ES2248953T3

ES2248953T3 - Procedimiento de amplificacion genetica.

Info

Publication number: ES2248953T3
Application number: ES99121773T
Authority: ES
Inventors: Mitsugu Usui
Original assignee: Sanko Junyaku Co Ltd
Current assignee: Sanko Junyaku Co Ltd
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1999-11-03
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2019-11-03
Also published as: DE69927113T2; US6261846B1; JP2000201687A; EP1002877B1; DE69927113D1; EP1002877A2; EP1002877A3; US20010019835A1; JP3267576B2; ATE304059T1

Abstract

Un procedimiento para formar un polímero de ácido nucleico que comprende (a) proveer una pluralidad de pares de sondas de ácido nucleico, cada sonda con una longitud desde 10 hasta 1000 bases, con una primera de dichas sondas que comprende 3 o más regiones de ácido nucleico, dicha primera sonda comprendiendo al menos una región de ácido nucleico X, una región de ácido nucleico Y y una región de ácido nucleico.

Description

Procedimiento de amplificación genética.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a sondas especiales y nuevas, un procedimiento para amplificar genes usando enlaces cruzados (alternados) de las sondas especiales, y un procedimiento para detectar directamente un gen blanco y un procedimiento para detectar un antígeno/anticuerpo usando el procedimiento para amplificar genes.

En los últimos años se han desarrollado: un procedimiento para amplificar genes mediante el uso de una polimerasa de ADN, representado por un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (de aquí en adelante denominado "procedimiento PCR"), un procedimiento para amplificar un gen mediante la hibridación del polímero de ADN habiéndose previamente ramificado ADN de una sola hebra, de aquí en más denominado "procedimiento de sonda de ADN ramificado", y otros para detectar una cantidad muy pequeña de gen blanco.

La amplificación de un gen mediante el procedimiento PCR involucra el emparejamiento (hibridación) de un cebador complementario con un gen blanco (o un cebador) y mediante la amplificación del gen a través del aumento y descenso de temperatura usando una polimerasa termoestable de ADN. La desventaja es que este procedimiento requiere mucho tiempo desde la amplificación hasta la detección del gen y es costoso. Además, la eficiencia y especificidad de la amplificación puede variar dependiendo del diseño del cebador complementario del gen blanco.

La amplificación del gen mediante el procedimiento de sonda de ADN ramificado, por otra parte, involucra la síntesis previa de una sonda de ADN de una hebra y la hibridación de la sonda de ADN de una hebra con un gen blanco para detectar el gen blanco.

Sin embargo, la hibridación de la sonda del polímero de ADN de una hebra ramificado con el gen blanco lleva largo tiempo porque la sonda de ADN ramificado es un polímero. Además, el polímero de ADN de una hebra ramificado es limitado en cuanto a tamaño, de modo que la detección del gen blanco está limitada también.

Objeto y resumen de la invención

La presente invención se hizo en vista de los problemas de la técnica anterior mencionados previamente, y su objetivo es proveer un procedimiento para amplificar eficientemente un gen sin usar enzima o ADN ramificado.

Para solucionar el problema mencionado anteriormente, un procedimiento para amplificar genes de acuerdo con la presente invención comprende las etapas de proveer una pluralidad de pares de sondas cada una de ellas compuesta de tres o más porciones complementarias a aquellas porciones de la otra sonda; e hibridando dichos pares de sondas de tal modo que ellas se crucen alternativamente para formar un polímero de doble hebra.

El par de sondas para ser usadas en el procedimiento de amplificación de genes pueden ser dos sondas de ADN, una sonda de ADN y una sonda de ARN, dos sondas de ARN, dos sondas de ANP (Ácido Nucleico Poliamida o Ácido Nucleico Peptídico), una sonda de ANP y una sonda de ADN, o una sonda de ANP y una sonda de ARN.

El par de sondas se estructura de tal modo que las porciones complementarias de tres o más lugares sean hibridados cada uno de ellos de una manera específica sin lugar a error durante la hibridación uno a uno.

Un procedimiento para detectar el gen blanco de acuerdo con la presente invención, en un primer aspecto, comprende las etapas de proveer un par de sondas, una de las cuales tiene un gen en una porción de la misma complementaria con un gen blanco, hibridando una pluralidad de dichos pares de sondas con el gen blanco mediante el procedimiento de amplificar genes descrito anteriormente para formar un polímero de doble hélice y amplificando las sondas para detectar el gen blanco.

El procedimiento para detectar un antígeno/anticuerpo de acuerdo con la presente invención, comprende, en un primer aspecto, las etapas de proveer un par de sondas una de las cuales tiene un gen en una porción de la misma complementario a un gen blanco unida a un antígeno/anticuerpo, hibridando una pluralidad de dichos pares de sondas con el gen blanco mediante el procedimiento de amplificación de genes descrito anteriormente para formar un polímero de doble hebra y detectar el antígeno/anticuerpo.

El procedimiento para detectar el gen blanco de acuerdo con la presente invención comprende, en un segundo aspecto las etapas de proveer un par de sondas y otra sonda complementaria a un gen en una porción de una de dichos pares de sondas y al gen blanco, previamente hibridando dicha otra sonda al gen blanco, hibridando dichos pares de sondas con el gen blanco mediante el procedimiento de amplificación de genes descrito anteriormente para formar un polímero de doble hebra y amplificar las sondas para detectar el gen blanco.

El procedimiento para detectar antígeno/anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende, en un segundo aspecto las etapas de proveer un par de sondas y otra sonda complementaria a un gen en una porción de una de dichos pares de sondas y a un gen blanco unido a un antígeno/anticuerpo, previamente hibridando dicha otra sonda con el gen blanco, e hibridando dichos pares de sondas con el gen blanco mediante el procedimiento de amplificación de genes descrito anteriormente para formar un polímero de doble hebra y detectar el antígeno/anticuerpo.

En el procedimiento para detectar el gen blanco, un colorante tal como bromuro de etidio, Oligreen, SYBR Green o similares puede unirse a las sondas amplificadas por el procedimiento de amplificación de genes para detectar un polímero amplificado mediante fluorescencia.

En el procedimiento para detectar antígeno/anticuerpo de acuerdo con la presente invención, un colorante tal como bromuro de etidio, Oligreen, SYBR Green o similares puede unirse a las sondas amplificadas mediante el procedimiento de amplificación de genes para detectar el gen blanco unido al antígeno/anticuerpo o similar mediante fluorescencia.

En el procedimiento para detectar el gen blanco de acuerdo con la presente invención, puede agregarse previamente a las sondas que se quieren amplificar mediante el procedimiento de amplificación de genes para detectar el gen blanco, como material marcador para detección, un colorante que confiera fluorescencia y un colorante que acepte fluorescencia utilizando FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente) como por ejemplo un radioisótopo tal como ^{125}I, ^{32}P o similares, materiales colorantes y emisores de luz tales como digoxigenina, éster de acridina o similar, fosfatasa alcalina para utilizar materiales emisores de luz tales como dioxetano o similares y materiales fluorescentes tales como 4-metil umbelliferil fosfato o similar, y biotina para utilizar materiales fluorescentes, emisores de luz o colorantes o similares unidos a avidina.

En el procedimiento para detectar antígeno/anticuerpo de acuerdo con la presente invención, puede agregarse con anterioridad a un par de sondas que se quieren amplificar mediante el procedimiento para detectar el antígeno/anticuerpo, como material marcador para detección, un colorante que confiera fluorescencia y un colorante que acepte fluorescencia utilizando FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente) como por ejemplo un radioisótopo tal como ^{125}I, ^{32}P o similares, materiales colorantes y emisores de luz tales como digoxigenina, éster de acridina o similar, fosfatasa alcalina para utilizar materiales emisores de luz tales como dioxetano o similares y materiales fluorescentes tales como 4-metil umbelliferil fosfato o similar, y biotina para utilizar materiales fluorescentes, emisores de luz o colorantes o similares unidos a avidina.

Cada una de las mencionadas sondas, de acuerdo con la presente invención se compone de tres o más porciones complementarias a tales porciones de la otra sonda.

El par de sondas pueden ser: dos sondas de ADN, una sonda de ADN y otra sonda de ARN, dos sondas de ARN, dos sondas de ANP, una sonda de ANP y otra sonda de ADN o una sonda de APN y una sonda de ARN.

Un polímero de doble hélice de acuerdo con la presente invención se forma mediante el uso de una pluralidad de los pares de sondas, e hibridándolas de tal modo que éstas se crucen alternativamente.

La sonda de ADN se compone de fragmentos de una hebra que comprenden principalmente ácido fosfórico, azúcar y bases (adenina, timina, guanina y citosina), mientras que la sonda de ARN está compuesta por fragmentos de una hebra que comprenden principalmente de bases que son adenina, uracilo, guanina y citosina. EL ANP tiene una estructura en la que el esqueleto de "ácido fosfórico y azúcar" del ADN es reemplazado por un "derivado N-(2-aminoetil)glicina" y tiene los mismos componentes de bases como ADN y ARN.

La longitud de las sondas para ser usadas en los procedimientos mencionados anteriormente va desde 10 bases hasta 1.000 bases, de mayor preferencia desde 10 bases hasta 100 bases.

Los pares de sondas no están particularmente limitados en los tipos de bases en las porciones mutuamente complementarias. Además, las longitudes de las porciones complementarias existentes en una sonda pueden ser iguales o diferentes.

El número de sondas hibridadas para formar un polímero de doble hebra para ser usadas en los procedimientos anteriormente mencionados está en un intervalo desde 10^{2} hasta 10^{15}.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN;

La Fig. 2 es un diagrama esquemático de un ejemplo que muestra cómo están unidas un par de sondas de ADN;

La Fig. 3 es un diagrama esquemático que muestra la formación de un polímero que resulta de la hibridación de un par de sondas de ADN alternativamente;

La Fig. 4 es un diagrama esquemático que ilustra un ejemplo de una estructura conceptual tridimensional del polímero mostrado en la Fig. 3;

La Fig. 5 es un diagrama esquemático que ilustra las sondas de ADN que están hibridadas en un patrón diferente a aquellas de la Fig. 3;

La Fig.6 ilustra un ejemplo de una estructura conceptual tridimensional del diagrama esquemático de la Fig. 5;

La Fig. 7 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN en las que están insertadas las porciones clivadas mediante una enzima de restricción;

La Fig. 8 es un diagrama esquemático que ilustra un ejemplo en el cual las sondas son unidas de forma tridimensional y alternadas para formar un polímero que es posteriormente clivado usando una enzima de restricción;

La Fig. 9 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN que están ambas compuestas de porciones complementarias que tienen diferentes longitudes una de la otra;

La Fig. 10 es un diagrama esquemático que ilustra la formación de un polímero que resulta de la hibridación alternada del par de sondas de ADN, mostradas en la Fig. 9.

La Fig. 11 es un diagrama esquemático que muestra un procedimiento para detectar directamente un gen blanco usando un par de sondas de ADN de acuerdo con la presente invención, en el que una sonda que tiene regiones complementarias a un gen blanco y el par de sondas de ADN de acuerdo con la presente invención (amplificando genes en la figura) se hibrida con el gen blanco y, posteriormente se agregan el par de sondas de ADN de acuerdo con la presente invención (amplificando el gen 1 y amplificando el gen 2 en la figura) para formar un polímero de doble hebra mientras se hibridan al gen blanco, de modo que el gen blanco puede ser rápidamente detectado.

La Fig. 12 es un diagrama esquemático que muestra un procedimiento para detectar un gen blanco que usa un par de sondas de ADN, una de las cuales es una sonda de ADN (amplificando el gen 1 en la figura) estructurada de tal manera que un gen en una porción de la misma es complementario al gen blanco, y la otra es una sonda de ADN (amplificando el gen 2 en la figura) que conforma un par con la primera sonda de ADN, hibrida una pluralidad de los pares de sondas con la sonda blanco para formar un polímero de doble hebra, y detecta el gen blanco;

La Fig. 13 es un diagrama de flujo que ilustra un primer aspecto de un procedimiento para detectar antígeno/anticuerpo de acuerdo con la presente invención;

La Fig. 14 es una fotografía que muestra los resultados del Ejemplo 1;

La Fig. 15 es una fotografía que muestra los resultados del Ejemplo 2; y

La Fig. 16 es una fotografía que muestra los resultados del Ejemplo 3.

Descripción detallada de las formas de realización de preferencia

Varias formas de realización de la presente invención serán descritas de aquí en adelante con referencia a los dibujos que las acompañan.

Sin embargo, no es necesario decir que estas formas de realización son meramente ilustrativas, y se puede realizar una gran variedad de modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención.

La Fig. 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de un par de sondas de ADN. Con referencia a la Fig. 1 específicamente, una sonda de ADN Nº 1 tiene una región X, una región Y y una región Z, mientras que una sonda de ADN Nº 2 tiene una región X', una región Y' y una región Z'.

La sonda de ADN Nº 1 y la sonda de ADN Nº 2 están estructuradas de manera tal que, cuando son hibridadas, la región X está unida solamente con la región X'; la región Y está unida solamente con la región Y'; y la región Z está unida solamente con la región Z' (ver Fig. 2).

Dicho de otra manera, con un par de sondas de ADN cada una de ellas compuesta de tres o más porciones complementarias a las porciones de la otra sonda de ADN, de acuerdo con la presente invención, cuando éstas están hibridadas de manera que se crucen alternativamente, la región X está unida solamente con la región X'; la región Y está unida solamente con la región Y'; y la región Z está unida solamente con la región Z', como se muestra en la Fig. 2, de modo que el par de sondas están hibridados alternativamente en tres patrones de unión.

Así, mediante el uso de las sondas estructuradas como se menciona anteriormente, las dos sondas están unidas alternativamente. Específicamente, la sonda de ADN Nº 1 y la sonda de ADN Nº 2 están unidas de forma tridimensional alternativamente para producir un polímero, como se ilustro en la Fig. 3.

Consecuentemente, una pluralidad de pares de sondas, que han sido hibridadas alternativamente en los tres patrones de unión mostrados en la Fig. 2 pueden formar un polímero de doble hebra, un ejemplo del cual es ilustrado esquemáticamente en la Fig. 3.

La Fig. 4 ilustra un ejemplo de una estructura conceptual tridimensional del polímero de doble hebra de la Fig. 3. La Fig. 5 es un diagrama esquemático que ilustra una pluralidad de pares de sondas de ADN que han sido hibridadas en diferentes patrones de unión. La Fig. 6 ilustra un ejemplo de una estructura conceptual tridimensional del diagrama esquemático de la Fig. 5.

El mismo principio de hibridación para las dos sondas de ADN ilustradas en la Fig. 3 se aplica a la hibridación de una sonda de ADN y una sonda de ARN, dos sondas de ARN, dos sondas de ANP, una sonda de ANP y una sonda de ADN o una sonda de ANP y una sonda de ARN.

Ilustrando la estructura de la presente invención mediante el uso de un ejemplo más específico, la hibridación de dos sondas de ADN puede realizarse de tal modo que cuando una sonda Nº 3 y una sonda Nº 4 son hibridadas, se forman los sitios clivados por una enzima de restricción (las porciones subrayadas son clivadas por una enzima llamada "Hae III"), como se muestra en la Fig. 7.

En otras palabras, luego que las sondas se han unido de forma tridimensional alternativamente para formar un polímero, se puede usar una enzima de restricción para evitar que el polímero tenga contaminación cruzada en una subsiguiente operación experimental diferente (ver Fig. 8).

Para ilustrar la estructura de la presente invención usando un ejemplo más específico, la hibridación de dos sondas de ADN no requiere que la longitud de las porciones complementarias de una sonda sean uniformes, como se muestra en la Fig. 9. Específicamente, cuando una sonda Nº 5 y una sonda Nº 6 se hibridan, una región X y una región X' hibridan con 24 bases; una región Y y una región Y' hibridan con 22 bases, y una región Z y una región Z' hibridan con 20 bases (ver fig.10)

A continuación, el procedimiento para detectar genes blanco de acuerdo con la presente invención se describirá usando ejemplos más específicos. En un primer aspecto, como se ilustra en la Fig. 11, de un par de sondas, una sonda se estructura de tal manera que una porción de gen en la sonda es complementario a un gen blanco. Luego que la primera sonda está hibridada con el gen blanco, una cantidad de los pares de sondas son hibridados mediante el procedimiento de amplificación de genes de acuerdo con la presente invención para formar un polímero de doble hebra que es detectado mediante la amplificación de las sondas.

En un segundo aspecto, como se ilustra en la Fig. 12, aparte de un par de sondas, se utiliza una sonda complementaria a un gen en una porción de una de las sondas y una sonda blanco y es hibridada previamente con el gen blanco. Posteriormente, una cantidad de los pares de sondas son hibridados mediante el procedimiento de amplificación de genes mencionado anteriormente para formar un polímero de doble hebra que es detectado mediante la amplificación de las sondas.

Luego, se describirá un primer aspecto del procedimiento de detección de antígeno/anticuerpo usando un ejemplo más específico con referencia a la Fig. 13. Como se ilustró, de un par de sondas, una sonda se estructura de tal modo que un gen en una porción del mismo sea complementario a un gen blanco unido al antígeno/anticuerpo. Luego, una cantidad de los pares de las sondas se hibridan mediante el procedimiento de amplificación de genes de acuerdo con la presente invención para formar un polímero de doble hebra para detectar el antígeno y el anti-
cuerpo.

A continuación, la presente invención será descrita en conjunción con varios ejemplos. Sin embargo, no es necesario aclarar que la presente invención no se limita a estos ejemplos.

1. Las sondas de ADN usadas en el Ejemplo 1 y Ejemplo 2:

(1) Sonda de Amplificación Genética 1

5-TgA CTT ACT TAA CCg gAA ACA T-AAg CAg gAT CCT CTA AgC CTg A-CgA AgT ATT TAA Cgg Tgg TAT g-3

(2) Sonda de Amplificación Genética 2

3-gCT TCA TAA ATT gCC ACC ATA C\cdotTTC gTC CTA ggA gAT TCg gAC T\cdotACT gAA TgA ATT ggC CTT Tgt A-5

(3) Sonda de Amplificación Genética 3

5'-TgC CgA CCg gCg AgC g-TAg CAT ggC CCT CTA g\cdotCTT ATC ggC CTC gAg A-3'

(4) Sonda de Amplificación Genética 4

3'-gAA TAg CCg gAg CTC T-ATC gTA CCg ggA gAT C-ACg gCT ggC CgC TCg C-5'

\vskip1.000000\baselineskip

2. ARN-VHC sintético y una variedad de sondas de ADN usadas en el Ejemplo 3 y Ejemplo 4:

(1) ARN-VHC que sintetiza una región 5' no codificante del virus de la hepatitis C (de aquí en más abreviado como "ARN-VHC sintetizado").

(2) Sonda de captura de ARN-VHC A

5'(ácido fosfórico)-TAg AgC gTg CAg ATA gTC gAT CCT CAC Agg ggA gTg ATT CAT ggT-3'

Esta es una combinación de una secuencia de bases sin significado y una secuencia de bases complementaria al ARN-VHC.

(3) Sonda de captura de ARN-VHC B

5'(marcador biotina)-TAg AgC gTg CAg ATA gTC gAT CCT CAC Agg ggA gTg ATT CAT ggT-3'

(4) Sonda C

3'-TAC TTA gTg Agg ggA CAC TCC gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5'

Esta es una combinación de una secuencia de bases complementaria al ARN-VHC y una secuencia de bases complementaria a la sonda de amplificación 5.

(5) Sonda D

3'-gCC CAg gAA AgA ACC TAg TTg gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5'

(6) Sonda E

3'-CAT CAC AAC CCA gCg CTT TCC gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5'

(7) Sonda de Amplificación Genética 5

5'-CTT ATT CAg TAT CgA gTA TAg CAg gAT CCC TCT AAg TgC Cgg ACC AgC gAg Cgg-3'

Esta es una secuencia de bases complementaria a las sondas de captura B, C, D.

(8) Sonda de Amplificación Genética 6

3'-ACg gCC Tgg TCg CTC gCC ATC gTC CTA ggg AgA TTC gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5'

(9) Sonda de Amplificación Genética 7

3'(biotinizada)-ACg gCC Tgg TCg CTC gCC ATC gTc CTA ggg AgA TTC gAA TAA gTC ATA gCT CAT-5'

Ejemplo 1 1. Objetivo

El efecto de la amplificación genética con respecto a la temperatura de hibridación se comprobó usando sondas de amplificación genética que son un par de sondas de ADN de acuerdo con la presente invención.

2. Materiales

1) Se usaron para amplificación genética la sonda 1 para amplificación genética y la sonda 2 para amplificación genética.

2) Se usó como solución tamponadora 20xSSC (NaCl 333 mM, C_{6}H_{5}O_{7}\cdot2H_{2}O 333 mM, pH 7,0).

3. Procedimiento

Se agregaron a un microtubo esterilizado de 0,2 ml 5 \mul de la sonda de amplificación 1 y de la sonda de amplificación genética 2, cada una preparada para tener 10^{13} copias/\mul, respectivamente. Posteriormente se agregaron 40 \mul de 20xSSC y el microtubo se cubrió con una tapa. Posteriormente, el microtubo se hirvió a 94ºC durante 30 segundos, y se calentó a 50ºC, 52ºC, 54ºC, 56ºC, 58ºC 60ºC, 62ºC, 64ºC, 66ºC, 68ºC y 70ºC durante 30 minutos, respectivamente.

Tras el calentamiento, se llevó a cabo la electroforesis usando gel de agarosa 0,5% para confirmar el efecto de la amplificación genética por medio de coloración con bromuro de etidio.

4. Resultados

La Fig. 14 es una fotografía que muestra los resultados del Ejemplo 1 con electroforesis a 100 voltios durante 30 minutos usando gel de agarosa 0,5%.

El gel de agarosa es un gel que puede separar moléculas de ADN de acuerdo con el tamaño, el gel de agarosa 0,5% se usa generalmente para separar moléculas de ADN de 30.000 - 40.000 pares de bases.

La fotografía de la Fig. 14 muestra un polímero que ha crecido tanto con los incrementos de temperatura que ya no puede migrar en un gel de agarosa 0,5% como resultado de un polímero de doble hebra exactamente alternado formado por el par de sondas de ADN dependiendo de la temperatura de hibridación.

Ejemplo 2 1. Objetivo

Se ha comprobado que un polímero amplificado por sondas para amplificación genética, que son un par de sondas de ADN de acuerdo con la presente invención, puede ser clivado por una enzima de restricción.

2. Materiales

1) Se usaron para la amplificación genética la sonda de amplificación genética 3 y la sonda de amplificación genética 4.

2) Se usó como enzima de restricción Hae III (fabricada por Takara Shuzo (elaborador) Co., Ltd).

3) Se usó como solución tamponadora para la enzima de restricción M-Buffer (fabricado por Takara Shuzo (elaborador) Co., Ltd).

4) Se usó una solución tamponadora 20xSSC NaCl 333 mM, C_{6}H_{5}O_{7}\cdot2H_{2}O 333 mM, pH 7,0).

3. Procedimiento

Se agregaron 5 \mul de sonda de amplificación genética 3 y sonda de amplificación genética 4, cada una de ellas preparadas para tener 10^{13} copias/\mul, en un microtubo esterilizado de 0,2 ml, respectivamente. Posteriormente se agregaron 5 \mul de 20xSSC y 35 \mul de agua destilada esterilizada para dar una solución de reacción A y se cubrió el microtubo con una tapa. De manera similar a la solución de reacción A, se agregaron 2,5 \mul de sonda de amplificación genética 3 y sonda de amplificación genética 4, cada una preparada para tener 10^{13} copias/\mul en un microtubo esterilizado de
0,2 ml, respectivamente. Posteriormente se agregaron 5 \mul de 20xSSC y 40 \mul de agua destilada esterilizada para dar una solución de reacción B y el microtubo se cubrió con una tapa. Las soluciones de reacción A, B se hirvieron a 94ºC durante 30 segundos, se calentaron luego a 62ºC durante 30 minutos respectivamente.

Tras el calentamiento, se agregaron 5 \mul de M-Buffer y 5 \mul de Hae III a cada una de las soluciones de reacción A y B para reaccionar a 37ºC durante 24 horas, se llevó a cabo la electroforesis usando gel de agarosa 2% para confirmar la amplificación del polímero clivado por la enzima de restricción por medio de coloración con bromuro de etidio.

4. Resultados

La Fig. 15 es una fotografía que muestra los resultados del Ejemplo 2 con electroforesis a 100 voltios durante 30 minutos usando gel de agarosa 2%. La fotografía muestra que un par de sondas de ADN que forman un polímero de doble hélice exactamente alternado es clivado hasta unidades mínimas por la enzima de restricción.

Ejemplo 3 1. Materiales

1) Se usaron para la amplificación genética la sonda de amplificación genética 5 y la sonda de amplificación genética 6.

2) Bolillas magnéticas con estreptavidina (nombre del producto: Streptavidin MagneSphere fabricado por Promega) unida se usaron como fase sólida para separación B/F.

3) Se usaron como soluciones tamponadoras 20xSSC y 0,5xSSC (dilución 40 veces de 20xSSC).

2. Procedimiento

Se agregó a cada microtubo esterilizado de 0,2 ml 10 \mul de cada ARN-VHC sintético preparado para tener 10^{1} copias/10 \mul, 10^{2} copias/10 \mul, 10^{3} copias/10 \mul, 10^{4} copias/10 \mul, 10^{5} copias/10 \mul, 10^{6} copias/10 \mul, 10^{7} copias/10 \mul, 10^{8} copias/10 \mul, 10^{9} copias/10 \mul y 10^{10} copias/10 \mul. Posteriormente, se agregaron 1 \mul de cada una de las sondas de captura de ARN-VHC B, sonda C, sonda D y sonda E preparadas para tener 10^{13}copias/\mul, 10 \mul de sonda de amplificación genética 5 preparada para tener 10^{13} copias/\mul y 25 \mul de 20xSSC. Los microtubos respectivos se cubrieron con una tapa, los ingredientes se mezclaron con un mezclador y se los calentó a 62ºC durante 60 minutos.

Una vez que la temperatura bajó hasta temperatura ambiente, se agregaron 5 \mul de la sonda de amplificación genética 6 preparada para ser 1013 copias/\mul a cada microtubo. Luego, cada microtubo se cubrió con una tapa, los ingredientes se mezclaron con un mezclador y se calentaron a 62ºC durante 60 minutos.

Una vez que la temperatura bajó hasta la temperatura ambiente, se agregó a cada microtubo, 10 \mul de Streptavidin Magnesphere (de aquí en más llamadas "bolillas magnéticas") para que reaccionen a 37ºC durante 30 minutos. Tras la reacción, las bolillas magnéticas se atraparon usando un imán y se eliminó el sobrenadante. Posteriormente, se agregaron 50 \mul de 0,5xSSC y 10 \mul de bromuro de etidio (fabricado por Wako Junyaku Co., Ltd.) preparado para ser 100 \mug/ml para que reaccionen a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Tras la reacción, las bolillas magnéticas se atraparon usando un imán y se eliminó el sobrenadante.

Posteriormente se agregaron 5 ml de 0,5xSSC. De inmediato, las bolillas magnéticas se atraparon usando un imán y se eliminó el sobrenadante. Luego se agregaron 50 \mul de 0,5xSSC y todos los ingredientes se transfirieron a una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se irradiaron rayos ultravioleta desde la parte inferior de la placa de 96 pocillos, y se fotografió un gen amplificado que terminó emitiendo fluorescencia por intercalado de bromuro de etidio

3. Resultados

La Fig. 16 es una fotografía que muestra la fluorescencia por el bromuro de etidio producida por la radiación mediante rayos ultravioletas desde el fondo de la placa de 96 pocillos. Como puede verse en la Fig. 16, la fluorescencia más notable se encontró en 10^{10} copias/10 \mul, la fluorescencia se debilitó gradualmente de acuerdo con la cantidad de ARN-VHC sintético.

Ejemplo 4 1. Materiales

1) Se usaron para la amplificación genética la sonda de amplificación genética 5 y la sonda de amplificación genética 7.

2) Se usó una placa de 96 pocillos (nombre del producto: NucleoLink™ fabricado por Nunc) como fase sólida para la separación B/F.

3) Se usó "HPR-Streptavidin" fabricado por ZYMED Laboratories, Inc. como Estreptavidina Conjugada con Peroxidasa.

4) Se usó como reactivo de tinción un kit de tinción T para peroxidasa fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.

5) Se usó como solución de parada de la reacción enzimática H_{2}SO_{4} 2N.

6) Se usaron como soluciones tamponadoras 20xSSC y 0,5xSSC.

2. Procedimiento

Se agregaron a cada uno de los pocillos de la placa de 96 pocillos (NucleoLink™ fabricada por Nunc) previamente unida con la sonda de captura de ARN-VHC A (no se aplicó bloqueo especial) 10 \mul de cada ARN-VHC sintético preparado para tener 0 copia/10 \mul, 10^{3} copias/10 \mul, 10^{4} copias/10 \mul, 10^{5} copias/10 \mul, 10^{6} copias/10 \mul y 10^{7} copias/10 \mul. Posteriormente se agregaron 10 \mul de cada sonda C, sonda D, sonda E preparadas para tener 10^{11} copias/\mul, 10 \mul de sonda de amplificación genética 5 preparada para tener 10^{11} copias/\mul y 60 \mul de 20xSSC.

Tras mezclar los ingredientes con una pipeta, se los calentó a 94ºC durante 30 minutos y se los llevó a 62ºC durante 60 minutos.

Una vez que la temperatura bajó hasta la temperatura ambiente, se agregaron a cada microtubo 10 \mul de sonda de amplificación genética 5 preparada para tener 10^{11} copias/\mul y 20 \mul de sonda de amplificación genética 7. Se los mezcló con una pipeta, se los calentó a 94ºC durante 30 segundos y se los llevó a 62ºC durante 60 minutos.

Después que la temperatura bajó hasta la temperatura ambiente, se usó 0,5xSSC incluyendo Tween20 0,1% para lavar cuatro veces. Se agregaron en cada pocillo 100 \mul de "HRP-Streptavidin" y se calentó a 37ºC durante 20 minutos. Tras eliminar la solución en cada pocillo mediante succión, se usó 0,5xSSC incluyendo Tween20 0,1% para lavar cuatro veces.

Se agregaron a cada pocillo 100 \mul del kit de tinción para peroxidasa para que reaccionen en cuarto oscuro (a temperatura ambiente) durante 10 minutos. Tras la reacción, se agregaron 100 \mul de la solución de parada de la reacción enzimática y se midió la absorción de luz a una longitud de onda de 450 nm.

3. Resultados

Los resultados del Ejemplo 4 se muestran en la Tabla 1 a continuación. La tinción fue confirmada de acuerdo con la cantidad de ARN-VHC sintético agregado en un intervalo desde 10^{3} hasta 10^{4} copias desde el hecho de que la tinción se observó en Estreptavidina Conjugada con Peroxidasa marcada en una de un par de sondas de ADN que estaban hibridadas alternativamente para formar un polímero de doble hélice.

TABLA 1

Número de Copias	Absorbancia
0	1,497
10^{3}	1,843
10^{4}	1,897
10^{5}	1,955
10^{6}	2,064
10^{7}	2,343

Como se describe anteriormente, el procedimiento de amplificación genética de acuerdo con la presente invención puede amplificar eficientemente un gen sin usar ADN polimerasa o ADN ramificado.

También, el procedimiento para detectar antígeno/anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede detectar eficientemente antígeno/anticuerpo usando el procedimiento de amplificación genética.

Claims

1. Un procedimiento para formar un polímero de ácido nucleico que comprende

(a) proveer una pluralidad de pares de sondas de ácido nucleico, cada sonda con una longitud desde 10 hasta 1000 bases, con una primera de dichas sondas que comprende 3 o más regiones de ácido nucleico, dicha primera sonda comprendiendo al menos una región de ácido nucleico X, una región de ácido nucleico Y y una región de ácido nucleico Z y con la siguiente estructura

1

una segunda sonda de dicho par de sondas que comprende 3 o más regiones de ácido nucleico, dicha segunda sonda comprendiendo al menos una región de ácido nucleico Z', una región de ácido nucleico Y' y una región de ácido nucleico X' y con la siguiente estructura

2

(b) unir dicha pluralidad de pares de sondas una a la otra para formar un polímero, en el que dicha región de ácido nucleico X es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico X', dicha región de ácido nucleico Y es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico Y' y dicha región de ácido nucleico Z es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico Z' de manera que dicha pluralidad de pares de sondas formen las siguientes estructuras

3

cuyas estructuras están unidas una a la otra de forma alternada para formar dicho polímero.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho par de sondas comprende dos sondas de ADN, una sonda de ADN y una sonda de ARN, dos sondas de ARN, dos sondas de ANP, una sonda de ANP y una sonda de ADN o una sonda de ANP y una sonda de ARN.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha región de ácido nucleico X es totalmente complementaria con dicha región de ácido nucleico X', dicha región de ácido nucleico Y es totalmente complementaria con dicha región de ácido nucleico Y' y dicha región de ácido nucleico Z es totalmente complementaria con dicha región de ácido nucleico Z'.

4. Un procedimiento para detectar un gen blanco que comprende

4

5

en la que una secuencia de una sonda de dicho par de sondas es complementaria a una secuencia de dicho gen blanco;

(b) unir dicho gen blanco y dicha pluralidad de pares de sondas uno al otro de manera que dicha pluralidad de pares de sondas formen un polímero, en el que dicha región de ácido nucleico X es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico X', dicha región de ácido nucleico Y es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico Y' y dicha región de ácido nucleico Z es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico Z' de manera que dicha pluralidad de pares de sondas formen las siguientes estructuras

6

cuyas estructuras están unidas una a la otra de forma alternada para formar dicho polímero; y

(c) detectar dicho polímero, y de esta manera detectar dicho gen blanco.

5. Un procedimiento para detectar un gen blanco que comprende

(a) proveer (1) una pluralidad de pares de sondas de ácido nucleico, cada sonda con una longitud desde 10 hasta 1000 bases, con una primera de dichas sondas que comprende 3 o más regiones de ácido nucleico, dicha primera sonda comprendiendo al menos una región de ácido nucleico X, una región de ácido nucleico Y y una región de ácido nucleico Z y con la siguiente estructura

7

8

(2) otra sonda que contiene una primera secuencia que es complementaria a una secuencia de dicho gen blanco y que contiene una segunda secuencia que es complementaria a una secuencia de una sonda de dicho par de sondas;

(b) unir dicho gen blanco, dicha otra sonda y dicha pluralidad de pares de sondas uno al otro de manera que dicha pluralidad de pares de sondas formen un polímero, en el que dicha región de ácido nucleico X es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico X', dicha región de ácido nucleico Y es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico Y' y dicha región de ácido nucleico Z es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico Z' de manera que dicha pluralidad de sondas formen las siguiente estructuras

9

(c) detectar dicho polímero, y de esta manera detectar dicho gen blanco.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho gen blanco está unido a un complejo antígeno/anticuerpo, y de esta manera detectar dicho complejo antígeno/anticuerpo.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho gen blanco está unido a un complejo antígeno/anticuerpo, y de esta manera detectar dicho complejo antígeno/anticuerpo.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que dicho par de sondas comprende dos sondas de ADN, una sonda de ADN y una sonda de ARN, dos sondas de ARN, dos sondas de ANP, una sonda de ANP y una sonda de ADN o una sonda de ANP y una sonda de ARN.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que dicha región de ácido nucleico X es totalmente complementaria con dicha región de ácido nucleico X', dicha región de ácido nucleico Y es totalmente complementaria con dicha región de ácido nucleico Y' y dicha región de ácido nucleico Z es totalmente complementaria con dicha región de ácido nucleico Z'.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que dicha etapa de detección (c) comprende incorporar un material fluorescente en dicho polímero, a partir de entonces detectar dicho material fluorescente.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que al menos una sonda de la pluralidad de pares de sondas incluye un material marcador y en el que dicha etapa de detección (c) comprende detectar dicho material marcador.

12. Un par de sondas de ácido nucleico, cada sonda con una longitud desde 10 hasta 1000 bases, con una primera de dichas sondas que comprende 3 o más regiones de ácido nucleico, dicha primera sonda comprendiendo al menos una región de ácido nucleico X, una región de ácido nucleico Y y una región de ácido nucleico Z y con la siguiente estructura

10

11

en la que dicha región de ácido nucleico X es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico X', dicha región de ácido nucleico Y es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico Y' y dicha región de ácido nucleico Z es capaz de hibridar con dicha región de ácido nucleico Z' de manera que dicho par de sondas formen una de las siguientes estructuras

12

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13. El par de sondas de la reivindicación 12, en el que dicho par de sondas comprende dos sondas de ADN, una sonda de ADN y una sonda de ARN, dos sondas de ARN, dos sondas de ANP, una sonda de ANP y una sonda de ADN o una sonda de ANP y una sonda de ARN.

14. Un polímero, comprendido por una pluralidad de pares de sondas de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha pluralidad de pares de sondas forman las siguientes estructuras

13

15. El polímero de la reivindicación 14, en el que dicho par de sondas comprende dos sondas de ADN, una sonda de ADN y una sonda de ARN, dos sondas de ARN, dos sondas de ANP, una sonda de ANP y una sonda de ADN o una sonda de ANP y una sonda de ARN.