JP2000288565A - 汚染環境浄化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 低コストで入手できる薬剤を用い、簡単な操
作で微生物群を保護して効率よく汚染環境を浄化するこ
とができる汚染環境浄化方法を提案する。 【解決手段】 培養槽１に微生物供給路５から植種用微
生物を添加した後、栄養素供給路６から有機物および栄
養塩類を添加し、必要により送気路７から空気または酸
素を送気するとともに、撹拌機８で撹拌しながら培養す
る。得られた微生物培養液は連絡路９を通して凝集槽２
に導入し、凝集剤供給路１０から無機凝集剤および／ま
たは有機凝集剤を添加するとともに、薬注路１１からｐ
Ｈ調整剤を添加し、撹拌機１２で撹拌して微生物のフロ
ックを形成する。得られた微生物フロック３を注入井４
から汚染地下水路１７に注入し、微生物により汚染物質
を分解する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、有害物質で汚染さ
れた土壌または地下水等の汚染環境を生物学的に浄化す
る汚染環境の浄化方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】有機塩素化合物等の化学物質その他の有
害物質により土壌または地下水等の環境が汚染される
と、その汚染は長期にわたって続き、また汚染が広範囲
に拡散するので、汚染環境の浄化が必要になる。このよ
うな有害物質で汚染された土壌または地下水を浄化する
場合、汚染から年数が経過していない、比較的範囲の狭
い高濃度の汚染に対しては物理化学的な処理が有効であ
るが、ある程度の時間が経過し、拡散や地下水の流れに
よって汚染物質が広範囲に広がった後の低濃度汚染に対
しては生物学的な浄化が効果的であると言われている。

【０００３】土壌または地下水中の有害物質を生物学的
に浄化するには、有機物や栄養塩および酸素などを汚染
サイトに添加し、対象汚染物質を分解できる微生物を現
場に生育させることが必要であり、また、場合によって
は温度やｐＨ等の環境条件の制御が必要な場合もある。
そして対象汚染物質が生物易分解性であり、その分解微
生物が現場サイトにある一定量以上存在する場合は、特
定の微生物を外部から添加せず、現場に土着する微生物
を処理に利用するのが一般的である。しかし、現場サイ
トに分解菌がほとんど存在しない場合や、汚染物質が生
物難分解性であり、汚染物質を基質とした増殖だけでは
高い分解効率が得られない場合や、その汚染物質をエネ
ルギー源や炭素源として増殖できる微生物が地球上に存
在しない場合などは、外部から特定の分解微生物を添加
し、処理の効率化を図ることが必要である。

【０００４】ところで特定の微生物を汚染サイトに注入
する場合、対象とする土壌または地下水中にはもともと
他の様々な生物が存在するため、これらが添加した微生
物の機能や生育を阻害する場合がある。中でも原生動物
による添加微生物の捕食は大きな問題であり、特にｆｌ
ａｇｅｌｌａｔｅやｃｉｌｉａｔｅと呼ばれる原生動物
は微生物を捕食しながら急速に増殖するため、数時間の
内に添加した微生物のほとんどを食べ尽くしてしまう場
合がある（Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｍｉｃｒｏ．Ｅｃｏｌ．，３０，ｐ６７−７
８）。

【０００５】現場環境下にもともと存在する微生物は、
増殖と原生動物による捕食が均衡を保っているか、ある
いは生物膜を形成したり、糸状性になったりすることに
よって原生動物による捕食を防ぎながら（Ｍ．Ｗ．Ｈａ
ｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，ｐ１９１０−１９１８）生育
していると考えられる。しかし、汚染サイトとは異なる
環境で培養された後に現場へ注入される微生物の場合、
原生動物の捕食に対する備えを持たないため、添加後速
やかに原生動物の餌食になってしまう可能性が高い。

【０００６】現場にて増殖可能なタイプの微生物であっ
ても、増殖速度よりも捕食される速度が大きければ、菌
数は時間と共に減少してしまう。増殖速度の方が捕食速
度より大きい場合でも、捕食される分、見かけの増殖速
度は低下する。いずれにしろ、汚染物質の処理効果は原
生動物の捕食によって大幅に低下してしまうことにな
る。さらに、もともと現場の環境下では増殖することが
できない、使い捨てタイプの分解微生物の場合、本来の
機能を十分に発揮する前に原生動物に捕食されて、添加
菌体量当たりの処理効果が著しく低下してしまう結果に
なる。

【０００７】このような、原生動物の捕食を防ぐ方法と
して、ポリビニルアルコールやポリアクリルアミド等の
高分子化合物を用いて微生物を包括固定化する方法が提
案されている（例えば特開平７−９７６７３号）。この
方法は高分子化合物の固化する力を利用して微生物を包
括固定化する方法であるが、この固定化の操作は複雑で
ありコストも高くなるという問題点がある。

【０００８】このほかの原生動物の捕食を防止する方法
として、多孔質担体とともに、あるいは担体を用いるこ
となく、微生物を吸水性ポリマーに保持させて汚染環境
に注入して浄化する方法が提案されている（例えば特開
平７−１２４５４３号）。この方法は吸水性ポリマーの
吸水力を利用して微生物および場合によってはさらに多
孔質担体を保持させるものであるが、吸水性ポリマーと
して水に不溶のゲル状親水性ポリマーを使用するため、
コスト高になるほか、保持の操作も熟練を要するという
問題点がある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、低コ
ストで入手できる薬剤を用い、簡単な操作で微生物を保
護して効率よく汚染環境を浄化することができる汚染環
境浄化方法を提案することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は次の汚染環境浄
化方法である。 （１） 汚染物質浄化能を有する微生物を、無機凝集剤
および／または有機凝集剤により凝集させ、フロックを
形成した状態で汚染環境に注入して浄化することを特徴
とする汚染環境浄化方法。 （２） 栄養物質および／またはインデューサを担持し
た担体と汚染物質浄化能を有する微生物とを混合し、無
機凝集剤および／または有機凝集剤により凝集させ、フ
ロックを形成した状態で汚染環境に注入して浄化するこ
とを特徴とする汚染環境浄化方法。 （３） フロックが１０〜５００μｍの粒径を有する上
記（１）または（２）記載の方法。

【００１１】本発明の汚染環境浄化方法においては、汚
染物質浄化能を有する微生物を、無機凝集剤および／ま
たは有機凝集剤により凝集させ、フロックを形成した状
態で汚染環境に注入することにより汚染物質を分解し、
汚染環境を浄化する。この場合、栄養物質および／また
はインデューサを担持した担体と汚染物質浄化能を有す
る微生物とを混合し、凝集させたフロックを注入する
と、栄養物質および／またはインデューサを必要とする
系においても汚染物質の浄化を行うことができる。上記
のフロックは１０〜５００μｍの粒径とすることにより
原生動物による捕食を防止し、かつ地下水路等のフロッ
クによる閉塞を防止することができる。

【００１２】本発明において浄化の対象となる汚染環境
は、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン（ＴＣ
Ｅ）、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン、ｔｒａｎｓ
−１，２−ジクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレ
ン、ビニルクロリド、塩化メチル、ジクロロメタン、ク
ロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、
１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタ
ン、１，１，２−トリクロロエタン、１，３−ジクロロ
プロペン、１，２−ジクロロプロパン、クロロベンゼ
ン、ジクロロベンゼン、ＰＣＢ、ダイオキシン類等の有
機塩素化合物；ベンゼン、エチルベンゼン、トルエン、
キシレン、多環芳香族化合物、重金属などの有害物質に
より汚染された土壌または地下水などの環境である。こ
のような環境には汚染源が河川や湖沼である場合には、
これらの河川や湖沼も含まれる。

【００１３】このような汚染環境を浄化するために添加
する微生物は、汚染環境に含まれる汚染有害物質を分解
または無害化して浄化する汚染物質浄化能を有する微生
物である。このような微生物はその後の効果の持続性の
観点から次の２つのタイプに分けることができる。その
一つは、現場にて増殖でき、一度注入すれば処理効果が
継続するタイプのものである。それに対し、他の一つは
現場では増殖できず、添加した微生物が一定の機能を発
揮した後、やがてはその機能を失う使い捨てタイプのも
のである。

【００１４】本発明で使用する微生物は、上記二つのい
ずれのタイプのものでもよく、自然界から単離された純
粋培養菌、純粋培養菌の数種類を混合した微生物群、対
象汚染物質に対する高い分解活性を示すような条件で集
積された混合微生物、自然界に存在する微生物よりも高
い分解能を示すように遺伝子組換え操作によって改良さ
れた遺伝子組換え体、およびこれらの混合物などが使用
できる。

【００１５】上記遺伝子組換え体としては、例えばトリ
クロロエチレン（ＴＣＥ）を分解できるように改変され
た遺伝子組換え体であるPseudomonas putida KN1-10A
（環境工学研究論文集、Ｖｏｌ．３３、ｐ１６５−１７
５、１９９６）、Ralstonia sp. KN1-200A（Pseudomona
s putida KN1-200Aが改名されたもの、Pseudomonas put
ida KN1-200Aについては特開平１１−１８７７３号に詳
しく記載されている）、Ralstonia sp. KN1-210A（Pseu
domonas putida KN1-210Aが改名されたもの、Pseudomon
as putida KN1-210Aについては特開平１１−１８７７４
号に詳しく記載されている）などがあげられる。これら
の組換え体はＴＣＥを酸化分解できる酵素をコードする
フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子がフェノール誘導な
しに発現するように改変された遺伝子組換え体である。
この組換え体はＴＣＥを基質として増殖することはでき
ないため、土壌または地下水に添加した菌体は一定量の
ＴＣＥを分解した後、死滅する。

【００１６】このような有用な機能を持った特定の微生
物を自然環境に添加する際、それらを捕食し効果を減少
させてしまうのは原生動物であり、その中で特に問題と
なるのはｆｌａｇｅｌｌａｔｅやｃｉｌｉａｔｅなどで
ある。これらは微生物を捕食することによって急速に増
殖していくが、大きさが数十μｍ程度であるため、それ
以上の大きさの生物は物理的に捕食できない（Ｎ．Ｅ．
Ｋｉｎｎｅｒ．Ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，ｐ６１８−６２
５）。そこで本発明では、大きさが１−２μｍの微生物
であっても、凝集させることによって、大きさが１０μ
ｍ以上のフロックになれば、これらの原生動物に捕食さ
れないという新しい知見に基づき、凝集によりフロック
を形成させて汚染環境に注入する。

【００１７】微生物の凝集に使用する凝集剤は、無機凝
集剤および有機凝集剤のいずれか一方または両者の組合
せであり、微生物を凝集してフロックを形成できるもの
であればよい。このような凝集剤としては一般の水処理
に使用されている無機凝集剤および／または有機凝集剤
がそのまま使用できるが、これらの中から微生物の凝集
に適したものを選択する。

【００１８】無機凝集剤としては硫酸バンド、ポリ塩化
アルミニウム等のアルミニウム塩；塩化鉄、硫酸鉄等の
鉄塩などが好ましいが他の無機凝集剤でもよい。有機凝
集剤としては、下記の非イオン性ビニルモノマー（Ａ）
を単独重合もしくは共重合したノニオン性高分子凝集
剤；下記のアニオン性ビニルモノマー（Ｂ）を単独重合
もしくは共重合したアニオン性高分子凝集剤、または下
記のアニオン性ビニルモノマー（Ｂ）と下記の非イオン
性ビニルモノマー（Ａ）とを共重合したアニオン性高分
子凝集剤；下記のカチオン性ビニルモノマー（Ｂ）を単
独重合もしくは共重合したカチオン性高分子凝集剤、ま
たは下記のカチオン性ビニルモノマー（Ｂ）と下記の非
イオン性ビニルモノマー（Ａ）とを共重合したカチオン
性高分子凝集剤などがあげられる。その他にも、アミジ
ン単位を有するカチオン性高分子凝集剤；ポリエチレン
イミン、ジメチルアミン／エピクロロヒドリンの縮合
物、またはジシアンジアミド／ホルムアルデヒドの縮合
物等を含むポリアミン系カチオン性高分子凝集剤；キト
サン、カチオン化デンプン、カチオン化セルロース等の
天然ポリマー；化学修飾した天然ポリマーからなるカチ
オン性高分子凝集剤；Ｎ−ビニルカルボン酸アミド、Ｎ
−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド等を必
須モノマーとする重合体の酸またはアルカリ変性物から
なるポリビニルアミン系カチオン性高分子凝集剤なども
あげられる。

【００１９】前記（Ａ）〜（Ｃ）の具体的なモノマーは
次の通りである。なお、「（メタ）アクリ」は「アク
リ」または「メタクリ」を示す。 （Ａ）非イオン性ビニルモノマー （メタ）アクリルアミド、ビニルメチルエーテル、ビニ
ルエチルエーテルなど。 （Ｂ）アニオン性ビニルモノマー （メタ）アクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチル
プロパンスルホン酸、ビニルスルホン酸、スチレンスル
ホン酸、イタコン酸、マレイン酸、フマール酸、アリー
ルスルホン酸およびこれらの塩など。

【００２０】（Ｃ）カチオン性ビニルモノマー 下記（Ｃ−１）〜（Ｃ−４）の群から選ばれるもの。 （Ｃ−１）第４級窒素含有（メタ）アクリレート ２−（メタ）アクリロイロキシエチルトリメチルアンモ
ニウムクロリド、２−（メタ）アクリロイロキシエチル
トリメチルアンモニウムメトサルフェート、２−（メ
タ）アクリロイロキシエチルトリエチルアンモニウムエ
トサルフェート、および３−（メタ）アクリロイロキシ
プロピルジメチルエチルアンモニウムメトサルフェート
等の（メタ）アクリロイロキシアルキルトリアルキルア
ルミニウム塩；３−メタクリロイロキシ−２−ヒドロキ
シプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、３−メタ
クリロイロキシ−２−ヒドロキシプロピルメチルジエチ
ルアンモニウムクロリド、および３−メタクリロイロキ
シ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムメ
トサルフェート等の（メタ）アクリロイロキシヒドロキ
シアルキルトリアルキルアンモニウム塩など。

【００２１】（Ｃ−２）第３級窒素含有（メタ）アクリ
レートと酸との塩 ２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート硫酸
塩、および２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレ
ート塩酸塩等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アク
リレートの塩；３−ジメチルアミノ−２−ヒドロキシプ
ロピル（メタ）アクリレート塩酸塩、および３−ジエチ
ルアミノ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレー
ト硫酸塩等のジアルキルアミノヒドロキシアルキル（メ
タ）アクリレートの塩など。

【００２２】（Ｃ−３）第４級窒素含有（メタ）アクリ
ルアミド ３−アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムク
ロリド、および２−（メタ）アクリロイルキシアミノエ
チルトリメチルアンモニウムメトサルフェート等の（メ
タ）アクリルアミドアルキルトリアルキルアンモニウム
塩；３−（メタ）アクリロイルアミノ−２−ヒドロキシ
プロピルトリメチルアンモニウムクロリド、および３−
（メタ）アクリロイルアミノエチルトリメチルアンモニ
ウムメトサルフェート等の（メタ）アクリルアミドヒド
ロキシアルキルトリアルキルアンモニウム塩など。

【００２３】（Ｃ−４）第３級窒素含有（メタ）アクリ
ルアミドと酸との塩 ２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド塩酸
塩、および２−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリ
ルアミド硫酸塩等のジアルキルアミノアルキル（メタ）
アクリルアミドの塩；３−ジメチルアミノ−２−ヒドロ
キシプロピル（メタ）アクリルアミド酢酸塩、および３
−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）ア
クリルアミド硫酸塩等のジアルキルアミノヒドロキシア
ルキル（メタ）アクリルアミドの塩など。

【００２４】凝集操作は微生物を含む懸濁液に上記の無
機凝集剤および／または有機凝集剤を添加して撹拌し、
フロックを形成させる。この場合の凝集は水処理工程で
行われる通常の凝集操作とは異なり、凝集汚泥の沈降性
や脱水性の良さ、または上澄み液の清澄性などが要求さ
れるわけではなく、ある程度の大きさ、例えば１０〜５
００μｍのフロックを単に形成させればよいだけなの
で、多量の凝集剤の注入や細かい凝集条件の設定は必要
としない。むしろ、土壌または地下水などの汚染環境に
注入することから、必要以上に大きなフロックを形成さ
せることは注入井戸の閉塞につながるため、注入する現
場の土壌の性状にもよるが、フロックの大きさは最大で
も５００μｍにするのが好ましい。

【００２５】このように凝集剤の添加量および撹拌条件
は一般的には粒径１０〜５００μｍ好ましくは３０〜３
００μｍのフロックを生成するように決めることがで
き、これらの値は微生物の種類、性状、凝集剤の種類、
撹拌条件等により任意に決めることができる。一般的に
は無機凝集剤の添加量は菌体乾燥重量に対して１〜３０
０重量％、好ましくは１０〜１００重量％、有機凝集剤
の添加量は菌体乾燥重量に対して１〜１００重量％、好
ましくは２〜２０重量％とするのが好適である。また撹
拌条件は２０〜１０００ｒｐｍ、好ましくは５０〜５０
０ｒｐｍの撹拌を０．５〜３０分間、好ましくは１〜１
０分間行うのが好ましい。

【００２６】微生物が増殖に際して栄養物質および／ま
たはインデューサを必要とする場合は、上記のフロック
形成に際して、栄養物質および／またはインデューサを
担持した担体と微生物とを混合した状態で無機凝集剤お
よび／または有機凝集剤を添加して凝集を行い、フロッ
クを形成するのが好ましい。

【００２７】栄養物質は添加した微生物が栄養源として
利用できる物質であり、汚染物質が栄養源となる場合、
あるいは汚染物質以外の栄養源が必要な場合でもそのよ
うな栄養源が環境中に存在するときは添加の必要はない
が、このような栄養源が存在しない場合、あるいは不足
する場合には添加することができる。このような栄養物
質としては、微生物の種類、性状等により異なるが一般
的には炭素源としての有機物、ならびにミネラル源とし
ての無機物などがあげられる。

【００２８】インデューサは浄化の対象となる有害物質
の分解を行うために必要な他の物質である。微生物の中
には浄化の対象となる有害物質を単独では分解できない
ものがあり、類似の構造ないし結合を有する類似物質が
共存する場合にこれらの類似物質とともに有害物質を分
解できる場合、これらの類似物質をインデューサとして
添加することができる。このようなインデューサも微生
物が必要としない場合、あるいはすでに汚染環境中に存
在する場合には添加の必要がないが、存在しない場合、
あるいは不足する場合には微生物とともに添加するのが
好ましい。

【００２９】本発明ではこれらの栄養物質および／また
はインデューサを含む担体を微生物と混合してフロック
を形成する。栄養物質およびインデューサの添加量は微
生物が汚染有害物質を分解するのに必要な量であり、実
験的に確認することができる。これらを担持する担体と
しては長期にわたって栄養物質およびインデューサを保
持し、微生物が有効に利用できるように担持する多孔質
物質が好ましい。この場合担体は微生物を担持できるも
のであってもよい。このような担体としては、活性炭、
ゼオライト、イオン交換樹脂、多孔質シリカなどがあげ
られる。これらの担体の形状、粒径も目的に応じて任意
に選ぶことができるが、粒径として１〜５０μｍ、好ま
しくは５〜２０μｍが望ましい。

【００３０】微生物あるいは微生物と栄養物質および／
またはインデューサを含む担体を、無機および／または
有機凝集剤により凝集させてフロックを形成すると、微
生物同士が凝集剤により凝集したフロック、あるいは微
生物同士もしくは微生物と担体とが凝集剤により凝集し
たフロック、さらには微生物が担持された担体が凝集し
たフロックなどの混合物が形成される。

【００３１】これらのフロックは従来の有機化合物で微
生物を包括固定したものや、吸水性ポリマーに微生物を
吸着させたものとは異なる構造、または形態を有してお
り、そのまま汚染環境に注入して浄化を行うことができ
る。注入の方法は形成されたフロックを汚染された土壌
表面に散布する方法、注入管から土壌中に注入する方
法、地下水源に注入する方法などがある。浄化の方法は
これらのフロックを注入するだけでよい場合もあるが、
微生物の種類によっては水、酸素、栄養源等を供給する
こともできる。また１回の注入により完全に浄化できな
い場合には、フロックの注入を繰り返すこともできる。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、汚染物質浄化能を有す
る微生物を、無機凝集剤および／または有機凝集剤によ
り凝集させ、フロックを形成した状態で汚染の環境に注
入して浄化するようにしたので、低コストで入手できる
薬剤を用い、簡単な操作で微生物を保護して効率よく汚
染環境を浄化することができる。

【００３３】

【発明の実施の形態】本発明の方法を図面を用いて説明
する。図１は微生物フロックを汚染地下水に注入して浄
化する例を示す実施例の模式的断面図であり、１は培養
槽、２は凝集槽、３は微生物フロック、４は注入井、１
５は表面土壌、１６は汚染土壌、１７は汚染地下水路、
１８は深土層である。注入井４は表面土壌１５からその
下端が汚染地下水路１７に到達するように形成されてい
る。

【００３４】図１の方法では、培養槽１に微生物供給路
５から植種用微生物を添加した後、栄養素供給路６から
培養する微生物が資化できる有機物および栄養塩類を添
加し、必要により送気路７から空気または酸素を送気す
るとともに、撹拌機８で撹拌しながら培養する。培養は
微生物の増殖に最適な温度に制御しながら行うのが好ま
しい。このようにして得られた微生物培養液は連絡路９
を通して凝集槽２に導入し、凝集剤供給路１０から無機
凝集剤および／または有機凝集剤を添加するとともに、
薬注路１１からｐＨ調整剤を添加し、撹拌機１２で撹拌
して微生物のフロックを形成する。得られた微生物のフ
ロック３を、ポンプ１３により注入井路１４を通して注
入井４に導入し、注入井４の下端から汚染地下水路１７
に注入する。

【００３５】このようにして汚染地下水路１７中に注入
された微生物フロック３は、地下水の流れ（図１では、
左から右）に乗って下流に拡散するとともに、汚染土壌
１６中にも入り込む。このようにして汚染地下水路１７
および汚染土壌１６に注入された微生物の作用により汚
染環境中の汚染物質が分解される。この場合、注入され
るフロックはある程度の大きさを有しているので原生動
物などにより捕食されることはなく、汚染環境中に長く
とどまって汚染物質を長期間にわたり分解するので、効
率よく汚染環境を浄化することができる。

【００３６】図１では、培養槽１と凝集槽２とを別々に
設けているが、微生物を回分式で培養したのち凝集を行
うことにより１個の槽で培養と凝集とを行うこともでき
る。また撹拌機１２を省略して、撹拌は混合液を移送す
る系路中で行うこともできる。

【００３７】

【実施例】次に本発明の実施例について説明する。製造
例で使用したプラスミドおよび微生物は次の通りであ
る。

【００３８】《ラルストニア ｓｐ． ＫＷＩ−９（Ra
lstonia sp. KWI-9）》フェノール資化能を有し、トル
エン資化能を有さない塩素化エチレン分解性菌株であ
る。塩素化エチレン分解性はフェノールの共存により著
しく阻害される。ラルストニア ｓｐ． ＫＷＩ−９
は、シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９（Pseudomona
s putida KWI-9）が改名されたものであり、シュードモ
ナス プチダＫＷＩ−９菌株は通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭＢＰ−６３５６（微
工研菌寄第Ｐ−１３１０９号より移管）の微生物受託番
号で寄託されており、その菌株的性質および培養方法等
については特開平６−７０７５３号に記載されている。 《E. coli S17-1株》IncP系プラスミドＲＰ４を染色体
上に内在する大腸菌であって、作成方法はBIO/TECHNOLO
GY 1, 784-791(1983)に記載されており、またUS. Depar
tment of Agriculture, Northern Regional Research C
enterに寄託されている（Accession No. B-15483, US.
Patent 4,680,264)。 《pTrc99A》タンパク質の発現ベクターpKK233-2（ファ
ルマシア社の製品コード番号27-4935-01）の誘導体。こ
のプラスミドはファルマシア社から市販されており、製
品コード番号は27-5007-01である。

【００３９】製造例１ 《１．Ralstonia sp. KN1-200Aの作製》Ralstonia sp.
KWI-9の染色体上にコードされている塩素化エチレン分
解能を有するフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群を、
図２に示す。塩素化エチレン分解のための必須遺伝子
は、pheAからpheEまでの５つの遺伝子群（塩素化エチレ
ン分解遺伝子群）である。またpheA上流のpheZは塩素化
エチレン分解促進遺伝子である。pheZの上流に、下記方
法によりtacプロモーターを導入した。そしてRalstonia
sp. KN1-200Aを、以下に示すように相同的組換えによ
って作製した（図２参照）。

【００４０】１）相同的組換えに必要なpheZ上流の相同
部分の取得pheZ 上流の１．１ｋｂをＰＣＲで合成するために、以下
のプライマーペアを用い、Ralstonia sp. KWI-9の染色
体をテンプレートとした。 Upper Primer: 5'-GGG GAA TTC GGG GGA GGG GGT AAG G
GG GTG GTG-3' Lower Primer: 5'-GGG CCC GGG AAG AGC GTG CCA GCT G
GC GCA AAC-3' (Upper PrimerのアンダーラインはEcoRIサイト、Lower
PrimerのアンダーラインはSmaIサイトを示す。)

【００４１】２）ＰＣＲ合成された相同部分の１．１ｋ
ｂの EcoRI-SmaI 断片のpKNA82（図３参照）への挿入 ＰＣＲ合成された相同部分の１．１ｋｂの EcoRI-SmaI
断片（図２においてＦ１で示されている断片）は、左右
にPacIサイトを有するプラスミドベクターpKNA82のEcoR
I-SmaIの部分に挿入した。

【００４２】３）相同的組換えに必要なpheZおよびpheA
の一部分を有する相同部分の取得pheZ およびpheAをＰＣＲ合成により取得するため、以下
のプライマーペアーを用いて、Ralstonia sp. KWI-9の
染色体をテンプレートとした。 Upper Primer: 5'-GGG GGA TCC CGC AAT AGA GGC CAT A
CC GCC CA-3' Lower Primer: 5'-CGC GGA TCC GGC GGT TTC CTC AGG C
GG CAA GGC-3' (Upper PrimerおよびLower PrimerのアンダーラインはB
amHIサイトを示す。)

【００４３】合成されたDNA断片は、BamHIとSalIで消化
し、pheZの開始点からpheA中のSalIサイトまでの１ｋｂ
の BamHI-SalI 断片（図２においてＦ２で示されている
断片）をもう一つの相同部分とした。

【００４４】４）ＰＣＲ合成された相同部分の１ｋｂの
BamHI-SalI 断片のpKNA82への挿入 ＰＣＲ合成された相同部分の１ｋｂの BamHI-SalI 断片
（Ｆ２）は、前記２）ですでに挿入されたEcoRI-SmaI
断片（Ｆ１）に続いてpKNA82の BamHI-SalIに挿入し
た。

【００４５】５）相同な断片に挟まれたSmaI-BamHIサイ
トへのtacプロモーターの挿入 Ｆ１およびＦ２の２個の断片が挿入されたpKNA82におい
て、まず左側（Ｆ１）の相同部分の右端のSmaIサイトに
HindIIIリンカー（d(pCAAGCTTG)）を挿入した。次に、
このプラスミドをHindIIIおよびBamHIで切断し、この部
分に以下のtacプロモーター（二本鎖ＤＮＡ、表示は一
本鎖ＤＮＡ）をHindIIIおよびBamHIで切断後挿入した。 5'-AAG CTT ACT CCC CAT CCC CCT GTT GAC AAT TAA TCA
TCG GCT CGT ATA ATG TGT GGA ATT GTG AGC GGA TAA CAA TTT CAC AC
A GGA AAC AGG ATC C-3' （アンダーライン部はHindIIIおよびBamHIサイトを示
す。）

【００４６】６）tacプロモーターを含む相同部分のpMO
K180への挿入tac プロモーターを含む相同部分は、PacIで切り出し、
図２に示すpMOK180のPacIサイトに挿入した。作製され
たプラスミドは、E. coli S17-1株に導入した後、下記
のようにしてRalstonia sp. KWI-9と接合し、相同的組
換えによってtacプロモーターが染色体上のpheZ上流に
組み込まれた組換え体Ralstonia sp. KN1-200Aを選出し
た。

【００４７】７）染色体上への挿入 相同的組換えを行う際には、供与菌のE. coli S17-1に
上記６）のtacプロモーターを含むpMOK180プラスミドを
導入後、ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス
５ｇおよびＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１ literに溶解）
で、３７℃で一晩培養し、同時に受容菌であるRalstoni
a sp. KWI-9株を３０℃で、ＬＢ培地で一晩培養し、各
々の培養液０．５ｍｌから菌体を遠心分離で集菌した。
これらの菌体は、生理食塩水（０．８％ＮａＣｌ）１ｍ
ｌで懸濁、混合した上で、再び遠心分離で集菌、上澄み
を捨て、生理食塩水１ｍｌで洗浄した。この洗浄操作を
再び繰り返し、沈殿させた後、混合菌体は５０μｌの生
理食塩水に懸濁させ、ＬＢ培地上の直径２５ｍｍ、孔径
０．２２μｍの滅菌ミリポアフィルター上に滴下させ、
３０℃で１０時間接合させた。その後、フィルター上の
菌体を１ｍｌの生理食塩水に懸濁させ、希釈液を無機塩
類、フルクトース２０ｍＭおよびカナマイシン１００μ
ｇ／ｍｌを含む寒天培地に塗布し、３０℃で３〜４日間
培養し、前記プラスミドすべてが染色体に挿入された菌
株を選出した。

【００４８】８）Ralstonia sp. KN1-200Aの選出 上記７）で作製された菌株をＬＢ液体培地で一晩培養
後、希釈液を２０μｇ／ｍｌのＸガル（すなわち５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクト
シド）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、青いコロニーに混
じって観察された白いコロニーをpMOK180が抜け落ちた
菌株として選出した。この中から、０．１Ｍのカテコー
ルをスプレーすることによって黄変する菌株（tacプロ
モーターの働きによってカテコール−２，３−オキシゲ
ナーゼをコードするpheFが発現するため）を、tacプロ
モーターがpheZ上流に挿入されたRalstonia sp. KN1-20
0Aとして選出した。

【００４９】９）pKNA82の作製（図３参照） ファルマシア製のpTrc99AのlacIqおよびtrcプロモータ
ー部分を、EcoT22IおよびNcoIで切断、削除し、得られ
た断片をＴ４ポリメラーゼで両端を平滑化した後、PacI
リンカー(d(pTTAATTAA))を挿入した。上記プラスミドの
マルチクローニングサイト内のHindIIIサイトをHindIII
で切断、Ｔ４ポリメラーゼで平滑化処理し、ここにもう
一つのPacIリンカー(d(pGTTAATTAAC))を挿入した。この
プラスミドをpKNA82とした。

【００５０】１０）pMOK180の作製 pMOK180は、環境工学研究論文集 Vol. 33, pp165-175
(1996)に記載された方法により作製した。pMOK180はpBR
322由来のori遺伝子を使用し、可動化に必要な遺伝子は
pKT240のmobA、mobB、oriTを使用した。またマーカーと
しては、pCH110由来のgptプロモーターおよびlacZを含
む断片を利用した。

【００５１】実施例１、比較例１ 図４は実施例において用いた浄化装置の試験装置を示す
フロー図である。図４において、２１は処理槽（内径４
０ｍｍ、高さ７５０ｍｍ、有効容積９４２ｍｌ）であ
り、内部に平均粒径０．３５ｍｍ、比重２．６ｇ／ｃｍ
³、空隙率０．４２の土壌２２が充填されている。処理
槽２１の下部には原水路２３およびこれに合流する菌体
注入路２４が連絡し、上部に処理水路２５が連絡してい
る。

【００５２】汚染物質をトリクロロエチレン（ＴＣＥ）
とし、前述の製造例１で得た遺伝子組換え体Ralstonia
sp. KN1-200A株を用いて以下の浄化試験を行った。

【００５３】１）菌体の調製および凝集方法 ＬＢ培地で培養したRalstonia sp. KN1-200A株をリン酸
緩衝液（５ｍＭ ＰＯ ₄、ｐＨ７．０）で遠心洗浄した
後、再び新鮮なリン酸緩衝液に懸濁させた。これを未凝
集菌体懸濁液（菌体濃度、３２００ｍｇ／Ｌ）とした。
この菌体懸濁液にｐＨが７．０付近となるように制御し
ながら、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ）を３０００
ｍｇ／Ｌ添加し、菌体を凝集させた。これを凝集菌体懸
濁液（ゆるやかに撹拌し、フロックを分散させた状態で
の菌体濃度は凝集前と同じ）とした。

【００５４】２）Ralstonia sp. KN1-200Aの生菌数測定 Ｒ２Ａ寒天培地に数段階希釈したサンプル液を塗布し、
３０℃で培養した。１週間後、生育したコロニーをカウ
ントすることによって、Ralstonia sp. KN1-200A株の生
菌数を求めた。なお、他の微生物が共存する系では、コ
ロニーの形態からRalstonia sp. KN1-200A株のコロニー
と他の微生物のコロニーとを区別し、測定した。また、
凝集させた菌体を含むサンプルの場合は、事前に超音波
処理（５０Ｗ、３ｍｉｎ）を行い、フロックを分散させ
た。

【００５５】３）原生動物の個体数の定量 サンプル液に１／１０容量の１０％グルタルアルデヒド
水溶液を添加し、固定化のため１０分間反応させた。次
に、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニル
インドール（4',6'-diamidino-2-phenylindole））溶液
（３００μｌ／ｍｌ）を１／１０００容量添加し、さら
に１０分間反応させた。この液を孔径０．８μｍのポリ
カーボネートフィルター（ニュークリポア社製）でろ過
し、原生動物を捕捉した。このフィルターを蛍光顕微鏡
で観察し、ＤＡＰＩに染まった原生動物の個体数をカウ
ントした。ここでは、大きさが３〜１０μｍのものだけ
を原生動物として測定した。

【００５６】４）無機培地（滅菌済み）中のＴＣＥ分解
実験 無機培地Ｂａｓａｌ ｓａｌｔ ｍｅｄｉｕｍ（ＢＳ
Ｍ）１０ｍＬを１５７ｍＬ容ガラスバイアル瓶に添加
し、オートクレーブ滅菌した。未凝集菌体懸濁液（比較
例）、または凝集菌体懸濁液（実施例）を液中の菌体濃
度が１５０ｍｇ／Ｌとなるように添加し、テフロンコー
トブチルゴムセプタムで栓をした後、アルミシールで密
閉した。液中の濃度が約５０ｍｇ／ＬとなるようにＴＣ
Ｅの飽和水溶液をセプタムを通して、ガラスシリンジで
注入した後、ロータリーシェーカーを用いて振とう培養
した（３０℃）。定期的に、バイアル中のヘッドスペー
スガスをサンプリングし、ガスクロマトグラフィーを使
ってＴＣＥ濃度を測定した。結果を図５に示す。

【００５７】５）原生動物共存水道水中でのＴＣＥ分解
実験 脱塩素水道水（活性炭に通水することによって残留塩素
を除去した水道水）約１００ｍＬを加えた容量１５７ｍ
Ｌのガラスバイアルビンに未凝集菌体懸濁液、または凝
集菌体懸濁液を最終の液中濃度が２．５ｍｇ／Ｌとなる
ように添加した。予め、Ｆｉｌｌ＆Ｄｒａｗ方式で原生
動物を培養しておいた水道水（１５７ｍＬガラスバイア
ルビンを脱塩素水道水で満たし、Ralstonia sp. KN1-20
0A株を２．５ｍｇ／Ｌ添加し、毎日バイアル中の液の１
／３を菌体２．５ｍｇ／Ｌを含む脱塩素水道水に入れ換
えるという操作を約１か月継続したもの。この液中の原
生動物の個体数は約２×１０⁴Ｎ／ｍｌ）を４０ｍＬ添
加し、残りのスペースを脱塩素水道水で満たした。テフ
ロンコートブチルゴムセプタムで栓をし、アルミシール
で密閉した後、液中のＴＣＥ濃度が約５００μｇ／Ｌと
なるようにＴＣＥの飽和水溶液をセプタムを通して、ガ
ラスシリンジで注入した。このバイアルを２０℃の室内
で静置し、定期的にバイアル中の液をセプタムを通して
サンプリングし、ペンタンを用いてＴＣＥを抽出した
後、ガスクロマトグラフィーを使ってＴＣＥ濃度を測定
した。結果を図６および図７に示す。

【００５８】６）土カラム中でのＴＣＥ分解実験 図４の試験装置に川砂（粒径０．３５ｍｍ）を充填した
後、ＴＣＥ約５００μｇ／Ｌを含んだ脱塩素水道水をＨ
ＲＴ＝１０ｄで通水した。約３０日間、予備通水を行っ
た後、菌体懸濁液を３〜４日に一度、液中の平均濃度が
２．５ｍｇ／Ｌとなるように菌体注入路２４から注入し
た。カラムは３本同じものを用意し、カラムＡには未凝
集菌体を、カラムＢには凝集菌体を添加し、カラムＣは
コントロールとして菌体を添加しなかった。結果を図８
に示す。

【００５９】７）結果 滅菌した無機培地中でのＴＣＥ分解実験 図５の結果からわかるように、未凝集菌体、凝集菌体と
もに１２０ｈｒで約５４ｍｇ／ＬのＴＣＥを分解し、両
者のＴＣＥ分解能に差はなかった。この実験では、バイ
アルを振とうしたため、フロックが若干分散し、その大
きさは２０〜５０μｍであった。

【００６０】原生動物共存水道水中でのＴＣＥ分解実
験 図６および図７の結果からわかるように、未凝集菌体
は、２４ｈｒ後、初期濃度５００μｇ／ＬのＴＣＥを４
１０μｇ／Ｌまで分解したが、それ以降はＴＣＥ濃度に
変化はなかった。この時の液中のRalstonia sp. KN1-20
0A株の生菌数は０〜２４ｈｒの間はほとんど変化が見ら
れなかったのに対し、２４〜４８ｈｒの間に約１００分
の一まで低下していた。また、液中の原生動物の個体数
は菌数の急激な低下が見られた期間に、急激に増加して
おり、これらの原生動物がRalstonia sp. KN1-200A株を
捕食することによって増殖したことが確認された。それ
に対して、凝集菌体（この実験での菌体フロックの大き
さは２０〜３００μｍであった）の場合、２４ｈｒ経過
した時点でのＴＣＥ分解量は未凝集菌体とほぼ同じであ
ったが、それ以降もＴＣＥ分解は継続し、１２０ｈｒ経
過後にはＴＣＥは９８μｇ／ｌまで低下した。したがっ
て、凝集菌体が１２０ｈｒに分解したＴＣＥの量は未凝
集菌体の約４倍であった。凝集菌体の場合、生菌数の急
激な低下や原生動物の個体数の顕著な増加も見られなか
ったことから、菌体を凝集させることによって原生動物
の捕捉を防ぎ、菌体のＴＣＥ分解量が向上したことが明
らかとなった。

【００６１】土カラム中でのＴＣＥ分解実験 図８の結果からわかるように、未凝集菌体をカラムに添
加した場合、５００μｇ／ＬのＴＣＥを約１１０μｇ／
Ｌ分解することができ、この能力は３か月以上安定して
いた。菌体を凝集させた場合、実験開始から２５日経過
した以降、実験を終了した１６０日経過後まで、処理水
ＴＣＥ濃度は１００μｇ／Ｌ付近で安定していた。上で
述べた回分実験同様、未凝集の場合よりもＴＣＥ分解量
は約４倍増加し、菌体凝集法が土壌が存在する系でも有
効であることが確認された。この実験での凝集菌体フロ
ックの大きさは１０〜５００μｍであったが、実験期間
を通じてカラム入口圧は未凝集菌体添加カラムと未凝集
菌体添加カラムで差はなく、菌体を凝集させることによ
る土壌の閉塞も認められなかった。

【００６２】

【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プライマーDNA 配列の特徴 存在位置：4..9 他の情報：EcoRIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 GGGGAATTCG GGGGAGGGGG TAAGGGGGTG GTG 33

【００６３】 配列番号：2 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プライマーDNA 配列の特徴 存在位置：4..9 他の情報：SmaIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 GGGCCCGGGA AGAGCGTGCC AGCTGGCGCA AAC 33

【００６４】 配列番号：3 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プライマーDNA 配列の特徴 存在位置：4..9 他の情報：BamHIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 GGGGGATCCC GCAATAGAGG CCATACCGCC CA 32

【００６５】 配列番号：4 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プライマーDNA 配列の特徴 存在位置：4..9 他の情報：BamHIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 CGCGGATCCG GCGGTTTCCT CAGGCGGCAA GGC 33

【００６６】 配列番号：5 配列の長さ：97 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プロモーターDNA 配列の特徴 存在位置：1..6 他の情報：HindIIIサイト 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：promoter 存在位置：7..91 特徴を決定した方法：S 存在位置：92..97 他の情報：BamHIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT 60 GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCC 97

【図面の簡単な説明】

【図１】微生物フロックを汚染地下水に注入して浄化す
る例を示す実施例の模式的断面図である。

【図２】フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群（pheR〜
pheG）およびtacプロモーター挿入に必要な相同部分のp
KNA82への挿入過程を示す概略図である。

【図３】プラスミドpKNA82の制限酵素切断位置を示す概
略図である。

【図４】実施例で用いた浄化装置の試験装置を示すフロ
ー図である。

【図５】実施例および比較例の結果を示すグラフであ
る。

【図６】実施例および比較例の結果を示すグラフであ
る。

【図７】実施例および比較例の結果を示すグラフであ
る。

【図８】実施例および比較例の結果を示すグラフであ
る。

【符号の説明】

１ 培養槽 ２ 凝集槽 ３ 微生物フロック ４ 注入井 ５ 微生物供給路 ６ 栄養素供給路 ７ 送気路 ８、１２ 撹拌機 ９ 連絡路 １０ 凝集剤供給路 １１ 薬注路 １３ ポンプ １４ 注入井路 １５ 表面土壌 １６ 汚染土壌 １７ 汚染地下水路 １８ 深土層 ２１ 処理槽 ２２ 土壌 ２３ 原水路 ２４ 菌体注入路 ２５ 処理水路pheA 、pheB、pheC、pheD、pheE 塩素化エチレン分解遺
伝子pheZ 塩素化エチレン分解促進遺伝子pheF 機能不明な遺伝子pheG カテコール−２，３−オキシゲナーゼ遺伝子pheR フェノールによって誘導される調節遺伝子tac tacプロモーター Amp アンピシリン耐性遺伝子 Km カナマイシン耐性遺伝子lacZ β−ガラクトシダーゼ遺伝子

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年４月２３日（１９９９．４．２
３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５５】３）原生動物の個体数の定量 サンプル液に１／１０容量の１０％グルタルアルデヒド
水溶液を添加し、固定化のため１０分間反応させた。次
に、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニル
インドール（4',6'-diamidino-2-phenylindole））溶液
（３００μｇ／ｍｌ）を１／１０００容量添加し、さら
に１０分間反応させた。この液を孔径０．８μｍのポリ
カーボネートフィルター（ニュークリポア社製）でろ過
し、原生動物を捕捉した。このフィルターを蛍光顕微鏡
で観察し、ＤＡＰＩに染まった原生動物の個体数をカウ
ントした。ここでは、大きさが３〜１０μｍのものだけ
を原生動物として測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA17 BA08 CA03 EA04 FA03 FA04 GA11 GA30 4B065 AA26Y AA44X AA44Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA30 BB04 CA27 CA56 4D004 AA41 AB06 AB07 AC07 CA18 CC07 CC08 CC20 DA03 DA20 4D027 CA01 4D040 DD01 DD31

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 汚染物質浄化能を有する微生物を、無機
   凝集剤および／または有機凝集剤により凝集させ、フロ
   ックを形成した状態で汚染環境に注入して浄化すること
   を特徴とする汚染環境浄化方法。
2. 【請求項２】 栄養物質および／またはインデューサを
   担持した担体と汚染物質浄化能を有する微生物とを混合
   し、無機凝集剤および／または有機凝集剤により凝集さ
   せ、フロックを形成した状態で汚染環境に注入して浄化
   することを特徴とする汚染環境浄化方法。
3. 【請求項３】 フロックが１０〜５００μｍの粒径を有
   する請求項１または２記載の方法。