ITRM960017A1

ITRM960017A1 - Molecole chimeriche ribozima-snrna ad attivita' catalitica per rna a localizzazione nucleare

Info

Publication number: ITRM960017A1
Application number: IT96RM000017A
Authority: IT
Inventors: Irene Bozzoni
Original assignee: Univ Roma
Priority date: 1996-01-12
Filing date: 1996-01-12
Publication date: 1997-07-12
Also published as: DE69613336T2; EP0784094A1; IT1283876B1; US5994124A; EP0784094B1; DE69613336D1; ATE202143T1; ITRM960017A0; ES2160796T3

Abstract

Sono descritte molecole chimeriche ricombinanti snRNA-ribozima da utilizzarsi in terapia per una efficiente veicolarizzazione in vivo di molecole ad attività catalitica per RNA substrato. In un aspetto preferito le molecole sono utilizzate contro RNA virali, ad esempio RNA di HIV.

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione dal titolo:

“Molecole chimeriche ribozima-snRNA ad attività catalitica per RNA a localizzazione nucleare”

La presente invenzione concerne molecole chimeriche ribozima-snRNA ad attività catalitica per RNA a localizzazione nucleare.

Più in particolare l’invenzione riguarda molecole chimeriche ribozima-snRNA, in cui la componente ribozima esercita la propria attività catalitica su specìfici RNA bersaglio, e la componente snRNA funziona come vettore per una efficiente veicolarizzazione della molecola stessa al sito bersaglio. Le molecole dell’invenzione trovano una utilizzazione nel campo della ricerca biomedica e tutte le volte si desideri veicolare in maniera specifica un ribozima al suo specifico bersaglio, per esempio nelle terapie antivirali, in particolare per la immunizzazione intracellulare anti-HIV (virus della immunodeficienza umana).

I ribozimi sono molecole di RNA ad attività endonucleolitica (catalitica) per specifiche sequenze di RNA substrato. I ribozimi mostrano tale attività sia in vivo che in vitro (1,2,3). E’ noto l’uso di alcuni ribozimi come molecole anti-HIV in vitro (4,5,6). Gli snRNA U1 sono molecole con strutture tridimensionali ad ansa e forcina (“sterri loop”), che sono numerate progressivamente dal 5' al 3’ della molecola (7).

Gli snRNA (piccoli RNA nucleari) sono RNA coinvolti nel processo di rimozione degli introni (“splicing") da RNA precursori nucleari (pre-mRNA). Lo snRNA U1 è coinvolto in una delle prime tappe del processo di “splicing”.

Uno dei problemi maggiori per quel che concerne l’uso in vivo dei ribozimi per terapia è che, mentre in vitro queste molecole e i loro substrati diffondono lìberamente, nelle cellule gli RNA sono confinati a specifiche localizzazioni cellulari. Anche gli RNA esogeni, virali, sono compartimentalizzati in vivo, riducendosi così la possibilità di interazione con i ribozimi e l’uso di questi in terapia.

Risulta pertanto evidente l’esigenza di mettere a punto nuove strategie per direzionare i ribozimi a specifici compartimenti cellulari.

L’autore della presente invenzione ha sviluppato molecole chimeriche in grado di veicolare in maniera specifica in vivo i ribozimi al compartimento cellulare in cui è presente l’RNA bersaglio, fornendo pertanto potenziali agenti terapeutici selettivi e specifici. Le molecole dell’invenzione comprendono una componente derivata da ribozima ad attività catalitica per un RNA bersaglio ed una componente vettore, in grado di veicolare in maniera specifica la molecola stessa al compartimento cellulare di interesse. In un aspetto preferito dell’invenzione nel caso che il compartimento cellulare sia il nucleo, la componente vettore è costituita da un snRNA.

L’autore dell’invenzione ha utilizzato snRNA da X. laevis e umani e ha dimostrato la corretta compartimentalizzazione in vivo delle molecole chimeriche da essi derivati, nonché l’attività catalitica utilizzando come substrato bersaglio il pre-mRNA REV del virus HIV.

Inoltre, l’autore dell’invenzione ha vantaggiosamente modificato la sequenza nucleotidica della componente vettore per ottenere un legame ottimale con l’RNA bersaglio.

Forma pertanto oggetto dell’invenzione una molecola chimerica comprendente:

- una componente vettore in grado di veicolare la molecola stessa a un RNA substrato bersaglio;

e, covalentemente legata ad essa.

- una componente derivata da un ribozima ad attività catalitica per detto RNA substrato bersaglio.

Preferibilmente la componente vettore è derivata da un snRNA, a condizione che detto RNA substrato bersaglio sia localizzato nel nucleo, più preferibilmente detto snRNA è lo snRNA U1.

In un aspetto preferito dell’invenzione lo snRNA è di X. laevis o di mammifero, preferibilmente umano.

In un aspetto preferito dell’invenzione una parte della sequenza nucleotidica di detto snRNA U1 è sostituita con la porzione di sequenza di un ribozima con attività catalitica per un RNA substrato bersaglio, a condizione che la sostituzione non riduca sostanzialmente la capacità di detto snRNA U1 di veicolare la molecola stessa a detto RNA substrato bersaglio. Preferibilmente detta parte di sequenza nucleotidica di detto snRNA U1 è quella che forma la struttura a stemloop Ili del snRNA U1.

Secondo un aspetto dell'invenzione l’RNA substrato bersaglio è una forma alterata di RNA cellulare o un RNA virale. Preferibilmente detto RNA virale è un RNA di HIV, più preferibilmente il pre-mRNA REV di HIV.

In un ulteriore aspetto dell’invenzione la porzione di sequenza del ribozima nella molecola chimerica è identica o è sostanzialmente omologa a alla seguente sequenza, a condizione che detta omologia mantenga la attività catalitica:

5 ' -AUGAGUCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUGCCUU-3' .

In un aspetto preferito lo snRNA nella molecola chimerica è modificato in modo da aumentare la sua affinità per l’RNA substrato bersaglio, preferibilmente a mezzo di sostituzioni nucleotidiche della sequenza di riconoscimento per il sito di “splicing” di detto RNA substrato bersaglio.

In un aspetto particolare dell’invenzione la molecola chimerica ha la seguente sequenza, o ha una sequenza sostanzialmente omologa ad essa, a condizione che detta omologia mantenga la capacità della componente vettore di veicolare la molecola stessa a un RNA substrato bersaglio e l’attività catalitica per detto RNA substrato bersaglio della componente derivata da ribozima:

AGGGCGACUUCUAUGUAGAUGAGGCAGCGCAGAGGCUGCCUUGUUCGCCACUUGCUGCUU

CACCACGAAGGAGUUCCCGUGCCCUGGGAGCGGGUUCAGGACCGCUGAUCGGAAGUGAGA

AUCCCAGCUGUGUGUCAGGGCUGGAAAGGGCUCGGGAGUGCGCGGGGCAAGUGACCGUGU GUGUAAAGAGUGAGGGUAUGAGGCUGUGUCGGGGCAGAGGCCCAAGAUCUCAUACUUACC

UGGCAGGGGAGAUACCAUGAUCACGAAGGUGGUUUUCCCAGGGCGAGGCUUAUCCAUUGC

ACUCCGGAUGUGCUGACCCCUGCGAUGAGUCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUGCC

UUCGACUGCAUAAUUUGUGGUAGUGGGGGACUGCGUUCGCGCUUUCCCCUGACUUUCUGG

AGUUUCAAAAGUAGA.

Costituisce un ulteriore aspetto dell’invenzione un acido nucleico codificante per una qualsiaisi delle molecole chimeriche dell'invenzione.

In un aspetto preferito l’acido nucleico viene utilizzato per la costruzione di vettori da utilizzarsi nella terapia genica di patologie da produzione di RNA cellulari alterati, o di patologie virali. La metodica comprende tecniche di subclonazione retrovirale e successsiva trasformazione, secondo tecnologie note agli esperti nel settore. Preferibilmente le patologie virali comprendono le patologie associate a infezione con HIV.

Costituisce un ulteriore aspetto dell’invenzione una composizione farmaceutica comprendente in forma e dosaggio farmacologicamente accettabili ed efficaci una molecola chimerica secondo l'invenzione stessa da utilizzarsi per terapia delle patologie da alterata produzione di RNA cellulari o delle patologie virali. Preferibilmente la molecola chimerica è ad attività catalitica per un RNA virale, più preferibilmente l’RNA virale è un RNA del virus HIV, ancora più preferibilmente è il pre mRNA REV del virus HIV.

La presente invenzione verrà ora descritta in sue forme particolari di attuazione, facendo riferimento ad esempi esplicativi ma non limitativi. Si farà riferimento alle seguenti figure:

La figura 1 rappresenta uno schema della costruzione e alcune sequenze delle molecole chimeriche ribozima-U1. Pannello a): rappresentazione schematica della struttura del snRNA U1 naturale e della molecola chimerica U1-Rz; la sequenza della struttura stem-loop III (7) del snRNA U1 è sostituita con la sequenza responsabile della struttura a testa di martello del ribozima. La sequenza inserita è indicata in basso: i nucleotidi in grassetto costituiscono il core catalitico a testa di martello, mentre le sequenze sottolineate indicano la regione di complementarità al RNA bersaglio. La freccia indica la sostituzione nucleotidica nei costrutti di controllo inattivi. Pannello b): la sequenza del sito di processamento canonico al 5' di un pre mRNA è mostrata insieme alla sequenza complementare del snRNA U1 (in alto). I nucleotidi sottolineati indicano le sostituzioni introdotte nel snRNA U1 in maniera da avere un perfetto accoppiamento con il 5’ del pre mRNA REV del virus HIV.

La figura 2 mostra la sequenza nucleotidica del DNA codificante per la molecola chimerica U1h-Rz (pannello 2a) e modificata in due nucleotidi in posizione 239-240 (U1-Rz-5’s, pannello 2b) per ottimizzare il legame al pre-mRNA REV.

La figura 3 mostra un’analisi in vitro delle attività delle molecole chimeriche. Pannello a): 0.15 μΜ di molecole chimeriche non marcate (U1-Rz, U1-Rzm e tRNA-Rz) sono state incubate per il tempo indicato con 0.05 μΜ di substrato REV marcato con 32P (S, 166 nuc!eotidi). I prodotti della reazione (5’, 53 nucleotidi e 3', 113 nucleotidi) sono stati analizzati su un gel di urea-6% acrilammide. Pannello b): 0.4 μΜ di U1-Rz non marcato e 0.1 μΜ di substrato REV marcato con ^P sono stati coincubati a tre temperature diverse (25°C, 30°C e 37°C) per i tempi indicati (min). I prodotti della reazione sono stati analizzati su un gel 6% di acrilammide.

La figura 4 mostra la compartimentalizzazione cellulare delle molecole chimeriche ribozima-U1. I DNA plasmidici contenenti i geni U1-Rz, UI-Rz-5’ e U1h-Rz sono stati iniettati nei nuclei di oociti di XJaevis e incubati per la notte. Quattro nuclei (colonne N) e i corrispondenti citoplasmi (colonne C) sono stati dissezionati manualmente e gli RNA analizzati per Northern blot con una sonda specifica per lo snRNA U1. Quattro nuclei aggiuntivi sono stati utilizzati per una immunoprecipitazione con anticorpi Sm, che riconoscono proteine associate in maniera specifica con il snRNA U1 (Dr. lan Mattaj, EMBL, Heidelberg, Germania), prima dell’estrazione dell’ RNA (colonne Sm). Le molecole ribozima-U1 sono 20 nucleotidi più lunghe del snRNA U1 endogeno.

La figura 5 mostra l’attività di taglio in vivo delle molecole chimeriche. 10 ni di una soluzione contenente 1 ng di plasmide SP-REV e 3 ng di ciascuno dei diversi costrutti U1 (U1 selvatico: colonna 1; U1-Rz: colonna 2; U1-Rzm: colonna 3; U1-Rz-5’: colonna 4; e U1-Rz-5’m: colonna 5) sono iniettati in nuclei di oociti di X.laevis. Come controllo interno, è anche coiniettato l’RNA U6 marcato con ΜΡ trascritto in vitro. L’RNA dallo stesso numero di nuclei è corso su un gel di urea acrilammide al 6% e trasferito. Una autoradiografia diretta del filtro permette la visualizzazione del segnale di RNA di U6, mentre le ibridazioni con una sonda REV e con una sonda di RNA U1 permettono la quantificazione dell’accumulo del pre-mRNA REV e dell’espressione dei diversi ribozimi chimerici U1.

Il bersaglio scelto per saggiare l’attività del ribozima è il premRNA REV del virus HIV (8,9,10). Lo snRNA U1 è scelto come vettore poiché ha una localizzazione nucleare ed è noto per partecipare nella reazione di processamento del mRNA. La specificità della interazione del snRNA U1 all'interno della particella in cui avviene lo “splicing” ("spliceosoma”) risiede nell’accoppiamento delle basi con la giunzione di "splicing” al 5’ del substrato pre-mRNA. Nel pre-mRNA REV questa sequenza è subottimale e riduce l'efficacia del riconoscimento del snRNA U1. Per aumentare la specificità del ribozima-U1 per il premRNA REV, sono state introdotte delle mutazioni nella regione del snRNA di appaiamento con il sito di “splicing” al 5’ del precursore REV. L’uso di tali vettori ha conferito le seguenti caratteristiche al ribozima: i) stabilità, ii) localizzazione nucleare e iii) una aumentata specificità di substrato per il precursore REV. Lo snRNA U1 veicola il ribozima attraverso l’apparato di “splicing” sul pre-mRNA REV, aumentando la concentrazione relativa del ribozima e del substrato, permettendo così un efficiente taglio. Inoltre, l’uso del snRNA U1 specifico per REV dovrebbe aumentare la specificità del ribozima U1 per il precursore REV, rispetto a tutti gli altri RNA U1 endogeni non modificati. L’autore ha saggiato l’attività di questi ribozimi sia in vitro che in vivo utilizzando oociti di X, laevis. che rappresentano un sistema modello per lo studio della compartimentalizzazione e dell’accumulo di RNA, ed ha trovato che i ribozimi chimerici sono attivi nella loro attività di taglio degradando in maniera specifica il pre-mRNA REV. L'autore ha anche sintetizzato molecole chimeriche derivate da snRNA U1 umano e ha dimostrato la corretta veicolarizzazione e attività catalitica in cellule umane infettate con HIV. In tali cellule si è rilevata una diminuita replicazione virale, saggiata a mezzo di una diminuzione sia dell'effetto citopatico del virus, che dei livelli della proteina p24 di HIV nel terreno di coltura.

Esempio 1 Costruzione dei ribozimi

La sequenza del core attivo e inattivo del ribozima a testa di martello del ribozima è stata derivata dagli studi di Uhlenbeck e Haseloff (2,11,12). La sequenza del RNA substrato bersaglio (51-UCAAGGCAGUCAGACUCAUCA-S') contiene il sito di taglio, rappresentato dalla C sottolineata, in posizione 5597 del genoma di HIV (13).

I ribozimi chimerici U1 (U1-Rz) sono stati ottenuti per PCR inversa sul clone XIU1-340 (14) contenente l’intero gene per l’RNA U1, o sul suo derivato di T7 che ne permette la trascrizione in vitro sotto il controllo del promotore di T7. Gli oligonucleotidi utilizzati sono

A: 5' -GGACTCATCA ( G/ C ) AGACTCATCACGCAGGGGTCAGCACAACCGGA-3 ' B: 5' -GTGAGGACGAAACTGCCTTGACGACTGCATAATTTCTGGTAGT-3 ' La degenerazione dell'oligo A permette la costruzione simultanea sia dei ribozimi attivi che inattivi.

Il U1-Rz-5’ è stato ottenuto per PCR inversa su Rz U1 e su Rz™ U1 utilizzando gli oligonucleotidi

C: 5' -TGGGCAGGGGAGATACCATG-3 '

D: 5 ' -GTAAGTATGAGTTGAACAAG-3 ' .

Il ribozima per il tRNA è stato ottenuto per PCR inversa su un gene tRNApro (15) clonato nel sito EcoRI del vettore Bluescript. Gli oligonucleotidi utilizzati sono:

1:5' -GGACTCATCAGAGACTCATGAGAATCA-TACCACTAGACCAT-3'

2: 5 ' — GTGAGGACGAAACTGCCTTTGGGTGCGAGAGG-TCCCGGGTT-3 ' .

Esempio 2 Costruzione dei substrati REV

Un frammento nucleotidico di 2510 basi, comprendente 76 nucleotidi del primo esone codificante, l'intero introne (2330 nt) e 104 nucleotidi del secondo esone della sequenza codificante per REV è stato generato per amplificazione per PCR del clone di HIV BH10 (13).

Gli inneschi includevano i siti EcoRI e BamHl che permettono la clonazione nei siti corrispondenti del vettore pGEM-4Z per generare il clone pGEM-REV. La digestione con BamHl di questo clone permette la trascrizione in vitro delle intere sequenze clonate, mentre la digestione con Avall produce uno stampo per la trascrizione di un RNA di 166 nucleotidi che è stato utilizzato per l’analisi in vitro dell’attività del ribozima. La digestione con EcoRI-BamHI di questo costrutto permette la clonazione delle sequenze REV tra il promotore del gene per la proteina L14 di X. laevis e il sito di poliadenilazione di SV40 del vettore 166pTCAT (16). Questo costrutto permette una espressione efficace del pre-mRNA REV in forma di un RNA poliadenilato (16).

Esempio 3 Costruzione di ribozimi-snRNA U1

La sequenza nucleotidica di 22 nucleotidi della regione stemloop III del snRNA U1 (7) è stata sostituita con il frammento di 42 nucleotidi, contenente il core catalitico a “testa di martello” del ribozima (12), più le sequenze fiancheggianti complementari alla regione contenente il sito bersaglio (posizione 5598, secondo il riferimento 13). La sostituzione dello stem-loop III è stata fatta per le seguenti ragioni: i) non partecipa al legame con le proteine specifiche che si associano a U1 e che contribuiscono alla compartimentalizzazione corretta della particella snRNP U1 matura (7, 17); ii) non è essenziale per la stabilità del snRNA U1 (18).

La sequenza bersaglio è rappresentata da 20 nucleotidi del primo esone codificante del pre-mRNA REV (vedi figura 1). Dal costrutto (U1-Rz) ne è stato derivato un secondo (U1-Rz-5’), in cui il terminale 5' del snRNA U1 (fr-GAUACUUACCUGGC— 3’ì è stato cambiato in 5'-GAUACUUACUGGGC — 3’. Queste sostituzioni (in grassetto), nella regione di appaiamento della giunzione di “splicing” 5’ (sottolineata), produce un snRNA U1 con una complementarità perfetta con il sito di “splicing” al 5', subottimale, del pre-mRNA REV.

La stessa mutazione è stata introdotta sia nei geni snRNA U1 di X. laevis e nei costrutti T7. Come controllo, le stesse sequenze contenenti il core catalitico a testa di martello più le sequenze fiancheggianti sono state clonate in un vettore di tRNA (15) proprio a monte del loop anticodone (tRNA-Rz).

Per controllare gli effetti antisenso dei ribozimi, sono stati sintetizzati derivati da U1-Rz e da U1-Rz-5’, in cui la C presente nel core catalitico della testa di martello (CUGAUGA) è stata sostituita con una G, nota per abolire completamente l’attività di taglio (12). Questi costrutti, nominati Ul-Rz,,, e U1-Rzm-5\ hanno un effetto antisenso simile al ribozima ma mancano dell'attività catalitica.

Esperimenti analoghi sono effettuati per sintetizzare molecole utilizzando lo snRNA umano ottenendo le molecole chimeriche U1h-Rz (fig. 2a) e U1hRz5’S (fig. 2b), in cui la specificità di riconoscimento per il pre-mRNA REV di HIV è aumentata sostituendo i due nucleotidi 239-240.

In breve il gene per il snRNA U1 umano è stato ottenuto per clonazione con PCR da DNA genomico totale utilizzando « i seuenti inneschi:

E. 5' -CCGGATCCTAAGGACCAGCTTCTTTGGG-3'

F. 5' -CCGGATCCTTAGCGTACAGTCTACTTTT-3'

Il frammento clonato contiene 400 basi a monte del sito di inizio della trascrizione e 40 basi (+40) a valle del 3’ del trascritto. (La sequenza di fig.2, mostra una regione più limitata, da -230 a 40).

Per la produzione delle molecole chimeriche ribozima-U1h, sono stati utilizzati i seguenti oligonucleotidi:

G. 5' -GGACTCATCA(G/C)AGACTCATCGCAGGGGTCAGCACATCCGGA-3' H. 5' -GTGAGGACGAAACTGCCTTCGACTGCATAATTTGTGGTAGT-3'

Per la produzione di U1h-Rz-5’ sono stati utilizzati i seguenti oligonucleotidi:

I. 5' -TGGGCAGGGGAGATACCATG-3'

L. 5' -GTAAGTATGAGATCTTGGGC-3'

In tutti i cloni la sequenza a testa di martello ha 18 nucleotidi di appaiamento con il substrato.

Esempio 4 Attività in vitro dei ribozimi chimerici U1

I ribozimi e i substrati RNA marcati con 32P sono stati trascritti in vitro dai corrispondenti costrutti di T7. Il ribozima e il substrato (0.15 μΜ e 0.05 μΜ rispettivamente, oppure 0.4 μΜ e 0.1 μΜ) in 50 mM Tris-HCI pH7.5 sono stati riscaldati a 95°C per 2 minuti e raffreddati 5 minuti in ghiaccio. Si aggiunge 10 mM di MgCI2 e si continua la reazione a 37°C, o quando specificato a temperature diverse, per il tempo indicato. L’RNA è stato analizzato su un gel di poliacrilammide 6% in 7 M urea.

I trascritti T7 di U1-Rz e U1-Rzm (186 nucleotidi) sono stati incubati con il sito bersaglio REV marcato con 3⁄4P (banda S, 166 nucleotidi). La figura 3a mostra l’andamento nel tempo di un’incubazione di 0.15 μΜ del ribozima e di 0.05 μΜ di substrato a 37°C in 10 mM MgCI2 e 50 mM Tris HCI pH 7.5. Lo U1-Rz converte il substrato in maniera molto efficace in prodotti di taglio (5’ e 3’), mentre nelle stesse condizioni non vi è alcun taglio prodotto dal ribozima mutante (colonne U1-Rzm). Il t-RNA-Rz funziona meno efficacemente del U1-Rz, come dimostrato dalla ridotta conversione del substrato in prodotti troncati (colonna tRNA-Rz).

La figura 3b mostra la dipendenza dalla temperatura dell’attività del U1-Rz, in un esperimento in cui il rapporto molare di ri bozi ma: substrato è di 4:1. A 25°C l’attività del ribozima è fortemente ridotta rispetto a 37°C.

Esempio 5 Espressione e localizzazione in vivo del trascritto U1-Rz Il DNA plasmidico, dopo un gradiente in CsCI è stato disciolto in 80 mM NaCI, 10 mM Tris pH 7.0 e iniettato nelle vescicole germinali dello stadio VI di oociti di X. laevis secondo Caffarelli et al (19). Dopo incubazione i nuclei sono stati dissezionati manualmente e l’RNA è stato estratto. Un’analisi per Northern blot è stata effettuata con sonde specifiche per snRNA U1 e per RNA REV (13, 14).

I geni che codificano per i ribozimi chimerici U1 sono stati purificati su gradienti di EtBr-CsCI e iniettati in nuclei di oociti ad una concentrazione di 200 ng/μΙ. Dopo incubazione per la notte i nuclei sono stati separati manualmente dai citoplasmi e gli RNA estratti dai due differenti compartimenti. La figura 4 mostra un’analisi Northern effettuata sugli oociti di controllo (colonne controllo) e sugli oociti iniettati con i geni per U1-Rz (colonne U1-Rz) e U1-Rz-5’ (colonne U1-Rz-5’). Entrambi i ribozimi chimerici Ut sono espressi in maniera efficace e vengono correttamente compartimentalizzati all'interno del nucleo. Livelli simili di espressione ed una corretta localizzazione nucleare sono stati osservati per i substrati mutanti e per substrati umani (colonne U1h-Rz) e per i substrati mutanti (non mostrato).

Una immunoprecipitazione con anticorpi Sm è stato utilizzata per saggiare se i ribozimi chimerici U1 erano in grado di formare complessi U1 SnRNP (7). La figura 4 mostra che entrambi U1-Rz e U1-Rz-5' sono legati alle proteine Sm. La loro immunoprecipitazione non quantitativa potrebbe essere dovuta sia ad una conformazione alterata della particella o ad una competizione dell'eccesso endogeno di U1 SnRNP che rappresentano il substrato ottimale per l'interazione con l'anticorpo Sm.

Esempio 6 Taglio del pre-mRNA REV catalizzato dal ribozima in vivo Per analizzare l’attività dei ribozimi U1 sul pre-mRNA REV: sono stati coiniettati i DNA plasmidici codificanti per i ribozimi U1 e per il pre-mRNA REV in nuclei di oociti di X.laevis e analizzati i livelli di accumulo dei diversi trascritti dopo incubazione per la notte. La trascrizione dei ribozimi U1 è diretta dal promotore del gene U1 snRNA omologo, mentre la trascrizione di REV è regolata dal promotore per la proteina ribosomale L14 di X.laevis. fuso con le sequenze REV. In questo modo l'RNA per il ribozima U1 e il pre-mRNA REV vengono espressi in maniera simultanea. L’eccesso molare del plasmide U1 rispetto al plasmide REV (5:1) e l’attesa maggiore efficienza del promotore U1 assicurano che i ribozimi chimerici U1 siano in eccesso rispetto ai trascritti REV. Come controllo interno di iniezione è stato anche coiniettato del snRNA U6 marcato con 32P, che è ritenuto in maniera specifica all'interno del nucleo (20).

La figura 5 mostra i risultati di Northern blot effettuati con sonde per REV e per snRNA U1 su RNA estratti da nuclei. Il segnale di pre-mRNA REV nelle iniezioni di controllo, quando il plasmide REV è stato coiniettato con i geni snRNA U1 selvatici (colonna 1), è 15 volte più intenso di quello in iniezioni di U1-Rz (colonna 2). Una riduzione aggiuntiva di due volte è osservata nelle iniezioni con U1-Rz-5’ (colonna 4). Le versioni inattive dei ribozimi U1 mostrano qualche effetto destabilizzante su REV (colonne 3 e 5), dovuto, come già descritto in (21), ad un effetto antisenso. Tuttavia la diminuzione è molto più bassa rispetto ai ribozimi attivi (tra 5 e 10 volte). Questi esperimenti dimostrano che il diminuito accumulo di pre-mRNA REV è principalmente dovuto all’attività di taglio dei ribozimi. E’ importante ricordare che gli oociti crescono a 20°C che non è la temperatura ottimale per l’attività dei ribozimi.

il segnale U6 nel pannello c deriva dai RNA U6 marcato iniettato e viene utilizzato come controllo interno e quantitativo della iniezione del DNA plasmidico.

Per quel che riguarda le molecole chimeriche con il snRNA U1 umano, i vari costrutti U1h-ribozima sono stati clonati in plasmidi pSV2 Neo e trasfettati in linfociti umani CD4+ (clone Jurkat). Le cellule trasfettate mostrano buoni livelli di espressione di questi costrutti. Dopo infezione delle cellule con HIV, si nota una diminuzione della citopaticità indotta dal virus, mostrato come percentuali di cellule vitali, e dei livelli di proteina p24 di HIV nel terreno di coltura.

Bibliografia

1. Zaug, A.J., Been, M.D. and Cech, T.R. (1986) Nature 324, 429-433 2. Haseloff, J. and Gerlach W.L. (1988) Nature 334, 585-591

3. Symons, R.H. (1992) Annu Rev. Biochem. 61, 641-671

4. Sarver, N. and Rossi, J.J. (1993) J. NIH Res. 5, 63-67

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Molecola chimerica comprendente: - una componente vettore in grado di veicolare la molecola stessa a un RNA substrato bersaglio; e, covalentemente legata ad essa: - una componente derivata da un ribozima ad attività catalitica per detto RNA substrato bersaglio.
2. Molecola chimerica secondo la rivendicazione 1 in cui la componente vettore è derivata da un snRNA, a condizione che detto RNA substrato bersaglio sia localizzato nel nucleo.
3. Molecola chimerica secondo la rivendicazione 3 in cui detto snRNA è lo snRNA U1.
4. Molecola chimerica secondo la rivendicazione 2 o 3 in cui detto snRNA è di X, laevis o di mammifero.
5. Molecola chimerica secondo la rivendicazione 4 in cui detto snRNA è umano.
6. Molecola chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 3 a 5 in cui una parte della sequenza nucleotidica di detto snRNA U1 è sostituita con la sequenza di un ribozima ad attività catalitica per un RNA substrato bersaglio, a condizione che la sostituzione non riduca sostanzialmente la capacità di detto snRNA U1 di veicolare la molecola stessa a detto RNA substrato bersaglio.
7. Molecola chimerica secondo la rivendicazione 6 in cui detta parte di sequenza nucleotidica di detto snRNA U1 è quella che forma la struttura a stem-loop III del snRNA U1.
8. Molecola chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto RNA substrato bersaglio è una forma alterata di RNA cellulare o un RNA virale.
9. Molecola chimerica secondo la rivendicazione 8 in cui detto RNA virale è un RNA di HIV.
10. Molecola chimerica secondo la rivendicazione 9 in cui detto RNA di HIV e il pre-mRNA REV di HIV.
11. Molecola chimerica secondo la rivendicazione 10 in cui detta sequenza di un ribozima è identica o è sostanzialmente omologa alla seguente sequenza, a condizione che detta omologia mantenga la attività catalitica: 5 ' -AUGAGUCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUGCCUU-3 ' .
12. Molecola chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 10 in cui detto snRNA è modificato in modo da aumentare la sua affinità per detto RNA substrato bersaglio.
13. Molecola chimerica secondo la rivendicazione 12 in cui detto snRNA è modificato a mezzo di sostituzioni nucleotidiche della sequenza di riconoscimento per il sito di “splicing" di detto RNA substrato bersaglio.
14. Molecola chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12 avente la sequenza: AGGGCGACUUCUAUGUAGAUGAGGCAGCGCAGAGGCUGCCUUGUUCGCCACUUGCUGCUU CACCACGAAGGAGUUCCCGUGCCCUGGGAGCGGGUUCAGGACCGCUGAUCGGAAGUGAGA AUCCCAGCUGUGUGUCAGGGCUGGAAAGGGCUCGGGAGUGCGCGGGGCAAGUGACCGUGU GUGUAAAGAGUGAGGGUAUGAGGCUGUGUCGGGGCAGAGGCCCAAGAUCUCAUACUUACC UGGCAGGGGAGAUACCAUGAUCACGAAGGUGGUUUUCCCAGGGCGAGGCUUAUCCAUUGC ACUCCGGAUGUGCUGACCCCUGCGAUGAGUCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUGCC UUCGACUGCAUAAUUUGUGGUAGTJGGGGGACUGCGUUCGCGCUUUCCCCUGACUUUCUGG AGUUUCAAAAGUAGA, o con una sequenza sostanzialmente omologa ad essa, a condizione che detta omologia mantenga la capacità della componente vettore di veicolare la molecola stessa a un RNA substrato bersaglio e l’attività catalitica per detto RNA substrato bersaglio della componente derivata da ribozima.
15. Acido nucleico codificante per una molecola chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
16. Acido nucleico secondo la rivendicazione 15 per la costruzione di vettori da utilizzarsi nella terapia genica di patologie da produzione di RNA cellulari alterati o di patologie virali.
17. Acido nucleico secondo la rivendicazione 16 in cui dette patologie virali comprendono le patologie associate a infezione con HIV.
18. Composizione farmaceutica comprendente in forma e dosaggio farmacologicamente accettabili ed efficaci una molecola chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14 da utilizzarsi per terapia delle patologie da produzione di RNA cellulari alterati o delle patologie virali.
19. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 18 comprendente una molecola chimerica ad attività catalitica per un RNA virale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14.
20. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19 in cui detto RNA virale è un RNA de! virus HIV.
21. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 20 in cui detto RNA del virus HIV è il pre mRNA REV del virus HIV.