JP2000270848A

JP2000270848A - 新規微生物

Info

Publication number: JP2000270848A
Application number: JP11086383A
Authority: JP
Inventors: Takashi Hosoe; 隆志細江; Masabumi Shinohara; 正文篠原
Original assignee: Osaka Gas Co Ltd
Current assignee: Osaka Gas Co Ltd
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 1999-03-29
Publication date: 2000-10-03

Abstract

(57)【要約】【課題】シアン化合物、特に、鉄シアノ錯体を分解す
ることが出来る微生物を提供する。【解決手段】シアン化合物を分解可能なロドコッカス
(Rhodococcus)属の新規微生物であり、具体的には、ロ
ドコッカス・ロドクロス(Rhodococcus Rhodochrous) K
R9-4株である。又、前記シアン化合物は、具体的には、
鉄シアノ錯体である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ロドコッカス(Rho
dococcus)属に属する細菌であって、弱アルカリ性の生
育条件下で、シアン化合物、特に、鉄シアノ錯体分解能
を有する新規な微生物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】シアン化合物には、シアン化物と金属シ
アノ錯体と称される化合物群が含まれる。前記シアン化
物は、「遊離シアン」とも呼ばれているもので、一般式
A_n(CN) _xで表され、Aには水素(H)、ナトリウム(Na)、カ
リウム(K)、アンモニウム(NH₄)、カルシウム(Ca)などが
あり、シアン化合物の中で最も毒性の高い形態である。
又、前記金属シアノ錯体は、シアン化水素の金属塩と金
属とが過剰のシアン化物イオン(CN^-)と結合したもの
で、一般式A_n [M(CN)_x]で表される。ここで、Mには銀(A
g)、金(Au)、カドミウム(Cd)、コバルト (Co)、銅(C
u)、鉄(Fe)、ニッケル(Ni)、亜鉛(Zn)などの金属が該当
し、溶液中に溶存、あるいは懸濁状で存在している。

【０００３】前記シアン化合物は、産業排水等に含まれ
ていることがあり、浄化処理で取り除かれるべき性質の
物質である。溶液(排水)中でのシアン化合物の存在形態
に関しては、排水処理分野で多くの研究が行われてお
り、その形態は大部分が前記遊離シアンと前記金属シア
ノ錯体であることが報告されている。これらのシアン化
合物を含有する排水の処理方法としては、アルカリ塩素
法、オゾン酸化法、電解酸化法、紺青法(難溶性錯化合
物沈殿法)、酸分解燃焼法、煮詰法(煮詰高温燃焼法)、
湿式加熱分解法、及び、吸着法などが知られている。し
かし、これらの処理方法においては、安定性の高い金属
シアノ錯体、例えば鉄、コバルト、銀、金のシアノ錯体
については適用されなかったり、反応条件が過酷で大規
模な設備が必要であったり、生成物の処理が更に必要で
あったりするという問題点があった。そこで、生物機能
を利用して環境を修復する技術、所謂、バイオレメディ
エーション(bioremediation)が注目されており、前記シ
アン化合物分解能を有する微生物の検索が行なわれてい
る。

【０００４】現在、シアン化カリウム、シアン化ナトリ
ウムなどの前記遊離シアンの微生物分解に関しては、遊
離シアンの分解菌としてPseudomonas putida、Pseudomo
nassp.、Acinetobacter sp.、Fusarium sp.、Klebsiell
a sp.などの微生物が単離、同定されたという報告があ
る。

【０００５】そして、前記金属シアノ錯体に関しては、
ニッケル-シアノ錯体([K₂Ni(CN)₄])の分解微生物とし
て、Fusarium solani、Trichoderum polysporumが報告
されている。又、鉄シアノ錯体であるフェロシアン化
カリウム([K₄Fe(CN)₆])の分解菌としては、Fusarium ox
ysporum、Scytalidium thermophilum、Penicillium mic
zynskiが報告されている(いずれもKnowles C.J. et. a
l, Enzyme and MicrobialTechnology 22:223-231,(199
8))。尚、前記金属シアノ錯体の分解に関する報告は、
すべて真菌によるものであって、放線菌を含めた細菌に
よる分解例は報告されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記鉄
シアノ錯体分解菌は全て真菌に分類されるものであるの
で、その生育ｐＨ域は弱酸性域に限られている。ここ
で、前記鉄シアノ錯体を含む排水の処理について考える
と、弱酸性条件下では、前記鉄シアノ錯体は難溶性の塩
を形成して存在しているので、前記排水中の鉄シアノ錯
体は、前記処理の過程で、流路や処理槽に沈殿し易い。
そのため、前記鉄シアノ錯体分解菌を用いて排水処理を
行なうとしても、分解効率が低かったり、その効率を上
げるために激しく攪拌する等の操作が必要となることが
考えられる。そのため、実質的には、前記鉄シアノ錯体
分解菌を、前記鉄シアノ錯体を含む排水の処理に適用す
ることは困難であった。

【０００７】従って、本発明の目的は、上記欠点に鑑
み、シアン化合物、特に、鉄シアノ錯体を分解すること
が出来る新規微生物を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】発明者らは、上記課題を
解決すべく、土壌を対象としてスクリーニングを行なっ
て、シアン化合物分解能を有する新規微生物を分離する
ことに成功し、本発明を完成させた。

【０００９】即ち、本発明は、シアン化合物を分解可能
なロドコッカス(Rhodococcus)属の新規微生物であり、
具体的には、ロドコッカス・ロドクロス(Rhodococcus R
hodochrous) KR9-4株である。又、前記シアン化合物
は、具体的には、金属シアノ錯体であり、更に具体的に
は、鉄シアノ錯体である。発明者らは、以下の様にし
て、本発明に係る新規微生物を単離した。

【００１０】各地から採取した土壌1gを夫々滅菌した0.
9％生理食塩水に懸濁し、その上清を、滅菌したフェロ
シアン寒天平板培地上に接種して、３０℃に保持した。
そして、前記フェロシアン寒天平板培地上に形成された
コロニーを採取して、夫々のコロニーを、再度、滅菌し
たフェロシアン寒天平板培地上に接種して３０℃で培養
した後に、前記フェロシアン寒天平板培地上に形成され
たコロニーを分離した。更に、滅菌した試験管に滅菌し
たフェロシアン液体培地10mlを分注し、前述の分離した
菌株を１白金耳接種し、３０℃で２週間、振とう培養
(１５０〜１７０rpm)した。そして、前記培養液を遠心
分離して菌体を除去し、上清に残存するフェロシアン濃
度をHPLCを用いて分析して、培養後に培地中のフェロシ
アン濃度が低下した菌株を選抜した。この結果、フェロ
シアン分解能を有する菌株が得られ、これをKR9-4株と
命名した。尚、前記フェロシアン寒天培地及びフェロシ
アン液体培地前記の組成及び調製方法は、以下に示す通
りである。

【００１１】

【表１】

【００１２】表1は、前記フェロシアン寒天培地の組成
を表わすものである。培地組成、、及びを混合
してｐＨ値を７．２±０．２に調整した後、１２１℃で
１５分間滅菌したものに、別途に１２１℃で１５分間滅
菌した培地組成と、フィルター滅菌した培地組成を
加えて、前記フェロシアン寒天培地を作成した。

【００１３】フェロシアン液体培地の組成は、下記の通
りである。〔フェロシアン液体培地の組成〕 K₄[Fe(CN)₆]・3H₂O 1mM グルコース 0.25％(W／V) Na₂HPO₄ 0.35％(W／V) KH₂PO₄ 0.15％(W／V) MgSO₄・7H₂O 0.001％(W／V) FeCl₃・6H₂O 0.001％(W／V) MEMビタミンミックス(ギブコ社製) 0.1％(W／V)

【００１４】前記フェロシアン液体培地は、特に記載が
無い限り、ｐＨ値を７．２±０．２に調整した後、１２
１℃で１５分間滅菌したものを用いた。

【００１５】前記KR9-4株の菌学的性質を、表２に記
す。

【００１６】

【表２】

【００１７】上記の菌学的性質を有するKR9-4株の分類
学上の位置を、「バージェイズ・マニュアル・オブ・
システマティック・バクテリオロジー第２巻」(Sneat
h,P.H.A., Mair,N.S., Sharpe,M.E. and Holt,J.G. ：
゛Bergery's Manual of Systematic Bacteriology″Vo
l.2, (1986)Williams & Wilkins.)、「バージェイズ・
マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロ
ジー第９版」(Holt.J.G., Krieg,N.R., Sneath,P.H.
A., Staley,j.T. and Williams,S.T.：゛Bergery'sManu
al of Determinative Bacteriology″Ninth Edition,
(1994)Williams & Wilkins.)、「微生物の化学分類実験
法初版」(駒形和男編(1982)学会出版センター)、及
び、「新しい分類学に伴走する細菌同定法第1版」(薮
内英子他(1987)菜根出版)を参照にして検索した。この
結果、前記KR9-4株は、ロドコッカス・ロドクロス(Rhod
ococcus Rhodochrous)であると判定された。しかし、公
知のロドコッカス・ロドクロスが、シアン化合物を分解
可能であるという報告は今までに無く、この点で、前記
KR9-4株は、公知の菌株と区別される新菌株である。そ
して、ロドコッカス・ロドクロス KR9-4株と判定された
本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託
番号ＦＥＲＭＰ−１７３２２号として寄託されてい
る。

【００１８】尚、前記ロドコッカス・ロドクロス KR9-
4株は、下記のSCDA培地(ｐＨ７．３±０．２、２５
℃、DIFCO社製)及びYG培地(ｐＨ７．２±０．２)を用
いて、３０℃の温度条件下で培養することが出来る。

【００１９】〔SCDA培地の組成〕 Bacto Tryptone 15g (Pancreatic Digest of Casein) Bacto Soytone 5g (Papaic Digest of Soybean Meal) NaCl 5g Bacto Agar 15g

【００２０】〔YG培地の組成〕 Yeast Extract 0.1% Glucose 0.1% K₂HPO₄ 0.03% KH₂PO₄ 0.02% MgSO₄・7H₂O 0.02% Agar 1.5%

【００２１】本発明にかかるロドコッカス・ロドクロス
KR9-4株は、細菌に分類される新規微生物である。一
般的に、細菌は、中性から弱アルカリ性のｐＨ域で生育
するものであり、発明者らは、後述する生育試験によ
って、前記ロドコッカス・ロドクロス KR9-4株も、中
性から弱アルカリ性の生育条件で、前記鉄シアノ錯体を
分解して生育できることを明らかにしている。上述の如
く、前記ロドコッカス・ロドクロス KR9-4株は、中性
から弱アルカリ性のｐＨ域で、シアン化合物、特に鉄シ
アノ錯体を分解可能であるので、バイオレメディエーシ
ョンによる排水処理に用いるのに適した微生物といえ
る。この菌株をシアン化合物を含む排水の処理に用いる
場合、難溶性の前記鉄シアノ錯体を排水中に溶存した状
態で分解することが出来るので、排水の浄化を効率的に
行なうことが出来る。

【００２２】又、土壌中でのシアンの存在形態は、大部
分が鉄とシアンの錯体であるフェロシアンであることが
知られているため、本発明に係るロドコッカス・ロドク
ロスKR9-4株を用いて土壌中のフェロシアンを分解除去
することによって、シアン化合物に汚染された土壌を浄
化することが出来ると考えられる。

【００２３】

【実施例】以下に本発明の実施例を説明する。

【００２４】〔実施例１〕ロドコッカス・ロドクロス
KR9-4株のフェロシアン分解能の測定滅菌した試験管に、滅菌した前記フェロシアン液体培地
10mlを分注して、これにロドコッカス・ロドクロス KR
9-4株を1白金耳接種した。そして、前記菌株を接種した
試験管を、３０℃で振とう培養(１５０〜１７０rpm)し
て、一定期間ごとに培地中のフェロシアン(全シアン)
含有量を測定した。ここで、培養液中のフェロシアン
(全シアン)含有量は、「低質土壌のCN含有量測定方法
(環水管127号14.2項)」に記載された「シアンの蒸留前
操作方法(土壌中の全シアンの加熱蒸留方法)」に従っ
て、培養物(培養液、菌体)全量を蒸留して得られた蒸留
液を、全自動シアン測定装置(アナテック・ヤナコ製T−
CN501)に供試して測定した。その結果を、図１に示す。

【００２５】尚、フェロシアンの分解率は以下の式によ
り求めた。フェロシアン(全シアン)分解率＝培養後のフェロシアン
(全シアン)含有量／培養前のフェロシアン(全シアン)含
有量×１００(％)

【００２６】図１に示すように、前記ロドコッカス・ロ
ドクロス KR9-4株は、培養開始から２、４、７週間後に
は液体培地中のフェロシアンを夫々１２．２％、２７．
２％、３０．８％分解していることがわかる。

【００２７】〔実施例２〕フェロシアン分解能の培地
ｐＨ依存性種々のｐＨ値に調製して滅菌した前記フェロシアン液体
培地を用いて、前記ロドコッカス・ロドクロス KR9-4
株のフェロシアン分解能のｐＨ依存性について検討し
た。具体的には、ｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．
０、１１．０又は１２．０に調整した後に滅菌したフェ
ロシアン液体培地10mlを夫々滅菌した試験管に分注し
て、ロドコッカス・ロドクロス KR9-4株を1白金耳接種
したものを、夫々実験区Ａ〜Ｆとした。これら６つの実
験区の夫々について、３０℃で振とう培養(１５０〜１
７０rpm)して、一定期間ごとに培地中のフェロシアン
(全シアン)含有量及び培地のｐＨを測定した。尚、培養
液中のフェロシアン(全シアン)含有量は、〔実施例１〕
と同じ方法を用いて測定した。以下、培地中のフェロシ
アン含有量の経時的変化を図２に示し、培地ｐＨの経時
的変化を図３に示す。

【００２８】図２から明らかなように、前記ロドコッカ
ス・ロドクロス KR9-4株によるフェロシアンの分解
は、実験区Ａ〜Ｄ、即ち、弱アルカリ性のｐＨ条件にお
いて良好であって、特に、実験区Ａにおいて著しい。
又、図３から明らかなように、前記ロドコッカス・ロド
クロス KR9-4株は、中性から弱アルカリ性域でフェロ
シアンを分解している。このとき、前記培地中のフェロ
シアンは、前記培地に溶解した状態で存在していると考
えられる。

【００２９】このように、前記ロドコッカス・ロドクロ
ス KR9-4株は、可溶化したフェロシアンを分解するこ
とが出来るので、工業排水等の浄化処理に使用する菌株
として、好適であると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ロドコッカス・ロドクロス KR9-4株によるフ
ェロシアン分解の経時的変化を表わすグラフ

【図２】ロドコッカス・ロドクロス KR9-4株によるフ
ェロシアン分解のｐＨ依存性を表わすグラフ

【図３】ロドコッカス・ロドクロス KR9-4株培養時の
培地ｐＨを表わすグラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B065 AA45X AC12 AC20 BA23 BB01 BC01 BC02 BC03 BC26 BC31 CA56 4D040 DD03 DD14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】鉄シアノ錯体分解能を有するロドコッカ
ス(Rhodococcus)属の細菌。
【請求項２】金属シアノ錯体分解能を有するロドコッ
カス・ロドクロス(Rhodococcus Rhodochrous)。
【請求項３】鉄シアノ錯体分解能を有するロドコッカ
ス・ロドクロス(Rhodococcus Rhodochrous)。
【請求項４】シアン化合物分解能を有する新菌株ロド
コッカス・ロドクロス(Rhodococcus Rhodochrous) KR9-
4株。