JP2000270849A

JP2000270849A - 新規微生物

Info

Publication number: JP2000270849A
Application number: JP8638499A
Authority: JP
Inventors: Takashi Hosoe; 隆志細江; Masabumi Shinohara; 正文篠原
Original assignee: Osaka Gas Co Ltd
Current assignee: Osaka Gas Co Ltd
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 1999-03-29
Publication date: 2000-10-03

Abstract

(57)【要約】【課題】金属シアノ錯体、特に、鉄シアノ錯体を分解
することが出来る微生物を提供する。【解決手段】金属シアノ錯体を分解可能なシュードモ
ナス(Pseudomonas)属の新規微生物であり、具体的に
は、シュードモナス(Pseudomonas) sp. 14SA3-2-5B2で
ある。又、前記金属シアノ錯体は、具体的には、鉄シア
ノ錯体である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、シュードモナス(P
seudomonas)属に属する細菌であって、弱アルカリ性の
生育条件下で、金属シアノ錯体、特に、鉄シアノ錯体分
解能を有する新規な微生物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】シアン化合物には、シアン化物と金属シ
アノ錯体と称される化合物群が含まれる。前記シアン化
物は、「遊離シアン」とも呼ばれているもので、一般式
A_n(CN) _xで表され、Aには水素(H)、ナトリウム(Na)、カ
リウム(K)、アンモニウム(NH₄)、カルシウム(Ca)などが
あり、シアン化合物の中で最も毒性の高い形態である。
又、前記金属シアノ錯体は、シアン化水素の金属塩と金
属とが過剰のシアン化物イオン(CN^-)と結合したもの
で、一般式A_n [M(CN)_x]で表される。ここで、Mには銀(A
g)、金(Au)、カドミウム(Cd)、コバルト (Co)、銅(C
u)、鉄(Fe)、ニッケル(Ni)、亜鉛(Zn)などの金属が該当
し、溶液中に溶存、あるいは懸濁状で存在している。

【０００３】前記シアン化合物は、産業排水等に含まれ
ていることがあり、浄化処理で取り除かれるべき性質の
物質である。溶液(排水)中でのシアン化合物の存在形態
に関しては、排水処理分野で多くの研究が行われてお
り、その形態は大部分が前記遊離シアンと前記金属シア
ノ錯体であることが報告されている。これらのシアン化
合物を含有する排水の処理方法としては、アルカリ塩素
法、オゾン酸化法、電解酸化法、紺青法(難溶性錯化合
物沈殿法)、酸分解燃焼法、煮詰法(煮詰高温燃焼法)、
湿式加熱分解法、及び、吸着法などが知られている。し
かし、これらの処理方法においては、安定性の高い金属
シアノ錯体、例えば鉄、コバルト、銀、金のシアノ錯体
については適用されなかったり、反応条件が過酷で大規
模な設備が必要であったり、生成物の処理が更に必要で
あったりするという問題点があった。そこで、生物機能
を利用して環境を修復する技術、所謂、バイオレメディ
エーション(bioremediation)が注目されており、前記シ
アン化合物分解能を有する微生物の検索が行なわれてい
る。

【０００４】現在、シアン化カリウム、シアン化ナトリ
ウムなどの前記遊離シアンの微生物分解に関しては、遊
離シアンの分解菌としてPseudomonas putida、Pseudomo
nassp.、Acinetobacter sp.、Fusarium sp.、Klebsiell
a sp.などの微生物が単離、同定されたという報告があ
る。

【０００５】そして、前記金属シアノ錯体に関しては、
ニッケル-シアノ錯体([K₂Ni(CN)₄])の分解微生物とし
て、Fusarium solani、Trichoderum polysporumが報告
されている。又、鉄シアノ錯体であるフェロシアン化カ
リウム([K₄Fe(CN)₆])の分解菌としては、Fusarium oxys
porum、Scytalidium thermophilum、Penicillium miczy
nskiが報告されている(いずれもKnowles C.J. et. al,
Enzyme and MicrobialTechnology 22:223-231,(199
8))。尚、前記金属シアノ錯体の分解に関する報告は、
すべて真菌によるものであって、放線菌を含めた細菌に
よる分解例は報告されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記鉄
シアノ錯体分解菌は全て真菌に分類されるものであるの
で、その生育ｐＨ域は弱酸性域に限られている。ここ
で、前記鉄シアノ錯体を含む排水の処理について考える
と、弱酸性条件下では、前記鉄シアノ錯体は難溶性の塩
を形成して存在しているので、前記排水中の鉄シアノ錯
体は、前記処理の過程で、流路や処理槽に沈殿し易い。
そのため、前記鉄シアノ錯体分解菌を用いて排水処理を
行なうとしても、分解効率が低かったり、その効率を上
げるために激しく攪拌する等の操作が必要となることが
考えられる。そのため、実質的には、前記鉄シアノ錯体
分解菌を、前記鉄シアノ錯体を含む排水の処理に適用す
ることは困難であった。

【０００７】従って、本発明の目的は、上記欠点に鑑
み、金属シアノ錯体、特に、鉄シアノ錯体を分解するこ
とが出来る新規微生物を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】発明者らは、上記課題を
解決すべく、土壌を対象としてスクリーニングを行なっ
て、金属シアノ錯体分解能を有する新規微生物を分離す
ることに成功し、本発明を完成させた。

【０００９】即ち、本発明は、金属シアノ錯体を分解可
能なシュードモナス(Pseudomonas)属の新規微生物であ
り、具体的には、シュードモナス(Pseudomonas) sp. 14
SA3-2-5B2である。又、前記金属シアノ錯体は、具体的
には、鉄シアノ錯体である。発明者らは、以下の様にし
て、本発明に係る新規微生物を単離した。

【００１０】各地から採取した土壌1gを夫々滅菌した0.
9％生理食塩水に懸濁し、その上清を、滅菌したフェロ
シアン寒天平板培地上に接種して、３０℃に保持した。
そして、前記フェロシアン寒天平板培地上に形成された
コロニーを採取して、夫々のコロニーを、再度、滅菌し
たフェロシアン寒天平板培地上に接種して３０℃で培養
した後に、前記フェロシアン寒天平板培地上に形成され
たコロニーを分離した。更に、滅菌した試験管に滅菌し
たフェロシアン液体培地10mlを分注し、前述の分離した
菌株を１白金耳接種し、３０℃で2週間、振とう培養(１
５０〜１７０rpm)した。そして、前記培養液を遠心分離
して菌体を除去し、上清に残存するフェロシアン濃度を
HPLCを用いて分析して、培養後に培地中のフェロシアン
濃度が低下した菌株を選抜した。この結果、フェロシア
ン分解能を有する菌株が得られ、これを14SA3-2-5B2株
と命名した。尚、前記フェロシアン寒天培地及びフェロ
シアン液体培地前記の組成及び調製方法は、以下に示す
通りである。

【００１１】

【表１】

【００１２】表１は、前記フェロシアン寒天培地の組成
を表わすものである。培地組成、、及びを混合
してｐＨ値を７．２±０．２に調整した後、１２１℃で
１５分間滅菌したものに、別途に１２１℃で１５分間滅
菌した培地組成と、フィルター滅菌した培地組成を
加えて、前記フェロシアン寒天培地を作成した。

【００１３】フェロシアン液体培地の組成は、下記の通
りである。〔フェロシアン液体培地の組成〕 K₄[Fe(CN)₆]・3H₂O 1mM グルコース 0.25％(W／V) Na₂HPO₄ 0.35％(W／V) KH₂PO₄ 0.15％(W／V) MgSO₄・7H₂O 0.001％(W／V) FeCl₃・6H₂O 0.001％(W／V) MEMビタミンミックス(ギブコ社製) 0.1％(W／V)

【００１４】前記フェロシアン液体培地は、特に記載が
無い限り、ｐＨ値を７．２±０．２に調整した後、１２
１℃で１５分間滅菌したものを用いた。

【００１５】前記14SA3-2-5B2株の菌学的性質を、表２
に記す。

【００１６】

【表２】

【００１７】上記の菌学的性質を有する14SA3-2-5B2株
の分類学上の位置を、「バージェイズ・マニュアル・オ
ブ・システマティック・バクテリオロジー第１巻」(K
rieg,N.R. and Holt,J.G.：゛Bergery's Manual of Sys
tematic Bacteriology″Vol.1, (1984)Williams & Wilk
ins.)、及び、「バージェイズ・マニュアル・オブ・デ
ターミネイティブ・バクテリオロジー第９版」(Holt.
J.G., Krieg,N.R., Sneath,P.H.A., Staley,j.T. and W
illiams,S.T.：゛Bergery's Manual of Determinative
Bacteriology″Ninth Edition, (1994)Williams & Wil
kins.)を参照にして検索した。この結果、前記14SA3-2-
5B2株は、シュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌
であると判定された。しかし、前記14SA3-2-5B2株の菌
学的性質を上記文献に照らして検討した結果、これらの
性質を有する公知のシュードモナス(Pseudomonas)属の
菌種は存在しなかった。又、公知のシュードモナス属細
菌が、鉄シアノ錯体分解能を有するという報告もなされ
ていない。従って、前記シュードモナス sp. 14SA3-2-5
B2は、公知の菌種と区別される新菌種であると考えられ
る。

【００１８】このようにして、シュードモナス sp.14S
A3-2-5B2と判定された本菌株は、工業技術院生命工学工
業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭＰ−１７３２１号
として寄託されている。

【００１９】尚、前記シュードモナス sp. 14SA3-2-5B
2は、下記のSCDA培地(ｐＨ７．３±０．２、２５℃、
DIFCO社製)及びYG培地(ｐＨ７．２±０．２)を用い
て、３０℃の温度条件下で培養することが出来る。

【００２０】〔SCDA培地の組成〕 Bacto Tryptone 15g (Pancreatic Digest of Casein) Bacto Soytone 5g (Papaic Digest of Soybean Meal) NaCl 5g Bacto Agar 15g

【００２１】〔YG培地の組成〕 Yeast Extract 0.1% Glucose 0.1% K₂HPO₄ 0.03% KH₂PO₄ 0.02% MgSO₄・7H₂O 0.02% Agar 1.5%

【００２２】本発明にかかるシュードモナス sp. 14SA
3-2-5B2は、細菌に分類される新規微生物である。一般
的に、細菌は、中性から弱アルカリ性のｐＨ域で生育す
るものであり、発明者らは、後述する生育試験によっ
て、前記シュードモナス sp.14SA3-2-5B2も、中性から
弱アルカリ性の生育条件で、前記鉄シアノ錯体を分解し
て生育できることを明らかにしている。上述の如く、前
記シュードモナス sp. 14SA3-2-5B2は、中性から弱アル
カリ性のｐＨ域で、金属シアノ錯体、特に鉄シアノ錯体
を分解可能であるので、バイオレメディエーションによ
る排水処理に用いるのに適した微生物といえる。この菌
株を金属シアノ錯体を含む排水の処理に用いる場合、難
溶性の前記鉄シアノ錯体を排水中に溶存した状態で分解
することが出来るので、排水の浄化を効率的に行なうこ
とが出来る。

【００２３】又、土壌中でのシアンの存在形態は、大部
分が鉄とシアンの錯体であるフェロシアンであることが
知られているため、本発明に係るシュードモナス sp. 1
4SA3-2-5B2を用いて土壌中のフェロシアンを分解除去す
ることによって、シアン化合物に汚染された土壌を浄化
することが出来ると考えられる。

【実施例】以下に本発明の実施例を説明する。

【００２４】〔実施例１〕シュードモナス sp. 14SA
3-2-5B2のフェロシアン分解能の測定滅菌した試験管に、滅菌した前記フェロシアン液体培地
10mlを分注して、これにシュードモナス sp. 14SA3-2-
5B2を1白金耳接種した。そして、前記菌株を接種した試
験管を、３０℃で振とう培養(１５０〜１７０rpm)し
て、一定期間ごとに培地中のフェロシアン(全シアン)含
有量を測定した。ここで、培養液中のフェロシアン(全
シアン)含有量は、「低質土壌のCN含有量測定方法(環水
管127号14.2項)」に記載された「シアンの蒸留前操作方
法 (土壌中の全シアンの加熱蒸留方法)」に従って、培
養物(培養液、菌体)全量を蒸留して得られた蒸留液を、
全自動シアン測定装置(アナテック・ヤナコ製T−CN501)
に供試して測定した。その結果を、図１に示す。

【００２５】尚、フェロシアンの分解率は以下の式によ
り求めた。フェロシアン(全シアン)分解率＝培養後のフェロシアン
(全シアン)含有量／培養前のフェロシアン(全シアン)含
有量×１００(％)

【００２６】図１に示すように、前記シュードモナス s
p. 14SA3-2-5B2は、培養開始から２週間後には液体培地
中のフェロシアンを１２．２％分解し、４週間後には３
５．２％分解していることがわかる。

【００２７】〔実施例２〕フェロシアン分解能の培地
ｐＨ依存性種々のｐＨ値に調製して滅菌した前記フェロシアン液体
培地を用いて、前記シュードモナス sp. 14SA3-2-5B2
のフェロシアン分解能のｐＨ依存性について検討した。
具体的には、ｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．
０、１１．０又は１２．０に調整した後に滅菌したフェ
ロシアン液体培地10mlを夫々滅菌した試験管に分注し
て、シュードモナス sp. 14SA3-2-5B2 を1白金耳接種
したものを、夫々実験区Ａ〜Ｆとした。これら６つの実
験区の夫々について、３０℃で振とう培養(１５０〜１
７０rpm)して、一定期間ごとに培地中のフェロシアン
(全シアン)含有量及び培地のｐＨを測定した。尚、培養
液中のフェロシアン(全シアン)含有量は、〔実施例１〕
と同じ方法を用いて測定した。以下、培地中のフェロシ
アン含有量の経時的変化を図２に示し、培地ｐＨの経時
的変化を図３に示す。

【００２８】図２から明らかなように、前記シュードモ
ナス sp. 14SA3-2-5B2によるフェロシアンの分解は、実
験区Ａ〜Ｄ、即ち、弱アルカリ性のｐＨ条件において良
好であって、特に、実験区Ａにおいて著しい。又、図３
から明らかなように、前記シュードモナス sp. 14SA3-2
-5B2は、中性から弱アルカリ性域でフェロシアンを分解
している。このとき、前記培地中のフェロシアンは、前
記培地に溶解した状態で存在していると考えられる。

【００２９】このように、前記シュードモナス sp. 14
SA3-2-5B2は、可溶化したフェロシアンを分解すること
が出来るので、工業排水等の浄化処理に使用する微生物
として、好適であると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】シュードモナス sp. 14SA3-2-5B2によるフェ
ロシアン分解の経時的変化を表わすグラフ

【図２】シュードモナス sp. 14SA3-2-5B2によるフェ
ロシアン分解のｐＨ依存性を表わすグラフ

【図３】シュードモナス sp. 14SA3-2-5B2培養時の培
地ｐＨを表わすグラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B065 AA41X AC12 AC20 BA23 BB01 BC01 BC02 BC26 BC31 CA56 4D040 DD03 DD14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】金属シアノ錯体分解能を有するシュード
モナス(Pseudomonas)属の細菌。
【請求項２】鉄シアノ錯体分解能を有するシュードモ
ナス(Pseudomonas)属の細菌。
【請求項３】シアン化合物分解能を有するシュードモ
ナス(Pseudomonas)sp. 14SA3-2-5B2。