JP2000295992A - シスエポキシコハク酸加水分解酵素をコードするｄｎａ及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 シスエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子及
びＤ（−）−酒石酸を効率よく製造する方法を提供す
る。 【解決手段】 アルカリゲネス・エスピーＭＣＩ３６１
１からシスエポキシコハク酸加水分解酵素を精製し、同
酵素の部分アミノ酸配列を決定し、決定されたアミノ酸
配列に基づいて作成したプローブを用いたハイブリダイ
ゼーションにより前記菌株の染色体ＤＮＡライブラリー
からシスエポキシコハク酸加水分解酵素をコードするＤ
ＮＡを単離し、同ＤＮＡで形質転換された形質転換体、
またはこの形質転換体の培養物から採取したシスエポキ
シコハク酸加水分解酵素の粗精製画分もしくは精製酵素
の存在下で、シスエポキシコハク酸と水を反応させてＤ
（−）−酒石酸を生成せしめることにより、Ｄ（−）−
酒石酸を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、シスエポキシコハ
ク酸加水分解酵素をコードするＤＮＡ及びその利用に関
し、詳しくは、アルカリゲネス・エスピー(Alcaligenes
sp)ＭＣＩ３６１１株由来であり、シスエポキシコハク
酸を立体選択的に加水分解することによりＤ（−）−酒
石酸に変換せしめる方法に属する。

【０００２】

【従来の技術】Ｄ（−）−酒石酸は光学活性な医農薬中
間原料を合成する際などに利用される重要な化合物であ
るが天然にはほとんど存在せず、安価な製造方法が強く
望まれている。すでに本発明者らは安価に大量供給が可
能であるマレイン酸又は無水マレイン酸を原料とし、こ
れらから公知の方法で容易に合成できるシスエポキシコ
ハク酸を立体選択的に加水分解し、Ｄ（−）−酒石酸の
みを高収率に生成する方法について研究を重ね、シスエ
ポキシコハク酸に、アルカリゲネス・エスピー（Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）ＭＣＩ３６１１（以下、
「ＭＣＩ３６１１株」と称することもある。）の菌体及
び／または該菌体処理物を水の存在下、作用させること
を特徴とするＤ（−）−酒石酸の製造方法（特開平８−
２４５４９７号公報）を確立している。しかしながら、
工業的に用いるには該菌体野生株そのままでは活性が低
く、高活性な形質転換体を得る必要があり、シスエポキ
シコハク酸を立体選択的に加水分解し、Ｄ（−）−酒石
酸を生成する酵素（シスエポキシコハク酸加水分解酵
素）をコードするＤＮＡの単離が強く望まれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】シスエポキシコハク酸
加水分解酵素遺伝子を取得し、これを適当なベクターを
用いて微生物に導入し、菌体内に同遺伝子を多コピー保
持する形質転換体を得ることが出来れば、微生物の触媒
能力を従来の方法に比して飛躍的に増大させることが可
能となる。本発明は、シスエポキシコハク酸加水分解酵
素遺伝子及びＤ（−）−酒石酸を効率よく製造する方法
を提供する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アルカリ
ゲネス・エスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）
ＭＣＩ３６１１の菌体からシスエポキシコハク酸加水分
解酵素をコードする遺伝子ＤＮＡ断片の単離を目的とし
て鋭意研究を重ねた結果、同遺伝子ＤＮＡ断片を単離
し、これをベクターに組み込んで組換えベクターとし、
更にこの組換えベクターで微生物を形質転換して、シス
エポキシコハク酸加水分解酵素活性が向上した形質転換
体を調製し、これを利用してＤ（−）−酒石酸生産性を
大幅に向上させ、本発明を完成した。

【０００５】かくして本発明によれば、 （１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコード
するＤＮＡ断片： （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列
番号４に記載のアミノ酸配列を有するシスエポキシコハ
ク酸加水分解酵素のβサブユニットとともにシスエポキ
シコハク酸を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成する
反応を触媒する活性を有するタンパク質を構成し得るポ
リペプチド； （２）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１）
記載のＤＮＡ断片： （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号
４に記載のアミノ酸配列を有するシスエポキシコハク酸
加水分解酵素のβサブユニットとともに、シスエポキシ
コハク酸を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成する反
応を触媒する活性を有するタンパク質を構成し得るポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ； （３）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコード
するＤＮＡ断片： （Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列
番号２に記載のアミノ酸配列を有するシスエポキシコハ
ク酸加水分解酵素のαサブユニットとともにシスエポキ
シコハク酸を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成する
反応を触媒する活性を有するタンパク質を構成し得るポ
リペプチド； （４）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（３）
記載のＤＮＡ断片： （ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ。 （ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号
２に記載のアミノ酸配列を有するシスエポキシコハク酸
加水分解酵素のαサブユニットとともに、シスエポキシ
コハク酸を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成する反
応を触媒する活性を有するタンパク質を構成し得るポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ； （５）前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡ、及び
（３）又は（４）に記載のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ； （６）前記（１）〜（５）のいずれか一項に記載のＤＮ
Ａがベクターに連結された組換えベクター； （７）前記（１）〜（５）のいずれか一項に記載のＤＮ
Ａが導入されることより形質転換された形質転換体： （８）前記（７）記載の形質転換体を培地で培養し、そ
の培養物からシスエポキシコハク酸加水分解酵素又はそ
のサブユニットを採取することを特徴とするシスエポキ
シコハク酸加水分解酵素又はそのサブユニットの製造
法；及び （９）前記（７）記載の形質転換体、またはこの形質転
換体の培養物から採取したシスエポキシコハク酸加水分
解酵素の粗精製画分もしくは精製酵素の存在下で、シス
エポキシコハク酸と水を反応させてＤ（−）−酒石酸を
生成せしめることを特徴とするＤ（−）−酒石酸の製造
法；が提供される。

【０００６】本発明の「シスエポキシコハク酸加水分解
酵素」とは、シスエポキシコハク酸を立体選択的に加水
分解することによりＤ（−）−酒石酸を生成する反応を
触媒する活性を有する酵素を意味する。本発明において
シスエポキシコハク酸加水分解酵素の比活性は、湿重量
１ｇの細胞に相当する酵素画分と１００ｇ／Ｌのシスエ
ポキシコハク酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）を３７℃で１時間反応させたときに生成するＤ
（−）−酒石酸の量（ｍｍｏｌ／時間）で表される。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のシスエポキシコハク酸加
水分解酵素はαおよびβサブユニットからなるヘテロ２
量体である。本発明の第一のＤＮＡは、シスエポキシコ
ハク酸加水分解酵素のαサブユニットをコードする。ま
た、本発明の第二のＤＮＡは、シスエポキシコハク酸加
水分解酵素のβサブユニットをコードする。さらに、本
発明の第三のＤＮＡは、これらのシスエポキシコハク酸
加水分解酵素のαサブユニットをコードするＤＮＡ及び
βサブユニットをコードするＤＮＡをともに含むＤＮＡ
である。以下、本明細書では、シスエポキシコハク酸加
水分解酵素の各サブユニットをコードするＤＮＡ断片、
及びこれらのＤＮＡ断片をともに含むＤＮＡを、便宜上
「シスエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子」というこ
とがある。

【０００８】本発明のシスエポキシコハク酸加水分解酵
素の各サブユニットをコードする遺伝子は、アルガリゲ
ネス属細菌からクローニングすることにより得られたも
のであるが、本発明によりその塩基配列が決定されたの
で、この配列に基づいて合成することも可能である。ま
た、この配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドを
プローブとするバイブリダイゼーションによって、又は
前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとするＰＣＲによって、アルガリゲネス属細菌染
色体ＤＮＡライブラリーから単離することもできる。

【０００９】アルカリゲネス属細菌としては、アルカリ
ゲネス・エスピーＭＣＩ３６１１株が挙げられる。本菌
株は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥ
ＲＭＰ−１６８６１として寄託されている。

【００１０】以下に、上記微生物からシスエポキシコハ
ク酸加水分解酵素の各サブユニットをコードする遺伝子
を取得する方法、これらの遺伝子産物であるシスエポキ
シコハク酸加水分解酵素の製造法、およびシスエポキシ
コハク酸を立体選択的に加水分解し、Ｄ（−）−酒石酸
を生成させる方法の一例を説明する。

【００１１】シスエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子
は、通常上記の供給源微生物の染色体上に存在し、染色
体由来のＤＮＡライブラリーから以下に述べるハイブリ
ダイゼーション法により分離・取得することができる。

【００１２】（１）シスエポキシコハク酸加水分解酵素
の精製及びそのアミノ酸配列の部分的決定とそれに基づ
くＤＮＡプローブの作製：アルカリゲネス・エスピーＭ
ＣＩ３６１１株の菌体からシスエポキシコハク酸加水分
解酵素を抽出・精製する方法は、公知の酵素の精製に関
するいずれの方法も使用できる。

【００１３】例えば菌体の破壊法としては、超音波破
砕；フレンチプレス、ホモジナイザーなどを用いた機械
的破壊法；リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を用い
ることができる。シスエポキシコハク酸加水分解酵素
は、この菌体破壊物より可溶性画分を分離することによ
り、粗酵素液として得ることができる。

【００１４】得られた粗酵素液からのシスエポキシコハ
ク酸加水分解酵素の精製法としては、通常、（イ）沈澱
法による分離、例えば硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラ
フィーによる分離法、例えばイオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティ吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィー等、（ハ）電気泳動による分離法等
を組み合わせることによって実施することができ、その
一例を後記実施例２で詳述する。

【００１５】上記精製過程におけるシスエポキシコハク
酸加水分解酵素画分の検出は、酵素画分とシスエポキシ
コハク酸を溶液中で反応させ、生成したＤ（−）−酒石
酸を定量することにより、行うことができる。反応液中
のシスエポキシコハク酸の濃度は特に限定されないが、
酵素活性を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが、
感度の点で有利である。好ましい濃度は３０重量％以下
である。反応は静置、攪拌、振とうのいずれの方法で行
っても良いが、効率よく反応を行うためには攪拌また
は、振とうが好ましい。反応の温度は１０℃〜６０℃、
好ましくは２０℃〜５０℃、pHは５〜９、好ましくは６
〜８で行う。以上のようにして反応液中に生成したＤ
（−）−酒石酸を公知の方法により分離精製、定量を行
う。

【００１６】精製されたシスエポキシコハク酸加水分解
酵素を、Ｄａｖｉｓ法［Ｂ． Ｊ．Ｄａｖｉｓ， Ａｎ
ｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．
１２１， ｐ．４０４ （１９６４）］またはＬａｅｍ
ｍｌｉ法［Ｕ． Ｋ． Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒ
ｅ， Ｖｏｌ．２２７， ｐ．６８０ （１９７０）］
によるポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシ
ーブルー色素液［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブ
リリアントブルーＲ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノー
ル、１０％（ｖ／ｖ）酢酸］、あるいは銀染色キット
（和光純薬製）等を用いて酵素タンパク質を染色するこ
とにより、精製純度およびシスエポキシコハク酸加水分
解酵素の分子量等を知ることができる。

【００１７】精製されたシスエポキシコハク酸加水分解
酵素のアミノ酸配列の部分的決定は、同酵素をこれを構
成するサブユニットに分離後、各サブユニットのＮ末端
からのアミノ酸配列、あるいは適当なタンパク質分解酵
素により各サブユニットを消化して得られるペプチド断
片のＮ末端からのアミノ酸配列を、エドマン分解法によ
るアミノ酸シーケンサー（アプライドバイオシステムズ
社製、４７３Ａ型）を用いて決定することにより、行う
ことができる。

【００１８】次いで、得られたアミノ酸配列から予想さ
れる塩基配列を持ったプローブをＤＮＡ合成装置（例え
ば、アプライドバイオシステムズ社製、３９４型）を用
いて合成する。

【００１９】上記のようにして得られたシスエポキシコ
ハク酸加水分解酵素の部分アミノ酸配列の一例を、配列
番号５および６に示した。また、該アミノ酸配列より推
定されるプローブＤＮＡの配列の一例を配列番号７及び
８に示した。

【００２０】（２）シスエポキシコハク酸加水分解酵素
遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片の単離：アルカリゲネス
・エスピーＭＣＩ３６１１株の菌体から、シスエポキシ
コハク酸加水分解酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡを単離
する方法は、遺伝子の単離に関する公知のいずれの方法
もが使用できる。以下にその一例を説明する。

【００２１】（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培
地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、
培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用す
ることも可能である。

【００２２】得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、
例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主
−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作
製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えば
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）等のラムダファージ
ベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２
（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。

【００２３】上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ
断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクター
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な
制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部
分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮ
Ａライブラリーが得られる。

【００２４】（Ｂ）シスエポキシコハク酸加水分解酵素
遺伝子を含むベクターの選別：上記（Ａ）項で調製した
染色体ＤＮＡライブラリーからシスエポキシコハク酸加
水分解酵素遺伝子を含むベクターを選別するには、この
染色体ＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物、例えば
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）の形質導入あるいは形質転換を行い、得られる形質
導入体あるいは形質転換体から、適当な手段によりシス
エポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子を保持するクロー
ンを選別すればよい。

【００２５】具体的には、上記ファージベクターをエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、例えばＰ２３９２株［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏ
ｌ．７， ｐ．１５１３ （１９７９）］に感染させ、
これを寒天培地上に重層することによりプラークを形成
させる。

【００２６】次いでこのプラーク中のファージＤＮＡを
ニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを
該ニトロセルロース膜に固定し、前記（１）項で作製し
たプローブ、例えば配列番号７及び／又は配列番号８に
示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた
プラークハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８
９）］を行う。

【００２７】こうして、アルカリゲネス・エスピーの染
色体ＤＮＡ由来のシスエポキシコハク酸加水分解酵素の
各サブユニットをコードする遺伝子を有するファージベ
クターを含む形質導入体を検出し、選別することが可能
である。

【００２８】あるいは上記プラスミドベクターを用いて
染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このラ
イブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質
転換し、得られた形質転換体から前記（１）で作製した
プローブ、例えば配列番号７及び／又は８に示す塩基配
列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いたコロニーハ
イブリダイゼーション法［Ｒ． Ｂｒｕｃｅ Ｗａｌｌ
ａｃｅ， ｅｔ ａｌ．， ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．９， ｐ．８７９ （１９８
１）］を行うことによっても選別可能である。

【００２９】更に、上記のようにして選別された形質導
入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいは
プラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵素
でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを取得す
ることができる。

【００３０】上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片
につき、前記（１）で作製したプローブ、例えば配列番
号７及び／又は８に示す塩基配列を有するプローブを用
いてサザンハイブリダイゼーション［Ｅ． Ｍ． Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｖｏ
ｌ．９８， ｐ．５０３ （１９７５）］を行うことに
より、シスエポキシコハク酸加水分解酵素の各サブユニ
ットをコードする遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在する
ことを再確認できる。

【００３１】このようにして得られるＤＮＡ断片の１つ
として、上記アルカリゲネス・エスピーＭＣＩ３６１１
株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩの完全分解により
切断して得られる、大きさが約３ｋｂのＤＮＡ断片を挙
げることができる。このＤＮＡ断片は、シスエポキシコ
ハク酸加水分解酵素のαサブユニット及びβサブユオッ
トをコードするＤＮＡをともに含む。

【００３２】（３）塩基配列の決定：前記（２）項で得
られたＫｐｎＩの３ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配列は、
例えばプラスミドｐＵＣ１１８ベクタ−（宝酒造（株）
製）を用いるダイデオキシヌクレオチド酵素法［ｄｉｄ
ｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法、Ｓ
ａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ， Ｖｏｌ．７４， ｐ．
５４６３ （１９７７）］により決定することができ
る。

【００３３】このようにして決定された上記約３ｋｂの
ＤＮＡ断片の塩基配列には、２つのオープンリーデイン
グフレームの存在が確認され、アルカリゲネス・エスピ
ーＭＣＩ３６１１株のシスエポキシコハク酸加水分解酵
素遺伝子は、２つの異なるオープンリーディングフレー
ムから構成されており、後記配列表の配列番号１に示す
アミノ酸番号１〜３８８の３８８個のアミノ酸配列をコ
ードする１１６４塩基対、および配列番号２に示す１〜
２９４の２９４アミノ酸配列をコードする８８２塩基対
から構成されることがわかった。また、得られた塩基配
列（配列番号１および２）には、前記（１）で決定した
配列番５および６に示すアミノ酸配列から予想される塩
基配列に相当する配列をそれぞれ含むことが再確認され
た。

【００３４】上記の塩基配列を包含する本発明のシスエ
ポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子は、天然のアルカリ
ゲネスの染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、
通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バ
イオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて
合成されたものであってもよい。

【００３５】尚、本発明のシスエポキシコハク酸加水分
解酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１及び配列番号
３に示す塩基配列に限定されるものではなく、配列番号
２及び配列番号４に示すアミノ酸配列をコードし得るも
のであればよい。また、本発明のシスエポキシコハク酸
加水分解酵素のαサブユニットをコードするＤＮＡは、
配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数
個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位
等の変異を含むアミノ酸配列からなるものであっても、
βサブユニットとともにシスエポキシコハク酸加水分解
酵素活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド
をコードするものであってもよい。

【００３６】また、本発明のシスエポキシコハク酸加水
分解酵素のβサブユニットをコードするＤＮＡは、配列
番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個の
アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むア
ミノ酸配列からなり、かつ、アルファサブユニットとと
もにシスエポキシコハク酸加水分解酵素活性を有するタ
ンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするもので
あってもよい。

【００３７】上記のような、配列番号２に記載のアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するシスエポ
キシコハク酸加水分解酵素のαサブユニットをコードす
るＤＮＡとしては、配列番号１に示す塩基配列を有する
ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得
るＤＮＡとして取得され得る。また、配列番号４に記載
のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する
シスエポキシコハク酸加水分解酵素のβサブユニットを
コードするＤＮＡとしては、配列番号３に示す塩基配列
を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダ
イズし得るＤＮＡとして取得され得る。具体的には、配
列番号１又は３に示す塩基配列と４０％以上、好ましく
は５０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。

【００３８】酵素活性を実質的に害さないアミノ酸残基
の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異位置及び
様式は、当業者に容易に選択され得る。また、酵素活性
に実質的に影響を与えないアミノ酸残基の置換、欠失、
挿入、付加、又は逆位等の変異を有するシスエポキシコ
ハク酸加水分解酵素又はそのサブユニットをコードする
ＤＮＡは、例えば、自然突然変異株又は変種から取得さ
れ得る。

【００３９】アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位等の変異を有するシスエポキシコハク酸加水分
解酵素遺伝子の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位
特異的変異法等の通常の変異操作によって得られる。ま
た、そのＤＮＡによりコードされるシスエポキシコハク
酸加水分解酵素が酵素活性を保持していることの確認
は、シスエポキシコハク酸に作用させＤ（−）−酒石酸
の生成を調べることにより行うことができる。

【００４０】（４）シスエポキシコハク酸加水分解酵素
遺伝子を有する組換えベクター及びこの組換えベクター
を保持する形質転換体の作製：

【００４１】本発明のシスエポキシコハク酸加水分解酵
素遺伝子またはこれを含むＤＮＡ断片は、これらを適当
なベクターに連結して組換えベクターを調製し、この組
換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換することに
より、発現させることができる。αサブユニットをコー
ドするＤＮＡを用いればαサブユニットを、βサブユニ
ットをコードするＤＮＡを用いればβサブユニットを、
これらの両方を含むＤＮＡを用いればαサブユニット及
びβサブユニットの両方を、産生させることができる。

【００４２】組換えベクターを調製する際には、通常、
シスエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子を宿主微生物
に適したプロモーターとともに、このプロモーターの下
流に該遺伝子のコード領域の５’末端側が連結されるよ
うにして、ベクターに挿入する。あるいはプロモーター
を含む発現ベクターを用い、これにシスエポキシコハク
酸加水分解酵素遺伝子を挿入してもよい。

【００４３】このような発現ベクターを用いた発現方法
の他に、プロモーターを連結したシスエポキシコハク酸
加水分解酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物の
染色体中に直接導入する相同組換え技術［Ａ． Ａ．
Ｖｅｒｔｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．
５７， ｐ．２０３６ （１９９３）、等］、あるいは
トランスポゾンや挿入配列等を用いて導入する技術
［Ａ． Ａ． Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１
１， ｐ．７３９ （１９９４）、等］によっても発現
させることができる。

【００４４】発現ベクターとしては、宿主微生物内で複
製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プ
ラスミドベクター、ファージベクターのいずれかを用い
ることができる。具体的なプラスミドベクターとして
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造
（株）から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＰＬ−
Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（以上は、例えばファルマシア社か
ら購入できる）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ３ＫＸ（米国特許第５，１８５，２６２号）、ある
いはこれらの誘導体等を挙げることができる。

【００４５】また、ファージベクターとしては、（λＦ
ｉｘＩＩベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入で
きる）等を挙げることができる。本発明のシスエポキシ
コハク酸加水分解酵素遺伝子を発現させるためのプロモ
ーターは、宿主微生物が保有するプロモーターを一般に
用いることができるが、それに限られるものではなく、
シスエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子の転写を開始
させるための原核生物由来の塩基配列であればいかなる
プロモーターであっても良い。具体的には、ラクトース
オペロンのプロモーター、トリプトファンオペロンのプ
ロモーター、λファージ由来のＰＬプロモーター、トリ
プトファンラクトース雑種（ｔａｃ）プロモーター
［Ｈ． Ａ． Ｂｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ．
Ａ．， Ｖｏｌ．８０， ｐ．２１ （１９８３）］等
が挙げられる。また、バチルス属細菌由来のプロモータ
ーが機能可能な微生物を宿主として用いる場合には、得
られたシスエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子固有の
プロモーターを使用してもよい。さらに、プロモーター
の塩基配列が分かっている場合には、通常用いられるＤ
ＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたもの
であってもよい。

【００４６】これらのプローモーターのうち、発現効率
を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用
することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンの
プロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加すること
により遺伝子発現を誘導することができる。

【００４７】シスエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子
を導入する宿主としては、特に限定されるものではない
が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカ
ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ラクトバチルス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトマ
イセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、サーマス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌等を好適に用いること
ができる。

【００４８】具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セラチア・マーセッ
センス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐ
ｕｔｉｄａ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コリネバ
クテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム
・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖ
ｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅ
ｎｔｕｍ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、サーマ
ス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチ
ルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）等を用いることがで
きる。

【００４９】上記宿主微生物への遺伝子の導入法として
はコンピテントセル法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．
１５９（１９７０）］、パルス波通電法［Ｊ． Ｉｎｄ
ｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．５，
ｐ．１５９ （１９９０）］等による形質転換法、ファ
ージを用いた形質導入法［Ｅ． Ｏｈｔｓｕｂｏ， Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ．６４， ｐ．１８９ （１
９７０）］、接合伝達法［Ｊ． Ｇ． Ｃ． Ｏｔｔｏ
ｗ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
Ｖｏｌ．２９，ｐ．８０ （１９７５） ］、細胞融合
法［Ｍ． Ｈ． Ｇａｂｏｒ， Ｊ．ｃｔｅｒｉｏ
ｌ．， Ｖｏｌ．１３７， ｐ．１３４６ （１９７
９）］等を用いることができる。これらの方法から、宿
主微生物に適した方法を適宜選択すればよい。

【００５０】（５）本発明の形質転換体を用いたシスエ
ポキシコハク酸加水分解酵素の製造、及びシスエポキシ
コハク酸加水分解酵素を用いたシスエポキシコハク酸の
Ｄ（−）−酒石酸への加水分解反応：上記（４）のよう
にして得られる形質転換体またはこの形質転換体の培養
物から採取したシスエポキシコハク酸加水分解酵素の粗
精製画分もしくは精製酵素をシスエポキシコハク酸を含
有する水性溶液に加えることにより、シスエポキシコハ
ク酸を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成せしめるこ
とができる。ここで培養物とは、形質転換体の菌体又は
／及び培養後の培地（培養に液体培地を用いた場合には
その培養上清）をいう。

【００５１】上記形質転換体の培養は、炭素源、窒素
源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行
うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ
糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等
のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機
塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。

【００５２】培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気
条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温
度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨにつ
いても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限は
ない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加し
て行うことができる。

【００５３】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、シスエポキシコハク酸加
水分解酵素遺伝子の発現産物、すなわちシスエポキシコ
ハク酸加水分解酵素を含有する菌体を取得することがで
きる。

【００５４】本発明のＤ（−）−酒石酸の製造法に用い
られる形質転換体としては、該形質転換体を培養した培
養液から分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体
の破砕物、抽出物、形質転換体より得られる粗酵素標
品、精製した酵素標品を使用してもよい。さらに、上記
形質転換体、その破砕物、抽出物または精製酵素を担体
に固定化したものも使用することができる。

【００５５】形質転換体を担体に固定化する場合には、
培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例
えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜
１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。ま
た、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手
段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出し
て得られるシスエポキシコハク酸加水分解酵素を含有す
る抽出物、該抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグ
ラフィー等の処理を行って得られるシスエポキシコハク
酸加水分解酵素の部分精製成分等を担体に固定化したも
のも、本発明のＤ（−）−酒石酸の製造に使用すること
ができる。

【００５６】これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精
製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている
方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、ま
たはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させ
る方法により行うことができる。

【００５７】以上の方法により得られる菌体、菌体破砕
物、抽出物または精製酵素は従来知られていたシュード
モナス等の野生株と比較して、少なくとも３倍以上のシ
スエポキシコハク酸加水分解活性を有し、Ｄ（−）−酒
石酸以外の副生成物が殆ど生成しないという特徴を有す
る。

【００５８】反応に用いる水性溶液は、シスエポキシコ
ハク酸を含有する水溶液または適当な緩衝液、例えば
０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１
０）とすることができる。この水性溶液には、更に菌体
の細胞膜の物質透過性を高める必要のあるときには、ト
ルエン、キシレン、非イオン性界面活性剤等を０．０５
〜２％（ｗ／ｖ）添加することもできる。

【００５９】水性溶液中の反応原料となるシスエポキシ
コハク酸濃度は、０．１〜２Ｍ程度が適当である。シス
エポキシコハク酸の形態は、酸あるいは塩の形態のみな
らず、その無水物を用いることもできる。無水シスエポ
キシコハク酸は水溶液とすることにより容易にシスエポ
キシコハク酸に変換する。シスエポキシコハク酸の塩と
しては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等を挙げるこ
とができる。

【００６０】上記の水性溶液における酵素反応温度およ
びｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ま
しくは１５〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５
〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。ま
た、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。発明で使用する酵素は、培養液をそのまま
又はそれから遠心分離、濾過等で集め、これを水又は緩
衝液に懸濁して得ることができる。このようにして得ら
れた酵素をシスエポキシコハク酸と水の存在下、反応さ
せるが、反応液中のシスエポキシコハク酸の濃度は酵素
の活性を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利
である。反応は静置、攪拌、振盪のいずれの方法で行っ
てもよい。また、酵素を適当な支持体に固定化してカラ
ムに充填し、シスエポキシコハク酸溶液を流す方法も利
用できる。反応は、通常、１０〜６０℃好ましくは２０
〜５０℃、ｐＨ５〜９、好ましくはｐ６〜８で行う。

【００６１】以上のようにして培養液中あるいは反応液
中に生成してきたＤ（−）−酒石酸は特開平８−２４５
４９７号公報等に記載の公知の方法、例えばカルシウム
塩などによる沈殿、イオン交換樹脂などによる不純物の
除去などの手段を用いて単離・精製される。

【００６２】

【実施例】以下に本発明の方法を実施例により具体的に
述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００６３】〔実施例１〕アルカリゲネス・エスピーＭ
ＣＩ３６１１株由来のシスエポキシコハク酸加水分解酵
素遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローン化 （１）シスエポキシコハク酸加水分解酵素の精製及びア
ミノ酸配列の部分的決定とそれに基づくＤＮＡプローブ
の作製：アルカリゲネス・エスピー ＭＣＩ３６１１
を、シスエポキシコハク酸０．１％、マレイン酸ナトリ
ウム１．０％、リン酸水素２カリウム０．３％、リン酸
２水素カリウム０．１％、酵母エキス１．０％、pH７．
５の液体培地１００mlを120 ℃、20分間滅菌したものに
植菌し、30℃で４０時間好気的に培養した。

【００６４】次いで、上記と同様の培地１０００ｍｌを
３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０
分間滅菌処理したものに、上記培養物３０ｍｌを接種
し、３０℃にて２４時間通気攪拌培養した。培養後の培
養液を遠心分離（３，５００×ｇ、４℃、２０分間）し
菌体を回収した。

【００６５】得られた菌体からのシスエポキシコハク酸
加水分解酵素の抽出は、菌体を０．５ｍＭジチオスレイ
トールを含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）に
懸濁し、超音波破砕器（ブランソン社製）により菌体を
破砕することにより行った。菌体破砕物を遠心分離（１
０，０００×ｇ、４℃、３０分間）し、上清の可溶性画
分を粗酵素液として得た。

【００６６】次に、この粗酵素液を硫安分画（３５〜７
０％）し、上記緩衝液中に対して４℃で一夜透析した。
次いで、この透析液をＤＥＡＥセファロース（ファルマ
シア社製）カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過（セフ
ァクリルＳ−２００、ファルマシア社製）カラムクロマ
トグラフィー、モノＱ（ファルマシア社製）カラムクロ
マトグラフィーにかけ、シスエポキシコハク酸加水分解
酵素の活性画分を得た。

【００６７】シスエポキシコハク酸加水分解酵素の活性
の検出は、酵素画分と１００ｇ／Ｌのシスエポキシコハ
ク酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を３７
℃で１時間反応させ、生成したＤ（−）−酒石酸を定量
することにより行った。以上のようにして反応液中に生
成したＤ（−）−酒石酸を回収し、本生成物を高速液体
クロマトグラフィー（カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬＯ
Ａ−５０００）で分析し、絶対配置を求めた。反応液か
らのＤ（−）−酒石酸の回収は、次のようにして行っ
た。反応液から不溶物を遠心分離により除去した後、１
Ｍ塩化カルシウム溶液を反応液１００ｍｌに対して１１
ｍｌ添加し、４℃で一夜おいてから生じた沈殿を遠心分
離により集めた。得られた沈殿を５０ｍｌの水に懸濁し
た後、再度遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を５
０ｍｌの水に懸濁した後、１Ｎ硫酸溶液を加えてｐＨ
１．８にし、再度遠心分離にかけて得られる上清を減圧
濃縮し、酒石酸の結晶を得た（特開平８−２４５４９７
号参照）。

【００６８】上記シスエポキシコハク酸加水分解酵素の
精製画分をポリアクリルアミドゲル（４〜２０％グラジ
エントゲル）電気泳動［２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグ
リシンからなる緩衝液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ
定電流で１時間泳動］により分離し、クマシーブルー色
素［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブ
ルーＲ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％
（ｖ／ｖ）酢酸］によって染色したところ、分子量約８
０ｋＤａの単一バンドが検出された。更に同精製画分を
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理液［組成：６
２．５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、
１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール、
０．００１％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）］に溶
解し、９５℃にて３分間熱変性処理後、ポリアクリルア
ミドゲル（１０〜２０％グラジエントゲル）電気泳動
［２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシン−０．１％ＳＤ
Ｓからなる緩衝液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電
流で１時間泳動］により分離し、上記と同様に染色した
ところ、分子量約４０ｋＤａ及び３３ｋＤａの２本のバ
ンドを検出した。これらの結果より、該シスエポキシコ
ハク酸加水分解酵素の構成は、分子量約４０ｋＤａ及び
３３ｋＤａの２つのサブユニットから成る分子量約８０
ｋＤａのヘテロ２量体であることが推定された。

【００６９】これらの精製酵素のサブユニットのＮ末端
からのアミノ酸配列をアミノ酸シーケンサー（アプライ
ドバイオシステムズ社製、４７３Ａ型）を用いて決定
し、それぞれの結果を配列番号５及び６に示した。次い
で、これらのアミノ酸配列から予想される配列番号７及
び８に示した塩基配列を有するプローブＤＮＡをＤＮＡ
合成装置（アプライドバイオシステムズ社製、３９４
型）を用いて合成した。

【００７０】（２）シスエポキシコハク酸加水分解酵素
遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片の調製：アルカリゲネス
・エスピーＭＣＩ３６１１株を前記培地を用いて３０℃
で対数増殖期後期まで振とう培養し、菌体を集めた。

【００７１】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、リゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ（宝酒
造（株）社製）を最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよ
うに添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、最終濃度が０．５％にな
るように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌させた。
この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を
添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を
遠心分離（５，０００×ｇ，２０分間，１０〜１２℃）
し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを
０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールを
ゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在する
ＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄
した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５
ｍｌを加え、４℃で一晩静置し染色体ＤＮＡ溶液を得
た。

【００７２】次に、染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限
酵素ＫｐｎＩ、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で
１時間反応させ完全分解し、アガロース電気泳動に供し
た。このアガロースゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移
し取り、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）及
び［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを用いて５’末端リン酸基をラジ
オアイソトープラベル［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１５８，３０７−３１５（１９８６）］した配列番号３
及び４に示した合成プローブを用い、常法［Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）］に従ってサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。

【００７３】その結果、上記ナイロン膜上の約３ｋｂの
位置に、上記合成プローブが強くハイブリダイズするＤ
ＮＡ断片の存在を確認した。

【００７４】（３）染色体ＤＮＡのベクターへの挿入：
上記（２）項で得たアルガリゲネス・エスピーＭＣＩ３
６１１株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反応
させて部分分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮＡ
と、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼク
レノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ）を用いてＴ（チミジン）、Ｃ（デオキシシトシン）
を埋めたファージベクターλＦＩＸＩＩ（λＦＩＸII／
ＸｈｏＩ−ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｔｒｅａ
ｔｅｄ ＤＮＡ：東洋紡績（株）社製）とを混合し、５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオス
レイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂お
よびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添加し
（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間
反応させて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、染
色体ＤＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。

【００７５】（４）形質転換体の作製及び目的組換え体
ＤＮＡの選別：上記（３）で作製したλＤＮＡライブラ
リーファージ溶液（２〜５×１０⁴ｐｆｕ；ＳＭ緩衝液
希釈）と、エシェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当
量混合し、３７℃で１５分間保温した。これに５０℃に
て保温しておいた ３〜４ｍｌのλ培地（１％ Ｔｒｙ
ｐｔｏｎ，０．５％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，０．
５％ＮａＣｌ，０．２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．５
％Ａｇａｒ）を加え、λプレート（１％ Ｔｒｙｐｔｏ
ｎ，０．５％ ＮａＣｌ，０．２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ，１％Ａｇａｒ）に均一に塗布し、３７℃で１２〜１
６時間培養した。この培地上にニトロセルロースフィル
ターを載せ、培地上に形成されたプラークをフィルター
に吸着させ、順次５分間ずつ以下イ）〜ハ）の試薬に浸
した濾紙上にフィルターをのせて処理した。

【００７６】 イ）０．５Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌ ロ）０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１．
５Ｍ ＮａＣｌ，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ ハ）２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３
ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留
水１Ｌに溶解）

【００７７】上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時
間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。前記（１）で作製
した配列番号３及び４に示したプローブを用い、上記で
作製したフィルターにつきプラークハイブリダイゼーシ
ョンを常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従って行った。
この結果、両方のプローブについてハイブリダイゼーシ
ョン陽性のプラークが見い出された。そのプラークから
ファージＤＮＡを抽出して、制限酵素ＫｐｎＩで切り出
される長さ約３ｋｂの挿入断片をアガロースゲル電気泳
動により確認した。

【００７８】（５）シスエポキシコハク酸加水分解酵素
遺伝子のサブクローニング：上記（４）で得られた長さ
が約３ｋｂのＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ）断片上に存
在するシスエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子の位置
をさらに特定するために、該ＤＮＡ断片を下記のように
プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社製）へサブク
ローニングした。

【００７９】上記ＫｐｎＩで切り出されるＤＮＡ断片
と、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）
製）を、各々制限酵素ＫｐｎＩで切断した後、脱リン酸
化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１
ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度で
ある）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＫｐｎＩ−Ｋ
ｐｎＩ断片とベクターを連結させた。

【００８０】得られた連結反応液を用い、塩化カルシウ
ム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７
０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキスト
ラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留
水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００８１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＫｐｎＩにより切断し、ハイブリダイゼー
ション法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミド
ｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長
さ約３ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。上記で得られた
プラスミドをｐＴＡ−１と命名し、該プラスミドで形質
転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造
（株）製）をＥＣＴＡ−１と命名した。

【００８２】〔実施例２〕シスエポキシコハク酸加水分
解酵素遺伝子の塩基配列の決定：実施例１で得られたシ
スエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子を含む長さが約
３ｋｂのＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ）断片について、
その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社製）を用
いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃ
ｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）［Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６
３，（１９７７）］により決定した。その塩基配列中に
は、２つのオープンリーデイングフレームが存在し、シ
スエポキシコハク酸加水分解酵素遺伝子は、後記配列表
の配列番号１及び２に示す塩基配列を有し、３８８個の
アミノ酸をコードする塩基対及び、２９４個のアミノ酸
をコードする塩基対より構成されることが判明した。
尚、この塩基配列の中には、実施例２で決定したアミノ
酸配列（配列番号５及び６）の全てをコードし得る塩基
配列が含まれていることが確認された。

【００８３】〔実施例３〕シスエポキシコハク酸加水分
解酵素の製造および活性の確認 実施例２で作製したＥＣＴＡ−１株を、アンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０ｇ，イ
ーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ）に植菌
し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られ
た培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分
間）して菌体を回収後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６．０）で洗浄した。次いで、洗浄菌体（湿重
量）を上記リン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液とした。

【００８４】対照として、外来遺伝子を含まないプラス
ミドｐＵＣ１１８について、実施例２と全く同様にエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９株に形質転換し、該形質転換
体から上記と同様に菌体懸濁液を調製し、以下の活性測
定に供した。

【００８５】シスエポキシコハク酸加水分解酵素活性の
確認は、これらの菌体懸濁液について、前記実施例１に
示したとおり、菌体懸濁液と１５０ｇ／Ｌのシスエポキ
シコハク酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）を３７℃で反応させ、生成したＤ（−）−酒石
酸を定量することにより行った。以上のようにして、反
応液中に生成したＤ（−）−酒石酸を、実施例１と同様
にして特開平８−２４５４９７号に記載の方法により回
収し、本生成物を高速液体クロマトグラフィー（カラ
ム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬＯＡ−５０００）で分析し、
絶対配置を求めた。その結果、ＥＣＴＡ−１から調製さ
れた菌体についてのみ、Ｄ（−）−酒石酸の生成が認め
られ、シスエポキシコハク酸加水分解酵素活性を検出し
得た。

【００８６】〔実施例４〕シスエポキシコハク酸加水分
解酵素を含む形質転換体によるシスエポキシコハク酸の
加水分解反応 実施例３と同様に、実施例２で作製したＥＣＴＡ−１株
を、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む上記ＬＢ培地
に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。
得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２
０分間）して菌体を回収後、５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。

【００８７】シスエポキシコハク酸加水分解反応は、１
５０ｇ／Ｌのシスエポキシコハク酸を含む５０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に、上記菌体懸濁液を
最終濃度０．６％として添加することにより行った。３
７℃で３時間反応させたところ、酒石酸が１００ｇ／Ｌ
蓄積した。更に反応を継続したところ、２２時間経過
後、シスエポキシコハク酸は完全に消失し、酒石酸が１
５０ｇ／Ｌ蓄積した。また、副生成物は認められなかっ
た。

【００８８】この反応液から、前記と同様にして特開平
８−２４５４９７号に記載の方法により酒石酸を回収
し、本生成物を高速液体クロマトグラフィー（カラム：
ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００）で分析し、絶
対配置を求めた結果、生成物はＤ（−）−酒石酸である
ことが確認された。以上の結果より、上記形質転換体が
含有するシスエポキシコハク酸加水分解酵素の作用によ
りシスエポキシコハク酸がＤ（−）−酒石酸へと加水分
解されていることが確認された。

【００８９】比較として、アルカリゲネス・エスピーＭ
ＣＩ３６１１野生株を０．１％シスエポキシコハク酸誘
導条件下で培養した菌体について、上記の反応を行っ
た。その結果、遺伝子組換え株を用いたときの酒石酸の
生成は、野生株に比べて約５倍であった。

【００９０】

【発明の効果】本発明により、新規なシスエポキシコハ
ク酸加水分解酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有す
る組換えベクター、及び該組換えベクターを含有する形
質転換体が提供される。本発明のシスエポキシコハク酸
加水分解酵素遺伝子を含有する形質転換体により、通常
塩濃度条件下はもちろんのこと、高塩濃度条件下におい
ても安定に活性を保持するシスエポキシコハク酸加水分
解酵素を著量生産することができ、本菌体あるいは本菌
から調製したシスエポキシコハク酸加水分解酵素を利用
することにより、シスエポキシコハク酸からＤ（−）−
酒石酸を効率よく製造することができる。

【００９１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 三菱化学株式会社 <120> シスエポキシコハク酸加水分解酵素をコードするＤＮＡ及びその利用 <130> J03254 <141> 1999-04-13 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００９２】 <210> 1 <211> 1167 <212> DNA <213> Alcaligenes sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1164) <400> 1 atg aag atc gtt gaa att cgt gaa ata acc gta ccc att agc tca ccc 48 Met Lys Ile Val Glu Ile Arg Glu Ile Thr Val Pro Ile Ser Ser Pro 1 5 10 15 att cga aac gcc tat atc gat ttc agc aag atg acg ctt agt ctg gtg 96 Ile Arg Asn Ala Tyr Ile Asp Phe Ser Lys Met Thr Leu Ser Leu Val 20 25 30 gcg gtc att acc gat gtc ata cgg gac ggc cgc cct gtt gtt ggg tat 144 Ala Val Ile Thr Asp Val Ile Arg Asp Gly Arg Pro Val Val Gly Tyr 35 40 45 ggt ttc aac tca aat ggc aga tac ggc cag gga aaa ctg atg cgc gag 192 Gly Phe Asn Ser Asn Gly Arg Tyr Gly Gln Gly Lys Leu Met Arg Glu 50 55 60 cgc ttt atc cct cgg ata ctg gag gcc gaa gcg tcc tcc cta atc aat 240 Arg Phe Ile Pro Arg Ile Leu Glu Ala Glu Ala Ser Ser Leu Ile Asn 65 70 75 80 gag gct ggg gac aat tta gac ccc cat aaa gtg tgg cag tgc atg ttt 288 Glu Ala Gly Asp Asn Leu Asp Pro His Lys Val Trp Gln Cys Met Phe 85 90 95 acc aac gaa aag cca ggc gga cat ggc gaa cgc tcg gtc gcg atc ggc 336 Thr Asn Glu Lys Pro Gly Gly His Gly Glu Arg Ser Val Ala Ile Gly 100 105 110 acc att gac atg gcg gta tgg gat gcc gtg gca aaa atc gcg aat aaa 384 Thr Ile Asp Met Ala Val Trp Asp Ala Val Ala Lys Ile Ala Asn Lys 115 120 125 cct ttg ttc caa cac ttg tcc gac acc tat ggc gac ggt gcc cct aac 432 Pro Leu Phe Gln His Leu Ser Asp Thr Tyr Gly Asp Gly Ala Pro Asn 130 135 140 agg aag gta ttc gtg tat gcc gct ggc ggc tac tac tat ccc ggt cag 480 Arg Lys Val Phe Val Tyr Ala Ala Gly Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly Gln 145 150 155 160 gat cat gag aag cta aaa gac gaa atg cgt agc tat atc gat aga ggc 528 Asp His Glu Lys Leu Lys Asp Glu Met Arg Ser Tyr Ile Asp Arg Gly 165 170 175 tac acc gtc gtc aag aaa aaa atc ggg gga gcc tca ttg gat gag gac 576 Tyr Thr Val Val Lys Lys Lys Ile Gly Gly Ala Ser Leu Asp Glu Asp 180 185 190 ctg cgc cgc atc gac tcc att ctg agt gtg ctg caa gac ggt caa aag 624 Leu Arg Arg Ile Asp Ser Ile Leu Ser Val Leu Gln Asp Gly Gln Lys 195 200 205 ctg tgt gtt gat gct aac gga cgc ttt gat cgg gac acg gcc gtt gcc 672 Leu Cys Val Asp Ala Asn Gly Arg Phe Asp Arg Asp Thr Ala Val Ala 210 215 220 tat gca aaa gct ctc tct caa tac gat ctg ttt tgg tac gaa gag ccg 720 Tyr Ala Lys Ala Leu Ser Gln Tyr Asp Leu Phe Trp Tyr Glu Glu Pro 225 230 235 240 ggc gac cca ttg gac tat gag ctc caa gcg acg cta aga aat tac tat 768 Gly Asp Pro Leu Asp Tyr Glu Leu Gln Ala Thr Leu Arg Asn Tyr Tyr 245 250 255 aaa aac ccg atg gct acc ggc gag gat ctg ttt tca atg cag gat gcc 816 Lys Asn Pro Met Ala Thr Gly Glu Asp Leu Phe Ser Met Gln Asp Ala 260 265 270 cga aac ctc att cgc tat ggc ggc atg agg cct gac cgc gat tgg ctt 864 Arg Asn Leu Ile Arg Tyr Gly Gly Met Arg Pro Asp Arg Asp Trp Leu 275 280 285 cag ttc gac tgt gcg ctt agc tac ggt tta gtg gag tat ttg cgc acg 912 Gln Phe Asp Cys Ala Leu Ser Tyr Gly Leu Val Glu Tyr Leu Arg Thr 290 295 300 ctg gat atg ctt aaa gaa cac ggt tgg tcg gcc aca cgg tgc atc cct 960 Leu Asp Met Leu Lys Glu His Gly Trp Ser Ala Thr Arg Cys Ile Pro 305 310 315 320 cac ggg ggc cac caa atg tca ttg aat ttg gct gct gga ctg ggg ctg 1008 His Gly Gly His Gln Met Ser Leu Asn Leu Ala Ala Gly Leu Gly Leu 325 330 335 gga ggc aac gag tca tac cct gat cta ttc caa cca ttt ggt ggt ttc 1056 Gly Gly Asn Glu Ser Tyr Pro Asp Leu Phe Gln Pro Phe Gly Gly Phe 340 345 350 cct gat ggc gtg cga gtc gaa aat ggc cac atc acg atg cct gac tta 1104 Pro Asp Gly Val Arg Val Glu Asn Gly His Ile Thr Met Pro Asp Leu 355 360 365 ata gga ata ggc ttc gaa ggt aag gct gac ctg tac gcc cag atg aag 1152 Ile Gly Ile Gly Phe Glu Gly Lys Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Met Lys 370 375 380 aat tta tct gcg taa 1167 Asn Leu Ser Ala 385

【００９３】 <210> 2 <211> 388 <212> PRT <213> Alcaligenes sp. <400> 2 Met Lys Ile Val Glu Ile Arg Glu Ile Thr Val Pro Ile Ser Ser Pro 1 5 10 15 Ile Arg Asn Ala Tyr Ile Asp Phe Ser Lys Met Thr Leu Ser Leu Val 20 25 30 Ala Val Ile Thr Asp Val Ile Arg Asp Gly Arg Pro Val Val Gly Tyr 35 40 45 Gly Phe Asn Ser Asn Gly Arg Tyr Gly Gln Gly Lys Leu Met Arg Glu 50 55 60 Arg Phe Ile Pro Arg Ile Leu Glu Ala Glu Ala Ser Ser Leu Ile Asn 65 70 75 80 Glu Ala Gly Asp Asn Leu Asp Pro His Lys Val Trp Gln Cys Met Phe 85 90 95 Thr Asn Glu Lys Pro Gly Gly His Gly Glu Arg Ser Val Ala Ile Gly 100 105 110 Thr Ile Asp Met Ala Val Trp Asp Ala Val Ala Lys Ile Ala Asn Lys 115 120 125 Pro Leu Phe Gln His Leu Ser Asp Thr Tyr Gly Asp Gly Ala Pro Asn 130 135 140 Arg Lys Val Phe Val Tyr Ala Ala Gly Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly Gln 145 150 155 160 Asp His Glu Lys Leu Lys Asp Glu Met Arg Ser Tyr Ile Asp Arg Gly 165 170 175 Tyr Thr Val Val Lys Lys Lys Ile Gly Gly Ala Ser Leu Asp Glu Asp 180 185 190 Leu Arg Arg Ile Asp Ser Ile Leu Ser Val Leu Gln Asp Gly Gln Lys 195 200 205 Leu Cys Val Asp Ala Asn Gly Arg Phe Asp Arg Asp Thr Ala Val Ala 210 215 220 Tyr Ala Lys Ala Leu Ser Gln Tyr Asp Leu Phe Trp Tyr Glu Glu Pro 225 230 235 240 Gly Asp Pro Leu Asp Tyr Glu Leu Gln Ala Thr Leu Arg Asn Tyr Tyr 245 250 255 Lys Asn Pro Met Ala Thr Gly Glu Asp Leu Phe Ser Met Gln Asp Ala 260 265 270 Arg Asn Leu Ile Arg Tyr Gly Gly Met Arg Pro Asp Arg Asp Trp Leu 275 280 285 Gln Phe Asp Cys Ala Leu Ser Tyr Gly Leu Val Glu Tyr Leu Arg Thr 290 295 300 Leu Asp Met Leu Lys Glu His Gly Trp Ser Ala Thr Arg Cys Ile Pro 305 310 315 320 His Gly Gly His Gln Met Ser Leu Asn Leu Ala Ala Gly Leu Gly Leu 325 330 335 Gly Gly Asn Glu Ser Tyr Pro Asp Leu Phe Gln Pro Phe Gly Gly Phe 340 345 350 Pro Asp Gly Val Arg Val Glu Asn Gly His Ile Thr Met Pro Asp Leu 355 360 365 Ile Gly Ile Gly Phe Glu Gly Lys Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Met Lys 370 375 380 Asn Leu Ser Ala 385

【００９４】 <210> 3 <211> 885 <212> DNA <213> Alcaligenes sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(882)

【００９５】 <400> 3 atg act cga acc aag ttg ata ctt gaa gct cgt ata aat gaa tac atg 48 Met Thr Arg Thr Lys Leu Ile Leu Glu Ala Arg Ile Asn Glu Tyr Met 1 5 10 15 ccg cgc cgc ggt aat ccc cat gtg cca tgg acg cca aag gag atc ggt 96 Pro Arg Arg Gly Asn Pro His Val Pro Trp Thr Pro Lys Glu Ile Gly 20 25 30 gaa gcc gct gca cag gca cgg gaa gcg ggt gca tcg att gtc cat ttc 144 Glu Ala Ala Ala Gln Ala Arg Glu Ala Gly Ala Ser Ile Val His Phe 35 40 45 cat gcc cgt caa gct gac ggt tct ccc agc cat gac tat gaa act tat 192 His Ala Arg Gln Ala Asp Gly Ser Pro Ser His Asp Tyr Glu Thr Tyr 50 55 60 gca gaa tcg atc cgt gag att cgc gca cgc agt gac gtt cta gta cat 240 Ala Glu Ser Ile Arg Glu Ile Arg Ala Arg Ser Asp Val Leu Val His 65 70 75 80 ccg aca ctg ggc cag atc acg ctt gga ggg agg gaa tca cga ctg gca 288 Pro Thr Leu Gly Gln Ile Thr Leu Gly Gly Arg Glu Ser Arg Leu Ala 85 90 95 cac att gag cga ctg tgc ctt gac cca gca cta aaa ccg gac ttt gca 336 His Ile Glu Arg Leu Cys Leu Asp Pro Ala Leu Lys Pro Asp Phe Ala 100 105 110 ccg gta gac ctg ggt agc acg aac atc gat cgt tat gac gat gtg gag 384 Pro Val Asp Leu Gly Ser Thr Asn Ile Asp Arg Tyr Asp Asp Val Glu 115 120 125 aag cgc tac gag aca ggc gac cgc gtg tac ttg aac aac atc gac acg 432 Lys Arg Tyr Glu Thr Gly Asp Arg Val Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Thr 130 135 140 ctg cag cac ttc agc aag aga cta cga gaa ctc ggg gtt aag cct gcg 480 Leu Gln His Phe Ser Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Lys Pro Ala 145 150 155 160 ttt atc gct tgg acg gtc ccc ttc acc cga aca ctt gac gcc ttt atg 528 Phe Ile Ala Trp Thr Val Pro Phe Thr Arg Thr Leu Asp Ala Phe Met 165 170 175 gat atg ggt ttg gtc gac gac ccg gca tat ctg ctg ttt gag ctc acc 576 Asp Met Gly Leu Val Asp Asp Pro Ala Tyr Leu Leu Phe Glu Leu Thr 180 185 190 gac tgc ggc atc cgt ggt gga cat ccg gga acg ata cgg ggg ctg cgt 624 Asp Cys Gly Ile Arg Gly Gly His Pro Gly Thr Ile Arg Gly Leu Arg 195 200 205 gca cat acc gac ttc ctg cca ccc gga cga cag atc caa tgg acc gtc 672 Ala His Thr Asp Phe Leu Pro Pro Gly Arg Gln Ile Gln Trp Thr Val 210 215 220 tgc aac aag atc ggc aac cta ttt ggc cct gct gct gcg gcc att gag 720 Cys Asn Lys Ile Gly Asn Leu Phe Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ile Glu 225 230 235 240 gaa gga gga cac gtc gca att ggc cta ggc gat tac ctc tat ccg gaa 768 Glu Gly Gly His Val Ala Ile Gly Leu Gly Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu 245 250 255 ttg ggt aca ccg acc aat gga gaa gtc gtt cag acc gta gcg aat atg 816 Leu Gly Thr Pro Thr Asn Gly Glu Val Val Gln Thr Val Ala Asn Met 260 265 270 gcg cgt gcg atg ggt cgt gag att gca acg cca gca gag aca aag gaa 864 Ala Arg Ala Met Gly Arg Glu Ile Ala Thr Pro Ala Glu Thr Lys Glu 275 280 285 att ctg ggt att agc aac tag 885 Ile Leu Gly Ile Ser Asn 290

【００９６】 <210> 4 <211> 294 <212> PRT <213> Alcaligenes sp. <400> 4 Met Thr Arg Thr Lys Leu Ile Leu Glu Ala Arg Ile Asn Glu Tyr Met 1 5 10 15 Pro Arg Arg Gly Asn Pro His Val Pro Trp Thr Pro Lys Glu Ile Gly 20 25 30 Glu Ala Ala Ala Gln Ala Arg Glu Ala Gly Ala Ser Ile Val His Phe 35 40 45 His Ala Arg Gln Ala Asp Gly Ser Pro Ser His Asp Tyr Glu Thr Tyr 50 55 60 Ala Glu Ser Ile Arg Glu Ile Arg Ala Arg Ser Asp Val Leu Val His 65 70 75 80 Pro Thr Leu Gly Gln Ile Thr Leu Gly Gly Arg Glu Ser Arg Leu Ala 85 90 95 His Ile Glu Arg Leu Cys Leu Asp Pro Ala Leu Lys Pro Asp Phe Ala 100 105 110 Pro Val Asp Leu Gly Ser Thr Asn Ile Asp Arg Tyr Asp Asp Val Glu 115 120 125 Lys Arg Tyr Glu Thr Gly Asp Arg Val Tyr Leu Asn Asn Ile Asp Thr 130 135 140 Leu Gln His Phe Ser Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Lys Pro Ala 145 150 155 160 Phe Ile Ala Trp Thr Val Pro Phe Thr Arg Thr Leu Asp Ala Phe Met 165 170 175 Asp Met Gly Leu Val Asp Asp Pro Ala Tyr Leu Leu Phe Glu Leu Thr 180 185 190 Asp Cys Gly Ile Arg Gly Gly His Pro Gly Thr Ile Arg Gly Leu Arg 195 200 205 Ala His Thr Asp Phe Leu Pro Pro Gly Arg Gln Ile Gln Trp Thr Val 210 215 220 Cys Asn Lys Ile Gly Asn Leu Phe Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ile Glu 225 230 235 240 Glu Gly Gly His Val Ala Ile Gly Leu Gly Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu 245 250 255 Leu Gly Thr Pro Thr Asn Gly Glu Val Val Gln Thr Val Ala Asn Met 260 265 270 Ala Arg Ala Met Gly Arg Glu Ile Ala Thr Pro Ala Glu Thr Lys Glu 275 280 285 Ile Leu Gly Ile Ser Asn 290

【００９７】 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Alcaligenes sp. <400> 5 Met Lys Ile Val Glu Ile Arg Glu Ile Thr Val Pro Ile Ser Ser Pro 1 5 10 15 Ile Arg Asn Ala Tyr Ile 20

【００９８】 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Alcaligenes sp. <400> 6 Met Thr Arg Thr Lys Leu Ile Leu Glu Ala Arg Ile Asn Glu Tyr Met 1 5 10 15 Pro Arg Arg Gly Asn Pro 20

【００９９】 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe for hybridization <220> <221> misc_feature <222> (6,15,24) <223> r=a or g <220> <221> misc_feature <222> (9,11,18,21,27,30,33,36) <223> n=inosine <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> m=a or c <400> 7 atgaaratng tngaratnmg ngaratnacn gtnccnat 38

【０１００】 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe for hybridization <220> <221> misc_feature <222> (6,9,11,18,21,24,27,30,33,36) <223> n=inosine <220> <221> misc_feature <222> (7,31) <223> m=a or c <220> <221> misc_feature <222> (15,27,42) <223> r=a or g <220> <221> misc_feature <222> (16,22,39,45) <223> y=c or t <400> 8 atgacnmgna cnaarytnat nytngargcn mgnatnaayg artayatgcc 50

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 内田 康一 東京都千代田区霞が関３丁目２番６号 日 本化学工業協会内 (72)発明者 寺沢 真人 東京都千代田区丸の内２丁目５番２号 三 菱化学株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA11 CA01 CA03 CA09 DA06 EA03 EA04 GA11 GA19 GA27 HA13 HA14 4B050 CC01 CC03 DD02 EE01 LL01 LL05 4B064 AD15 CA02 CA19 CA21 CB01 CC01 CC24 CD07 DA01 DA16 DA20 4B065 AA12Y AA26X AB01 AC14 AC16 BA02 BA25 BB01 BC01 BC03 BC06 BC26 BD15 BD29 BD50 CA11 CA31 CA44 CA60

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ断片。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
   るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
   加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列
   番号４に記載のアミノ酸配列を有するシスエポキシコハ
   ク酸加水分解酵素のβサブユニットとともにシスエポキ
   シコハク酸を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成する
   反応を触媒する活性を有するタンパク質を構成し得るポ
   リペプチド。
2. 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項１記載のＤＮＡ断片。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
   Ａ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
   ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号
   ４に記載のアミノ酸配列を有するシスエポキシコハク酸
   加水分解酵素のβサブユニットとともに、シスエポキシ
   コハク酸を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成する反
   応を触媒する活性を有するタンパク質を構成し得るポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ断片。 （Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
   るタンパク質。 （Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
   加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列
   番号２に記載のアミノ酸配列を有するシスエポキシコハ
   ク酸加水分解酵素のαサブユニットとともにシスエポキ
   シコハク酸を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成する
   反応を触媒する活性を有するタンパク質を構成し得るポ
   リペプチド。
4. 【請求項４】 下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡであ
   る請求項３記載のＤＮＡ断片。 （ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮ
   Ａ。 （ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリン
   ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号
   ２に記載のアミノ酸配列を有するシスエポキシコハク酸
   加水分解酵素のαサブユニットとともに、シスエポキシ
   コハク酸を加水分解してＤ（−）−酒石酸を生成する反
   応を触媒する活性を有するタンパク質を構成し得るポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１又は２に記載のＤＮＡ、及び請
   求項３又は４に記載のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤ
   ＮＡがベクターに連結された組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤ
   ＮＡが導入されることより形質転換された形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を培地で培養
   し、その培養物からシスエポキシコハク酸加水分解酵素
   又はそのサブユニットを採取することを特徴とするシス
   エポキシコハク酸加水分解酵素又はそのサブユニットの
   製造法。
9. 【請求項９】 請求項７記載の形質転換体、またはこの
   形質転換体の培養物から採取したシスエポキシコハク酸
   加水分解酵素の粗精製画分もしくは精製酵素の存在下
   で、シスエポキシコハク酸と水を反応させてＤ（−）−
   酒石酸を生成せしめることを特徴とするＤ（−）−酒石
   酸の製造法。