ITTO20130284A1 - Procedimento per la produzione di microparticelle polimeriche sagomate - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

"Procedimento per la produzione di microparticelle polimeriche sagomate"

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la preparazione di microparticelle polimeriche sagomate.

Il termine "sagomato" à ̈ utilizzato nella presente descrizione per indicare particelle aventi una forma diversa dalla forma sferica o sostanzialmente sferica, che costituisce la forma termodinamicamente favorevole e che può pertanto essere facilmente ottenuta in diverse dimensioni, con diversi polimeri, in procedimenti di tipo batch.

In particolare, l'invenzione si riferisce alla produzione di microparticelle sagomate ingegnerizzate. Con il termine "ingegnerizzate", si intendono indicare particelle aventi un'idonea microstruttura e formulazione, come ad esempio microparticelle con una porosità controllata, oppure microparticelle polimeriche preventivamente caricate con molecole bioattive.

Negli ultimi decenni, si à ̈ verificato un crescente interesse verso la produzione di microparticelle polimeriche sagomate per diverse applicazioni che vanno dall'ingegneria tessutale (Soft Matter, 2009, 5, 1312-1319) a microserbatoi per la somministrazione di farmaci, quali micro e nanoveicoli destinati ad essere introdotti nel corpo (Macromolecular Research, vol. 17, n. 3, pagg. 163-167 (2009); Small 2007, 3, n.3, 412-418, Journal of Controlled Release 104 (2005) 51-66; Biomaterials 29 (2008) 2113-2124; Biomed Microdevices (2007) 9:223-234).

In particolare, nel campo dell'ingegneria tessutale dove sono altamente desiderate proprietà anisotrope, l'attenzione si à ̈ focalizzata recentemente su microparticelle polimeriche aventi forme diverse da quella sferica. Forme diverse da quella sferica possono anche essere utilizzate nella fotonica e come sonde per analisi reologica (Langmuir 2005, 21, 2113-2116). Altre possibili applicazioni riguardano forme avanzate di erogazione di farmaci, forme di rilascio controllato di farmaci ed applicazioni relative al targeting ed al riconoscimento (Biomaterials 27 (2006) 4034-4041).

Per questi scopi, la morfologia della particella (cioà ̈ la forma e la dimensione) deve essere ingegnerizzata in accordo con la funzione dell'agente particellare (J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 10096-10100).

In contrasto con la produzione della forma sferica termodinamicamente favorevole, facilmente ottenibile, forme diverse devono essere prodotte e consolidate con modalità più sofisticate. In letteratura sono noti tre metodi principali per la produzione di microparticelle sagomate.

Un primo approccio à ̈ quello microfluidico (Langmuir 2005, 21, 2113-2116), in cui goccioline polimeriche, formate sottoponendo a sforzo di taglio un polimero in una fase acquosa continua in una giunzione a T, sono vincolate ad assumere forme non sferiche mediante confinamento utilizzando appropriate geometrie di microcanale.

Quantunque questo procedimento consenta di ottenere forme precise, soffre di limitazioni per ciò che riguarda il numero limitato di forme che possono essere ottenute (principalmente cilindri o parallelepipedi e dischetti), il numero limitato di polimeri utilizzabili e la limitata velocità di produzione, essendo le microparticelle prodotte una ad una. Un altro approccio si fonda su un procedimento di stampaggio, dove la forma à ̈ definita dalle cavità dello stampo stesso. In questo caso, il principale problema à ̈ la presenza di uno strato continuo che collega le microparticelle che restano quindi collegate l'una dall'altra.

E' possibile contrastare questo problema utilizzando stampi particolari, costituiti da PFPE oppure più vantaggiosamente utilizzando, come materiale dello stampo PDMS trattato superficialmente, ma l'ottimizzazione del processo per variare il tipo di polimero e la forma può essere comunque dispendiosa in termini di tempo.

Inoltre, con tale metodo, per alcuni polimeri sarebbe difficile o anche impossibile produrre determinati spessori (superiori ad alcuni µm). Infine, tanto più ampia à ̈ l'area di lavoro, quanto più difficile à ̈ evitare la presenza dello strato continuo. In ogni caso, anche evitando tale strato, i suddetti metodi noti come detto non permettono di realizzare sempre un'adeguata microstruttura.

WO2008/031035 descrive un ulteriore procedimento, in cui microsfere polimeriche sono inglobate in una matrice polimerica e sottoposte a stiramento. Le particelle di partenza sono riscaldate al di sopra della loro temperatura di transizione vetrosa o sottoposte a plasticizzazione mediante solvente. In linea di principio questo metodo potrebbe conservare la microstruttura e/o preservare eventuali agenti attivi con opportuni accorgimenti. Tuttavia, il metodo à ̈ comunque dipendente dal materiale utilizzato à ̈ limitato in termini di forme ottenibili, nonché dispendioso in termini di tempo.

Lo scopo principale della presente invenzione à ̈ quello di fornire un procedimento per la produzione di microparticelle polimeriche sagomate che sia versatile in termini di materiali utilizzabili e forme realizzabili e a basso costo.

Un altro scopo dell'invenzione à ̈ quello di fornire un procedimento che consenta di produrre particelle ingegnerizzate che presentano specifiche proprietà o che mantengono proprietà ingegnerizzate di particelle sferiche.

In vista di tali scopi, costituisce oggetto dell'invenzione un procedimento come definito nelle rivendicazioni che seguono, che costituiscono parte integrale della presente descrizione.

Il procedimento secondo l'invenzione prevede l'impiego, come materiale di partenza, di microparticelle sferiche preformate. Nella forma più vantaggiosa di attuazione, si impiegano particelle sferiche preformate ingegnerizzate, cioà ̈ presentanti una microstruttura, come ad esempio una porosità o una carica di principi attivi, che sostanzialmente corrisponde alla microstruttura che si intende ottenere per le microparticelle sagomate, costituenti il prodotto finale desiderato.

Le microparticelle sferiche di partenza, ingegnerizzate e non, possono essere ottenute con una varietà di metodi di per sé noti, tra cui ad esempio essiccazione a spruzzo, polimerizzazione interfacciale, incapsulazione hot-melt, emulsione, microincapsulazione con evaporazione di solvente, coacervazione, microfluidica e preferibilmente tramite membrana porosa, ecc.

Microparticelle così ottenute sono trasformate nella forma non sferica desiderata, con l'impiego di uno stampo appropriato che presenta microcavità (non tra loro interconnesse) aventi la forma desiderata, generalmente disposte a schiera o a matrice.

Preferibilmente, ciascuna microparticella sferica viene posizionata in una rispettiva microcavità dello stampo e viene quindi sottoposta a rammollimento mediante esposizione ad un solvente, atto a plasticizzare il materiale polimerico, o ad una miscela di solvente e non solvente, allo stato liquido o, preferibilmente, allo stato vapore. Alternativamente, il rammollimento può essere coadiuvato da eventuale riscaldamento ad una temperatura preferibilmente < 60°C e ancora più preferibilmente < 40°C. Alternativamente, in casi meno stringenti per la conservazione della microstruttura e/o per principi attivi più resistenti alla temperatura, il rammollimento può essere ottenuto mediante trattamento termico, sottoponendo a riscaldamento ad una temperatura compresa nel campo di rammollimento del polimero impiegato, che generalmente à ̈ compresa tra la temperatura di transizione vetrosa e la temperatura di fusione (per polimeri cristallini), preferibilmente non superiore al 40% del valore di temperatura di transizione vetrosa e preferibilmente non superiore ai 50°C.

Il procedimento consente sicuramente di evitare la formazione di uno strato continuo che interconnette (scum layer) le microstrutture ed à ̈ applicabile a qualsiasi tipo di polimero suscettibile di rammollimento ed a qualsiasi dimensione da submicrometrica a sub-millimetrica. Si rende possibile la deformazione di microparticelle sferiche di dimensione da pochi micron di diametro a centinaia di micron, preferibilmente da 2 µm a 600 µm, più preferibilmente da 10 a 300 µm rimanendo la dimensione minima vincolata alla capacità di manipolare in modo automatizzato le microparticelle e la dimensione massima alle cinetiche di plasticizzazione. Nel caso di cavità con la base strutturata à ̈ possibile ottenere una ulteriore topografia di superficie della microparticella sagomata che può essere anche submicrometrica fino a poche decine di nanometri.

In particolare, la formatura in cavità di stampo assistita da solvente permette di operare a temperatura ambiente, evitando da un lato l'alterazione di agenti attivi, quali farmaci o biomolecole, inglobate nelle microparticelle sferiche preformate, dall'altro l'alterazione della microstruttura.

Ad esempio, se si desidera mantenere una determinata microstruttura porosa che permette un certo profilo di rilascio di agenti attivi inglobati nella microparticella, Ã ̈ altamente preferibile l'impiego di un trattamento con solvente in fase vapore a temperatura ambiente.

E' altresì contemplato l'impiego di microparticelle caricate con diversi farmaci o biomolecole. Ad esempio, nel caso di microaghi, microparticelle caricate con diversi farmaci possono essere utilizzate contemporaneamente in diverse cavità permettendo l'ottenimento di una schiera di microparticelle sagomate idonee al rilascio multiplo di farmaci.

Il consolidamento delle microparticelle sagomate si esegue per evaporazione del solvente o tramite raffreddamento, nel caso di formatura assistita da un incremento di temperatura.

In una forma preferita di attuazione, prima del consolidamento, le microparticelle allo stato rammollito sono sottoposte ad una leggera pressione, esercitata ad esempio tramite un controstampo, quale una lastra di vetro, che viene posto a contatto con le microparticelle all'interno della cavità di stampo, al fine di migliorare la loro formatura in termini di fedeltà alla geometria della cavità (ad esempio per ottenere spigoli vivi, in caso di forme di tipo prismatico).

Si intende che il materiale costituente le cavità di stampo deve essere meno adesivo rispetto al materiale del controstampo, e.g. stampo di PDMS e controstampo di vetro.

Il procedimento consente naturalmente di ottenere un'ampia varietà di forme non sferiche, come ad esempio dischi, ellissoidi, barrette, forme prismatiche, di vario genere. Il procedimento à ̈ applicabile a qualsiasi polimero termoplastico da scegliere in base al tipo di applicazione tra un'ampia varietà di polimeri, in combinazione con un'appropriata scelta del solvente o sistema solvente/non solvente.

Nel caso di bioapplicazioni, polimeri preferiti sono ad esempio PLA, PLGA, PCL, gelatina, così come qualsivoglia polimero biodegradabile o biocompatibile termoplastico.

Come già indicato, le microparticelle sferiche di partenza possono contenere un'ampia varietà di additivi, come agenti attivi funzionali, farmaci, biomolecole attive, ligandi che facilitano il targeting delle microparticelle ad uno specifico sito in vivo.

Nei disegni ammessi:

- la fig. 1 Ã ̈ un'illustrazione schematica dell'apparecchiatura di stampo utilizzata nel procedimento secondo l'invenzione;

- la fig. 2 Ã ̈ un'illustrazione schematica di un dispositivo vaporizzatore;

- le figg. 3a e 3b sono fotografie che illustrano microparticelle ottenute mediante il procedimento dell'esempio 1;

- le figg. 4a e 4b presentano immagini al microscopio confocale relative a microparticelle porose, rispettivamente prima del processo di formatura e dopo il processo di formatura; e

- la fig. 5 Ã ̈ una fotografia ottenuta tramite microcopio a scansione elettronica relativa a microsfere sagomate, ottenute nell'esempio 2.

Per l'attuazione del procedimento secondo l'invenzione, Ã ̈ stata utilizzata un'apparecchiatura del tipo illustrata schematicamente nelle figg. 1 e 2.

Tale apparecchiatura comprende uno stampo 2, presentante una pluralità di microcavità di stampo 4. Lo stampo può essere realizzato con diversi materiali e ottenuto mediante diversi metodi idonei, quali tecnologie di litografia, RIE, ecc. Nelle prove effettuate, si à ̈ utilizzato uno stampo di PDMS, prodotto in due stadi utilizzando la tecnica di "replica moulding".

Inizialmente, à ̈ stato prodotto uno stampo inverso con strutture in rilievo, aventi la forma delle cavità di stampo da realizzare, quali ad esempio forme prismatiche con base a croce, triangolare, a rettangolo, o con forma cilindrica a disco.

Lo stampo inverso à ̈ stato prodotto utilizzando un substrato di silicio con microstrutture in SU8 ottenute utilizzando un'apparecchiatura Laser 2d. Le strutture in rilievo presentavano un volume pari a circa 4,2x10<6>µm<3>, corrispondente al volume delle microparticelle che si intendevano produrre.

Per la produzione dello stampo, PDMS allo stato liquido (Sylgard 184<®>) preventivamente miscelato in rapporto in peso 1:10 con un agente reticolante à ̈ stato versato sul substrato di silicio/SU8 e fatto reticolare in forno a 80°C per 2 ore. Lo stampo di PDMS indurito fu quindi facilmente separato dallo stampo inverso di PMMA.

Allo scopo di fornire un processo automatizzato, l'apparecchiatura utilizzata comprende inoltre un dispositivo micromanipolatore 6 atto a raccogliere simultaneamente una pluralità di microsfere ed a permetterne la deposizione nelle cavità di stampo 4.

A titolo esemplificativo, il dispositivo micromanipolatore comprende un corpo definente al suo interno una camera di aspirazione ed avente una parete inferiore provvista di una pluralità di fori, comunicanti con detta camera di aspirazione e disposti a matrice secondo un passo corrispondente al passo delle cavità di stampo 4 realizzate nello stampo.

A ciascun foro à ̈ collegato un tubicino rigido o un ago di aspirazione 8, il cui lume presenta un diametro inferiore al diametro delle microsfere da raccogliere e depositare. La parete superiore del corpo del micromanipolatore presenta un singolo foro a cui à ̈ collegato a tenuta un collettore 10, costituito da un tubicino o ago collegabile a sua volta ad una pompa a vuoto.

Il micromanipolatore permette, a seguito dell'azionamento della pompa a vuoto, di raccogliere una pluralità di microsfere e permette la loro deposizione nelle cavità di stampo, a seguito della disattivazione della pompa a vuoto.

Per evitare fenomeni di aggregazione delle microparticelle causate da interazioni elettrostatiche che possono verificarsi in funzione del materiale plastico costituente le particelle ed assicurare la ritenzione di una singola microsfera in corrispondenza di ciascun foro di aspirazione, Ã ̈ possibile applicare un leggero flusso d'aria oppure un'operazione di spazzolatura prima della disattivazione della pompa a vuoto.

Lo stesso dispositivo micromanipolatore può essere utilizzato per erogare vapori della miscela solvente e plastificante, eventualmente in un gas di trasporto, quale azoto, in modo localizzato sulle microsfere o in vicinanza delle microsfere posizionate in ciascuna cavità di stampo.

Per generare un flusso di vapore di solvente, si può utilizzare una convenzionale apparecchiatura di vaporizzazione a gorgogliamento 12, provvista di una camicia riscaldante 18, del tipo illustrato schematicamente in fig. 2. In tale apparecchiatura 12, un veicolo di trasporto, ad esempio azoto, à ̈ alimentato ad un setto poroso 14 immerso nella soluzione liquida di solvente 16. Il vapore solvente generato, come indicato, può essere alimentato al micromanipolatore.

Esempio 1 - Microsfere di acido D,L-lattico-co-glicolico (PLGA) rammollite con una miscela allo stato a vapore di dimetilcarbonato (DMC) ed etanolo

E' noto che PLGA Ã ̈ un polimero rapidamente disciolto in DMC. Al contrario, l'etanolo non discioglie PLGA.

Microsfere di PLGA (Resomer 504H<®>) aventi un volume di 4,2x10<6>µm<3>sono state precedentemente prodotte mediante un opportuno sistema a membrana con porosità di dimensione comparabile a quella delle micro particelle sferiche da realizzare (Sistema Micropore®).

Ciascuna microsfera à ̈ stata disposta in una rispettiva cavità di stampo in PDMS (cioà ̈ una microsfera in una singola cavità) con l'impiego del mi cromanipolatore 6, come illustrato in fig. 1. Lo stampo à ̈ stato quindi posizionato su un supporto piano con la sua parete inferiore piana affacciata alla superficie piana del supporto.

Una soluzione liquida di DMC ed etanolo (DMC:EtOH, 2:1, v:v) à ̈ stata quindi vaporizzata mediante un'apparecchiatura di vaporizzazione come precedentemente descritta sulle microsfere disposte nelle cavità. Dopo 2 minuti di flusso di vapore, un vetrino à ̈ stato posto in contatto con le microsfere plasticizzate per migliorare la formatura e così pure per rimuovere le microsfere sagomate dallo stampo.

Il procedimento à ̈ stato condotto a temperatura ambiente (circa 25°C) e pressione ambiente.

Le figg. 3a e 3b illustrano alcune delle microparticelle ottenute, utilizzando stampi con cavità di diversa conformazione.

Il procedimento sopra descritto à ̈ stato ripetuto con l'impiego di microsfere aventi una struttura interna porosa.

Le figg. 4a e 4b sono immagini al microscopio confocale che illustrano il mantenimento della porosità a seguito della formatura, con l'impiego di microparticelle porose caricate con un cromoforo.

Esempio 2 - Microsfere di gelatina polimerica plastificate con acqua allo stato liquido

Microsfere di polimero di gelatina aventi un volume di 65,5x10<6>µm<3>, solubili in acqua, sono state preparate con il metodo noto di singola emulsione.

La procedura descritta nell'esempio 1 à ̈ stata ripetuta, effettuando tuttavia il rammollimento delle microsfere utilizzando acqua come solvente allo stato liquido. L'acqua a temperatura inferiore di 50°C à ̈ stata versata tramite una siringa e lasciata parzialmente ad evaporare. Dopo 15 minuti in questa condizione, un vetrino à ̈ stato posto in contatto con tutte le microsfere plastificata per migliorare la sagomatura ed altresì per rimuovere le microsfere dallo stampo.

La fig. 5 illustra microsfere sagomate, ottenute con questo esempio in diverse geometrie. Si nota l'elevata fedeltà della geometria delle microparticelle sagomate con la geometria delle cavità di stampo. Inoltre, le microparticelle sagomate sono separate l'una dall'altra, ovvero non sono interconnesse.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la produzione di microparticelle polimeriche sagomate di forma non sferica, caratterizzato dal fatto che comprende le operazioni di: - provvedere microparticelle in forma sostanzialmente sferica; - disporre una o più di dette microparticelle polimeriche in una rispettiva microcavità di uno stampo avente la forma non sferica desiderata; - sottoporre dette microparticelle a rammollimento mediante esposizione ad un solvente o miscela di solvente/non solvente, allo stato di liquido o vapore, atto a plasticizzare il materiale polimerico costituente dette microparticelle, opzionalmente coadiuvando il processo di plasticizzazione da solvente con riscaldamento ad una temperatura preferibilmente < 60°C e ancora più preferibilmente < 40°C o esclusivamente mediante trattamento termico a temperatura non superiore al 40% al disopra della temperatura di transizione vetrosa; e - estrarre dette microparticelle così sagomate dalle cavità di stampo.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che comprende l'operazione di sottoporre dette microparticelle, sottoposte a rammollimento, ad una pressione nelle rispettive cavità di stampo prima dell'estrazione da dette cavità di stampo.
3. 3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 o 2, caratterizzato dal fatto che il rammollimento delle particelle à ̈ causato mediante applicazione localizzata nelle cavità di stampo di un solvente o miscela di solvente/non solvente allo stato vapore, preferibilmente a temperatura ambiente.
4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, per la produzione di microparticelle polimeriche sagomate aventi una struttura microporosa, e/o caricate con un agente attivo, caratterizzato dal fatto che si utilizzano microparticelle sferiche di partenza, aventi una struttura microporosa e/o, rispettivamente, caricate con un agente attivo.
5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, per la deformazione di microparticelle di dimensione da pochi micron di diametro a centinaia di micron, preferibilmente da 2 µm a 600 µm, più preferibilmente da 10 µm a 300 µm.
6. 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dette cavità presentano una base con superficie strutturata tale per cui la microparticella sagomata presenta un'ulteriore topografia di superficie.
7. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dette microparticelle sagomate sono costituite da un polimero termoplastico.
8. 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto polimero à ̈ un polimero biodegradabile o biocompatibile quale, preferibilmente, poli(acido lattico) (PLA), acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA), policaprolattone (PCL) e gelatina.