JP2000214169A - 改良されたクレアチニン検出検査 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】尿検査の感度を高めかつ、より正確にする方法
を提供する。 【解決手段】試料を、第二銅イオン、ヒドロペルオキシ
ド、シトレート及びクレアチニンの存在で呈色応答を示
す酸化性染料と接触させる工程を含む、流体試料中のク
レアチニンを検出する方法で、 （式中、２，３，４及び５は、 からなる群より選択され、Ｍは、Ｈ又は第Ｉ族もしくは
第ＩＩ族金属であり、ｌは、上記のいずれかであるか又
は−Ｏ−でありそしてｍとｎは、独立して０又は１であ
る）で示されるイオン化性リン酸含有化合物の安定化量
を流体試料に導入する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術】ペルオキシダーゼは、種々の化合物、た
とえばフェノール類及びアミン類の過酸化物による酸化
を触媒する酵素である。加えて、特定の化合物が、ヒド
ロペルオキシドから酸素を遊離させ、その酸素を特定の
受容体化合物に移すことによってペルオキシダーゼ酵素
に類似した挙動を示すため、擬ペルオキシダーゼ（pseu
doperoxidase）と呼ばれている。したがって、擬ペルオ
キシダーゼは、過酸化物と酸化性化合物との反応を触媒
する、又は他の方法でそれに関与するような酵素であ
る。ヘモグロビン及びその誘導体を含む擬ペルオキシダ
ーゼは、過酸化的活性物質とみなされている。たとえ
ば、グルコースに関する尿検査では、酵素グルコースオ
キシダーゼが、酸素の存在で、まず尿中のグルコースを
グルコン酸及び過酸化水素に転換し、次いで、検査系に
含まれる過酸化酵素が過酸化水素（ヒドロペルオキシ
ド）と酸化性染料、たとえばＯ−トリジン又はテトラメ
チルベンジジンとの相互作用を触媒して、還元状態では
無色である染料を呈色させ、そのように、検出可能な応
答を与える。染料の酸化を触媒するのに十分なペルオキ
シダーゼが存在するならば、呈色応答の程度及び強さ
は、グルコース転換によって生成される過酸化水素の量
に正比例する。

【０００２】同様に、過酸化的活性物質、たとえばヘモ
グロビン又はその誘導体は、ヒドロペルオキシドと酸化
性染料との相互作用を触媒することができる。そのよう
な相互作用では、過酸化的活性物質はペルオキシダーゼ
に似て、ヒドロペルオキシドと酸化性染料との相互作用
を触媒する。得られる相互作用は、応答の強さが過酸化
的活性物質の濃度を示す、検出可能な応答、たとえば色
遷移を起こさせる。

【０００３】クレアチニンは、クレアチンがクレアチン
リン酸になり、筋収縮のエネルギー源として使用される
ときの代謝産物である。生成されたクレアチニンは、腎
糸球体によってろ過されたのち、再吸収されることなく
尿中に排出される。体液中のクレアチニンの測定は、筋
疾患又は種々の腎疾患、たとえば腎炎及び腎不全の診断
に有用である。Jaffe法として知られるクレアチニン測
定のための最初の実用的な試験は、アルカリ性溶液中の
ピクリン酸とクレアチニンとの結合によって赤黄色を帯
びた褐色のクレアチニンピクレートを形成することを含
む。より最近のクレアチニン測定方法が、Benedict及び
BehreによってJ. Biol. Chem., 113: 515 (1936)で報告
されており、この方法は、アルカリ性媒体中の３，５−
ジニトロ安息香酸とクレアチニンとの反応を含む。これ
らの反応はいずれも、系が正しく作用するようクレアチ
ニンを脱プロトン化するため、高いpH、すなわち１２〜
１３のオーダのpHを要する。通常、強塩基性物質、たと
えばアルカリ及びアルカリ土類金属の水酸化物を使用し
て、これらの試薬系中に適切に高いpHを維持する。その
ような高pH値での操作は、特に吸収性支持体、たとえば
ろ紙又は多孔質膜を試薬系の支持体として使用する場合
に種々の難題を提起する。これは、アルカリの導入によ
って、支持体は脆化傾向を示し、支持体マトリックス中
に均一なアルカリの分散を得ることが困難になる場合が
ある。さらには、試薬を溶液の形態で支持体に塗布した
のち、溶剤を蒸発させて乾燥残渣を残す場合、乾燥した
アルカリは、クレアチニン濃度に関して試験する流体、
たとえば尿試料と接触したときには、容易には可溶化し
ない。

【０００４】米国特許第５，３７４，５６１号明細書に
は、クレアチニンを含有する疑いのある媒体を、ヒドロ
ペルオキシドと、酸素フリーラジカルの存在下で呈色応
答を示す酸化還元指示薬の存在で、第二銅イオンと接触
させる工程を含む、水性媒体中のクレアチニンを検出す
る方法が記載されている。また、この特許で開示された
クレアチニン試薬配合物には、クレアチニン以外の尿成
分が第二銅イオンと錯化することを防ぐためのシトレー
トが含まれる。この特許は、また、クレアチニン測定の
ために検出可能な応答をもたらす反応を表すと考えられ
る一連の反応式を提示している。

【０００５】１．Ｈ⁺＋ＣｕII・シトレート＋クレアチ
ニン−^K ₁ →ＣｕII・クレアチニン＋クエン酸 ２．ＣｕII・クレアチニン＋ＴＭＢ−^K ₁ →ＣｕＩ・クレ
アチニン＋ＴＭＢ₁ ⁺・ ３．ＣｕＩ・クレアチニン＋ＲＯＯＨ−^K ₂ →ＲＯ・＋Ｏ
Ｈ^-＋ＣｕII・クレアチニン

【０００６】以上の反応式のうち、反応１は、その静止
状態からのＣｕII・クレアチニン錯体の形成を表す。反
応２は、ＴＭＢからＣｕII・クレアチニン錯体への電子
１個の移動によってＴＭＢ染料が酸化されて非反応性Ｃ
ｕＩ型を生じさせる工程を表す。反応３は、ＣｕＩが過
酸化物に対して電子を失ってＣｕIIを再生する工程であ
る。この検査のための改良された緩衝剤系が、米国特許
第５，７３３，７８７号明細書に開示されている。

【０００７】尿検査の感度を高めかつ、尿の希釈をもた
らす高い尿流動の問題を最小限にするため、尿分析対象
物（たとえばタンパク）の検査では、尿濃度を規格化す
るため分析対象物／クレアチニン比を利用する。尿中に
は臨床的に重要な多くの分析対象物が存在し、クレアチ
ニン比法の使用によってそれらに関する尿分析をより正
確にすることができる。そのような分析対象物（標的分
析対象物と呼ばれることもある）には、デオキシピリジ
ノリン、ヒト血清アルブミン、乱用薬物、たとえばアン
フェタミン、バルビツレート及びコカイン、臨床的に重
要なタンパク質マーカ、たとえば前立腺特異性抗原、腎
疾患タンパク質、たとえばα−１−ミクログロブリン、
乳酸デヒドロゲナーゼ及びＮ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グル
コサミンダーゼ、妊娠もしくは受胎能関連ホルモン、た
とえばヒト絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン及
び黄体化ホルモン、尿路感染のマーカ、たとえばタム−
ホースフォールムコタンパクもしくはリポ多糖類、β−
２−ミクログロブリン、アミラーゼならびにクラミジア
ＬＰＳがある。

【０００８】米国特許第５，１７３，４３１号明細書に
は、流体、たとえば体液中のタンパク質を検出する方法
であって、流体を、擬ペルオキシダーゼとして作用する
銅／タンパク質錯体を形成することができる形態の銅
と、過酸化物と、酸化されると検出可能な応答を示す酸
化還元指示薬とを、フィチン酸であることができるイオ
ン化性リン酸化合物とともに含有する組成物と接触させ
る工程を含む方法が開示されている。クエン酸は銅／タ
ンパク質錯体の形成を制限するため、この方法はクエン
酸の存在を要しない。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料を、第二
銅イオン、ヒドロペルオキシド、シトレート及びクレア
チニンの存在で呈色応答を示す酸化性染料と接触させる
工程を含む、流体試料中のクレアチニンを検出する方法
に対する改良である。改良は、評価用製剤の中に、式
Ｉ：

【００１０】

【化３】

【００１１】（式中、２、３、４及び５は、

【００１２】

【化４】

【００１３】からなる群より選択され、Ｍは、Ｈ又は第
Ｉ族もしくは第II族金属であり、ｌは、上記のいずれか
又は−Ｏ−であり、ｍ及びｎは、独立して０又は１であ
る）で示される安定化量のイオン化性リン酸含有化合物
を含めることを含む。

【００１４】式Ｉを参照すると、Ｍは好ましくは水素で
ある。しかし、Ｍが第Ｉ族金属のイオン、たとえばＬｉ
⁺、Ｎａ⁺もしくはＫ⁺又は第II族金属のイオン、たとえ
ばＣａ⁺⁺もしくはＭｇ⁺⁺である塩を本発明に使用しても
よい。

【００１５】本発明の改良クレアチニン評価は、第二銅
イオン、ヒドロペルオキシド、クエン酸及びクレアチニ
ンの存在で呈色応答を発する酸化性染料を含有する評価
媒体を要する。

【００１６】第二銅イオンの供給源は、そのアニオン
が、評価系中でクレアチニンの比色測定のための反応と
有害に相互作用しない、いかなる可溶性銅塩であっても
よい。適当な塩は、銅の硫酸塩、硝酸塩、酸化物、水酸
化物、リン酸塩、ヨウ化物、塩化物、臭化物、酢酸塩又
はシュウ酸塩を含む。ＣｕII・クレアチニン錯体の形成
を可能にするならば、他の可溶性の第二銅塩を使用する
こともできる。アニオンが銅に強く結合しすぎる塩は、
銅II・クレアチニン錯体を形成させず、したがって、Ｃ
ｕII錯体、たとえば第二銅イオンと、ＥＤＴＡ、ＨＥＤ
ＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡとの間で形成されるＣｕII
錯体は、ＣｕII・クレアチニン錯体の形成に十分なＣｕ
IIを遊離しないであろう。クエン酸塩及び硫酸塩が最も
低いブランク反応性を有し、これらは好適である。クエ
ン酸第二銅が、他の尿成分に対して最小ブランク反応性
及び最大のＣｕII・クレアチニン錯体の形成を示し、同
時に、銅／タンパク質錯体の形成を妨げるため、特に好
ましい。クレアチニンの非存在で染料を酸化することが
できる塩、たとえば第二銅２，２′−ビピリジンは、検
査で偽陽性の結果を示す傾向があるため、それほど望ま
しくない。クエン酸銅を第二銅イオン源として使用する
とき、クエン酸イオンの濃度は、少なくとも銅の濃度に
あるべきであり、クエン酸イオンによるＣｕIIの完全な
錯化を保証し、尿試料中の他の種との錯化を防ぐために
は、過剰量のクエン酸イオンが好ましい。

【００１７】通常、尿が試験される水性流体であると
き、尿中クレアチニンの基準範囲は３〜２０mMであるた
め、第二銅イオンの濃度は５〜８０mMである。この範囲
は、他の流体、たとえば０．０５〜０．３０mMの範囲の
第二銅イオンの濃度を用いることが好ましい血清では異
なるであろう。第一銅イオンは、クレアチニンの非存在
における染料の酸化により、いくらかバックグラウンド
干渉を生じさせる傾向にある。したがって、ＣｕＩ塩を
使用することはできない。

【００１８】適当な酸化性指示薬は、たとえば、ベンジ
ジン、ｏ−トリジン、３，３′，５，５′−テトラアル
キルベンジジン（アルキル基が炭素原子１〜約６個を含
む）、ｏ−ジアニシジン、２，７−ジアミノフルオレ
ン、ビス−（Ｎ−エチルキノール−２−オン）−アジ
ン、（Ｎ−メチルベンズチアゾール−２−オン）−（１
−エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾール−２
−オン）−アジン又はそれらの組み合わせを含む。

【００１９】本発明に使用するのに適したヒドロペルオ
キシドは、クメンヒドロペルオキシド、５−ブチルヒド
ロペルオキシド、ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオ
キシド、１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒドロペ
ルオキシド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒ
ドロペルオキシド、パラメンタンヒドロペルオキシド、
１，４−ジイソプロピルベンゼンモノヒドロペルオキシ
ド、ｐ−tert−ブチルイソプロピルベンゼンヒドロペル
オキシド、２−（α−ヒドロペルオキシイソプロピル）
−６−イソプロピルナフタレン、テトラリンヒドロペル
オキシド又はそれらの組み合わせを含む。

【００２０】通常、可溶性銅塩、ヒドロペルオキシド及
び酸化性指示薬を含む試薬系は、水に溶解される。しか
し、検査機作に干渉しないならば、有機溶媒を系に組み
込むこともできる。ヒドロペルオキシド及び酸化性指示
薬の濃度は通常、１０〜１５０mMの範囲であり、３０〜
９０mMの範囲が好ましい。ヒドロペルオキシドの濃度は
通常、１８〜２７０nMの範囲であり、５０〜１６０nMの
範囲が好ましい。

【００２１】本発明の実施において、検査は、湿式フォ
ーマット又は乾式フォーマット（試験片）のいずれかで
実施することができる。検査を実施する際には、試薬試
験片又は試薬の水性溶液及びアセトニトリル溶液を使用
して、試料を、緩衝したpH、好ましくは４．０〜９．０
で銅塩、たとえばクエン酸第二銅、染料及びヒドロペル
オキシドと混合する。試薬試験片は、吸収性支持体を第
二銅塩及び緩衝剤の水性溶液に浸漬し、支持体を乾燥さ
せ、それを染料及びヒドロペルオキシドの有機溶液に浸
漬したのち乾燥させる従来の方法で調製される。

【００２２】前記式Ｉによって限定されるフィチン酸及
び／又はその特定の誘導体の使用は、先に記載したクレ
アチニンを測定するための配合物に対して安定化効果を
有することがわかった。この安定化は、染料が酸化され
て色を発し、それによって偽陽性の結果を生じさせるこ
とのないことによって証明される。前記式に対応するフ
ィチン酸又はその誘導体なしでは、配合物が熱又は水分
にさらされると、クレアチニンの非存在で酸化が起こ
る。

【００２３】本発明がクレアチニン検査配合物の安定性
を改善する所望の結果を達成する方法に関して特定の理
論又は機作によって拘束されることを意図しないが、第
二銅イオンは、酸素、水分及び／又は熱への暴露によっ
て第一銅イオンに転換されると考えられる。第一銅イオ
ンは、クレアチニンの非存在でさえ、酸化性染料及びヒ
ドロペルオキシド、たとえばＴＭＢ及びＤＢＤＨに対し
て反応性が高い。フィチン酸又はその誘導体の添加が錯
化によって第二銅イオンの原子価状態を安定化させ、酸
素、水分及び熱による転換に対してより大きな障壁を示
すと考えられる。さらには、フィチン酸及びその誘導体
は、クレアチニンによる第二銅イオンの錯化を妨げず、
検査をクレアチン検出方法として機能させることを可能
にする。より強力な錯化剤、たとえばＥＤＴＡもまた、
錯化によって第二銅イオンの原子価状態を安定化させる
が、クレアチニンによる第二銅イオンの錯化も妨げる。
単純なホスフェート、たとえばグリセリン−２−リン酸
及びリン酸ナトリウムは第二銅イオンの原子価状態を安
定化させない。

【００２４】本発明は、まず銅塩、フィチン酸、シトレ
ート及び緩衝剤をクレアチン含有試料と混合し、次いで
極性溶剤中の染料、たとえばＴＭＢ、及びヒドロペルオ
キシド、たとえばＤＢＤＨを加えたのち、６６０nmでス
ペクトル応答を測定することにより、溶液検査として実
施することができる。通常、試薬系は、試験片を試薬溶
液に浸漬したのちキャリヤ液を蒸発させることによって
試薬が吸収される吸湿性又は非吸湿性の支持体の形態で
ある試験片として使用される。通常は水性溶液を使用す
るが、極性有機溶剤、たとえばメタノール、エタノール
及びアセトニトリルを試薬の溶剤として使用してもよ
い。試験片に使用される吸収性基材は、キャリヤとして
一般に使用される材料、たとえば紙、セルロース、合成
樹脂製の織物、たとえばナイロン製の布又は不織布から
なる。吸収性材料は通常、構造的支持を与えるための支
持材料、たとえばガラス繊維又は合成ポリマーシートの
層に結合される。

【００２５】

【実施例】以下の例によって本発明をさらに説明する。 例Ｉ Whatman ３MMろ紙の細片を第一の溶液に浸漬し、乾くま
で（約５〜１０分）９０℃で乾燥させたのち、第二の溶
液に浸漬し、引き続いて乾燥させる二浸漬法により、本
発明にしたがって、クレアチニンを検出するための配合
物を調製した。浸漬溶液の配合は以下のとおりであっ
た。

【００２６】

【表１】

【００２７】

【表２】

【００２８】上述したように調製した試験片を、開口ボ
トル耐用寿命に関して試験した。その測定方法は、試験
片のボトルを開口して湿度８０％で２４〜４８時間放置
し、試験片の性能に対する影響を評価することを含むも
のであった。クレアチニン試験片は、フィチン酸なしで
は、乾式パッドの色及び試験片性能における変化を示し
た。試験片は、２４時間後には過剰な酸化によって褐色
に変色した。乾式カラーパッドの変色に対する配合物の
種々の要素の影響を評価するため、特定の成分を欠く試
験片を製造した。これらの試験片をキャップなしで比較
的高湿度で貯蔵し、４８時間後に評価した。変化を表１
にまとめる。

【００２９】

【表３】

【００３０】表１にまとめた結果は、フィチン酸を含ま
ない試験片が、硫酸銅及びＤＢＤＨによるＴＭＢの酸化
によって褐色に変色することを示す。ＴＭＢ、ＤＢＤＨ
又は硫酸銅を配合物から除いた場合、褐色化は認められ
なかった。褐色の試験片は、ＴＭＢが消費されており、
評価中に反応することができないため、クレアチニンに
対してほとんど完全に反応しない。

【００３１】さらには、クレアチニン試薬の発色中、促
進的な熱ストレス中で収集されたデータで大きな安定性
シフトが注目された。このシフトは、許容レベルを越え
る３０mg/dl示度の増加を生ずるであるろうし、製品の
貯蔵寿命にわたる安定性の減少として現れるであろう。
表２は、フィチン酸を添加した場合と添加しなかった場
合でのクレアチニン試薬の安定性に関するデータを提示
する。

【００３２】

【表４】

【００３３】フィチン酸の添加が、２５℃で２週間及び
６０℃で１週間の場合でこの安定性シフトを減少させ
た。計器数値は、CLINITEK（登録商標）反射分光計によ
って計測した試薬からの色の反射率を表す数であるデコ
ードで表した。より小さな数は、よりいっそう呈色して
いることを示す。デコード数が減少するにつれ、ＴＭＢ
の酸化による呈色のため、６６０nmでの反射率は減少し
て、６６０nmでは青になり、４５０nmでは褐色になっ
た。

フロントページの続き (72)発明者 マイケル・ジェー・プジア アメリカ合衆国、インディアナ州、46530、 グレンジャー、タッディントン・ドライブ 14342

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 流体試料を、第二銅イオン、ヒドロペル
   オキシド、シトレート、ならびに酸素フリーラジカル及
   び擬過酸化物の存在下で呈色応答を示す酸化性染料と接
   触させる工程、呈色応答の強さを測定し、その強さを、
   既知の濃度のクレアチニンを含有する流体試料を使用し
   て得られた強さと比較することによって流体試料中のク
   レアチニンの濃度を測定する工程とを含む、流体試料中
   のクレアチニンを測定する方法において、 下記式： 【化１】 （式中、２、３、４及び５は、 【化２】 からなる群より選択され、Ｍは、Ｈ又は第Ｉ族もしくは
   第II族金属であり、ｌは、上記のいずれかであるか又は
   −Ｏ−でありそしてｍとｎは、独立して０又は１であ
   る）で示されるイオン化性リン酸含有化合物の安定化量
   を該流体試料に導入することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 該イオン化性リン酸含有化合物がフィチ
   ン酸である、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 Ｍが水素である、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 該第二銅イオンの供給源が硫酸第二銅で
   ある、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 該試験流体が尿であり、第二銅イオンの
   濃度が５〜３０mMである、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 該酸化性染料が、ベンジジン、ｏ−トリ
   ジン、３，３′，５，５′−テトラアルキルベンジジン
   （ここで、アルキル基は、炭素原子１〜約６個を含
   む）、ｏ−ジアニシジン、２，７−ジアミノフルオレ
   ン、ビス−（Ｎ−エチルキノール−２−オン）−アジ
   ン、（Ｎ−メチルベンズチアゾール−２−オン）−（１
   −エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾール−２
   −オン）−アジン又はそれらの組み合わせである、請求
   項１記載の方法。
7. 【請求項７】 該ヒドロペルオキシドが、クメンヒドロ
   ペルオキシド、５−ブチルヒドロペルオキシド、ジイソ
   プロピルベンゼンヒドロペルオキシド、１−ヒドロキシ
   シクロヘキサン−１−ヒドロペルオキシド、２，５−ジ
   メチルヘキサン−２，５−ジヒドロペルオキシド、パラ
   メンタンヒドロペルオキシド、１，４−ジイソプロピル
   ベンゼンモノヒドロペルオキシド、ｐ−tert−ブチルイ
   ソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、２−（α−ヒ
   ドロペルオキシイソプロピル）−６−イソプロピルナフ
   タレン、テトラリンヒドロペルオキシド又はそれらの組
   み合わせである、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 該試薬を吸収性支持体に組み込んで試験
   片を形成する、請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 クレアチニンの濃度を、標的分析対象物
   の濃度と組み合わせて比を得る、請求項１〜８のいずれ
   か１項記載の方法。
10. 【請求項１０】 尿中のクレアチニンを測定する方法に
    おいて、 尿試料を、第二銅イオン、シトレート、ヒドロペルオキ
    シド、酸化されると呈色応答を示す酸化性染料及びフィ
    チン酸を含む試薬配合物と組み合わせて、尿試料中のク
    レアチニンの濃度を示す呈色応答を与えることを特徴と
    する方法。