、通常遺伝千組換え技
術で製造でき、通常大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞を
用いて発現させることにより製造できる。

上記蛋白質としては、各種生理活性蛋白質が挙げられ、
例えば、インターフェロノ（ＩＦＮ；　　例、ＩＦＮ−
α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなど）、インターロイキノ
（インターロイキン−１，インターロイキン−２など）
、Ｂ細胞増殖因子（ＢＧＦ）、Ｂ細胞分化因子（ｎＤＦ
）、マクロファーノ活性化因子（ＭＡＦ）、リノホトキ
ノン（ＬＴ）、腫瘍壊死因子（Ｔ′ＦＪＦ）などのサイ
トカイ／、トランスホーミンググロースファクター（Ｔ
ＧＦ−α）、エリスロボエチン。

上皮細胞増殖因子、イノスリン７ヒト成長ホルモンなど
ペプチド蛋白質ホルモン：　Ｂ型肝炎ウィルス抗原、イ
ンフルエンザ抗原９ロ蹄疫ウイルス抗原。

マラリア原虫抗原などの病原性微生物抗原蛋白質、ペプ
チダーゼ（例、ナインユプラスミノーゲンアクチベータ
ー、ウロキナーゼ、セラチオペプチダーゼなど）やり１
チームなどの酵素、　ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）な
どの血中蛋白成分が挙げられこれら蛋白質の中でも、分
子傷約３．０００゜５０．０００、とりわけ約５，００
０〜３０．０００のもの、またアミノ酸数として約３０
〜５００、とりわけ約５０〜３００のものに対して、本
発明の蛋白質の相互分離方法は有利に適用ができる。

また蛋白質の等電点が約４〜＋１とりわけ、約５〜８の
らのにおいて、有ｆ１１に相互分離を行うことができ、
また蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基を有する蛋白質
との等電点の差が、約０．０１以上、好ましくは約０１
以上とりわけ０．０１−０．２程度あることが好ましい
。

とりわけ、遺伝子組換え技術で製造されたインターロイ
キン−２やインターフェロン−αに対して、有利に本発
明の相互分離方法が適用できる。

ここでインターロイキノ−２とは天然のヒトイノターロ
イキン−２と同様の生物学的もしくは免疫学的活性例え
ばインターロイキノ−２レセプターや抗インターロイキ
ンー２抗体との結合能、を【丁するものであればいずれ
でもよく、具体的には第１図で示されるアミノ酸配列を
有するポリペプチド（ト：但しＸは水素原子）や、その
生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ
酸配列からなるフラグメントでもよく、例えばポリペプ
チド（１）のアミノ末端からＩＩＩ！Ｉのアミノ酸（Ｅ
ＰＣ公開９１５３９号公報）または４個のアミノ酸を欠
くフラグメント（特願昭５８−２３５６３８号、昭和５
８年１２月１３日出願、明細書参照、特開昭６０−１２
６０８８号公報に対応）やカルホキノル末端部分の数個
のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられ、さらに
上記ポリペプチド（１）の構成アミノ酸の一部が欠旧し
ているか他のアミノ酸に置換されたもの、例えば１２５
位のンステイン残基がセリン残基に置換されたもの（特
開昭５９−９３０９３号公報）でらよい。これらのポリ
ペプチドは、非グリコシル化ポリペプチドであることが
好ましく、とりわけ第１図に示すアミノ酸配列を有する
！し−２が好ましい。

以下の本願明細書においては、これらのインターロイキ
ン−２をＩし−２と略記し、それらのアミノ末端にさら
にメチオニン残基を有するインターロイキン−２をＭｅ
ｔ−ＩＬ−２と略記することがある。

ここでインターフェロノーαとは天然のヒトインターフ
ェロン−αと同様の生物学的らしくは免疫学的活性例え
ばインターフェロンαレセプターや抗インターフェロン
α抗体との結合能を宵するものであればいずれでもよく
、例えば第２図で示されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド（■、但しＸは水素原子）が挙げられる。さらに
インターフェロン−αの生物学的もしくは免疫学的活性
に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントで
もよく、たとえばポリペプチド（ＩＩ）のアミノ末端部
分の数個のアミノ酸を欠くフラグメントやカルホキノル
末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙
げられ、さらに上記ポリペプチド（ＩＩ）の構成アミノ
酸の一部が欠損しているか池のアミノ酸に置換されたも
のでもよい。とりわけインターフェロン−αＡか好まし
い。これらのポリペプチドは非グリコシル化ポリペプチ
ドであることか好ましい。

以下の本願明細書においては、これらのインターフェロ
ノーαＡをＩＦＮ−αＡと略記し、ＩＦＮ−αＡのアミ
ノ末端にメチオニン残基を有するＩＦＮ−αＡをＭｅｔ
−［ＦＮ−αＡと略記することがある。

上記蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を
有する蛋白質の混合物としては、混合蛋白質として５０
％以上、好ましくは８０％以上、とりわけ９９％以上の
純度をＨするものが用いられる。

本発明においては、上記混合物を等電点の差異に基づく
分離手段に付すことによりこれらを相互分離することが
できる。

なお、実施例１記載の方法によれば、ＩＬ−２およびＭ
ｅｔ−ＩＬ−２の等電点はそれぞれ７．７および７，５
と算出された。

また、実施例６記載の方法によれば、ＩＦＮ−αＡおよ
びＭｅｔ　−Ｉ　Ｆ　Ｎ−αＡの等電点は、それぞれ６
，２および６．３と算出された。

本発明における等電点の差異に基づく分離手段としては
、等電点の差が０．０１−０．２程度である蛋白質を相
互に分離する方法であればどんなものでも適用でき、た
とえばアンホラインを利用する密度勾配等電点電気泳動
法、ゲル等電点電気泳動法。

等速度４気泳動法などの電場の中で蛋白質を泳動させる
方法やクロマトホーカンング法、ＦＰＬＣ法（Ｆ　ａｓ
ｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ）、Ｄ　ＥＡ　Ｅ　（ｄｉｅｔｈｙｌａｍ
ｉｎｏｅｔｈｙｌ）　−、ＣＭ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔ
ｈｙｌ）−またはＳＰ（スルホプロピル）−イオン交換
カラムクロマトグラフ法などの、溶出カラム等の荷電担
体に付加した蛋白質を、ρトｌ勾配または塩濃度勾配を
作成して等電点の差異をもたらす荷電の相異に従って担
体から蛋白質を順に脱離して溶出させる方法など自体公
知の方法やこれらを組合せた方法などが挙げられる。こ
れらの分離法に用いられる試薬および器具類はいずれも
市販されているものであり容易に入手可能である。たと
えばアンホラインはＬＫＢ社（スエーデン）から、ゲル
等電点分離法に用いろゲルはセファデックスＩＥＦとし
てファルマノア社から、またＰＡＧ（ポリアクリルアミ
ドゲル）プレートとしてＬＫＢ社から、クロマトホーカ
ソング法の担体および溶出緩衝液はポリバッファー交換
体ＰＢＥ９４．同ＰＢＥ１１Ｂやポリバッファー７４．
ポリバッファー９６としてファルマシア社（スエーデン
）から、ＦＰＬＣ法に用いるたとえばモノＰカラムやモ
ノＱカラムおよび溶出用緩衝液はファルマンア社から、
ＤＥＡＥ−イオン交換体はＤＥＡＥ−トヨバールとして
東洋曹達工業（株）から、ＣＭ−イオン交換体はＣＭ−
トヨパールとして東洋曹達工業（殊）から、ＳＰイオン
交換体は５Ｐ−５ＰＷとして東洋曹達工業（味）からあ
るいはＳＰ−セファデックスとしてファルマノア社から
人手できる。［メソヅズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　５．３
−２７（＋９６２）］。

市販ツタとえばＰＡＧプレート（２４５ｘ　ｌｌ０Ｘ　
ｌｎ＋ｍ。

ＬＫＢ社製）を用いるゲル等電点電気泳動分離法ではＰ
ＡＧプレートとしてｐＨ３，５，−９，５用プレート、
ｐＨ５，５−８，５用プレートなどを、陽極液とじて１
Ｍリン酸、０．４Ｍ　ＨＥＰＥＳ綬衝液などを、陰極液
として１Ｍ水酸化ナトリウム、０１Ｍ水酸化ナトリウム
などを使用する。通常プレート１枚あたり１０〜１００
０μｇの蛋白質をのせて、電ツノは１−２００Ｗ、好ま
しくは１Ｏ−５０Ｗで、温度は０〜２０°Ｃ１好ましく
は２〜５℃で、＊動を行う。

体動時間は０５〜５０時間１通常は１５〜５時間である
。

また１１１販のたとえばモノ１フカラム（Ｑ、５ｘ　２
０　ｃｍ。

ファルマノア社製）を用いるＦＰＬＣ１去では平衡化緩
衝液として、たとえば０．０２５Ｍノエタノールアミノ
ー塩酸緩衝液（ｐｉ−１９，５）、０．０７５Ｍ　トリ
ス−酢酸緩衝液（１１，１−１９，３）などを用い、溶
出緩衝液として１％（Ｖ／Ｖ）ファルマライト（８−１
０，５）−５，２％（Ｖ／ｖ）ポリバッファー９６−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，０−８，０）、　ｌ　０％（Ｖ／Ｖ
）ポリバブファー９６−塩酸緩衝液（ｉ）８８．０−７
．０）および１０％（ｖ／ｖ）ポリバブ７ｙ−−９６−
酢酸緩衝液（１）Ｈ６，０−’７．　Ｑ）などを用いる
。通常、０．１＝　　Ｉ　Ｏｍｇの蛋白質をのせて、１
−１−５Ｏ／ｈの、好ましくはＩ　Ｏ−３０ｉｆ／ｈの
流速でＦＰＬＣを行う。

クロマトホー力ノノグ法ではゲルとして市販のＰＢＥ１
１８およびＰＢＥ９４（７アルマンア社製）などを用い
、平衡化ｖ１衝液として０．０２５Ｍｈリエチルアミノ
ー塩酸緩衝’ｔａｃｐＨ１１，０）、（１，０２５Ｍノ
エタノールアミンー塩酸緩衝液（ｐＨ９，４）および１
１．０２５Ｍノエタノールアミノー酢酸緩衝液（ｐＨ９
，４）などを、溶出緩衝液として２．２％（Ｖ／　Ｖ）
ファルマライ１−（８−１［１，５）−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，Ｉｌ　〜Ｌｆｌ）。

１０％（ｖ／ｖ）ポリバッファー９６−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０〜８．０）および１０％（Ｖ／Ｖ）ポリバッフ
ァー９６−酢酸緩衝液（ｐＨ６，０〜７０）などを用い
る。

カラムのベッド容積としては蛋白質１ｇあたり０．０１
〜０．１．好ましくハｌｏＯ〜１００’０ｍ１（７）ら
のを用い、流速はＳ■＝０．０１〜１０．好ましくはＳ
Ｖ　＝０．１−１．０でクロマトフォーカンノブを行う
。

カラム温度は０〜３０℃、好ましくは２〜５℃に保つの
がよい。

本発明の分離法によれば、蛋白質とそれにメチオニン残
基を付加した蛋白質（ＭｅＬ−蛋白質）はその等重点の
差異に従って、電場中でｌＩｋ動するからしくはｐＨ勾
配をっけたカラム中の担体から順に脱離して溶出される
かして互いに分離される。特にｐＨ勾配や塩濃度勾配を
つけずに、イオン交換体を用いるイソクラチック溶出法
を適用しても分離しうる。

所望により上記の方法に従って分離した蛋白質のみを含
む両分およびそれにさらにメチオニン残基が付加した蛋
白質を含む画分から実質的に純粋な蛋白質およびそれに
さらにメチオニン残基が付ＩＩＩ］　した蛋白質（Ｍｅ
ｔ−蛋白質）をそれぞれ採取することができろ。この目
的のためには、自体公知の塩析法、疎水りロマトグラフ
法、ゲルろ適法、イオン交換りロマトグラフ法や高速液
体クロマトグラフ法などの蛋白質の精製に一般的に用い
られる方法を適宜組み合わせて用いればよい。

本発明は、遺伝子工学技術で製造した蛋白質を、そのＮ
−Ｍ８Ｌ類似体なと対応するＭｅｔ〜蛋白質を実質的に
含まないよう分離することを＋／Ｊめて可能ｔらしめた
しのである。本発明により製造される蛋白質は、対応す
るＭｅｔ−蛋白質を重量比で３％以下、好ましくは２％
以下、とりわけｌ以下しか含まないのである。

同様に、本発明は遺伝子工学技術で製造したＭ、ｅｔ−
蛋白質を、その対応する蛋白質を実質的に含まないよう
分離することを初めて可能ならしめたものである。本発
明により製造される　Ｍｅｔ−蛋白質は、対応する蛋白
質を重量比で３％以下、好ましくは２％以下、とりわけ
１％以下しか含まないものである。

これまでＭｅｔ−ＩＬ−２およびＭｅｔ−ＩＦＮ−αＡ
を蛋白質として分離したとの報告はなく、本発明ははじ
めて高度に精製されたＭｅｔ−ＩＬ７．２蛋白質および
Ｍｅｔ−ＩＦＮ−αＡ蛋白質をら提供するものである。

本発明により製造される蛋白質およびそれにメチオニン
残基が付加した蛋白質（Ｍｅｔ−蛋白質）は、いずれら
天然の対応する蛋白質と同様の生物学的らしくは免疫学
的活性を何し、高純度に精製されており夾雑蛋白質、発
熱物質がきわめて少ないのてｔｌ、射削除体等として安
全に使用される。

本発明により得られるＩし−２およびＭｅｌ、−１１、
−２はいずれら正常なＴ細胞やナチュラルキラー細胞を
その機能を保持さ仕たまま増殖さ口る活性をａする。し
たがって、本発明により得られろＩ　Ｌ−２およびＭｅ
ｔ−［Ｌ−２は、それぞれＴ細胞やナチュラルキラー細
胞をインビトロで長期にわたり増殖、継代したりクロー
）化するのに使用できる。なお、この性質を（す用して
ヒト１シー２の活性を測定することかできる。

さらに、本発明により得られるＩＬ−２およびＭｅｔ−
ＩＩ、−２は、たとえば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗
原特異的なキラーＴ細胞や抗原感作の経験の有無と無関
係に腫瘍を殺す能力をもっところのナチュラルキラー細
胞をイノビトロで選択的に増殖させることができ、また
このキラーＴ細胞を生体へ移入する際に、本発明により
得られる■１、　Ｔ−２またはＭｅｔ　−１１−−２を
同時に接種することにより、その抗腫瘍効果を増大さ仕
ることから、温血動物（例、マウス、ラット２ウサギ、
犬、ネコ７ブタ、ウマ、ヒツジ、０７１人など）の腫瘍
の予防、治療や免疫機能低下疾売の治療のために用いる
ことができる。

本発明により得られるＩＬ−２およびＭｅｔ　−１し−
２はそれぞれ夾雑蛋白質による抗原性がなく低毒性であ
る。

本発明により得られるＩＬ−２またはＭｅｔ　　ＩＬ−
２を腫瘍の予防、治療剤として用いるには、当該物質を
自体公知の担体と混合希釈して、たとえば注射剤、カプ
セル剤などとして非経口的にまたは経口的に投与するこ
とができる。さらに、萌述したようにインヒドロで増殖
させたキラーＴ細胞やナチュラルキラー細胞と共にまた
は単独で使用することができる。

本発明のＩＬ−２およびＭｅｔ−ＩＬ−２は、公知の天
然から分離されたヒトＩＬ−２と実質的に同じ生物活性
を有するのでこれと同様に使用することができ、細胞の
ＩＬ−２受容体との解離定数がきわめて小さいことから
、極く小量の投与で良い。

′ｒ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用するため
には、本発明のＩＬ−２またはＭｅｔ−ＩＬ−２を約ｏ
、ｏｔ−ｔユニット／１１１１、好ましくは約Ｏｌ〜０
５ユニット／ｍｌの濃度で培地に添加して用いることが
できる。

インターロイキン−２の生物活性の測定は、インターロ
イキン−２依存性細胞を用いる方法［バイオケミカル・
アンド・パイオフイノカル・リサーチ・コミュニケーノ
ｇンズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　ＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓ、
　　Ｃｏｍｍｕｎ、）、　Ｉ　０９．３６３（１９８２
）］により行なうことができる。

Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用する具体例
としては、たとえば、２０％ウノ胎児血／ｌＪｆを含む
ＲＰＭ［１６４０培地にヒト末ｔｌ’Ｊ面より分離した
Ｔ！［＋胞（ｌ　Ｘ　ｌ　Ｏ＠個／　ｍ　ｌ　）および
Ｘ線（１５００ラブド）照射したＢ細胞トランスフォー
マント（ｌ　ｘ　ｌ　Ｏ＠ＩＩＭ／ｍｌ）を加えて３７
℃、５％ＣＯ７存在下で３日間リンパ球混合培養を行な
って得られろアロ抗原感作Ｔ細胞を含む細胞浮遊液に本
発明のＩＬ−２またはＭｅｔ−［Ｌ−２を０．１〜０５
ユニット／ｍｌの濃度で加え約−週間ごとに培地交換し
ながら約１か月間培養を続ける方法などが挙げられる。

本発明により得られるＩＦＮ−αＡおよびＭｅｔ−ＩＦ
Ｎ−αＡはいずれも細胞に作用してその細胞を抗ウィル
ス状聾にする活性を有する。なお、この性質を利用して
ヒトｒＦＮ−αＡの活性を測定することができる。

さらに、本発明により得られるＩＦＮ−αＡおよびＭｅ
ｔ−ＩＦＮ−αＡは、坑ウィルス作用だけでなく、細胞
増殖抑制作用、抗体産生抑制作用、ナチュラルキラー活
性の増強作用などを併せ６っている。

本発明により得られる［ＦＮ−αＡおよびＭｅｔ−’［
ＦＮ−αＡはそれぞれ夾雑蛋白質による抗原性がなく低
毒性である。

本発明により得られるＩＦＮ−αＡまたはｔｖｌｅｔｉ
ＦＮ−αＡを治療剤として用いるには、当該物質を自体
公知の担体と混合希釈して、たとえば、注射剤、カプセ
ル剤などとして非経口的にまたは好日的に投１）するこ
とができる。投与ｍは１０当ｒニリｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ＠〜
ｌＸｌ０’ユニット、好ましくは５ｘｔｏ’〜６ＸｌＯ
’ユニツトである。

本願明細書、請求の範囲および図面において、アミノ酸
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　　Ｃｏｍ
ｍ１ｓｓｉｏｎ　　ｏｎ　　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮ
　ｏｍｅｎｃ　１ａｔｕｒｅ　　による略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
次に挙げる。また、アミノ酸に関し先学異性体がありう
る場合は、特に明示しなければし一体を示すものとする
。

ｃｔｙ　　　グリッツ Ａｌａ　　：　　アラニン Ｖａｌ　　　バリ７ Ｌｅｕ　　：　　Ｏイノノ １１ｃ　　　イソロインン Ｓｅｒ　　　セリン Ｔｈｒ　　　スレオニ７ Ｃｙｓ　　　ソステイン １／２Ｃｙｓ　　　ハーフノスチン ｍｃｙｓ　　・　カルボキノメヂルノスティノＭｅｔ　
　：　　メチオニン Ｇｌｙ　　：　　グルタミン酸 Ａｓｐ　　・　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　　リジン Ａｒｇ　　：　　アルギニン Ｈｉｓ　　　ヒスチジン Ｐｈｅ：　　フェニールアラニン Ｔｙｒ　　　チロシン Ｔｒｐ　：　トリプトファン Ｐｒｏ：　　プロリン Ａｓｎ　　アスパラギン Ｇｌｎ　　：　　グルタミン Ａｓｐ／Ａｓｎ　　　アスパラギン酸およびアスパラギ
ン Ｇｌｕ／Ｇｌｎ　　：　　グルタミン酸およびグルタミ
ン 作用および実施例 以下の実施例および参考例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

なお参考例に開示した形質転換体、エノエリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｄ　ｌ−１１／
ｐＴ　Ｆ　４は財団法人発酵研究所（ＩＦＯンにＩ　Ｆ
　Ｏ−１４２９９として、また昭和５９年４月６日から
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＹ）
にＦＥＲＭ　　Ｐ−７５７８として寄託され、該寄託が
ブタペスト条約に基づく寄託に切換えられて、受託番号
ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２８として同研究所に保管されてい
る。

また、形質転換体、エノエリヒア・コリＮ４１１３０／
ｐＴ　［３２８５はＩＦＯにＩＦＯ−１４４３７として
、また昭和６０年４月３０日からＦｉｌｌにＦＥｒｔＭ
　　Ｐ−８１９９として寄託され、該寄託がブタベスト
条約に基づく寄託に切換えられて受託番号ＦＥｒｔＭ　
　ＢＰ−８５２として同研究所に保管されている。

実施ＰＩ　Ｉ　　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃによる【Ｌ−２とＭｅ
ｔ−ＩＬ−２との分離 参考例１（ｉｖ）で得られたＩＬ−２およびＭｅｔ　−
ＩＬ−２の混合物である非グリコ／ル化ヒトインターロ
イキノン−２を含む０．００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ５，０）（蛋白質濃度、１．１８＋ｇ／ｍｌ）
　５　＊Ｉ（５９ｍｇ）を０．０２５Ｍノエタノールア
ミンー塩酸緩衝液（ｐＨ９，４）で平衡化したＦＰＬＣ
用モノＰカラム（０，５Ｘ２０ｃｍ、ファルマンア社製
）にのせ、ついで　１％（Ｖ／　Ｖ）ファルマライト（
８−１０，５）−５，２％（ｖ／　ｖ）ポリバッファー
９６−塩酸緩衝液（ｐｉ−１８，０）を用いてモノＰカ
ラムに吸着したクツバク質を溶出した。なおＦＰＬＣは
室温下、流速３０ｍ１／ｈで行った。

その結果、第２図に示すようにｐｉ−１８，０で溶出さ
れるピークＬとｐＨ７，９で溶出されろビーク２とに分
離された。そこで、これらを分取後、ＦＰＬＣで用いた
ポリバッファーを除去するため、トリフルオロ酢酸−ア
セトニトリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラ
フィーを行った。

カラム、ウルトラボアＲＰＳＣ（１，０Ｘ２５ｃＩＩ＋
。

アルテックス社、アメリカ）：カラム温度、３０℃：溶
出溶媒Ａ、Ｏ，１％トリフルオロ酢酸−９９，９％水：
溶出溶媒８．０．１％トリフルオロ酢酸−９９９％アセ
トニトリル、溶出プログラム、０分（５５％Ａ＋４５％
Ｂ）−４分（５５％Ａ＋４５％Ｂ）−２８分（４２％Ａ
＋５８％［３）−３８分（３４％Ａ＋６６％Ｂ）−４３
分（２０％Ａ＋８０％Ｂ）−４４分（５５％Ａ＋４５％
Ｂ）；溶出速度３　、０　ｍｌ／　ｍｉｎ。

このクロマトグラフィーによって得られた溶液をそれぞ
れ凍結乾燥に付し、白色粉末を得た。ＦＰＬＣにおける
ピークｌおよびピーク２から得られたものを、それぞれ
ＰｌおよびＰ２となずけた。

ＰＩの収量は１．ｌ　２Ｂ（１９，０％）、Ｐ２の収量
は３．　　Ｏｌａｇ（５１，０％）であった。

次に得られたＰＩおよびＰ２について蛋白化学的分計を
行った。ＰｌおよびＰ２それぞれ４５μｇ（３ｎｍｏｌ
）を用い、気相プロテインノークエンサー（アプライド
・バイオノステムズ社製４７０Ａ型）を用いる自動エン
ドマン分解法によりＰｌおよびＰ２のアミノ末端アミノ
酸配列を決定した。

フェニルチオヒダントインアミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸
）はミクロパック５Ｐ−ＣＩ　８カラム（パリアン社製
）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより同定した
。各ステップで検出されたＰＴＨ−アミノ酸を第１表に
示す。

第　　　１　　　　表 サイクル　　検出されたＰＴＨ−アミ ノ酸（ｐｍｏｌ） ＰＩ　　　　　　Ｐ２ Ｉ　　　　　Ａｌａ　　　Ｍｅｔ　　　Ａｌａ　　　Ｍ
ｅｔ（２３３０）　（２１）　　（５６）　　（２６０
Ｇ）２　　　　　Ｐｒｏ　　　Ａｌａ　　　Ｐｒｏ　　
　Ａｌａ（＋６７０）　（７７）　　（３３）　　（２
４３Ｇ）３　　　　　Ｔｈｒ　　　Ｐｒｏ　　　Ｔｈｒ
　　　Ｐｒ。

４　　　　　Ｓｅｒ　　　Ｔｈｒ　　　Ｓｅｒ　　　Ｔ
ｈｒカルボキンキシ端アミノ酸の分析は次のようにして
行った。ずなわちＰｌおよびＰ２をヒドラノン分解用ガ
ラス管にとり、無水ヒドラノンを加えて減圧下に封管し
たのち１００℃で６時間加熱した。得られたヒドラジン
分解物をヘンズアルデヒド処理したのち、遊離アミノ酸
を日立製８３５型アミノ酸分析計により測定した。その
結果、ＰｌおよびＰ２ともにスレオニンのみが検出され
、回収率はそれぞれ３４８％および３４０％であった。

このことがらＰＩお上びＰ２のカルボキシル末端アミノ
酸はスレオニンと同定された。アミノ酸組成分析は４％
チオグリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて減圧下に封
管後、１１０℃で２４．４８．７２時間、加水分解し、
日立製８３５型アミノ酸分析計により実施した。ンスチ
ンおよびシスティンは過ギ酸酸化したのち、減圧不定沸
点塩酸中で２４時間加水分解してアミノ酸分析計により
ノステイン酸として定量した。アミノ酸分析値は２４．
４８および７２時間の加水分解で得られた１直を平均し
て求めた。ただし、セリンおよびスレオニンの値は加水
分解時間を０時間に外挿して求めた。その結果を第２表
に示す。アミノ末端アミノ酸配列分析およびアミノ酸組
成分析の結果から、Ｐｌは第１図中Ｘ＝水素原子で示さ
れる分子種（［Ｌ−２）を、Ｐ２は第１図中Ｘ＝メチオ
ニ’ｉ残基で示される分子Ｆｌ（Ｍｅｔ−Ｉ　Ｌ　−２
）をそれぞれ９８％および９９％以上の純度で含んでい
ることが確認された。

第　　　２　　　表 配列より予想 １”ｈｒ　　　　　　１２．６　１２．６　　　　Ｈ５
ｅｔ　　　　　　７．５　　７．５　　　８Ｇ　ｌｕ／
　Ｏｌｅ　　１８．６　１８．７　　　１８Ｐｒｏ　　
　　　　５．３　　５．３　　　５Ｇｌｙ　　　　　　
２．２　　２．２　　　２Ａ　ｌａ　　　　　　４．９
　　　０　　　　５１／２Ｃｙｓ　　　　２．６　　２
．８　　　３Ｖａｌ　　　　　　４．１　　４．１　　
　　４Ｖａｌ　　　　　　４．１　　５．１　　　　４
１ｉｅ　　　　　　８．６　　８．６　　　９しｅｕ　
　　　　　２１，８　２１．９　　　２２Ｔｙｒ　　　
　　　３．１３．２３ Ｐｈｅ　　　　　　６．０　　６．１　　　　６１、ｙ
ｓ　　　　　　１１．９　１１．９　　　１１Ｈｉｓ　
　　　　　３．０　　３．０　　　３Ａｒｇ　　　　　
　４．２　　４．２　　　４Ｔｒｐ　　　　　　１．１
　　１．１　　　　１次にアンフォライノＰＡＧプレー
ト（ＬＫＢ社製）を用いてＰＩおよびＰｌの等電点を測
定した結果を第３図に示す。原料として用いた！Ｌ−２
およびＭｅｔｌＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒ
トインターロイキン−２は等電点電気泳動では２本のバ
ンドを示すのに対し、本実施例で得られたＰｌおよびＰ
ｌは、それぞれ互いに泳動距離の異なる１本のバンドと
して泳動された。また、泳動後のＰＡＧプレート断片の
ｐＨを測定することにより、ＰＩ（［Ｌ−２）の等電点
は７．７、Ｐｌ（ＭｅｔｌＬ−２）の等電点は７．５と
算出された。

さらに、得られたＰｌに関して以下のようにしてトリプ
シン消化を行いペプチドマツプを得た。

すなわち、５０μｇのＰｌを含む０．０２Ｍ炭酸水素ナ
トリウム溶液（ｐＨ８，０）１００μｌに、１．２５μ
ｇのＴＰＣＫ−トリプシン（ワシントン社製、アメリカ
）を加えて３７℃で２８時間反応させた。反応液に１％
（Ｖ／Ｖ））リフルオロ酢酸４００μｌを加えて反応を
停止させた。得られた消化液について下記の条件下で高
速液体クロマトグラフィーを行い第４図に示すマツプを
得た。

高速液体クロマトグラフ：バリアン社（アメリプ７）５
０４０型 カラム・ヌクレオノル５ＣＩ８（マヘレーナーゲル社製
、西ドイツ） カラム温度：３０℃ 溶出溶媒：Ａ液、０．１％トリフルオロ酢酸−９９９％
水（ｖ／　ｖ） Ｂ液、０．１％トリフルオロ酢酸− ９９９％アセトニトリル （ｖ／　ｖ） 溶出プログラム、０分（８５％Ａ＋１５％Ｂ）−１５分
（７２％Ａ１２８％Ｂ）−１６分（６４％Ａ＋３６％Ｂ
）−８０分（４０％Ａ＋６０％Ｂ）−８５分（１５％Ａ
＋８５％Ｂ）［直線勾配］ 溶出速度：３．Ｏｍｌ／分 検出法：オルトフタールアルデヒド法［Ａｎａｌ、。

Ｃｈｅｍ、４３．８８０（１９７１）］によるボストラ
ベル法 実施例２　クロマトホーカンングによるＩＬ−２とＭｅ
ｔ−ＩＬ−２との分離 参考例１（ｉｖ）で得られたＩＬ−２およびＭｅｔ−■
し−２の混合物である非グリコシル化ヒトインターロイ
キン−２を含む０．００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（
ｐＨ５，０）（蛋白質濃度、１．０９■ｇ／ｍ１）５０
０Ｉｌｌ（５４５ａ＋ｇ）を０．０２５Ｍジェタノール
アミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９，４）で平衡化したＰＢＥ
９４Ｃ７アルマノア社製）カラム（２，７ｘ８７ａｍ）
にのせ、ついで溶出液として１％（Ｖ／Ｖ）ファルマラ
イト（８−１０，５）−５，２％（Ｖ／Ｖ）ポリバッフ
ァー９６−塩酸緩衝液（１１Ｈ８，０）を用いてクロマ
トホーカンングを行った。なお、この操作は４℃、流速
２００ｉ＋ｌ／ｈで行った。その結果、第５図に示すよ
うに、ｐＨ８，５で溶出されるピークｌとｐＨ８，３で
溶出されるピーク２とに分離された。実施例１で示した
同様の方法でボリバツアーを除去した後のタンパクの収
量はピーク１で９４．８ｍｇ　　（１７，４％）、ピー
ク２で３３６ｍｇ（６１６％）であった。また、アミノ
末端アミノ酸分析をダンノル化反応後、塩酸加水分解し
、生したダンノルアミノ酸をミクロパックＳＰカラムを
用いる漏速液体クロマトグラフィーで検出する方法でｉ
すった結果、ピークｌはＩＬ−２を９９．６％以上の純
度でピーク２はＭｅｔ−ＩＬ−２を９９５％以上の純度
で含んでいることか確認された。

実施ＰＩ３　　ＤＥＡＥ−１ヨパール　イオン交換クロ
マトグラフィーによるＩＬ−２ とＭｅｔ−［Ｌ−２との分離 参考例１（ｉｖ）で得られたＩＬ−２およびＭｅｔ−Ｉ
Ｌ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインターロイ
キン−２を含む０．００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（
ｐＨ５、０）（蛋白質濃度　１．０３ｍｇ／　ｍｌ）　
ｌ　Ｏｍｌ（１０、３ｍｇ）に等容のｌｏｍＭ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ１ｏ）を加えてｐｌ−１を８５に調整
したのち、１０１１１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８５
）で平衡化ＬＪ、：ＤＥＡＥ−１ヨバーｊｌ、６５０Ｍ
（東洋曹達工業（株）製）カラム（１，０Ｘ６４ｃｎ＋
）にのせ、ｌＯａ＋Ｍ）リスー塩酸Ｒ新液（ｐＨ８，５
）＋１とｌ　ＯｍＭ　ト’）　スー塩酸緩衝液（ｐＨ７
，０）ＩＩを用いるＩ）Ｈ勾配法で溶出を行った。なお
、この操作は４℃、流速１００ｍ１／ｈで行った。その
結果、分離能はＦ　ｆ）　Ｌ　Ｃやクロマトフォーカノ
ングに比べて劣っていたが、２つのピーク（ピーク１と
ピーク２）が検出された。それぞれのピークが重なり合
わないように、ピークｌは前半分をピーク２は後半分を
分取した。収量はピークｆで０．８２ｍｇ（８，０％）
、ピーク２で１．９８Ｂ　（１９，２％）であった。ま
た、ダンシル法にょるアミノ末端アミノ酸分析の結果、
ピーク１はＩＬ−２を９０％以上、ピーク２はＭＱ−Ｉ
Ｌ−２を９５％以上含んでいることが確認された。

実施例４　　ＦＰＬＣによるＩＬ−２とＭｅｔ−ＩＬ−
２との分離： 参考例＋（ｉｉｉ）で得られたＩＬ−２およびＭｅｔ−
ＩＬ−２を含む非グリコシル化ヒトインターロイキン−
２部分精製漂品５ｍｌを、０．０２５Ｍジェタノールア
ミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９，４）で平衡化したＦ　Ｐ　
Ｌ　Ｃ用モノＰカラム（０，５ｘ２０ｃ１１１゜ファル
マノア社製）にのせ、ついで１％（Ｖ／　Ｖ）ファルマ
ライト（８〜１０．５）−５，２％（ｖ／　ｖ）ポリバ
ッファー９６−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用いてモノ
Ｐカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出速度：２５
ｍ１／ｈ、カラム温度：室温。その結果、［Ｌ−２を含
む両分（ピーク１）とＭｅｔ−ＩＬ−２を含む画分（ピ
ーク２）とに分離された。ピークｌの活性回収率は２５
％、ピーク２の活性回収率は５４％であった。

実施例５　５ｌ−５ＰＷカラムによるＩＬ−２とＭｅｔ
−ＩＬ−２との分離 ？考例２で得られたＩＬ−２およびＭｅｔ−ＩＬ−２の
混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキン−２
を含む０．００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝１ｉｔ（ｐＨ
５，０，蛋白質濃度１．０３ｍｇ／ｍ１）０．５ｍｌを
００２５Ｍリン酸緩衝液（Ｉｌ１８７．４）で平衡化し
た高速液体クロマトグラフィー用５Ｐ−５ＰＷカラム（
Ｑ、７５ｘ７　、５ｃ＋ｎ　：東洋曹達社製）にのせ０
．０２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて蛋白質
を溶出した。カラム温度は３５℃に、緩衝液の流速は０
．５ｍｌ／ｗｉｎに設定した。クロマトグラフッステム
はバリアン社製５５００型液体クロマトグラフを用いた
。

その結果１７図に示すように、非グリコシル化イノター
ロイキン−２は２つのピーク（ピークＡおよびピークＢ
）として溶出された。それぞれのピークを分取しく図中
■で示す）アミノ末端アミノ酸の分析を行った結果、ピ
ークＡはＭｅｔ　　ＩＬ−２を、ピークＢはＩＬ−２を
それぞれ９９．５％以上の純度で含んでいることが確認
された。

実施例６　　ＦＰＬＣによる［ＦＮ−ａＡとＭｅｔ−Ｉ
ＦＮ−ａＡとの分離 参考例３記戦の方法によって得られたＩＦＮへａＡおよ
びＭｅｔ−ＩＦＮ−ａＡの混合物である非グリコシル化
ヒトインターフェロンαＡを含む０．１２Ｍ塩化ナトリ
ウム−０，０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，
０Ｍ蛋白質濃度、２．９６ａ＋ｇ／　ｍｌ）１．Ｏｍ！
（２，９６ｍｇ）を０．０２５Ｍイミダゾール−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，７）で平衡化したＰＤ−１０カラム（１
，５％５ｃｍ。

ファルマノア社製）にのせ脱塩を行った。この上うにし
て得られた非グリコシル化ヒトインターフェロンα＾を
含む溶出液（蛋白質濃度、１．５−Ｒｍｇ／ｍ１）１．
５ｍ１（２，３７ｍｇ）を０．０２５Ｍイミダゾール−
塩酸緩衝液（＋１ｌ−ｒ６．７）で平衡化したＦＰＬＣ
用モノ■）カラム（０，５ｘ　２０ｃｍ、ファルマンア
社製）にのせ、ついでｔａ％（ｖ／ｖ）ポリバー／７７
−７４−塩酸緩衝液（ｐＨ５，５）を用いてモノＰカラ
ムに吸着した蛋白質を溶出した。なおＦＰＬＣは室温下
、流速３０ｍ１／ｈて行った。

その結果、第８図に示すようにｐＨ５，６で溶出される
ビーク１とｐＨ５，４で溶出されるビークｌとして分離
された。そこで、これらを分取後、ＦＰＬＣて用いたポ
リバッファーを除去するため、トリフルオロ酢酸−アセ
トニトリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフ
ィーを行った。

カラム、ウルトラボアＲＰ　Ｓ　Ｃ（１，ＯＸ　２５ｃ
ｍ、アルテックス社製）７カラム温度、３０℃、溶出溶
媒Ａ。

０１％トリフルオロ酢酸−９９９％水：溶出溶媒Ｂ、０
．１％トリフルオロ酢酸−９９９％アセトニトリル：溶
出プログラム、０分（６０％Ａ＋４０％Ｂ）−４５分（
４５％Ａ＋５５％Ｂ）−４６分（６０％Ａ＋４０％Ｂ）
、溶出速度３．０ｍｌ／ｗｉｎ−ｏ　このクロマトグラ
フィーによって得られた溶液をそれぞれ凍結乾燥に付し
、白色粉末を得た。Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ＋、：おけるビーク
１およびビークＵから得られたものを、それぞれＰｌお
よびｐｎとなずけた。ＰＩの収量は０．７２３＋ｎｇ（
２４，４％）。

ＰＨの収量は０．９４５ｍｇ（３１，９％）であった。

次に得られたＰＩおよびＰ［Ｉについて蛋白化学的分析
を行った。ＰＩおよびＰＨを還元カルボキンメチル化し
たのち、それぞれ４Ｑｔｔｇ（２，ｌｎｍｏｌ）を用い
、気相プロティノンークエンサー（アプライド・パイオ
ノステムズ社製４７０Ａ型）を用いる自動エドマン分解
法によりＰｌおよびＰＩＩのアミノ末端アミノ酸配列を
決定した。フェニルチオヒグントインアミノ酸（ＰＴＨ
−アミノ酸）はミクロバック５Ｐ−ＣＩ８カラム（パリ
アン社製）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより
同定した。、各ステップで検出されたＰＴＨ−アミノ酸
を第３表に示す。

第　　３　　表 Ｐ　［１）■ Ｉ　　ＣａＣｙｓ　ＭｅＬ　　ＣｍＣｙｓ　Ｍｅｔ（２
ｇ）　（１８３０）　（１３７０）　（１５）２　　Ａ
ｓｐ　ＣｍＣｙｓ　　Ａｓｐ　Ｃ＋１ｌＣｙｓ（２０）
　（１２５０）　（１２２Ｇ）　（２１）３　　　　　
　　　　Ｌｅｕ　　　　　ＡＳｐ　　　　　　Ｌｅｕ　
　　　　　Ａｓｐ４　　　　　　　　　ｔ’ｒｏ　　　
　　Ｌｅｕ　　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　Ｌｅｕカ
ルホキノル末端アミノ酸の分析を実施例１と同様にして
行った結果、ＰＩおよびｐＨともにグルタミン酸のみが
検出され回収率はそれぞれ１２５％および【４，３％で
あった。

アミノ酸組成分析を実施例１１と同様にして行った結果
を第４表に示す。アミノ末端アミノ酸配列分析およびア
ミノ酸組成分析の結果から、ＰＩはｉ２図図中−メチオ
ニン残基で示される分子種（Ｍｅｔ　−Ｉ　ＦＮ−ａＡ
）を、ＰＩＮは第２図中Ｘ＝水素原子で示される分子種
（ｒＦＮ−ａＡ）をそれぞれ９８％以上の純度で含んで
いることが確認された。

第　　４　　表 より予想され Ｔｂｒ　　　　　　９．７　９．７　　　　　１０Ｓｅ
ｒ　　　　　　１２．９　１２．５　　　　　１４Ｇｌ
ｕ／Ｇｉｎ　　　　２６．１　２６．［ｌ　　　　　　
２６Ｐｒｏ　　　　　　５．０　４．９　　　　　　５
ｃｒｙ　　　　　　４．９　４．９　　　　　　５Ａｌ
ａ　　　　　　８．１　８．１　　　　　８１／２Ｃｙ
ｓ　　　　　３．３　３．９　　　　　４Ｖａｌ　　　
　　　　７．２　７．１　　　　　７Ｎｅｔ　　　　　
　８．１　５．１　　　　　　５１ｉｅ　　　　　　７
．９　７．８　　　　　８Ｌｅｕ　　　　　　２Ｇ、８
　２０．６　　　　　２１Ｔｙｒ　　　　　　５．２　
５．１　　　　　　５Ｐｈｅ　　　　　　９．９　９．
８　　　　　１０Ｌｙｓ　　　　　　１１．０　１１．
＋　　　　　　１１Ｈ４ｓ　　　　　　３．５　３．４
　　　　　３Ａｒｇ　　　　　　８．８　８．８　　　
　　９また、アンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社
製）を用いてＰＩおよびＰ■の等電点を測定した結果、
Ｐ　［（Ｍｅｔ　−［ＦＮ−αＡ）の等電点は６．３．
　Ｐ　ＩＩ（Ｉ　ＦＮ−αＡ）の等電点は６２と算出さ
れた。

実施例７　１Ｌ−２注射用製剤・ 実施例１で得られたＩＬ−２含有溶液を、０．０２５Ｍ
酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化した０
Ｍトヨパール（東洋曹達工業（株））カラムに無菌条件
下で吸着させ、０　」５ＭのＮａＣ１を含む上記緩衝液
で溶出させる。溶出液に０．１５ＭＮａｃｌを適宜加え
て希釈し、Ｈ９Ａを０．５％になるように添加してメン
ブランフィルタ−（孔径０．２２μｍ）を用いてろ過後
、得られたろ液を無菌的にｆｉｌずつバイアル瓶に分注
して凍結乾燥し、注射用［Ｌ−２を調製する。本注射用
製剤は、用時注射用蒸留水１ｍｌに溶解する。

実施例８　１ＦＮ−αＡ注射用製剤： 実施例６で得られた［ＦＮ−αＡ含有溶液を、０、（１
２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化
したＣＭ）ヨパール（東洋曹達工業（株））カラムに無
菌条件下で吸着させ、０．１５ＭのＮａＣ１を含む上記
緩衝液で溶出させる。溶出液に０．１５ＭＮａＣ１を適
宜加えて希釈し、１１　Ｓ　Ａを０５％になるように添
加してメンプラノフィルター（孔径０．２２μｍ）を用
いてろ過後、得られたろ液を無菌的にｌ＋１ずつバイア
ル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用ＩＦＮ−αＡを調製
する。本注射用製剤は、用時注射用蒸留水ｆＩｌｌに溶
解する。

上記注射用製剤は、それぞれ上記精製ＩＬ−２およびＩ
ＦＮ−αＡを、精製Ｍｅｔ−［Ｌ−２およびＭｅｔ−Ｉ
ＦＮ−αＡに置き換えることにより、Ｍｅｔ−ＩＬ−２
およびＭｅｔ−ＩＦＮ−αＡの注射用製剤とすることが
できる。

参考例」　非グリコシル化ヒトインターロイキン−２の
製造　１ （ｉ）　　形質転換体の培養 形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＩ−ＩＩ／ｐＴＦ４［特
願昭５８−２２５０７９号（昭和５８年１１月２８日出
願）明細書参照、該出願は特開昭６０−１１５５２８号
公報に対応するコを２５０ｍ１容三角フラスコ内のバク
ト・トリプトン（ディフコ・ラボラトリーズ、アメリカ
）１％、バクト・イーストエキス（ディフコ・ラボラト
リーズ、アメリカ）０．５％１食塩　０．５％およびテ
トラサイクリン７μｇ／ａ＋１を含む液体培地（ｐＨ７
，０）５０ｍｌに接種して３７℃で１晩回転振盪培養し
た。この培養液をカザミノ酸０．５％、グルコース０．
５％およびテトラサイクリノアμｇ／ｍｌを含むＭ９培
地２．５１の入った５１容ツヤ−ファーメンタ−に移し
３７℃で４時間、ついて３−βインドリルアクリル酸（
２５μｇ／ｌ）を添加して、さらに４時間通気陸拌培養
して培養液２，５Ｑ得た。この培養液を遠心分離し一閑
体を集め、−８０℃で凍結して保存した。

（ｉ墨）抽出 上記で得た凍結保存菌体１２．１ｇを７Ｍ塩酸グアニノ
７，０．ＩＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩを含む抽出液（ｐＨ
７，０）ｌ　００Ｉｌｌｌに均一に懸濁し、４℃で１時
間攪拌した。この溶菌液を２８．０００ｘｇで２０分間
遠心分離して上ｉｆｆ９３ｍｌを得た。

（ｉｉｉ）　　インターロイキン−２蛋白質の部分精製
」−記で得た上清をＯ，ＯＩＭ’Ｔｒｉｓｌ（ＣＩ緩衝
液（ｐＨ８，５）に対して透析後１９．ｏｏＯＸｇで１
０分間遠心分離して透析上清９４ｍ１を得た。この透析
上清をＯ，ＯＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩＪ衝液（ｐＨ８，５
）で平衡化したＤＥ５２（ＤＥＡＥ−セルロース、ワッ
トマン社製、イギリス）カラム（５０ｍｌ容）に通して
蛋白を吸着後、ＮａＣ１ｆ５度直線勾配（０〜Ｏ，ｌ　
５ＭＮａＣ１，ｌｌ）を作成してＩＬ−２を溶出させ、
活性画分５３ｍ１を得た。

（１ｖ）　　インターロイキン−２蛋白質の精製上記の
活性画分５３ｍ１をＹＭ−５メンプラン（アミコン社製
、アメリカ）を用いて４．８１１＋１に濃縮し、０、Ｉ
ＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ＰＨ８，０）−１ＭＮａｃｌ緩衡
液で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマノア
社製、スエーデン）カラム（５００ｍｌ容）を用いてゲ
ルろ過を行った。活性画分２８ｍ１をＹＭ−５メンプラ
ンで２５ｍｌに濃縮した。（昇られた濃縮液をウルトラ
ボアＲＰＳＣ（アルテックス社製、アメリカ）カラムに
吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出
溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った。カラ
ム、ウルトラボアＲＰ　Ｓ　Ｃ（４、６ｘ’７５１１ｍ
）：カラム温度、３０℃、溶出溶媒Ａ、Ｏ，１％トリフ
ルオロ酢酸−９９９％水、溶出溶媒８．０．１％トリフ
ルオロ酢酸−９９９％アセトニトリル、溶出プログラム
、０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−２５分（５５％Ａ＋４
５％ｌ３）−３５分（４５％Ａ＋５５％Ｂ）−４５分（
３０％Ａ＋７０％Ｂ）−４８分（１００％Ｂ）；溶出速
度、　０　、８　ｍｌ／ｗｉｎ；検出波長、２３０ｍｍ
。

本条件下で保持時間約３９分の活性画分を集め、非グリ
コシル化ヒトインターロイキン−２蛋白質０．５３ｍｇ
［比活性、３０．０００　Ｕ／ｐｇ、出発材料からの活
性回収率、３０６％：蛋白質の純度。

９９％（デンソトメトリーによる）〕を含む溶液＋００
１１を得た。

なお上記溶液の凍結乾燥品（白色粉末）の比活性は２６
　、ＯＯＯＵ／ｍｇであった。

参考例２　非グリコシル化ヒトインターロイキン−２の
製造　■ （ｉ）　　発現用プラスミドの構築 ヒトＩＬ−２遺伝子を有するプラスミドｐｌＬＯＴ１３
５−８　［特願昭５８−２２５０７９号（昭和５８年１
１月２８日出願）明細書（特開昭６０−１１５５２８号
公報に対応）実施例１（ｖｉ）参照］を制限酵素■土＾
ｌで切断した。得られた１２９４ｂｐＤＮ＾断片をＴ４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて、釘ｏＲＩリンカ−ｄＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧＧＣＡを結合させた。得られたＤＮＡを除重
で消化し、翻訳開示コドンＡＴＧおよびヒトＩＬ−２遺
伝子を有するＤＮＡ断片を得た。

このＤＮＡ断片を、あらかじめＥｃｏＲＩ−Ｐｓυ部位
を消化したｐｔｒｐ７ｇＨヌクレイツク・アノズ・リサ
ーチ、ｉｕａ、　３０７７頁ｏ９８３）］ニｒ　４　Ｄ
ＮＡ　ＩＪガーゼを用いて挿入した。かくして得られた
発現用プラスミドｐＴＦｌはＬｒｐプロモーターの下流
に翻訳開示コドンとヒトＩＬ−２遺伝子を有する（第９
図）。

旧リンカ−と結合させた。このプラスミドＤ　Ｎ　Ａを
制限酵素匣１！１および険旦旧で処理し、ついで１組旧
−Ｂａｔ　Ｉ１１部位にλＰしプロモーターを有するプ
ラスミドｐＴＢ２８１に挿入した。かくして得た発現用
プラスミドをｐＴＢ２８５と命名した（第１０図）。

（ｉｉ）　　形質転換体の製造 上記で得たプラスミドｐＴ８２８５でエシェリヒアコリ
Ｎ４８３Ｇをコーエンらの方法［プロン−ノンゲス・オ
ブ・ナンヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒ
ｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、第
６９巻、　２１１Ｑ頁（１９７２）］に従い形質転換し
、上記プラスミドを含有する形質転換体エシェリヒア　
コリ！１４８３０／ｐＴＢ２８５を得た。

（ｉｉｉ）　　形質転換体の培養 形質転換体Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｎ４８３０／ｐＴＢ２８５
を２５０ｍ１容フラスコ内のバクト・トリプトン（ディ
フコ・ラボラトリーズ、アメリカ）１％、バクト・イー
ストエキス（ディフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）０
．５％。

食塩０．５％およびアンピンリン５０μｇ／ｍｌを含む
液体培地（１）Ｉｔ　７．０）５０ｍｌに接種して３７
℃で−晩回転振但培養した。この培養液をカザミノ酸０
５％、グルコース０．５％およびアンピノリン５０μｇ
／ｍｌを含むＭ９培地２．５２の入った５Ｑ容ジヤーフ
アーメツターに移し３５℃で６時間、ついで４２℃でさ
らに３時間通気攪拌培養して培養液２．’５Ｑを得た。

この培養液を遠心分離し、菌体を集め、−８０℃て凍結
して保存した。

（ｌｖ）　　抽出 凍結菌体２０ｇを７Ｍ塩酸グアニジンＯ，１Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−１１ＣＩを含む抽出（ｐＨ７，０）ｌＱＯｍｌに均
一に廿澗し、４℃で１時間攪拌した後、２８．０００ｘ
ｇで２０分間遠心分離し−にｌｉをｉすた。

（ｖ）　　インターロイキン−２蛋白質の部分精製得ら
れた上演を０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩＩＩ衝液（
ｐＨ８，５）に対してａｆｒ後１９．０００Ｘｇで１０
分間遠心分離して得た上清を０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔ
ｌｃｌ緩衝液（ｐＨ３，５）で平衡化したＤＥ５２（Ｄ
ＥＡＥ−ゼルロース、ワブトマン社製。

イギリス）カラム（５０ｍｌ容）に通して蛋白を吸着後
、ＮａＣｌａ度直線勾配（０〜Ｑ、１５Ｍ　　ＮａＣ１
，Ｉ　Ｑ）を作成して、ＩＬ−２を溶出させ、活性画分
を得た。

（ｖｉ）　　インターロイキノ−２蛋白質の精製上記で
得られた活性画分をＹＭ−５メンプラン（アミコン社製
、アメリカ）を用いて、５ｍｌにａ縮し、ｆｌ、ＩＭ　
Ｔｒｉｓ−１（Ｃｌ（ｐＨ８，［ｌ）　−１Ｍ　ＮａＣ
１緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファル
マノア製、スウェーデン）カラム（５００ｍｌ容）を用
いてゲルろ過を行った。活性画分４０ｍ１をＹＭ’−５
メンプランで３ｍｌに濃縮した。得られた濃縮液を、ウ
ルトラボアＲＰＳＣ（アルテックス社製、アメリカ）カ
ラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系
を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った
。カラム、ウルトラボアＲＰＳＣ（４，６ｘ　７５ｍｍ
）；カラム温度、３０℃・溶出溶媒Ａ、’０．１％トリ
フルオロ酢酸−９９９％水：溶出溶媒Ｂ、　０．１％ト
リプルオロ酢酸−９９９％アセトニトリル、溶出プログ
ラム、０分（６８％＾＋３２％Ｂ）−２５分（５５％＾
＋−４５％Ｂ）−３５分（４５％Ａ＋５５％Ｂ）−４５
分（３０％Ａ＋７０％Ｂ）　−４８分（１００％Ｂ）：
溶出速度、　０．８ｍｌ／＋ｉｎ；検出波長、２３０１
ｍ０木条件下で保持時間約３９分の活性画分、＾Ｉａ−
［Ｌ−２およびＭｅｔ−Ａｌａ−［Ｌ−２の混合物１０
ｍ１４：集めた。

参考例３　非グリコシル化ヒトＩＦＮ−αＡの製造 （１）形質転換体の培養 第２図に示すアミノ酸配列をコードするヒト！ＦＮ−α
Ａ遺伝子を組入れた発現プラスミドを持ツエンエリヒア
　コリ２９４（＾ＴＣＣ３１４４Ｂ）／ｐＬｅｌＦＡｔ
ｒｐ２５［ＥＰｃ公開第４３９８０号公報実施例１参照
］を、Ｍ−９培地にグルコース２５ｇ／Ｌ　Ｌ−グルタ
ミン酸ナトリウム４　ｇ／Ｉ！、　ＦｅＣ１５・６Ｈｔ
Ｏ２７ｍｇ／Ｉ！、　Ｃｕ５Ｏ，Ｈ５ＨｙＯ８ｍｇＩＱ
、　ＺｎＳＯ４・７１１，０　８ｍｇ／Ｉ！、　　ビタ
ミンＢ。

塩酸塩７ｈｇ／Ｌ塩酸テトラサイタリン５　ｍｇ／Ｌ　
Ｌ−プロリン５０１１ｇ／Ｑおよびｌ、−ａイノ７５０
ｍｇ／Ｑを添加した培地（合成培地）夫々２．５Ｑを仕
込んだ５Ｑ容ツヤ−ファーメンタ−へ接種し、通気２．
５Ｏ１分。

攪拌１０００ｒ、ｐ、ｍ、　、３７℃で培養を開始し、
途中００３０００ＫＵ　テ３３℃、　５０００ＫＵ　テ
２９℃、７０００ＫＵ　テ２５℃に温度を下げて４８時
間培養を続けた。培徨中溶存酵素蟲度は５％以上に保た
れた。途中培養液中のグルコースａ変が１％以下に低下
した時、２５ｇ／ｌ！の割合でグルコースを添加した。

（ｉｉ）　　抽出 （ｉ）で得られた培養液２Ｑを遠心分離して菌体を集め
、これを１００Ｉｌ＋ｌの１０％ツユクロース、Ｉｌ、
２ＭＮａＣ１，ｉｏ＋ｅＭエチレンジアミノテトラアセ
テート（ＥＤＴＡ）、　ｌｏｓＭスベルミノン、２ｄフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド ームを含む５０ＭＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣＩ（ｐＨ　７．
６）に懸濁し、４℃で１時間攪拌したのち、３７℃で５
分間保温し、これをさらに超音波破砕器（アルテブク社
製．米国）で、０℃４０秒処理した。この溶菌液を１１
．３００Ｘｇで１時間遠心分離して上清９５ｍｌを集め
た。

（山）、ＩＦＮ−αＡ蛋白質の精製 この上清９５ｍｌをｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ．　０．１５Ｍ
　ＮａＣｌを含む２ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐＨ
　７．６）（ＴＥＮ）で３００ｍｌに希釈したのち、抗
ＩＦ−αＡ抗体カラム（２０ｍｌ）にかけた。

ＴＥＮで十分洗浄したのち、さらにＯ１％トウイーン２
０（和光純薬工業株式会社製）を含む０．２Ｍ酢酸でＩ
Ｆ−αＡを溶出し活性画分を集め、ｐＨ４、５にＲ整し
たのち０Ｍセルロースカラムに吸着させ、十分洗浄後、
０．１５１１　ｔｌａｃＩを含む０．０２５Ｍ酢酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ５，０）にて溶出した。再び活性
画分を集めて凍結乾燥に付し３２０ｍｇのヒト白血球＋
　１”−αＡ扮末を得た。

このものの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
による分子量は、１９０００±１０００であった。

また、ここで得られた最終のヒト白血球ＩＦ蛋白質の比
活性は　２　Ｘ　ＩＱ’Ｕ／ｍｇであっｒ為また、その
池の理化学的性状、アミノ酸組成、ベプチドマソビノグ
において、従来の培地で生産される遺伝子組換えヒト白
血球ＩＦと全く同一の挙動を示した。

発明の効果 本発明により蛋白質と該蛋白質にさらにメチオニン残基
が付加した蛋白質との相互分離が可能である。

該分離方法により得られる蛋白質は、それぞれ医薬品等
として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例１で得られた非グルコツル化ヒトインタ
ー〇イキノン−２蛋白質の、第２図は参考例３で得られ
た非グリコンル化ヒトインターフェロン−αＡ蛋白質の
アミノ酸配列（図中Ｘは、水素原子またはメチオニン残
基を表わす）を示す。 第３図は実施例１におけるＦＰＬＣの結果を、第４図は
等電点電気泳動の結果を、第５図はトリプノン消化ペプ
チドマツピングの結果をそれぞれ示す。第６図は実施例
２におけるクロマトホーカシングの結果を、第７図は実
施例５における５Ｐ−５ＰＷイオン交換クロマトグラフ
イーの結果を、第８図は実施例６におけるＦＰＬＣの結
果をそれぞれ示す。第９図および第１Ｏ図は参考ＩＦＩ
Ｉ３に開示するプラスミドｐＴＦｌおよびｐＴ８２８５
の構築図をそれぞれ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が付加し
   、該蛋白質と同様の生理活性を有する蛋白質の混合物を
   等電点の差異に基づく分離手段に付すことを特徴とする
   蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した蛋白質と
   の相互分離方法。 （２）分離工程が（ｉ）電場の中で蛋白質の混合物を泳
   動させる方法、または（ｉｉ）荷電担体に付加した蛋白
   質の混合物を、ｐＨ勾配または塩濃度勾配を作成して等
   電点の差異をもたらす荷電の相異に従って担体から順に
   脱離して溶出させる方法である特許請求の範囲第１項記
   載の分離方法。 （３）電場の中で蛋白質の混合物を泳動させる方法が、
   密度勾配等電点電気泳動法、ゲル等電点電気泳動法また
   は等速度電気泳動法である特許請求の範囲第２項記載の
   分離方法。 （４）荷電担体に付加した蛋白質の混合物を荷電の相異
   に従って担体から順に脱離して溶出させる方法が、クロ
   マトホーカシング法、ファースト・プロテイン・リキッ
   ド・クロマトグラフ法、ジエチルアミノエチル−イオン
   交換カラムクロマトグラフ法、カルボキシメチル−イオ
   ン交換カラムクロマトグラフ法またはスルホプロピル−
   イオン交換カラムクロマトグラフ法である特許請求の範
   囲第２項記載の分離方法。 （５）メチオニン残基が付加した蛋白質が、アミノ末端
   に付加したメチオニン残基を有する蛋白質である特許請
   求の範囲第１項記載の分離方法。 （６）付加したメチオニン残基が、蛋白質のアミノ末端
   のみである特許請求の範囲第５項記載の分離方法。 （７）蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が付加し
   た蛋白質が、遺伝子工学技術で製造された蛋白質である
   特許請求の範囲第１項記載の分離方法。 （８）蛋白質が、サイトカイン、ペプチドホルモン、病
   原性微生物抗原蛋白質、酵素または血中蛋白成分である
   特許請求の範囲第１項記載の分離方法。 （９）蛋白質の分子量が約３，０００〜５０，０００で
   ある特許請求の範囲第１項記載の分離方法。 （１０）分子量が５，０００〜３０，０００である特許
   請求の範囲第９項記載の分離方法。 （Ｉ１）蛋白質が３０〜５００のアミノ酸からなる蛋白
   質である特許請求の範囲第１項記載の分離方法。 （１２）５０〜３００のアミノ酸からなる蛋白質である
   特許請求の範囲第１１項記載の分離方法。 （１３）蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した
   蛋白質の等電点が約４〜１１である特許請求の範囲第１
   項記載の分離方法。 （１４）蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した
   蛋白質の等電点が約５〜８である特許請求の範囲第１項
   記載の分離方法。 （１５）蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した
   蛋白質との等電点の差が約０．０１以上である特許請求
   の範囲第１項記載の分離方法。 （１６）蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した
   蛋白質との等電点の差が約０．１以上である特許請求の
   範囲第１項記載の分離方法。 （１７）蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した
   蛋白質との等電点の差が約０．０１〜０．２である特許
   請求の範囲第１項記載の分離方法。 （１８）蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基を有する蛋
   白質が非グリコシル化蛋白質である特許請求の範囲第１
   項記載の分離方法。 （１９）蛋白質がサイトカインである特許請求の範囲第
   １項記載の分離方法。 （２０）サイトカインがインターロイキン−２である特
   許請求の範囲第１９項記載の分離方法。 （２１）インターロイキン−２が第１図（但しＸは水素
   原子を示す）で表わされるアミノ酸配列からなる非グリ
   コシル化蛋白質である特許請求の範囲第２０項記載の分
   離方法。 （２２）サイトカインがインターフェロンである特許請
   求の範囲第１９項記載の分離方法。 （２３）インターフェロンがインターフェロン−αであ
   る特許請求の範囲第２２項記載の分離方法。 （２４）インターフェロン−αが第２図（但しＸは水素
   原子を示す）で表わされるアミノ酸配列からなる非グリ
   コシル化蛋白質である特許請求の範囲第２３項記載の分
   離方法。 （２５）蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した
   蛋白質の混合物の純度が約５０％以上である特許請求の
   範囲第１項記載の分離方法。 （２６）蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した
   蛋白質の混合物の純度が約９９％以上である特許請求の
   範囲第１項記載の分離方法。 （２７）非グリコシル化インターロイキン−２とそのア
   ミノ末端にさらにメチオニン残基を有する非グリコシル
   化インターロイキン−２との混合物を、クロマトホーカ
   シング法、ファースト・プロテイン・リキッド・クロマ
   トグラフ法、ジエチルアミノエチル−イオン交換クロマ
   トグラフ法またはスルホプロピル−イオン交換クロマト
   グラフ法に付し、非グリコシル化インターロイキン−２
   とそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有する非グ
   リコシル化インターロイキン−２とを相互に分離する特
   許請求の範囲第１項記載の分離方法。 （２８）非グリコシル化インターロイキン−２が、第１
   図（但しＸは水素原子を示す）で表わされるアミノ酸配
   列からなる非グリコシル化インターロイキン−２である
   特許請求の範囲第２７項記載の分離方法。 （２９）非グリコシル化インターフェロン−αＡとその
   アミノ末端にさらにメチオニン残基を有する非グリコシ
   ル化インターフェロン−αＡとの混合物を、ファースト
   ・プロテイン・リキッド・クロマトグラフ法に付し、非
   グリコシル化インターフェロン−αＡとそのアミノ末端
   にさらにメチオニン残基を有する非グリコシル化インタ
   ーフェロン−αＡとを相互に分離する特許請求の範囲第
   １項記載の分離方法。 （３０）非グリコシル化インターフェロン−αＡが第２
   図（但しＸは水素原子を示す）で表わされる非グリコシ
   ル化インターフェロン−αＡである特許請求の範囲第２
   ９項記載の分離方法。 （３１）メチオニン残基が付加した蛋白質を実質的に含
   有しない遺伝子工学技術で製造された蛋白質。 （３２）アミノ末端にメチオニン残基が付加したインタ
   ーロイキン−２を実質的に含有しないインターロイキン
   −２である特許請求の範囲第３１項記載の蛋白質。 （３３）アミノ末端にメチオニン残基を有するインター
   フェロン−αを実質的に含有しないインターフェロン−
   αである特許請求の範囲第３１項記載の蛋白質。 （３４）メチオニン残基が付加した蛋白質の含有率が３
   ％以下である特許請求の範囲第３１項記載の蛋白質。 （３５）メチオニン残基が付加した蛋白質がアミノ末端
   にメチオニン残基が付加した蛋白質である特許請求の範
   囲第３４項記載の蛋白質。