JP2000279189A - 化合物の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】特定の医薬中間体化合物をＯ−脱メチル化し
て、所望の医薬品化合物を製造するのに、特定の微生物
を使用することにより、処理困難な副生物（臭化メチ
ル）が生成しない方法の提供。 【解決手段】式Ｉで示される化合物を得るための式IIで
示される化合物の使用に関する。すなわち、モノスポリ
ウム・オリバセウム（Ｍｏｎｏｓｐｏｒｉｕｍ ｏｌｉ
ｖａｃｅｕｍ）の培養物から誘導される酵素の存在下
に、式IIで示される化合物を脱メチル化することにより
式Ｉで示される化合物を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定の医薬中間体
化合物をＯ-脱メチル化するのに微生物による生体内変
換を利用することに関する。さらに詳細には、本発明
は、特定の医薬中間体化合物をＯ-脱メチル化するのに
特定の微生物を使用することに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】“An
alytical Chimica Acta(1990) 233, 191-198”における
論文は、特定のｎ−プロピルノラポルフィン化合物を脱
メチル化するのにカンニンガメラ・エレガンス（Cunnin
ghamella elegans）を使用する、ということについて説
明している。

【０００３】“Biomedical and Environmental Mass Sp
ectrometry(1986) 13, 223-229”における論文は、Ｎ−
ｎ−プロピルノラポモルフィンの可能な代謝産物を生成
させるのにカンニンガメラ・エレガンス（Cunninghamel
la elegans）を使用する、ということについて説明して
いる。

【０００４】“Enzyme and Microbial Technology(198
4) 6, 242-253”中のレビュー論文（250〜252ページ）
は、特定の化合物をＯ-脱メチル化するのに特定の微生
物〔たとえば、カンニンガメラ（Cunninghamella）、ア
スペルギラス（Aspergillus）、タムノスチラム（Thamn
ostylum）、ペニシリウム（Penicillium）、およびセペ
ドニウム（Sepedonium）等の真菌種〕を使用する、とい
うことについて広範囲に概説している。

【０００５】H.G.Daviesらによる“Biotransformation
in Preparative Organic Chemistry”の5.5章は、特定
の化合物（ビンドリンと10,11−ジメトキシアポルフィ
ンを含めて）を脱メチル化するのにセペドニウム・クリ
ソスペルマム（Sepedonium chrysospermum）および カ
ンニンガメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）
を使用する、ということについて説明している。

【０００６】“Phytochemistry(1997) 44(8), 1479-148
2”における論文は、(±)−オイデスミンのＯ-脱メチル
化によって(−)−ピノレジノールを生成させるのにアス
ペルギラス・ニゲル（Aspergillus niger）を使用す
る、ということについて説明している。

【０００７】1997年４月18日付け取得の米国特許第5,61
8,707号は、ペンタン酸化合物をフェニルオキサゾリジ
ノン生成物に立体選択的に還元するのにジゴサッカロマ
イセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）を使用す
る、ということについて説明している。

【０００８】米国特許第5,580,764号は、カルボニック
アンヒドラーゼ阻害剤の合成において中間体を還元する
のにラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus pl
antarum）、ピチア・ハプロフィラ（Pichia haplophil
a）、キャンディダ・ユーティリス（Candida utili
s）、ラクトバシラス・ブックマンズ（Lactobacillus b
uchmans）、アスペルギラス・フラバス（Aspergillus f
lavus）、およびニューロスポラ・クラスサ（Neurospor
a crassa）からの酸化還元酵素を使用する、ということ
について説明している。

【０００９】

【課題を解決するための手段】１つの実施態様において
は、本発明は、モノスポリウム（Monosporium）属の微
生物の培養物から誘導される酵素の存在下にて式IIの化
合物を選択的に脱メチル化することを含む、式

【００１０】

【化３】

【００１１】で示される化合物から式

【００１２】

【化４】

【００１３】で示される化合物を製造するための方法に
関する。前記微生物がモノスポリウム・オリバセウム
（Monosporium olivaceum）である場合の製造法が好ま
しい。

【００１４】さらに、前記モノスポリウム・オリバセウ
ム（Monosporium olivaceum）がモノスポリウム・オリ
バセウム（Monosporium olivaceum）ATCC36300である場
合の製造法が好ましい。

【００１５】他の実施態様においては、本発明は、タム
ノスチラム（Thamnostylum）属の微生物の培養物から誘
導される酵素の存在下にて式IIの化合物を選択的に脱メ
チル化することを含む、式

【００１６】

【化５】

【００１７】で示される化合物から式

【００１８】

【化６】

【００１９】で示される化合物を製造するための方法に
関する。前記微生物がタムノスチラム・ピリフォルメ
（Thamnostylum piriforme）である場合の製造法が好ま
しい。

【００２０】さらに、前記タムノスチラム・ピリフォル
メ（Thamnostylum piriforme）がタムノスチラム・ピリ
フォルメ（Thamnostylum piriforme）ATCC8992である場
合の製造法が好ましい。

【００２１】他の実施態様においては、本発明は、式

【００２２】

【化７】

【００２３】で示される化合物を得るのに式

【００２４】

【化８】

【００２５】で示される化合物を使用すること、に関す
る。式IIの化合物を非選択的にＯ-脱メチル化させる場
合の使用が好ましい。本発明は、CP-336,156（エストロ
ゲン作用薬／骨粗鬆症）の合成において、中間体のＯ-
脱メチル化を果たすのに微生物を使用することを含む。
微生物を使用すると、臭化メチル（捕集するのが困難で
しかも高価な温室効果ガス）が副生物として生成される
化学工程がなくなる。

【００２６】生体内変換は、微生物の全細胞培養物、微
生物の細胞抽出物、または微生物からの精製酵素を使用
して行うことができる。この微生物生体内変換のための
出発物質はCP-324,098であり、本物質はシスジアステレ
オマーの混合物である。この反応を異なった立体選択性
で行う３種の真菌類が見いだされている。カンニンガメ
ラ・エチヌラタ（Cunninghamella echinulata）は、両
方のジアステレオマーをＯ-脱メチル化してCP-319,609
と呼ばれるラセミ混合物（CP-336,156とCP-335,992で構
成される）を形成する。モノスポリウム・オリバセウム
（Monosporium olivaceum）とタムノスチラム・ピリフ
ォルメ（Thamnostylum piriforme）は、CP-324,098にお
けるジアステレオマーの一方のみに作用し、下記のよう
な単一のジアステレオマー物質を生成する。

【００２７】

【化９】

【００２８】 カンニンガメラ・エチヌラタ ジアステレオ選択的ではない （Cunninghamella echinulata） タムノスチラム・ピリフォルメ ジアステレオ選択的−“望ましさ （Thamnostylum piriforme） の程度の低い”生成物（ＣＰ−３３ ５，９９２） モノスポリウム・オリバセウム ジアステレオ選択的−所望の生成物 （Monosporium olivaceum） （ＣＰ−３３６，１５６） 出発物質とこれら３種の有機体によって造り出される生
成物を、図１〜４に示すようなキラルＨＰＬＣによって
調べた。３種全ての微生物の反応の最終生成物を発酵ブ
ロスから単離し、それらのアイデンティティを確認する
ために、ＮＭＲ、ＭＳ、およびキラルＨＰＬＣによって
特性決定した。

【００２９】本発明を一般的な面に関して説明してきた
ので、次に特定の実施例を挙げて説明する。理解してお
かなければならないことは、本発明がこれらの実施例に
よって限定されることはなく、また本発明の範囲は特許
請求の範囲によって規定される、という点である。

【００３０】モノスポリウム・オリバセウム（Ｍｏｎｏ
ｓｐｏｒｉｕｍ ｏｌｉｖａｃｅｕｍ）ＡＴＣＣ３６３
００とタムノスチラム・ピリフォルメ（Ｔｈａｍｎｏｓ
ｔｙｌｕｍ ｐｉｒｉｆｏｒｍｅ）ＡＴＣＣ８９９２
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手することができる。こうし
て得られる培養物を適切な成長培地に加え、成長が起こ
るまで振盪しながらインキュベートする。このようにし
て調製した培養物を使用して斜面に植え付ける。これら
斜面の一部をマスター・ストック（ｍａｓｔｅｒ ｓｔ
ｏｃｋ）として凍結させる。それぞれの微生物を、斜面
から成長培地（組成を下記に示す）を含んだ２つのフラ
スコ中に植え付ける。約２２〜３２℃の範囲の温度で発
酵を行うが、最適の結果を得るためには、約２８℃で発
酵を行うのが好ましい。適切な有機もしくは無機緩衝液
を発酵培地に導入することにより、あるいは塩基を定期
的に加えることにより、培地のｐＨを約６〜７に調節す
る。微生物の良好な成長が４８〜７２時間以内に達成さ
れる。従来使用されている成長培地と同じ組成を有する
フレッシュな成長培地を収容したフェルンバッハ・フラ
スコ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ ｆｌａｓｋ）にフラスコの内
容物を移す。培地が変わると、化合物の収率および化合
物の生成速度が変わる。好ましい培地組成が実施例セク
ション（ｅｘａｍｐｌｅ ｓｅｃｔｉｏｎ）に示されて
いる。さらに１日間振盪した後、ラパマイシンを適切な
溶媒（たとえば、ジメチルスルホキシドやジメチルホル
ムアミド）中に溶解して得た無菌濾過溶液を加える。発
酵を１〜６日間続ける。発酵を約２日間継続するのが好
ましい。

【００３１】本発明の方法において使用するための適切
な成長培地は、同化可能炭素、同化可能窒素、および必
須ミネラルを含有した無機塩の供給源を含んでいる。一
般には、多くの炭化水素〔たとえばグルコース、マルト
ース、マンノース、スクロース、スターチ、グリセリ
ン、ミレットゼリー（ｍｉｌｌｅｔ ｊｅｌｌｙ）、お
よび大豆など〕を同化可能炭素の供給源として使用する
ことができる。同化可能窒素の供給源としては、酵母加
水分解産物、カゼイン加水分解産物、プライマリー酵母
（ｐｒｉｍａｒｙ ｙｅａｓｔ）、酵母抽出物、綿実
粉、大豆ソリッド、小麦麦芽、食肉エキス、ペプトン、
コーン・スティープ・リカー、およびアンモニウム塩等
の物質がある。培地中に混和することのできる無機塩栄
養物は、ナトリウム、鉄、マグネシウム、カリウム、コ
バルト、およびリン酸塩を生成する通常の塩である。当
然のことながら、一般には使用される技術が限定される
ことはない。

【００３２】適切な成長培地としては、（ａ）デキスト
ロース（２０ｇ）、酵母抽出物（５ｇ）、大豆粉（５
ｇ）、ＮａＣｌ（５ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（５ｇ）、およ
び蒸留水（１０００ｍｌ）を混和し、塩酸でｐＨを７．
０に調節した培地；（ｂ）デキストリン（１０ｇ）、牛
肉エキス（３ｇ）、アルダミンｐＨ（５ｇ）、Ｎ−Ｚア
ミンタイプＥ（５ｇ）、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ（０．５
ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．３７ｇ）、ＣａＣＯ３（０．
５ｇ）、および蒸留水（１０００ｍｌ）を混和して塩酸
でｐＨを７．１に調節し、次いで第二段階としてグルコ
ース（１０ｇ）、Ｈｙ−Ｃａｓｅ ＳＦ（２ｇ）、牛肉
エキス（１ｇ）、コーン・スティープ・リカー（３
ｇ）、および蒸留水（１０００ｍｌ）を混和してｐＨを
７．０に調節した培地；（ｃ）グルコース（１０ｇ）、
コーン・スティープ・リカー（６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４
（３ｇ）、ＣａＣＯ３（３．５ｇ）、大豆油（粗製品，
２．２ｍｌ）、酵母抽出物（２．５ｇ）、および蒸留
水（１０００ｍｌ）を混和し、塩酸でｐＨを７．０〜
７．３に調節した培地；（ｄ）麦芽シロップ（２０
ｇ）、大豆ミール（５ｇ）、カゼイン（１ｇ）、乾燥酵
母（１ｇ）、ＮａＣｌ（５ｇ）、および蒸留水（１００
０ｍｌ）を混和した培地；（ｅ）ラクトース（７５
ｇ）、ファーマメディア（酵母抽出物代用品， ４０
ｇ）、ＣａＣＯ３（１０ｇ）、Ｎａ２ＳＯ３（４ｇ）、
および蒸留水（１０００ｍｌ）を混和した培地；（ｆ）
ＩＳＰ＃３；（ｈ）ＩＳＰ＃４；および（ｉ）ＩＳＰ＃
５；などがある。手順 培養物： カンニンガメラ・エチヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎ
ｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）ＡＴＣＣ９
２４４とＡＴＣＣ３６１９０、モノスポリウム・オリバ
セウム（Ｍｏｎｏｓｐｏｒｉｕｍ ｏｌｉｖａｃｅｕ
ｍ）ＡＴＣＣ３６３００、およびタムノスチラム・ピリ
フォルメ（Ｔｈａｍｎｏｓｔｙｌｕｍ ｐｉｒｉｆｏｒ
ｍｅ）ＡＴＣＣ８９９２。

【００３３】 生体内変換 成長培地（植え付け段階及び生体内変換段階）： グルコース ２０ｇ／ｌ ｐＨ ７．０に 大豆粉または大豆ミール ５ 酵母抽出物 ５ ＮａＣｌ ５ Ｋ２ＨＰＯ４ ５ 植え付けと生体内変換に対して１２５ｍｌの三角フラス
コ１つ当たり２５ｍｌ。凍結貯蔵した培養物を、斜面か
ら１２５ｍｌの三角フラスコ中の上記培地２５ｍｌ中に
植え付け、振盪しながら２８℃で２〜３日インキュベー
トする。２．５ｍｌを三角フラスコ中の２５ｍｌフレッ
シユなブロス中に移し、さらに１日振盪する。ＣＰ−３
２４，０９８をＤＭＳＯ中に溶解して得た溶液を加え、
無菌状態で濾過して０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にす
る。追加の基質は１日間隔で供給することができる。振
盪しながら１〜６日間インキュベーションを続ける。

【００３４】抽出と精製 分液ロートにてブロスを同体積の酢酸エチルで２回抽出
した。１０００×ｇで５分間遠心分離にかけることによ
り相を分離させた後、上側の酢酸エチル相を慎重に取り
出し、溶媒を蒸発除去した。メタノールも抽出溶媒とし
て適切である。固相抽出と分取HPLCを使用して生成物を
精製することができる。

【００３５】キラルHPLCアッセイ カラム キラル OD, 4.6×250mm（ダイセ
ル，キラルテクノロジーズ） 流量 0.7ml/分 サンプルサイズ 20μl 濃度 0.1mg/ml 温度 30℃ 検出 UV, 220nmにて 移動相 100mlのエチルアルコール（USP, 脱
水処理したもの200プルーフ）＋900mlのヘキサン＋１ml
のN',N'-ジエチルアミン サンプルをエタノール中に溶解する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ３種の真菌類培養物による微生物生体内変換
を使用して生成される高速液体クロマトグラフィーのプ
ロフィールを示している。

【図２】 ３種の真菌類培養物による微生物生体内変換
を使用して生成される高速液体クロマトグラフィーのプ
ロフィールを示している。

【図３】 ３種の真菌類培養物による微生物生体内変換
を使用して生成される高速液体クロマトグラフィーのプ
ロフィールを示している。

【図４】 ３種の真菌類培養物による微生物生体内変換
を使用して生成される高速液体クロマトグラフィーのプ
ロフィールを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式 【化１】 で示される化合物を得るための、式 【化２】 で示される化合物の使用。
2. 【請求項２】 式IIの化合物を非選択的にＯ-脱メチル
   化させる、請求項１記載の使用。