JP2000201687A - 遺伝子増幅法 - Google Patents
遺伝子増幅法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】酵素や枝分かれしたＤＮＡを用いずに、効率よ
く遺伝子の増幅を行なうことができるようにした遺伝子
増幅方法を提供する。 【解決手段】お互いに相補的な部分が３カ所以上の数か
ら構成される一対のプローブの複数対を用いて、互い違
いに交差するようにハイブリダイゼーションさせること
により、２本鎖の高分子を形成させるようにした。
く遺伝子の増幅を行なうことができるようにした遺伝子
増幅方法を提供する。 【解決手段】お互いに相補的な部分が３カ所以上の数か
ら構成される一対のプローブの複数対を用いて、互い違
いに交差するようにハイブリダイゼーションさせること
により、２本鎖の高分子を形成させるようにした。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特殊かつ新規なプ
ローブ、この特殊なプローブの交差（交互）結合を利用
した遺伝子増幅法、この遺伝子増幅法によってターゲッ
ト遺伝子を直接検出する方法及び抗原・抗体を検出する
方法に関する。
ローブ、この特殊なプローブの交差（交互）結合を利用
した遺伝子増幅法、この遺伝子増幅法によってターゲッ
ト遺伝子を直接検出する方法及び抗原・抗体を検出する
方法に関する。
【０００２】
【関連技術】近年、微量のターゲット遺伝子を検出する
ために、Polymerase chain reaction 法（以下、ＰＣＲ
法）に代表される核酸合成酵素を用いて遺伝子を増幅す
る方法やあらかじめ一本鎖ＤＮＡが枝分かれした高分子
のＤＮＡをハイブリダイゼーションさせて遺伝子を増幅
する方法（以下、分岐ＤＮＡプローブ法）等が開発され
ている。
ために、Polymerase chain reaction 法（以下、ＰＣＲ
法）に代表される核酸合成酵素を用いて遺伝子を増幅す
る方法やあらかじめ一本鎖ＤＮＡが枝分かれした高分子
のＤＮＡをハイブリダイゼーションさせて遺伝子を増幅
する方法（以下、分岐ＤＮＡプローブ法）等が開発され
ている。
【０００３】ＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、ターゲッ
ト遺伝子にそうほてきなプライマー（またはプライマ
ー）をアニーリング（ハイブリダイゼーション）させ、
耐熱性の核酸合成酵素を用いて、温度の上下によって遺
伝子を増幅させる方法であるが、遺伝子の増幅から検出
までに時間がかかりまた高価であり、ターゲット遺伝子
にそうほてきなプライマーのデザインによっては増幅効
率や特異性が変化する。
ト遺伝子にそうほてきなプライマー（またはプライマ
ー）をアニーリング（ハイブリダイゼーション）させ、
耐熱性の核酸合成酵素を用いて、温度の上下によって遺
伝子を増幅させる方法であるが、遺伝子の増幅から検出
までに時間がかかりまた高価であり、ターゲット遺伝子
にそうほてきなプライマーのデザインによっては増幅効
率や特異性が変化する。
【０００４】一方、分岐ＤＮＡプローブ法による遺伝子
の増幅は、枝分かれした高分子の一本鎖ＤＮＡプローブ
をあらかじめ合成しておき、ターゲット遺伝子にハイブ
リダイゼーションさせることにより、ターゲット遺伝子
を検出する方法であるが、枝分かれした高分子の一本鎖
ＤＮＡプローブをターゲット遺伝子にハイブリダイゼー
ションさせるためには、分岐ＤＮＡプローブが高分子で
あるため時間がかかり、また、枝分かれした高分子の分
岐ＤＮＡプローブの大きさに限界があるため、ターゲッ
ト遺伝子の検出には限界があった。
の増幅は、枝分かれした高分子の一本鎖ＤＮＡプローブ
をあらかじめ合成しておき、ターゲット遺伝子にハイブ
リダイゼーションさせることにより、ターゲット遺伝子
を検出する方法であるが、枝分かれした高分子の一本鎖
ＤＮＡプローブをターゲット遺伝子にハイブリダイゼー
ションさせるためには、分岐ＤＮＡプローブが高分子で
あるため時間がかかり、また、枝分かれした高分子の分
岐ＤＮＡプローブの大きさに限界があるため、ターゲッ
ト遺伝子の検出には限界があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点に鑑みて発明されたもので、酵素や枝分
かれしたＤＮＡを用いずに、効率よく遺伝子の増幅を行
うことができるようにした方法を提供することを目的と
するものである。
来技術の問題点に鑑みて発明されたもので、酵素や枝分
かれしたＤＮＡを用いずに、効率よく遺伝子の増幅を行
うことができるようにした方法を提供することを目的と
するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記した課題を解決する
ために、本発明の遺伝子増幅方法は、お互いに相補的な
部分が３カ所以上の数から構成される一対（２つ一組）
のプローブの複数対を用いて、互い違いに交差するよう
にハイブリダイゼーションさせることにより、２本鎖の
高分子を形成させるものである。
ために、本発明の遺伝子増幅方法は、お互いに相補的な
部分が３カ所以上の数から構成される一対（２つ一組）
のプローブの複数対を用いて、互い違いに交差するよう
にハイブリダイゼーションさせることにより、２本鎖の
高分子を形成させるものである。
【０００７】上記した遺伝子増幅方法で用いられる一対
のプローブとしては、ＤＮＡプローブ同士、ＤＮＡプロ
ーブとＲＮＡプローブ、又はＲＮＡプローブ同士、ＰＮ
Ａ（Peptide Nucleic Acid 又は Polyamide Nucleic Ac
id）プローブ同士、ＰＮＡプローブとＤＮＡプローブ、
又はＰＮＡプローブとＲＮＡプローブ同士をあげること
ができる。
のプローブとしては、ＤＮＡプローブ同士、ＤＮＡプロ
ーブとＲＮＡプローブ、又はＲＮＡプローブ同士、ＰＮ
Ａ（Peptide Nucleic Acid 又は Polyamide Nucleic Ac
id）プローブ同士、ＰＮＡプローブとＤＮＡプローブ、
又はＰＮＡプローブとＲＮＡプローブ同士をあげること
ができる。
【０００８】前記一対のプローブの構成は、１対１でハ
イブリダイゼーションする時に必ず３カ所以上の相補的
な部分の中で、１カ所ずつが特異的にハイブリダイゼー
ションするように構成される。
イブリダイゼーションする時に必ず３カ所以上の相補的
な部分の中で、１カ所ずつが特異的にハイブリダイゼー
ションするように構成される。
【０００９】本発明のターゲット遺伝子検出方法の第１
の態様は、一対のプローブのうち、一方のプローブの一
部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子とな
るように構成し、ターゲット遺伝子と一対のプローブの
複数対をハイブリダイゼーションさせた後、上記した遺
伝子増幅方法で２本鎖の高分子を形成させ、プローブを
増幅して検出するものである。
の態様は、一対のプローブのうち、一方のプローブの一
部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子とな
るように構成し、ターゲット遺伝子と一対のプローブの
複数対をハイブリダイゼーションさせた後、上記した遺
伝子増幅方法で２本鎖の高分子を形成させ、プローブを
増幅して検出するものである。
【００１０】本発明の抗原・抗体検出方法の第１の態様
は、一対のプローブのうち、一方のプローブの一部分の
遺伝子を抗原・抗体等に結合しているターゲット遺伝子
と相補的な遺伝子となるように構成し、ターゲット遺伝
子と一対のプローブの複数対をハイブリダイゼーション
させた後、上記した遺伝子増幅方法で２本鎖の高分子を
形成させ、プローブを増幅して検出するものである。
は、一対のプローブのうち、一方のプローブの一部分の
遺伝子を抗原・抗体等に結合しているターゲット遺伝子
と相補的な遺伝子となるように構成し、ターゲット遺伝
子と一対のプローブの複数対をハイブリダイゼーション
させた後、上記した遺伝子増幅方法で２本鎖の高分子を
形成させ、プローブを増幅して検出するものである。
【００１１】本発明のターゲット遺伝子検出方法の第２
の態様は、一対のプローブとは別に、一対のプローブの
うちどちらか一方のプローブの一部分の遺伝子とターゲ
ット遺伝子に相補的なプローブを用いて、あらかじめタ
ーゲット遺伝子とハイブリダイゼーションさせた後、上
記した遺伝子増幅方法で一対のプローブの複数対をハイ
ブリダイゼーションさせ、２本鎖の高分子を形成させて
プローブを増幅して検出するものである。
の態様は、一対のプローブとは別に、一対のプローブの
うちどちらか一方のプローブの一部分の遺伝子とターゲ
ット遺伝子に相補的なプローブを用いて、あらかじめタ
ーゲット遺伝子とハイブリダイゼーションさせた後、上
記した遺伝子増幅方法で一対のプローブの複数対をハイ
ブリダイゼーションさせ、２本鎖の高分子を形成させて
プローブを増幅して検出するものである。
【００１２】本発明の抗原・抗体検出方法の第２の態様
は、一対のプローブとは別に、一対のプローブのうちど
ちらか一方のプローブの一部分の遺伝子と抗原・抗体等
に結合しているターゲット遺伝子に相補的なプローブを
用いて、あらかじめターゲット遺伝子とハイブリダイゼ
ーションさせた後、上記した遺伝子増幅方法で一対のプ
ローブの複数対をハイブリダイゼーションさせ、２本鎖
の高分子の形成により検出するものである。
は、一対のプローブとは別に、一対のプローブのうちど
ちらか一方のプローブの一部分の遺伝子と抗原・抗体等
に結合しているターゲット遺伝子に相補的なプローブを
用いて、あらかじめターゲット遺伝子とハイブリダイゼ
ーションさせた後、上記した遺伝子増幅方法で一対のプ
ローブの複数対をハイブリダイゼーションさせ、２本鎖
の高分子の形成により検出するものである。
【００１３】上記ターゲット遺伝子検出方法において、
上記した遺伝子増幅方法で増幅したプローブに、エチジ
ウムブロミド、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅ
ｎ等のインターカレーティング色素を結合させて増幅し
た高分子を蛍光により検出することができる。
上記した遺伝子増幅方法で増幅したプローブに、エチジ
ウムブロミド、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅ
ｎ等のインターカレーティング色素を結合させて増幅し
た高分子を蛍光により検出することができる。
【００１４】本発明の抗原・抗体検出方法において、上
記した遺伝子増幅方法で増幅したプローブに、エチジウ
ムブロミド、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
等のインターカレーティング色素を結合させて抗原・抗
体等に結合しているターゲット遺伝子を蛍光により検出
することができる。
記した遺伝子増幅方法で増幅したプローブに、エチジウ
ムブロミド、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
等のインターカレーティング色素を結合させて抗原・抗
体等に結合しているターゲット遺伝子を蛍光により検出
することができる。
【００１５】本発明のターゲット遺伝子検出方法におい
て、上記した遺伝子増幅方法で増幅させる一対のプロー
ブにあらかじめ検出のための標識物質として、125Ｉや
32Ｐ等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリ
ジニウム・エステル等の発光・発色物質、ジオキセタン
等の発光物質や４−メチルウンベリフェリルリン酸等の
蛍光物質を利用するためのアルカリフォスファターゼ、
アビジンに結合した蛍光・発光・発色物質等を利用する
ためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥ
Ｔ）を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍
光色素を付加させておき、ターゲット遺伝子を検出する
ことも可能である。
て、上記した遺伝子増幅方法で増幅させる一対のプロー
ブにあらかじめ検出のための標識物質として、125Ｉや
32Ｐ等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリ
ジニウム・エステル等の発光・発色物質、ジオキセタン
等の発光物質や４−メチルウンベリフェリルリン酸等の
蛍光物質を利用するためのアルカリフォスファターゼ、
アビジンに結合した蛍光・発光・発色物質等を利用する
ためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥ
Ｔ）を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍
光色素を付加させておき、ターゲット遺伝子を検出する
ことも可能である。
【００１６】本発明の抗原・抗体検出方法においては、
上記した遺伝子増幅方法で増幅させる一対のプローブに
あらかじめ検出のための標識物質として、125Ｉや32Ｐ
等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニ
ウム・エステル等の発光・発色物質、ジオキセタン等の
発光物質や４−メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光
物質を利用するためのアルカリフォスファターゼ、アビ
ジンに結合した蛍光・発光・発色物質等を利用するため
のビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を
利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素
を付加させておき、抗原・抗体を検出することも可能で
ある。
上記した遺伝子増幅方法で増幅させる一対のプローブに
あらかじめ検出のための標識物質として、125Ｉや32Ｐ
等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニ
ウム・エステル等の発光・発色物質、ジオキセタン等の
発光物質や４−メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光
物質を利用するためのアルカリフォスファターゼ、アビ
ジンに結合した蛍光・発光・発色物質等を利用するため
のビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を
利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素
を付加させておき、抗原・抗体を検出することも可能で
ある。
【００１７】本発明の一対のプローブは、お互いに相補
的な部分が３カ所以上の数から構成されるものである。
的な部分が３カ所以上の数から構成されるものである。
【００１８】上記一対のプローブとしては、ＤＮＡプロ
ーブ同士、ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブ、又はＲＮ
Ａプローブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブ
とＤＮＡプローブ、又はＰＮＡプローブとＲＮＡプロー
ブ同士をあげることができる。
ーブ同士、ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブ、又はＲＮ
Ａプローブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブ
とＤＮＡプローブ、又はＰＮＡプローブとＲＮＡプロー
ブ同士をあげることができる。
【００１９】本発明の２本鎖の高分子は、上記した一対
のプローブの複数対を用いて、互い違いに交差するよう
にハイブリダイゼーションさせることにより形成される
ものである。
のプローブの複数対を用いて、互い違いに交差するよう
にハイブリダイゼーションさせることにより形成される
ものである。
【００２０】上記したプローブの構成は、ＤＮＡプロー
ブの場合は、リン酸と糖と塩基（アデニン・チミン・グ
アニン・シトシン）を成分とする一本鎖断片であり、Ｒ
ＮＡプローブの場合は、塩基がアデニン・ウラシル・グ
アニン・シトシンを成分とする一本鎖断片である。ＰＮ
Ａは、ＤＮＡの「リン酸と糖」の骨格が、「Ｎ−（２−
アミノエチル）グリシン誘導体」に置き換わった構造
で、塩基の成分はＤＮＡ・ＲＮＡと同じである。
ブの場合は、リン酸と糖と塩基（アデニン・チミン・グ
アニン・シトシン）を成分とする一本鎖断片であり、Ｒ
ＮＡプローブの場合は、塩基がアデニン・ウラシル・グ
アニン・シトシンを成分とする一本鎖断片である。ＰＮ
Ａは、ＤＮＡの「リン酸と糖」の骨格が、「Ｎ−（２−
アミノエチル）グリシン誘導体」に置き換わった構造
で、塩基の成分はＤＮＡ・ＲＮＡと同じである。
【００２１】上記したプローブの長さは、塩基数にして
１０塩基から１０００塩基の範囲で使用するが、最も好
適には１０塩基から１００塩基の範囲のものを使用す
る。
１０塩基から１０００塩基の範囲で使用するが、最も好
適には１０塩基から１００塩基の範囲のものを使用す
る。
【００２２】上記した一対のプローブのお互いに相補的
な部分の塩基の種類は特に限定されるものではない。ま
た、１本のプローブ内にある相補的な部分同士の長さは
それぞれ等しくても、異なっていてもかまわない。
な部分の塩基の種類は特に限定されるものではない。ま
た、１本のプローブ内にある相補的な部分同士の長さは
それぞれ等しくても、異なっていてもかまわない。
【００２３】上記した一対のプローブをハイブリダイゼ
ーションさせ、２本鎖の高分子を形成させるために使用
するプローブの本数は、１０2〜１０15本の範囲で用い
られる。
ーションさせ、２本鎖の高分子を形成させるために使用
するプローブの本数は、１０2〜１０15本の範囲で用い
られる。
【００２４】
【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を添付
図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示
的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない
限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示
的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない
限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
【００２５】図１は一対のＤＮＡプローブの一例を示す
模式図である。同図において、Ｎｏ．１のＤＮＡプロー
ブは、Ｘ領域、Ｙ領域及びＺ領域を有し、Ｎｏ．２のＤ
ＮＡプローブは、Ｘ´領域、Ｙ´領域及びＺ´領域を有
している。
模式図である。同図において、Ｎｏ．１のＤＮＡプロー
ブは、Ｘ領域、Ｙ領域及びＺ領域を有し、Ｎｏ．２のＤ
ＮＡプローブは、Ｘ´領域、Ｙ´領域及びＺ´領域を有
している。
【００２６】このＮｏ．１のＤＮＡプローブとＮｏ．２
のＤＮＡプローブは、両者をハイブリダイゼーションさ
せたとき、Ｘ領域はＸ´領域とだけ結合し、Ｙ領域はＹ
´領域とだけ結合し、Ｚ領域はＺ´領域とだけ結合する
ような構成とされている（図２）。
のＤＮＡプローブは、両者をハイブリダイゼーションさ
せたとき、Ｘ領域はＸ´領域とだけ結合し、Ｙ領域はＹ
´領域とだけ結合し、Ｚ領域はＺ´領域とだけ結合する
ような構成とされている（図２）。
【００２７】つまり、本発明のお互いに相補的な部分が
３カ所以上の数から構成される一対のＤＮＡプローブ同
士を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼ
ーションさせた場合は、図２に示したように、Ｘ領域は
Ｘ´領域とだけ結合し、Ｙ領域はＹ´領域とだけ結合
し、Ｚ領域はＺ´領域とだけ結合し、３つの結合パター
ンで一対のプローブが互い違いにハイブリダイゼーショ
ンする。
３カ所以上の数から構成される一対のＤＮＡプローブ同
士を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼ
ーションさせた場合は、図２に示したように、Ｘ領域は
Ｘ´領域とだけ結合し、Ｙ領域はＹ´領域とだけ結合
し、Ｚ領域はＺ´領域とだけ結合し、３つの結合パター
ンで一対のプローブが互い違いにハイブリダイゼーショ
ンする。
【００２８】上記した構成のプローブを用いることによ
り、２本のプローブが互い違いに結合する。具体的に
は、図３に示したように、Ｎｏ．１のＤＮＡプローブ及
びＮｏ．２のＤＮＡプローブが立体的に互い違いに結合
し、高分子となる。
り、２本のプローブが互い違いに結合する。具体的に
は、図３に示したように、Ｎｏ．１のＤＮＡプローブ及
びＮｏ．２のＤＮＡプローブが立体的に互い違いに結合
し、高分子となる。
【００２９】つまり、図２に示した３つの結合パターン
で互い違いにハイブリダイゼーションした一対のプロー
ブの複数対は、図３に模式的な一例を示したように２本
鎖の高分子を形成させることができる。
で互い違いにハイブリダイゼーションした一対のプロー
ブの複数対は、図３に模式的な一例を示したように２本
鎖の高分子を形成させることができる。
【００３０】図３の模式図を立体的な概念構造の一例を
示すと図４のように示される。図５は図３の結合パター
ンを変えた模式図で、図５の模式図の立体的な概念構造
の一例は図６のように示される。
示すと図４のように示される。図５は図３の結合パター
ンを変えた模式図で、図５の模式図の立体的な概念構造
の一例は図６のように示される。
【００３１】ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブ、又はＲ
ＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプロー
ブとＤＮＡプローブ、又はＰＮＡプローブとＲＮＡプロ
ーブ同士の場合も、そのハイブリダイゼーションの原理
は、図３に示したＤＮＡプローブ同士の場合と同様であ
る。
ＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプロー
ブとＤＮＡプローブ、又はＰＮＡプローブとＲＮＡプロ
ーブ同士の場合も、そのハイブリダイゼーションの原理
は、図３に示したＤＮＡプローブ同士の場合と同様であ
る。
【００３２】本発明の構成をさらに具体的な例でいえ
ば、のＤＮＡプローブどうしの場合は、図７に示した
ように、Ｎｏ．３プローブとＮｏ．４プローブをハイブ
リダイゼーションさせたとき、制限酵素による切断部位
（下線の部分がＨａｅ IIIという酵素で切断される）が
できるように構成することもできる。つまり、立体的に
プローブどうしが互い違いに結合し高分子になった後、
その後の別の実験操作にその高分子がクロスコンタミネ
ーションしないように、制限酵素を用いて防止すること
ができる（図８）。
ば、のＤＮＡプローブどうしの場合は、図７に示した
ように、Ｎｏ．３プローブとＮｏ．４プローブをハイブ
リダイゼーションさせたとき、制限酵素による切断部位
（下線の部分がＨａｅ IIIという酵素で切断される）が
できるように構成することもできる。つまり、立体的に
プローブどうしが互い違いに結合し高分子になった後、
その後の別の実験操作にその高分子がクロスコンタミネ
ーションしないように、制限酵素を用いて防止すること
ができる（図８）。
【００３３】本発明の構成をさらに具体的な例でいえ
ば、のＤＮＡプローブどうしの場合は、図９に示した
ように、一本のプローブの中でお互いに相補的になる部
分の長さは、それぞれ均等である必要はなく、Ｎｏ．５
プローブとＮｏ．６プローブをハイブリダイゼーション
させたとき、Ｘ領域とＸ´領域は２４塩基でハイブリダ
イゼーションし、Ｙ領域とＹ´領域は２２塩基でハイブ
リダイゼーションし、Ｚ領域とＺ´領域は２０塩基でハ
イブリダイゼーションする（図１０）。
ば、のＤＮＡプローブどうしの場合は、図９に示した
ように、一本のプローブの中でお互いに相補的になる部
分の長さは、それぞれ均等である必要はなく、Ｎｏ．５
プローブとＮｏ．６プローブをハイブリダイゼーション
させたとき、Ｘ領域とＸ´領域は２４塩基でハイブリダ
イゼーションし、Ｙ領域とＹ´領域は２２塩基でハイブ
リダイゼーションし、Ｚ領域とＺ´領域は２０塩基でハ
イブリダイゼーションする（図１０）。
【００３４】本発明のターゲット遺伝子検出方法の第１
の態様をさらに具体的な例でいえば、図１１に示したよ
うに、一対のプローブのうち、一方のプローブの一部分
の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子となるよ
うに構成し、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーショ
ンさせた後、本発明の遺伝子増幅方法で一対のプローブ
の複数対をハイブリダイゼーションさせ、２本鎖の高分
子を形成させてプローブを増幅して検出するものであ
る。
の態様をさらに具体的な例でいえば、図１１に示したよ
うに、一対のプローブのうち、一方のプローブの一部分
の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子となるよ
うに構成し、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーショ
ンさせた後、本発明の遺伝子増幅方法で一対のプローブ
の複数対をハイブリダイゼーションさせ、２本鎖の高分
子を形成させてプローブを増幅して検出するものであ
る。
【００３５】本発明のターゲット遺伝子検出方法の第２
の態様をさらに具体的な例でいえば、図１２に示したよ
うに、一対のプローブとは別に、一対のプローブのうち
どちらか一方のプローブの一部分の遺伝子とターゲット
遺伝子に相補的なプローブを用いて、あらかじめターゲ
ット遺伝子とハイブリダイゼーションさせた後、上記し
た遺伝子増幅方法で一対のプローブの複数対をハイブリ
ダイゼーションさせ、２本鎖の高分子を形成させてプロ
ーブを増幅して検出するものである。
の態様をさらに具体的な例でいえば、図１２に示したよ
うに、一対のプローブとは別に、一対のプローブのうち
どちらか一方のプローブの一部分の遺伝子とターゲット
遺伝子に相補的なプローブを用いて、あらかじめターゲ
ット遺伝子とハイブリダイゼーションさせた後、上記し
た遺伝子増幅方法で一対のプローブの複数対をハイブリ
ダイゼーションさせ、２本鎖の高分子を形成させてプロ
ーブを増幅して検出するものである。
【００３６】本発明の抗原・抗体検出方法の第１の態様
をさらに具体的な例でいえば、図１３に示したように、
一対のプローブのうち、一方のプローブの一部分の遺伝
子を抗原・抗体に結合しているターゲット遺伝子と相補
的な遺伝子となるように構成し、本発明の遺伝子増幅方
法で一対のプローブの複数対をハイブリダイゼーション
させ、２本鎖の高分子を形成させて抗原・抗体を検出す
るものである。
をさらに具体的な例でいえば、図１３に示したように、
一対のプローブのうち、一方のプローブの一部分の遺伝
子を抗原・抗体に結合しているターゲット遺伝子と相補
的な遺伝子となるように構成し、本発明の遺伝子増幅方
法で一対のプローブの複数対をハイブリダイゼーション
させ、２本鎖の高分子を形成させて抗原・抗体を検出す
るものである。
【００３７】
【実施例】以下に、本発明の実施例を挙げて説明する
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないこ
とは勿論である。
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないこ
とは勿論である。
【００３８】 １．実施例１と実施例２で使用したＤＮＡプローブ。 遺伝子増幅用プローブ１ 5-TgA CTT ACT TAA CCg gAA ACA T・AAg CAg gAT CCT CTA AgC CTg A・CgA Ag T ATT TAA Cgg Tgg TAT g-3 遺伝子増幅用プローブ２ 3-gCT TCA TAA ATT gCC ACC ATA C・TTC gTC CTA ggA gAT TCg gAc T・ACT gA A TgA ATT ggC CTT TgT A-5 遺伝子増幅用プローブ３ 5´- TgC CgA CCg gCg AgC g・TAg CAT ggC CCT CTA g・CTT ATC ggC CTC gAg A -3´ 遺伝子増幅用プローブ４ 3´- gAA TAg CCg gAg CTC T・ATC gTA CCg ggA gAT C・ACg gCT ggC CgC TCg C -5´
【００３９】 ２．実施例−３と実施例−４で使用した合成ＨＣＶ−ＲＮＡと各種ＤＮＡプロー ブ。 Ｃ型肝炎ウイルスの5´-noncoding領域を合成したHCV-RNA。 （以下、合成ＨＣＶ−ＲＮＡと略）。 ＨＣＶ−ＲＮＡ捕捉用プローブＡ 5´(リン酸化)-TAg AgC gTg CAg ATA gTC gAT・CCT CAC Agg ggA gTg ATT CAT ggT -3´ （無意味な塩基配列） （HCV-RNAに相補的な塩基配列 ） ＨＣＶ−ＲＮＡ捕捉用プローブＢ 5´(ビオチン標識)-TAg AgC gTg CAg ATA gTC gAT・CCT CAC Agg ggA gTg ATT CAT ggT -3´ （無意味な塩基配列） （HCV-RNAに相補的な塩基 配列） プローブＣ 3´- TAC TTA gTg Agg ggA CAC TCC・gAA TAA gTC ATA gCT CAT- 5´ （HCV-RNAに相補的な塩基配列）（増幅プローブ５に相補的な塩基配列） プローブＤ 3´- gCC CAg gAA AgA ACC TAg TTg・gAA TAA gTC ATA gCT CAT- 5´ （HCV-RNAに相補的な塩基配列）（増幅プローブ５に相補的な塩基配列） プローブＥ 3´- CAT CAC AAC CCA gCg CTT TCC・gAA TAA gTC ATA gCT CAT- 5´ （HCV-RNAに相補的な塩基配列）（増幅プローブ５に相補的な塩基配列） 遺伝子増幅用プローブ５ 5´-CTT ATT CAg TAT CgA gTA・TAg CAg gAT CCC TCT AAg・TgC Cgg ACC AgC gAg Cgg-3´ （キャプチャープローブＢ・Ｃ・Ｄに相補的な塩基配列） 遺伝子増幅用プローブ６ 3´-ACg gCC Tgg TCg CTC gCC・ATC gTC CTA ggg AgA TTC・gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5´ 遺伝子増幅用プローブ７ 3´（ビオチン化）-ACg gCC Tgg TCg CTC gCC・ATC gTC CTA ggg AgA TTC・ gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5´
【００４０】（実施例１） １．目的 本発明の一対のＤＮＡプローブである遺伝子増幅用プロ
ーブを用いて、ハイブリダイゼーションの温度による遺
伝子増幅の効果を証明した。
ーブを用いて、ハイブリダイゼーションの温度による遺
伝子増幅の効果を証明した。
【００４１】２．材料 １）遺伝子の増幅に遺伝子増幅用プローブ１，遺伝子増
幅用プローブ２を使用。 ２）緩衝液として２０×ＳＳＣ（333mM-NaCl,333mM-C6H
5O7Na3・2H2O,pH 7.0）を使用。
幅用プローブ２を使用。 ２）緩衝液として２０×ＳＳＣ（333mM-NaCl,333mM-C6H
5O7Na3・2H2O,pH 7.0）を使用。
【００４２】３．方法 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、１０13コピ
ー／μＬに調製した遺伝子増幅用プローブ１と遺伝子増
幅用プローブ２をそれぞれ５μＬずつ加え、４０μＬの
２０×ＳＳＣを加えて蓋をした後、９４℃で３０秒間煮
沸し、５０℃，５２℃，５４℃，５６℃，５８℃，６０
℃，６２℃，６４℃，６６℃，６８℃，７０℃，でそれ
ぞれ３０分間加温した。
ー／μＬに調製した遺伝子増幅用プローブ１と遺伝子増
幅用プローブ２をそれぞれ５μＬずつ加え、４０μＬの
２０×ＳＳＣを加えて蓋をした後、９４℃で３０秒間煮
沸し、５０℃，５２℃，５４℃，５６℃，５８℃，６０
℃，６２℃，６４℃，６６℃，６８℃，７０℃，でそれ
ぞれ３０分間加温した。
【００４３】加温後、０．５％のアガロースゲルを用い
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により遺伝子増
幅の効果を確認した。
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により遺伝子増
幅の効果を確認した。
【００４４】４．成績 図１３は、０．５％のアガロースゲルを用いて１００
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例１の成績を写真を
用いて示したものである。
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例１の成績を写真を
用いて示したものである。
【００４５】アガロースゲルは、ＤＮＡ分子をその大き
さによって分けることができるゲルで、一般的に０．５
％のアガロースゲルは、３０，０００〜４０．０００塩
基対のＤＮＡ分子の分離に用いられるものである。
さによって分けることができるゲルで、一般的に０．５
％のアガロースゲルは、３０，０００〜４０．０００塩
基対のＤＮＡ分子の分離に用いられるものである。
【００４６】図１３の写真には、一対のＤＮＡプローブ
がハイブリダイゼーションの温度に依存して互い違いに
正確に２本鎖の高分子を形成した結果として、温度の上
昇とともに０．５％のアガロースゲルではもはや泳動で
きないほどに大きくなった高分子が示されている。
がハイブリダイゼーションの温度に依存して互い違いに
正確に２本鎖の高分子を形成した結果として、温度の上
昇とともに０．５％のアガロースゲルではもはや泳動で
きないほどに大きくなった高分子が示されている。
【００４７】（実施例２） １．目的 本発明の一対のＤＮＡプローブである遺伝子増幅用プロ
ーブで増幅された高分子が制限酵素によって切断される
ことを証明した。
ーブで増幅された高分子が制限酵素によって切断される
ことを証明した。
【００４８】２．材料 １）遺伝子の増幅に遺伝子増幅用プローブ３，遺伝子増
幅用プローブ４を使用。 ２）制限酵素として、Ｈａｅ III（タカラ酒造社製）を
使用。 ３）制限酵素用緩衝液としてＭ-Buffer（タカラ酒造社
製）を使用。 ４）緩衝液として２０×ＳＳＣ（333mM-NaCl,333mM-C6H
5O7Na3・2H2O,pH 7.0）を使用。
幅用プローブ４を使用。 ２）制限酵素として、Ｈａｅ III（タカラ酒造社製）を
使用。 ３）制限酵素用緩衝液としてＭ-Buffer（タカラ酒造社
製）を使用。 ４）緩衝液として２０×ＳＳＣ（333mM-NaCl,333mM-C6H
5O7Na3・2H2O,pH 7.0）を使用。
【００４９】３．方法 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、１０13コピ
ー／μＬに調製した遺伝子増幅用プローブ３と遺伝子増
幅用プローブ４をそれぞれ５μＬずつ加え、５μＬの２
０×ＳＳＣと３５μＬの滅菌蒸留水を加えて蓋をした反
応液Ａと同じく１０13コピー／μＬに調製した遺伝子増
幅用プローブ３と遺伝子増幅用プローブ４をそれぞれ
２．５μＬずつ加え、５μＬの２０×ＳＳＣと４０μＬ
の滅菌蒸留水を加えて蓋をした反応液Ｂを９４℃で３０
秒間煮沸し、６２℃でそれぞれ３０分間加温した。
ー／μＬに調製した遺伝子増幅用プローブ３と遺伝子増
幅用プローブ４をそれぞれ５μＬずつ加え、５μＬの２
０×ＳＳＣと３５μＬの滅菌蒸留水を加えて蓋をした反
応液Ａと同じく１０13コピー／μＬに調製した遺伝子増
幅用プローブ３と遺伝子増幅用プローブ４をそれぞれ
２．５μＬずつ加え、５μＬの２０×ＳＳＣと４０μＬ
の滅菌蒸留水を加えて蓋をした反応液Ｂを９４℃で３０
秒間煮沸し、６２℃でそれぞれ３０分間加温した。
【００５０】加温後、４０μＬの反応液Ａと反応液Ｂに
５μＬのＭ-Bufferと５μＬのＨａｅ IIIを加えて、３
７℃で２４時間反応させ、２％のアガロースゲルを用い
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により遺増幅さ
れた高分子の制限酵素による切断を確認した。
５μＬのＭ-Bufferと５μＬのＨａｅ IIIを加えて、３
７℃で２４時間反応させ、２％のアガロースゲルを用い
て電気泳動し、エチジウムブロミド染色により遺増幅さ
れた高分子の制限酵素による切断を確認した。
【００５１】４．成績 図１４は、２．０％のアガロースゲルを用いて１００
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例２の成績を写真を
用いて示したものである。
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例２の成績を写真を
用いて示したものである。
【００５２】互い違いに正確に２本鎖の高分子を形成し
た一対のＤＮＡプローブが制限酵素によって最小単位に
まで切断されたことが示されている。
た一対のＤＮＡプローブが制限酵素によって最小単位に
まで切断されたことが示されている。
【００５３】（実施例３） １．材料 １）遺伝子の増幅に遺伝子増幅用プローブ５，遺伝子増
幅用プローブ６を使用。 ２）Ｂ／Ｆ分離用の固相に、ストレプトアビジンを結合
させた磁性体ビーズを使用。（商品名：Streptavidin M
agneSphere／Promega社製）。 ３）緩衝液として２０×ＳＳＣと０．５×ＳＳＣ（２０
×ＳＳＣの４０倍希釈液）を使用。
幅用プローブ６を使用。 ２）Ｂ／Ｆ分離用の固相に、ストレプトアビジンを結合
させた磁性体ビーズを使用。（商品名：Streptavidin M
agneSphere／Promega社製）。 ３）緩衝液として２０×ＳＳＣと０．５×ＳＳＣ（２０
×ＳＳＣの４０倍希釈液）を使用。
【００５４】２．方法 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、１０1コピ
ー／１０μＬ，１０2コピー／１０μＬ，１０3コピー／
１０μＬ，１０4コピー／１０μＬ，１０5コピー／１０
μＬ，１０6コピー／１０μＬ，１０7コピー／１０μ
Ｌ，１０8コピー／１０μＬ，１０9コピー／１０μＬ，
１０10コピー／１０μＬとなるように調製した合成ＨＣ
Ｖ−ＲＮＡをそれぞれ１０μＬずつ加え、次に１０13コ
ピー／μＬに調製したＨＣＶ−ＲＮＡ捕捉用プローブ
Ｂ、プローブＣ、プローブＤ、プローブＥをそれぞれ１
μＬ、１０13コピー／μＬに調製した遺伝子増幅用プロ
ーブ５を１０μＬ、及び２０×ＳＳＣを２５μＬを加え
る。マイクロチューブの蓋を閉めてミキサーで混和した
後、６２℃で６０分間加温する。
ー／１０μＬ，１０2コピー／１０μＬ，１０3コピー／
１０μＬ，１０4コピー／１０μＬ，１０5コピー／１０
μＬ，１０6コピー／１０μＬ，１０7コピー／１０μ
Ｌ，１０8コピー／１０μＬ，１０9コピー／１０μＬ，
１０10コピー／１０μＬとなるように調製した合成ＨＣ
Ｖ−ＲＮＡをそれぞれ１０μＬずつ加え、次に１０13コ
ピー／μＬに調製したＨＣＶ−ＲＮＡ捕捉用プローブ
Ｂ、プローブＣ、プローブＤ、プローブＥをそれぞれ１
μＬ、１０13コピー／μＬに調製した遺伝子増幅用プロ
ーブ５を１０μＬ、及び２０×ＳＳＣを２５μＬを加え
る。マイクロチューブの蓋を閉めてミキサーで混和した
後、６２℃で６０分間加温する。
【００５５】室温まで温度が下がったら、それぞれのマ
イクロチューブに１０13コピー／μＬに調製した遺伝子
増幅用プローブ６を５μＬずつ加えて、マイクロチュー
ブの蓋を閉めてミキサーで混和した後、６２℃で６０分
間加温する。
イクロチューブに１０13コピー／μＬに調製した遺伝子
増幅用プローブ６を５μＬずつ加えて、マイクロチュー
ブの蓋を閉めてミキサーで混和した後、６２℃で６０分
間加温する。
【００５６】室温まで温度が下がったら、それぞれのマ
イクロチューブに１０μＬのStreptavidin MagneSphere
（以下、磁性体ビーズ）を加え、３７℃で３０分間反応
する。反応後、磁石を用いて磁性体ビーズをトラップ
し、上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬと１
００μｇ／ｍＬに調製したエチジウムブロミド（和光純
薬社製）を１０μＬ加えて、室温で２０分間反応させ
る。
イクロチューブに１０μＬのStreptavidin MagneSphere
（以下、磁性体ビーズ）を加え、３７℃で３０分間反応
する。反応後、磁石を用いて磁性体ビーズをトラップ
し、上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬと１
００μｇ／ｍＬに調製したエチジウムブロミド（和光純
薬社製）を１０μＬ加えて、室温で２０分間反応させ
る。
【００５７】反応後、磁石を用いて磁性体ビーズをトラ
ップし、上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬ
加え、直ちに磁石を用いて磁性体ビーズをトラップし、
上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬ加えて、
全量を平底の９６ウェルプレートに移して下から紫外線
を照射し、エチジウムブロミドのインタカレーションに
よって蛍光を発するようになった増幅遺伝子を写真撮影
する。
ップし、上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬ
加え、直ちに磁石を用いて磁性体ビーズをトラップし、
上清を除去した後、０．５×ＳＳＣを５０μＬ加えて、
全量を平底の９６ウェルプレートに移して下から紫外線
を照射し、エチジウムブロミドのインタカレーションに
よって蛍光を発するようになった増幅遺伝子を写真撮影
する。
【００５８】３．成績 図１５は、９６ウェルプレートの下から紫外線を照射
し、エチジウムブロミドの蛍光を写真で撮影した状態を
示すものである。
し、エチジウムブロミドの蛍光を写真で撮影した状態を
示すものである。
【００５９】結果は図１５の写真に示したように、１０
10コピー／１０μＬで一番強い蛍光が認められ、合成Ｈ
ＣＶ−ＲＮＡの量に応じて、段階的に蛍光が弱くなって
いった。
10コピー／１０μＬで一番強い蛍光が認められ、合成Ｈ
ＣＶ−ＲＮＡの量に応じて、段階的に蛍光が弱くなって
いった。
【００６０】（実施例４） １．材料 １）遺伝子の増幅に遺伝子増幅用プローブ５，遺伝子増
幅用プローブ７を使用。 ２）Ｂ／Ｆ分離用の固相に、９６ウェルプレートを使
用。（商品名：NucleoLinkTM／Nunc社製） ３）Peroxidase Conjugated Streptavidinとして、
「HRP-Streptavidin／ZYMED LABORATORIES,INC.」を使
用。４）発色試薬として、「ペルオキシダーゼ用発色キ
ットＴ／住友ベークライト社製」を使用。 ５）酵素反応停止液として、2N-H2SO4を使用。 ６）緩衝液として２０×ＳＳＣと０．５×ＳＳＣを使
用。
幅用プローブ７を使用。 ２）Ｂ／Ｆ分離用の固相に、９６ウェルプレートを使
用。（商品名：NucleoLinkTM／Nunc社製） ３）Peroxidase Conjugated Streptavidinとして、
「HRP-Streptavidin／ZYMED LABORATORIES,INC.」を使
用。４）発色試薬として、「ペルオキシダーゼ用発色キ
ットＴ／住友ベークライト社製」を使用。 ５）酵素反応停止液として、2N-H2SO4を使用。 ６）緩衝液として２０×ＳＳＣと０．５×ＳＳＣを使
用。
【００６１】２．方法 あらかじめＨＣＶ−ＲＮＡ捕捉用プローブＡが結合（た
だし、特別なブロッキング処理は施していない）してい
る９６ウェルプレート（NucleoLinkTM／Nunc社製）の各
ウェルに、０コピー／１０μＬ，１０3コピー／１０μ
Ｌ，１０4コピー／１０μＬ，１０5コピー／１０μＬ，
１０6コピー／１０μＬ，１０7コピー／１０μＬとなる
ように調製した合成ＨＣＶ−ＲＮＡをそれぞれ１０μＬ
ずつ加え、次に１０11コピー／μＬに調製したプローブ
Ｃ、プローブＤ、プローブＥをそれぞれ１０μＬ、１０
11コピー／μＬに調製した遺伝子増幅用プローブ５を１
０μＬ、及び２０×ＳＳＣを６０μＬを加える。
だし、特別なブロッキング処理は施していない）してい
る９６ウェルプレート（NucleoLinkTM／Nunc社製）の各
ウェルに、０コピー／１０μＬ，１０3コピー／１０μ
Ｌ，１０4コピー／１０μＬ，１０5コピー／１０μＬ，
１０6コピー／１０μＬ，１０7コピー／１０μＬとなる
ように調製した合成ＨＣＶ−ＲＮＡをそれぞれ１０μＬ
ずつ加え、次に１０11コピー／μＬに調製したプローブ
Ｃ、プローブＤ、プローブＥをそれぞれ１０μＬ、１０
11コピー／μＬに調製した遺伝子増幅用プローブ５を１
０μＬ、及び２０×ＳＳＣを６０μＬを加える。
【００６２】ピペットで混和した後、９４℃で３０秒間
加熱し、６２℃で６０分間加温する。室温まで温度が下
がったら、それぞれのマイクロチューブに１０11コピー
／μＬに調製した遺伝子増幅用プローブ５を１０μＬ、
遺伝子増幅用プローブ７を２０μＬずつ加える。ピペッ
トで混和した後、９４℃で３０秒間加熱し、６２℃で６
０分間加温する。
加熱し、６２℃で６０分間加温する。室温まで温度が下
がったら、それぞれのマイクロチューブに１０11コピー
／μＬに調製した遺伝子増幅用プローブ５を１０μＬ、
遺伝子増幅用プローブ７を２０μＬずつ加える。ピペッ
トで混和した後、９４℃で３０秒間加熱し、６２℃で６
０分間加温する。
【００６３】室温まで温度が下がったら、０．１％-Twe
en20を含む０．５×ＳＳＣで４回洗浄し、各ウェルに
「HRP-Streptavidin」を１００μＬ加え、３７℃で２０
分間加温する。各ウェルの液を吸引除去した後、０．１
％-Tween20を含む０．５×ＳＳＣで４回洗浄する。
en20を含む０．５×ＳＳＣで４回洗浄し、各ウェルに
「HRP-Streptavidin」を１００μＬ加え、３７℃で２０
分間加温する。各ウェルの液を吸引除去した後、０．１
％-Tween20を含む０．５×ＳＳＣで４回洗浄する。
【００６４】各ウェルに「ペルオキシダーゼ用発色キッ
トＴ」を１００μＬ加えて、暗所（室温）で１０分間反
応させる。反応後、酵素反応停止液を１００μＬ加え、
波長４５０ｎｍでの吸光度を測定する。
トＴ」を１００μＬ加えて、暗所（室温）で１０分間反
応させる。反応後、酵素反応停止液を１００μＬ加え、
波長４５０ｎｍでの吸光度を測定する。
【００６５】３．成績 実施例４の成績を表１に示した。互い違いにハイブリダ
イゼーションして２本鎖の高分子を形成した一対のＤＮ
Ａプローブのうち、一方に標識されていた Peroxidase
Conjugated Streptavidin が発色することによっ
て、加えた１０3〜１０7コピーまでの合成ＨＣＶ−ＲＮ
Ａの量に応じて発色が確認された。
イゼーションして２本鎖の高分子を形成した一対のＤＮ
Ａプローブのうち、一方に標識されていた Peroxidase
Conjugated Streptavidin が発色することによっ
て、加えた１０3〜１０7コピーまでの合成ＨＣＶ−ＲＮ
Ａの量に応じて発色が確認された。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【発明の効果】以上述べたごとく、本発明の遺伝子増幅
方法によれば、核酸合成酵素や枝分かれしたＤＮＡを用
いずに、効率よく遺伝子の増幅を行うことができる。
方法によれば、核酸合成酵素や枝分かれしたＤＮＡを用
いずに、効率よく遺伝子の増幅を行うことができる。
【００６８】また、本発明の抗原・抗体を検出する方法
によれば、上記した遺伝子増幅方法を利用することによ
って効率よく抗原・抗体を検出することができる。
によれば、上記した遺伝子増幅方法を利用することによ
って効率よく抗原・抗体を検出することができる。
【図１】一対（２本）のＤＮＡプローブの一例を示す模
式図である。
式図である。
【図２】一対のＤＮＡプローブの結合態様の例を示す模
式図である。
式図である。
【図３】一対のＤＮＡプローブが互い違いにハイブリダ
イゼーションした場合にできる高分子の形成を示した模
式図である。
イゼーションした場合にできる高分子の形成を示した模
式図である。
【図４】図３の模式図の立体的な概念構造の一例を示す
模式図である。
模式図である。
【図５】図３の結合パターンを変えた模式図である。
【図６】図５の模式図の立体的な概念構造の一例を示す
模式図である。
模式図である。
【図７】制限酵素による切断部位を挿入した一対（２
本）のＤＮＡプローブの一例を示す模式図である。
本）のＤＮＡプローブの一例を示す模式図である。
【図８】立体的にプローブどうしが互い違いに結合し高
分子になった後、制限酵素を用いて切断した場合の一例
を示す模式図である。
分子になった後、制限酵素を用いて切断した場合の一例
を示す模式図である。
【図９】一本のプローブの中でお互いに相補的になる部
分の長さ異なる一対（２本）のＤＮＡプローブの一例を
示す模式図である。
分の長さ異なる一対（２本）のＤＮＡプローブの一例を
示す模式図である。
【図１０】図９に示した一対のＤＮＡプローブが互い違
いにハイブリダイゼーションした場合にできる高分子の
形成を示した模式図である。
いにハイブリダイゼーションした場合にできる高分子の
形成を示した模式図である。
【図１１】本発明の一対のＤＮＡプローブを用いてター
ゲット遺伝子を直接検出する方法を示した模式図で、ま
ずターゲット遺伝子に対して、ターゲット遺伝子と本発
明の一対のＤＮＡプローブ（図中の増幅遺伝子）に相補
的な領域を持つプローブをハイブリダイゼーションさ
せ、その後、本発明の一対のＤＮＡプローブ（図中の増
幅遺伝子１と増幅遺伝子２）を加えることにより、本発
明の一対のＤＮＡプローブは、ターゲット遺伝子にハイ
ブリダイゼーションした状態で２本鎖の高分子を形成す
るため、容易にターゲット遺伝子を検出することができ
ることを示した図面である。
ゲット遺伝子を直接検出する方法を示した模式図で、ま
ずターゲット遺伝子に対して、ターゲット遺伝子と本発
明の一対のＤＮＡプローブ（図中の増幅遺伝子）に相補
的な領域を持つプローブをハイブリダイゼーションさ
せ、その後、本発明の一対のＤＮＡプローブ（図中の増
幅遺伝子１と増幅遺伝子２）を加えることにより、本発
明の一対のＤＮＡプローブは、ターゲット遺伝子にハイ
ブリダイゼーションした状態で２本鎖の高分子を形成す
るため、容易にターゲット遺伝子を検出することができ
ることを示した図面である。
【図１２】一対のプローブのうち、一方のプローブの一
部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子とな
るように構成したＤＮＡプローブ（図中の増幅遺伝子
１）とそのＤＮＡプローブに対して対をなすＤＮＡプロ
ーブ（図中の増幅遺伝子１）を用いて、ターゲット遺伝
子と一対のプローブの複数対をハイブリダイゼーション
させ、２本鎖の高分子を形成させ、ターゲット遺伝子を
検出する方法を示す模式図である。
部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子とな
るように構成したＤＮＡプローブ（図中の増幅遺伝子
１）とそのＤＮＡプローブに対して対をなすＤＮＡプロ
ーブ（図中の増幅遺伝子１）を用いて、ターゲット遺伝
子と一対のプローブの複数対をハイブリダイゼーション
させ、２本鎖の高分子を形成させ、ターゲット遺伝子を
検出する方法を示す模式図である。
【図１３】 本発明の抗原・抗体の検出方法の第１の態
様を示す構成図である。
様を示す構成図である。
【図１４】 実施例１の成績を示す写真である。
【図１５】 実施例２の成績を示す写真である。
【図１６】 実施例３の成績を示す写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１２月８日（１９９９．１２．
８）
８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】４．成績 図１４は、０．５％のアガロースゲルを用いて１００
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例１の成績を写真を
用いて示したものである。
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例１の成績を写真を
用いて示したものである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】図１４の写真には、一対のＤＮＡプローブ
がハイブリダイゼーションの温度に依存して互い違いに
正確に２本鎖の高分子を形成した結果として、温度の上
昇とともに０．５％のアガロースゲルではもはや泳動で
きないほどに大きくなった高分子が示されている。
がハイブリダイゼーションの温度に依存して互い違いに
正確に２本鎖の高分子を形成した結果として、温度の上
昇とともに０．５％のアガロースゲルではもはや泳動で
きないほどに大きくなった高分子が示されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５１】４．成績 図１５は、２．０％のアガロースゲルを用いて１００
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例２の成績を写真を
用いて示したものである。
Ｖ，３０分間の電気泳動による実施例２の成績を写真を
用いて示したものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５８】３．成績 図１６は、９６ウェルプレートの下から紫外線を照射
し、エチジウムブロミドの蛍光を写真で撮影した状態を
示すものである。
し、エチジウムブロミドの蛍光を写真で撮影した状態を
示すものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５９】結果は図１６の写真に示したように、１０
10コピー／１０μＬで一番強い蛍光が認められ、合成Ｈ
ＣＶ−ＲＮＡの量に応じて、段階的に蛍光が弱くなって
いった。
10コピー／１０μＬで一番強い蛍光が認められ、合成Ｈ
ＣＶ−ＲＮＡの量に応じて、段階的に蛍光が弱くなって
いった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 BB24 BB50 DA13 DA14 FA20 FB01 FB02 FB03 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 CA09 CA11 HA11 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR08 QR32 QR55 QS25 QX01
Claims (14)
- 【請求項１】 お互いに相補的な部分が３カ所以上の数
から構成される一対のプローブの複数対を用いて、互い
違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせるこ
とにより、２本鎖の高分子を形成させることを特徴とす
る遺伝子増幅方法。 - 【請求項２】 前記一対のプローブが、ＤＮＡプローブ
同士、ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブ、又はＲＮＡプ
ローブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブとＤ
ＮＡプローブ、又はＰＮＡプローブとＲＮＡプローブ同
士であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子増幅方
法。 - 【請求項３】 前記一対のプローブの構成は、１対１で
ハイブリダイゼーションする時に必ず３カ所以上の相補
的な部分の中で、１カ所ずつが特異的にハイブリダイゼ
ーションするように構成されることを特徴とする請求項
１又は２記載の遺伝子増幅方法。 - 【請求項４】 一対のプローブのうち、一方のプローブ
の一部分の遺伝子をターゲット遺伝子と相補的な遺伝子
となるように構成し、請求項１〜３のいずれか１項記載
の方法でターゲット遺伝子と一対のプローブの複数対を
ハイブリダイゼーションさせ、２本鎖の高分子を形成さ
せてプローブを増幅し、ターゲット遺伝子を検出するこ
とを特徴とするターゲット遺伝子検出方法。 - 【請求項５】 一対のプローブのうち、一方のプローブ
の一部分の遺伝子を抗原・抗体に結合しているターゲッ
ト遺伝子と相補的な遺伝子となるように構成し、請求項
１〜３のいずれか１項記載の方法でターゲット遺伝子と
一対のプローブの複数対をハイブリダイゼーションさ
せ、２本鎖の高分子を形成させて抗原・抗体を検出する
ことを特徴とする抗原・抗体検出方法。 - 【請求項６】 一対のプローブとは別に、一対のプロー
ブのうちどちらか一方のプローブの一部分の遺伝子とタ
ーゲット遺伝子に相補的なプローブを用いて、あらかじ
めターゲット遺伝子にハイブリダイゼーションさせた
後、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法で一対のプ
ローブをハイブリダイゼーションさせ、２本鎖の高分子
を形成させてプローブを増幅し、ターゲット遺伝子を検
出することを特徴とするターゲット遺伝子検出方法。 - 【請求項７】 一対のプローブとは別に、一対のプロー
ブのうちどちらか一方のプローブの一部分の遺伝子と抗
原・抗体に結合しているターゲット遺伝子に相補的なプ
ローブを用いて、あらかじめターゲット遺伝子にハイブ
リダイゼーションさせた後、請求項１〜３のいずれか１
項記載の方法で一対のプローブをハイブリダイゼーショ
ンさせ、２本鎖の高分子形成により抗原・抗体を検出す
ることを特徴とする抗原・抗体検出方法。 - 【請求項８】 前記増幅したプローブに、蛍光物質を結
合させ、ターゲット遺伝子を発光させて検出することを
特徴とする請求項４又は６記載のターゲット遺伝子検出
方法方法。 - 【請求項９】 前記増幅したプローブに、蛍光物質を結
合させ、抗原・抗体に結合しているターゲット遺伝子を
発光させて抗原・抗体を検出することを特徴とする請求
項５又は７記載の抗原・抗体検出方法。 - 【請求項１０】 前記増幅させるプローブに、あらかじ
め検出のための標識物質を付加させておき、ターゲット
遺伝子を検出することを特徴とする請求項４又は６記載
のターゲット遺伝子検出方法。 - 【請求項１１】 前記増幅させるプローブに、あらかじ
め検出のための標識物質を付加させておき、抗原・抗体
を検出することを特徴とする請求項５又は７記載の抗原
・抗体検出方法。 - 【請求項１２】 お互いに相補的な部分が３カ所以上の
数から構成されることを特徴とする一対のプローブ。 - 【請求項１３】 前記一対のプローブがＤＮＡプローブ
同士、ＤＮＡプローブとＲＮＡプローブ又はＲＮＡプロ
ーブ同士、ＰＮＡプローブ同士、ＰＮＡプローブとＤＮ
Ａプローブ又はＰＮＡプローブとＲＮＡプローブ同士で
あることを特徴とする請求項１２記載のプローブ。 - 【請求項１４】 請求項１２又は１３記載の一対のプロ
ーブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイ
ブリダイゼーションさせることによって形成された２本
鎖の高分子。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| JP06347699A JP3267576B2 (ja) | 1998-11-09 | 1999-03-10 | プローブ高分子の形成方法 |
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| AT99121773T ATE304059T1 (de) | 1998-11-09 | 1999-11-03 | Methode zur genvervielfältigung |
| DE69927113T DE69927113T2 (de) | 1998-11-09 | 1999-11-03 | Methode zur Genvervielfältigung |
| EP99121773A EP1002877B1 (en) | 1998-11-09 | 1999-11-03 | Gene amplifying method |
| ES99121773T ES2248953T3 (es) | 1998-11-09 | 1999-11-03 | Procedimiento de amplificacion genetica. |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31805698 | 1998-11-09 | ||
| JP10-318056 | 1998-11-09 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=26404605
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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