JPH1033181A - マレイン酸異性化酵素をコードするｄｎａおよびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アルスロバクター属由来のマレイン酸異性化
酵素をコードするＤＮＡを得、それを用いてフマル酸を
効率よく製造する。 【解決手段】 アルスロバクター・グロビホルミスに属
する微生物が産生するマレイン酸異性化酵素のＮ末端配
列をもとにプローブを合成し、該プローブと該菌体の染
色体ＤＮＡ断片とのサザンハイブリダイゼーションで目
的断片を有するλＤＮＡライブラリーを作成し、プラ−
クハイブリダイゼ−ション等の操作を行い、目的のＤＮ
Ａ断片を得、その塩基配列を決定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、マレイン酸異性化酵素
をコードするＤＮＡ及びその利用に関し、詳しくは、ア
ルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来であり、マレイ
ン酸を異性化してフマル酸を生成する活性を有する酵素
をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを保持する形質転換
体、及びこの形質転換体を用いた前記酵素の製造法並び
にフマル酸の製造法に関する。マレイン酸の異性化物で
あるフマル酸は、アスパラギン酸、リンゴ酸等の各種フ
ァインケミカルズの原料として利用できる有用な有機酸
である。

【０００２】

【従来の技術】マレイン酸を異性化してフマル酸を製造
する方法としては、主に化学的方法が提案されているが
（米国特許第２，８１６，９２３号、同第２，９５５，
１３６号、同第２，３３２，９９２号）、反応平衡によ
りフマル酸への変換率が制約を受けること、この方法は
高温反応であるためにマレイン酸あるいはフマル酸の劣
化が起こり、副生物を生成するため収率が低下するなど
の問題点を有している。

【０００３】一方、酵素反応によるフマル酸の製造に関
しては、マレイン酸異性化酵素（ｍａｌｅａｔｅ ｃｉ
ｓ−ｔｒａｎｓ −ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）がマレイン酸
をフマル酸へと異性化することが知られている。マレイ
ン酸異性化酵素を産生する微生物としては、例えばシュ
ードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ
ｐ．）［Ｋ． Ｏｔｓｕｋａ， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５， Ｎｏ．９， ｐ．
７２６ （１９６１）］、アルカリゲネス・フェカリス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＢ−
１４ ［Ｔａｋａｍｕｒａ， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．３３，ｐ．７１８（１９
６９）］、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ
２３７２８ ［Ｓｃｈｅｒ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．， Ｖｏｌ．２４４， ｐ．１８７８ （１９６
９）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ３７３６［Ｔ． Ｋｉｍ
ｕｒａ， Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．
５０， Ｎｏ．１， ｐ．８２（１９８６）］ 、アル
スロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＩＡＭ１２１０２
［Ｙ． Ｋａｔｏ， Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ．８０， Ｎｏ．
６， ｐ．６１０（１９９５）］が知られているもの
の、これらにより産生されるマレイン酸異性化酵素は、
酵素学的性質の一部が報告されているに過ぎず、該酵素
の正確な分子量、サブユニット構造、全アミノ酸配列、
全ＤＮＡ塩基配列などの詳細については未だ明かではな
い。また、工業的に用いるには従来のマレイン酸異性化
酵素そのままでは活性が低く、高活性な形質転換体を得
る必要があり、該酵素をコードするＤＮＡを単離するが
望まれていた。さらに、コリネ型細菌は、工業的に用い
られる微生物宿主として有用である。しかしながら、コ
リネ型細菌の属するグラム陽性菌からはマレイン酸異性
化酵素遺伝子が単離されておらず、グラム陽性菌である
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微
生物由来のマレイン酸異性化酵素遺伝子を単離すること
が望まれていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】アルスロバクター（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のマレイン酸異性化酵
素遺伝子を取得し、これを適当なベクターを用いて微生
物に導入し、菌体内に同遺伝子を多コピー保持する形質
転換体を得ることができれば、微生物の触媒能力を従来
の方法に比して飛躍的に増大させることが可能となる。

【０００５】本発明は、微生物由来のマレイン酸異性化
酵素をコードするＤＮＡ、及びそれを用いたフマル酸の
製造方法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アルスロ
バクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物から
マレイン酸異性化酵素をコードする遺伝子ＤＮＡ断片の
単離を目的として鋭意研究を重ねた結果、同遺伝子ＤＮ
Ａ断片を単離し、これをベクターに組み込んで組換えベ
クターとし、更にこの組換えベクターで微生物を形質転
換して、マレイン酸異性化酵素活性が向上した形質転換
体を調製し、これを使用してフマル酸あるいはフマル酸
を原料とした各種誘導体を効率的に製造することに成功
し、本発明を完成するに至った。

【０００７】かくして本発明によれば、（ａ）配列番号
１に示すアミノ酸配列を有し、マレイン酸を異性化して
フマル酸を生成する活性を実質的に害さないアミノ酸残
基の置換、欠失、挿入を有してもよいマレイン酸異性化
酵素をコードするＤＮＡ、（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡが
ベクターに連結されてなる組換えベクター、（ｃ）上記
（ａ）のＤＮＡが導入されて形質転換された形質転換
体、（ｄ）上記（ｃ）の形質転換体を培地で培養し、そ
の培養物からマレイン酸異性化酵素を採取することを特
徴とするマレイン酸異性化酵素の製造法、および（ｅ）
上記（ｃ）の形質転換体、またはこの形質転換体の培養
物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗精製画分もし
くは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に加え、
マレイン酸を異性化してフマル酸を生成せしめることを
特徴とするフマル酸の製造法が提供される。

【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の「マレイン酸異性化酵素（ｍａｌｅａｔｅ ｃｉ
ｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ； ＥＣ５．２．
１．１）」とは、マレイン酸（シス型）を異性化してフ
マル酸（トランス型）を生成する反応を触媒する酵素を
意味する。また、本明細書では、マレイン酸異性化酵素
をコードするＤＮＡを、便宜上「マレイン酸異性化酵素
遺伝子」ということがある。

【０００９】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子の塩
基配列としては、配列番号１のアミノ酸配列中のアミノ
酸番号１〜アミノ酸番号２７２に示すアミノ酸配列をコ
ードし得る塩基配列が挙げられる。また、本発明のＤＮ
Ａは、この配列に限定されるものではなく、前記アミノ
酸配列のうち、マレイン酸を異性化してフマル酸を生成
する活性を実質的に害さない限り、アミノ酸残基の置
換、欠失、挿入又は転移を有するマレイン酸異性化酵素
をコードするＤＮＡ、更にまた、これらのＤＮＡにハイ
ブリダイズし得るマレイン酸異性化酵素をコードするＤ
ＮＡのいずれもが本発明の遺伝子ＤＮＡに包含されるも
のである。

【００１０】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子の塩
基配列としてより具体的には、配列番号１に示すが挙げ
られる。

【００１１】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子は、
アルスロバクター属の微生物からクローニングすること
により初めて得られたものであるが、本発明によりその
塩基配列が決定されたので、この配列に基づいて合成す
ることも可能である。

【００１２】アルスロバクター属の微生物としては、ア
ルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＩＡＭ１２１０２、
アルスロバクター・パセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ ｐａｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ１２３４３、アルスロバク
ター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）ＩＡＭ１２１４０等［Ｙ．
Ｋａｔｏ， Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ．８０， Ｎｏ．６， ｐ．
６１０（１９９５）］が挙げられる。これらの菌株は、
東京大学細胞生物学研究所細胞・機能高分子総合センタ
ーＩＡＭカルチャーコレクションから入手可能である。

【００１３】以下に、これらの供給源微生物からマレイ
ン酸異性化酵素遺伝子を取得する方法、該遺伝子産物で
あるマレイン酸異性化酵素の製造法、及びマレイン酸を
異性化しフマル酸を生成させる方法の一例を説明する。

【００１４】マレイン酸異性化酵素遺伝子は、通常上記
の供給源微生物の染色体上に存在し、染色体由来のＤＮ
Ａライブラリーから以下に述べるハイブリダイゼーショ
ン法により分離・取得することができる。

【００１５】（１）マレイン酸異性化酵素の精製及びそ
のアミノ酸配列の部分的決定とそれに基づくＤＮＡプロ
ーブの作製：アルスロバクター・グロビホルミス ＩＡ
Ｍ１２１０２株等の菌体からマレイン酸異性化酵素を抽
出・精製する方法は、公知の酵素の精製に関するいずれ
の方法も使用できる。

【００１６】例えば菌体の破壊法としては、超音波破
砕；フレンチプレス、ホモジナイザーなどを用いた機械
的破壊法；リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を用い
ることができる。マレイン酸異性化酵素は、この菌体破
壊物より可溶性画分を分離することにより、粗酵素液と
して得ることができる。

【００１７】得られた粗酵素液からのマレイン酸異性化
酵素の精製法としては、通常、（イ）沈澱法による分
離、例えば硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラフィーによ
る分離法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティ吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグ
ラフィー等、（ハ）電気泳動による分離法等を組み合わ
せることによって実施することができ、その一例を実施
例２に詳述する。

【００１８】上記精製過程におけるマレイン酸異性化酵
素画分の検出は、マレイン酸異性化酵素活性を大塚らの
方法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．
２５， ｐ．７２６ （１９６１）］に従い、ブタ心臓
由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）存在
下、マレイン酸異性化酵素活性による基質マレイン酸の
減少を２４０ｎｍの吸光度減少として測定することによ
り、行うことができる。

【００１９】精製されたマレイン酸異性化酵素を、Ｄａ
ｖｉｓ法［Ｂ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．１２１， ｐ．４０４
（１９６４）］またはＬａｅｍｍｌｉ法［Ｕ．Ｋ．Ｌａ
ｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．２２７，
ｐ．６８０ （１９７０）］によるポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供し、クマシーブルー色素液［組成：
０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＲ２５
０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢
酸］、あるいは銀染色キット（和光純薬製）等を用いて
酵素タンパク質を染色することにより、精製純度および
マレイン酸異性化酵素の分子量等を知ることができる。

【００２０】精製されたマレイン酸異性化酵素のアミノ
酸配列の部分的決定は、同酵素をこれを構成するサブユ
ニットに分離後、各サブユニットのＮ末端からのアミノ
酸配列、あるいは適当なタンパク質分解酵素により各サ
ブユニットを消化して得られるペプチド断片のＮ末端か
らのアミノ酸配列を、エドマン分解法によるアミノ酸シ
ーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製、４７３
Ａ型）を用いて決定することにより、行うことができ
る。

【００２１】次いで、得られたアミノ酸配列から予想さ
れる塩基配列を持ったプローブをＤＮＡ合成装置（アプ
ライドバイオシステムズ社製、３９４型）を用いて合成
する。

【００２２】上記のようにして得られたマレイン酸異性
化酵素の部分アミノ酸配列の一例を、配列番号２に示し
た。また、該アミノ酸配列より推定されるプローブＤＮ
Ａの配列の一例を配列番号３及び４に示した。

【００２３】（２）マレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
染色体ＤＮＡ断片の単離：アルスロバクター・グロビホ
ルミス ＩＡＭ１２１０２株等の菌体から、マレイン酸
異性化酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡを単離する方法
は、遺伝子の単離に関する公知のいずれの方法もが使用
できる。以下にその一例を説明する。

【００２４】（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培
地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、
培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用す
ることも可能である。

【００２５】得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、
例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主
−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作
製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えば
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）等のラムダファージ
ベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２
（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。

【００２６】上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ
断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクター
λＦＩＸII（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な制
限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部分
分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結す
ることにより行うことができる。かくして染色体ＤＮＡ
ライブラリーが得られる。

【００２７】（Ｂ）マレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
ベクターの選別：上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡ
ライブラリーからマレイン酸異性化酵素遺伝子を含むベ
クターを選別するには、この染色体ＤＮＡライブラリー
を用いて宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形
質転換を行い、得られる形質導入体あるいは形質転換体
から、適当な手段によりマレイン酸異性化酵素遺伝子を
保持するクローンを選別すればよい。

【００２８】具体的には、上記ファージベクターをエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、例えばＰ２３９２株［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．
７， ｐ．１５１３ （１９７９）］に感染させ、これ
を寒天培地上に重層することによりプラークを形成させ
る。

【００２９】次いでこのプラーク中のファージＤＮＡを
ニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを
該ニトロセルロース膜に固定し、前記（１）項で作製し
たプローブ、例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を
有する合成オリゴヌクレオチドを用いたプラークハイブ
リダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）］を行う。

【００３０】こうして、アルスロバクター・グロビホル
ミスの染色体ＤＮＡ由来のマレイン酸異性化酵素遺伝子
を有するファージベクターを含む形質導入体を検出し、
選別することが可能である。

【００３１】あるいは上記プラスミドベクターを用いて
染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このラ
イブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質
転換し、得られた形質転換体から前記（１）で作製した
プローブ、例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を有
する合成オリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブリ
ダイゼーション法［Ｒ． Ｂｒｕｃｅ Ｗａｌｌａｃ
ｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，
Ｖｏｌ．９， ｐ．８７９ （１９８１）］を行うこ
とによっても選別可能である。

【００３２】更に、上記のようにして選別された形質導
入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいは
プラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵
素、例えばＰｖｕIIでベクターから切り出すことで本発
明のＤＮＡを取得することができる。

【００３３】上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片
につき、前記（１）で作製したプローブ、例えば配列番
号３及び４に示す塩基配列を有するプローブを用いてサ
ザンハイブリダイゼーション［Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．９８，
ｐ．３０３ （１９７５）］を行うことにより、マレイ
ン酸異性化酵素遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在するこ
とを再確認できる。

【００３４】このようにして得られるＤＮＡ断片の１つ
として、上記アルスロバクター・グロビホルミス ＩＡ
Ｍ１２１０２株染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩの完
全分解により切断して得られる、大きさが約３．７ｋｂ
のＤＮＡ断片を挙げることができる。

【００３５】（３）塩基配列の決定：前記（２）項で得
られたＰｖｕＩＩの約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基
配列は、例えばプラスミドｐＵＣ１１８ベクタ−（宝酒
造（株）製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
［ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ法 Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， Ｖｏｌ．７４，
ｐ．５４６３ （１９７７）］により決定することが
できる。

【００３６】このようにして決定された上記約３．７ｋ
ｂのＤＮＡ断片の塩基配列には、オープンリーデイング
フレームの存在が確認され、アルスロバクター・グロビ
ホルミス ＩＡＭ１２１０２株のマレイン酸異性化酵素
遺伝子は、後記配列表の配列番号１に示公すアミノ酸配
列中のアミノ酸番号１〜アミノ酸番号２７２の２７２個
のアミノ酸配列をコードする８１９塩基対から構成され
ることがわかった。また、得られた塩基配列（配列番号
１）には、前記（１）で決定した配列番号２に示すアミ
ノ酸配列から予想される塩基配列に相当する配列を含む
ことが再確認された。

【００３７】上記の塩基配列を包含する本発明のマレイ
ン酸異性化酵素遺伝子は、天然のアルスロバクター属細
菌の染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常
用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオ
システムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社
製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成さ
れたものであってもよい。

【００３８】（４）マレイン酸異性化酵素遺伝子を有す
る組換えベクター及びこの組換えベクターを保持する形
質転換体の作製：

【００３９】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子はま
たはこれを含むＤＮＡ断片は、これらを適当なベクター
に連結して組換えベクターを調製し、この組換えベクタ
ーで適当な宿主微生物を形質転換することにより、発現
させることができる。組換えベクターを調製する際に
は、通常、マレイン酸異性化酵素遺伝子を宿主微生物に
適したプロモーターとともに、このプロモーターの下流
に該遺伝子のコード領域の５’末端側が連結されるよう
にして、ベクターに挿入する。あるいはプロモーターを
含む発現ベクターを用い、これにマレイン酸異性化酵素
遺伝子を挿入してもよい。

【００４０】このような発現ベクターを用いた発現方法
の他に、プロモーターを連結したマレイン酸異性化酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物の染色体中に直
接導入する相同組換え技術［Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，
ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．５７， ｐ．２０３
６ （１９９３）、等］、あるいはトランスポゾンや挿
入配列等を用いて導入する技術［Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ
ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１１， ｐ．７３９ （１９９
４）、等］によっても発現させることができる。

【００４１】発現ベクターとしては、宿主微生物内で複
製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プ
ラスミドベクター、ファージベクターのいずれかを用い
ることができる。具体的なプラスミドベクターとして
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造
（株）から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＰＬ−
Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（以上は、例えばファルマシア社か
ら購入できる）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ３ＫＸ（米国特許第５，１８５，２６２号）、ある
いはこれらの誘導体等を挙げることができる。

【００４２】また、ファージベクターとしては、（λＦ
ｉｘＩＩベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入で
きる）等を挙げることができる。本発明のマレイン酸異
性化酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿
主微生物が保有するプロモーターを一般に用いることが
できるが、それに限られるものではなく、マレイン酸異
性化酵素遺伝子の転写を開始させるための原核生物由来
の塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良
い。具体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、
トリプトファンオペロンのプロモーター、λファージ由
来のＰＬプロモーター、トリプトファンラクトース雑種
（ｔａｃ）プロモーター［Ｈ．Ａ．Ｂｏｓｅ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．， Ｖｏｌ．８０， ｐ．２１ （１９８
３）］等が挙げられる。また、バチルス属細菌由来のプ
ロモーターが機能可能な微生物を宿主として用いる場合
には、得られたマレイン酸異性化酵素遺伝子固有のプロ
モーターを使用してもよい。更には、通常用いられるＤ
ＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたもの
であってもよい。

【００４３】これらのプローモーターのうち、発現効率
を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用
することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンの
プロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加すること
により遺伝子発現を誘導することができる。

【００４４】マレイン酸異性化酵素遺伝子を導入する宿
主としては、特に限定されるものではないが、エシェリ
ヒア（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ）属細菌、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）
属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属細菌等を好適に用いることができる。

【００４５】具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セラチア・マーセッ
センス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐ
ｕｔｉｄａ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コリネバ
クテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム
・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖ
ｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅ
ｎｔｕｍ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、サーマ
ス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチ
ルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）等を用いることがで
きる。

【００４６】上記宿主微生物への遺伝子の導入法として
はコンピテントセル法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．
１５９ （１９７０）］、パルス波通電法［Ｊ．Ｉｎｄ
ｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．５， ｐ．
１５９ （１９９０）］等による形質転換法、ファージ
を用いた形質導入法［Ｅ．Ｏｈｔｓｕｂｏ， Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ， Ｖｏｌ．６４， ｐ．１８９ （１９７
０）］、接合伝達法［Ｊ．Ｇ．Ｃ．Ｏｔｔｏｗ，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．２９，
ｐ．８０ （１９７５） ］、細胞融合法［Ｍ．Ｈ．
Ｇａｂｏｒ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， Ｖｏｌ．
１３７， ｐ．１３４６ （１９７９）］等を用いるこ
とができる。

【００４７】（５）本発明の形質転換体を用いたマレイ
ン酸異性化酵素の製造、及びマレイン酸異性化酵素を用
いたマレイン酸のフマル酸への異性化反応：上記（４）
のようにして得られる形質転換体またはこの形質転換体
の培養物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗精製画
分もしくは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に
加えることにより、マレイン酸を異性化してフマル酸を
生成せしめることができる。ここで培養物とは、形質転
換体の菌体又は／及び培養後の培地（培養に液体培地を
用いた場合にはその培養上清）をいう。

【００４８】上記形質転換体の培養は、炭素源、窒素
源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行
うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ
糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等
のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機
塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。

【００４９】培養は、通常、通気撹拌、振とう等の好気
条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温
度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨにつ
いても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限は
ない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加し
て行うことができる。

【００５０】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、マレイン酸異性化酵素遺
伝子の発現産物、すなわちマレイン酸異性化酵素を含有
する菌体を取得することができる。

【００５１】本発明のフマル酸の製造法に用いられる形
質転換体としては、該形質転換体を培養した培養液から
分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体の破砕物
もしくは抽出物等も用いることができる。また、形質転
換体より得られる粗酵素標品を用いてもよく、さらに精
製した酵素標品を使用してもよい。さらに、上記形質転
換体、その破砕物もしくは抽出物、または精製酵素を担
体に固定化したものも使用することができる。

【００５２】形質転換体を担体に固定化する場合には、
培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例
えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜
１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。ま
た、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手
段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出し
て得られるマレイン酸異性化酵素を含有する抽出物、該
抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の
処理を行って得られるマレイン酸異性化酵素の部分精製
成分等を担体に固定化したものも、本発明のフマル酸の
製造に使用することができる。

【００５３】これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精
製物の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方
法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、また
はカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる
方法により行うことができる。

【００５４】反応に用いる水性溶液は、マレイン酸を含
有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜
０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とするこ
とができる。この水性溶液には、更に菌体の細胞膜の物
質透過性を高める目的で、トルエン、キシレン、非イオ
ン性界面活性剤等を０．０５〜２％（ｗ／ｖ）添加する
こともできる。

【００５５】水性溶液中の反応原料となるマレイン酸濃
度は、０．１〜２Ｍ程度が適当である。マレイン酸の形
態は、酸あるいは塩の形態のみならず、その無水物を用
いることもできる。無水マレイン酸は水溶液とすること
により容易にマレイン酸に変換する。マレイン酸の塩と
しては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等を挙げるこ
とができる。

【００５６】上記の水性溶液における酵素反応温度およ
びｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ま
しくは２０〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５
〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。ま
た、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。また、マレイン酸イソメラーゼ活性を有す
る微生物またはその処理物をマレイン酸を含有する水溶
液中で酵素反応させるに際し、マレイン酸含有水溶液槽
内あるいは反応槽内またはその両者をＮ₂、Ａｒ、Ｈｅ
より選択される１つ以上のガスシール中で酵素反応を行
うことにより高収率でフマル酸を製造することも可能で
ある。

【００５７】かくして得られるフマル酸を含有する水性
溶液は、そのままリンゴ酸、アスパラギン酸等の製造原
料として用いることができる。以上に本発明を説明して
きたが、下記の実施例により更に具体的に説明する。し
かしながら、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助
とみなすべきのものであり、本発明の範囲を何等限定す
るものではない。

【００５８】

【実施例】

〔実施例１〕アルスロバクター・グロビホルミスＩＡＭ
１２１０２株が産生するマレイン酸異性化酵素の性質 （１）マレイン酸異性化酵素の精製 ５Ｌ容ジャーファーメンターに、ＹＡ培地［組成：マレ
イン酸二ナトリウム１０ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２ｇ、ＮａＣ
ｌ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．２ ｇ、イースト
・エキストラクト １０ｇ、蒸留水 １Ｌ（ｐＨ７．０
にＮａＯＨで調製）］３Ｌを入れ、１２１℃にて２０分
間減菌処理したものにアルスロバクター・グロビホルミ
スＩＡＭ１２１０２株を植菌し、３０℃にて２４時間振
とう培養した。培養後、遠心分離（３，０００×ｇ、４
℃、２０分間）により培養液より菌体を回収し、緩衝液
Ａ［組成：２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．２）、０．５ｍＭ ジチオレイトール（ｔｈｒｅｏ
−１，４−ｄｉｍｅｒｃａｐｔｏ−２，３−ｂｕｔａｎ
ｅｄｉｏｌ）］で洗浄した。

【００５９】得られた菌体を再度緩衝液Ａに懸濁し、約
３０％（ｗ／ｖ）の菌体懸濁液を超音波破砕器（ブラン
ソン社）にかけ菌体を破壊した。次いで、この菌体破壊
物を遠心分離（１２，０００×ｇ，４℃、３０分間）に
かけ、マレイン酸異性化酵素を含有する粗酵素液として
上清を回収した。得られた粗酵素液につき、２．２％
（ｗ／ｖ）となるようにストレプトマイシン硫酸塩を添
加し、除核酸した後、常法により３０〜７０％硫安沈澱
画分を回収し、上記緩衝液Ａ（４℃）中にて一夜透析し
た。得られた硫安画分を、緩衝液Ａにて平衡化したＤＥ
ＡＥ-Ｓｅｐｈａｃｅｌ（ファルマシア社）カラム（直
径２．６ｃｍ×３０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液Ａにて
十分洗浄後、塩化カリウムの直線濃度勾配（０〜０．２
Ｍ）によって溶出した。尚、流速は２ｍｌ／分とし、各
フラクションは１０ｍｌずつ分取した。マレイン酸異性
化酵素画分の検出は、マレイン酸異性化酵素活性を大塚
らの方法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏ
ｌ．２５，ｐ．７２６（１９６１）］に従い、ブタ心臓
由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）存在下
で、４５℃における基質マレイン酸の減少を、２４０ｎ
ｍの吸光度減少として分光光度計（ベックマン社ＤＵ７
５００）を用いて測定することにより行った。

【００６０】得られた活性画分を、限外濾過装置（東洋
濾紙製ＵＨＰ−４３Ｋ、分画分子量２０，０００）によ
り濃縮後、緩衝液Ａで平衡化されたゲル濾過カラム（フ
ァルマシア社製Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００、φ
ｌ．６×６０ｃｍ）にのせ、流速０．５ｍｌで溶出し
た。活性画分は上記と同様な方法で検出した。次に、得
られた活性画分を、緩衝液Ａで平衡化された陰イオン交
換カラム（ファルマシア社製Ｍｏｎｏ-Ｑ、φ１×１０
ｃｍ）にのせ、塩化カリウムの直線濃度勾配（０〜１
Ｍ）によって溶出し、得られた活性画分をマレイン酸異
性化酵素の精製画分とした。

【００６１】このマレイン酸異性化酵素の精製画分を、
前記のＤａｖｉｓ法およびＬａｅｍｍｌｉ法によるポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、クマシーブルー色
素液［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアント
ブル−Ｒ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％
（ｖ／ｖ）酢酸］により染色したところ、いずれの方法
においても、ほぼ単一のバンドが検出された。

【００６２】〔実施例２〕アルスロバクター・グロビホ
ルミス ＩＡＭ１２１０２株由来のマレイン酸異性化酵
素遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローン化 （１）マレイン酸異性化酵素の精製及びアミノ酸配列の
部分的決定とそれに基づくＤＮＡプローブの作製：実施
例１で用いたＹＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角
フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌処理したも
のに、アルスロバクター・グロビホルミスＩＡＭ１２１
０２株を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。

【００６３】次いで、上記と同様の培地１０００ｍｌを
３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０
分間滅菌処理したものに、上記培養物３０ｍｌを接種
し、３０℃にて２４時間通気撹拌培養した。培養後の培
養液を遠心分離（３，５００×ｇ、４℃、２０分間）し
菌体を回収した。

【００６４】得られた菌体からのマレイン酸異性化酵素
の抽出は、菌体を０．５ｍＭジチオスレイトールを含む
リン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．２）に懸濁し、超音
波破砕器（ブランソン社製）により菌体を破砕すること
により行った。菌体破砕物を遠心分離（１０，０００×
ｇ、４℃、３０分間）し、上清の可溶性画分を粗酵素液
として得た。

【００６５】次に、この粗酵素液を硫安分画（３５〜７
０％）し、上記リン酸緩衝液中に対して４℃で一夜透析
した。次いで、この透析液をＤＥＡＥセファロース（フ
ァルマシア社製）カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過
（セファクリルＳ−２００、ファルマシア社製）カラム
クロマトグラフィー、モノＱ（ファルマシア社製）カラ
ムクロマトグラフィーにかけ、マレイン酸異性化酵素の
活性画分を得た。

【００６６】マレイン酸異性化酵素の活性の検出は、大
塚らの方法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖ
ｏｌ．２５， ｐ．７２６ （１９６１）］に従い、ブ
タ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸光度変化と
して測定した。

【００６７】上記マレイン酸異性化酵素の精製画分をド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理液［組成：６２．
５ｍＭトリス-塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０
％グリセロール、５％２-メルカプトエタノール、０．
００１％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）］に溶解
し、９５℃にて３分間熱変性処理後、ポリアクリルアミ
ドゲル（１０〜２０％グラジエントゲル）電気泳動［２
５ｍＭトリス-１９２ｍＭグリシン-０．１％ＳＤＳから
なる緩衝液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電流で１
時間泳動］により分離し、上記と同様に染色したとこ
ろ、分子量約３０ｋＤａのバンドのみを検出した。これ
らの結果より、該マレイン酸異性化酵素は、分子量約３
０ｋＤａのみのサブユニットから成ることが推定され
た。

【００６８】この精製異性化酵素のＮ末端からのアミノ
酸配列をアミノ酸シーケンサー（アプライドバイオシス
テムズ社製、４７３Ａ型）を用いて決定し、その結果を
配列番号２に示した。

【００６９】次いで、得られたアミノ酸配列から予想さ
れる配列番号３及び４に示した塩基配列を有するプロー
ブＤＮＡをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム
ズ社製、３９４型）を用いて合成した。

【００７０】（２）マレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
染色体ＤＮＡ断片の調製：アルスロバクター・グロビホ
ルミス ＩＡＭ１２１０２株を前記ＹＡ培地を用いて３
０℃で対数増殖期後期まで振とう培養し、菌体を集め
た。

【００７１】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、リゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８.０）− １ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ（宝酒
造製）を最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加
し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が０.５％になるように添
加し、３０℃で６時間保温して溶菌させた。この溶菌液
に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室
温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離
（５,０００×ｇ， ２０分間，１０〜１２℃）し、上清
画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０.３Ｍ
となるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくり
と加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡを
ガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、
風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７.５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加
え、４℃で一晩静置し染色体ＤＮＡ溶液を得た。

【００７２】次に、染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限
酵素ＰｖｕII、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で
１時間反応させ完全分解し、アガロース電気泳動に供し
た。このアガロースゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移
し取り、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）及
び[γ-³²Ｐ]ＡＴＰを用いて５’末端リン酸基をラジオ
アイソトープラベル［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１５８， ３０７−３１５ （１９８６）］した配列番
号３及び４に示した合成プローブを用い、常法［Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ （１９８９）］に従ってサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。

【００７３】その結果、上記ナイロン膜上の約３．７ｋ
ｂの位置に、上記合成プローブが強くハイブリダイズす
るＤＮＡ断片の存在を確認した。

【００７４】（３）染色体ＤＮＡのベクターへの挿入：
上記（２）項で得たアルスロバクター・グロビホルミス
ＩＡＭ１２１０２株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１
０分間反応させて部分分解した。この様々な長さの部分
分解ＤＮＡと、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリ
メラーゼクレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）を用いてＴ（チミジン）、Ｃ（デオキシシ
トシン）を埋めたファージベクターλＦＩＸＩＩ（λＦ
ＩＸＩＩ／ＸｈｏＩ−ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎ
ｔｒｅａｔｅｄ ＤＮＡ：東洋紡績（株）製）とを混
合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）,１０ｍＭジ
チオスレイトール,１ｍＭＡＴＰ,１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂
およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添加
し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時
間反応させて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、
染色体ＤＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。 （４）形質転換体の作製及び目的組換え体ＤＮＡの選
別：上記（３）で作製したλＤＮＡライブラリーファー
ジ溶液（２〜５×１０⁴ｐｆｕ;ＳＭ緩衝液希釈）と、エ
シェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当量混合し、３
７℃で１５分間保温した。これに３０℃にて保温してお
いた ３〜４ｍｌのλ培地（１％ Ｔｒｙｐｔｏｎ，０.
５％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，０.５％ＮａＣｌ，
０.２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０.５％Ａｇａｒ）を加
え、λプレート（１％ Ｔｒｙｐｔｏｎ，０.５％ Ｎａ
Ｃｌ，０.２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，１％Ａｇａｒ）に
均一に塗布し、３７℃で１２〜１６時間培養した。

【００７５】この培地上にニトロセルロースフィルター
を載せ、培地上に形成されたプラークをフィルターに吸
着させ、順次５分間ずつ以下 イ)〜ハ)の試薬に浸した
濾紙上にフィルターをのせて処理した。

【００７６】イ)０.５Ｍ ＮａＯＨ，１.５Ｍ ＮａＣｌ ロ)０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１．５
Ｍ ＮａＣｌ，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ ハ)２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３
ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留
水１Ｌに溶解）

【００７７】上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時
間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。前記（１）で作製
した配列番号３及び４に示したプローブを用い、上記で
作製したフィルターにつきプラークハイブリダイゼーシ
ョンを常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従って行った。

【００７８】この結果、両方のプローブについてハイブ
リダイゼーション陽性のプラークを選択し、そこからフ
ァージＤＮＡを抽出して、制限酵素ＰｖｕIIで切り出さ
れる長さ約３．７ｋｂの挿入断片をアガロースゲル電気
泳動により確認した。 （５）マレイン酸異性化酵素遺伝子の位置の特定化 上記（４）で得られた長さが約３．７ｋｂのＤＮＡ（Ｐ
ｖｕII−ＰｖｕII）断片上に存在するマレイン酸異性化
酵素遺伝子の位置をさらに特定するために、該ＤＮＡ断
片を下記のようにプラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造
（株）製）へサブクローニングした。

【００７９】上記ＰｖｕIIで切り出されるＤＮＡ断片
と、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）
製）を、各々制限酵素ＰｖｕIIで切断した後、脱リン酸
化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７.６），１０ｍＭジチオスレイトール，１ｍＭ ＡＴ
Ｐ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １
ｕｎｉｔ の各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度
である）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＰｖｕII−
ＰｖｕII断片とベクターを連結させた。

【００８０】得られた連結反応液を用い、塩化カルシウ
ム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９ （１９７
０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを
含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキストラクト
５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに
溶解］に塗抹した。

【００８１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＰｖｕIIにより切断し、ハイブリダイゼー
ション法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミド
ｐＵＣ１１８の長さ２．８ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長
さ約３．７ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。

【００８２】上記で得られたプラスミドをｐＭＩ１２１
０２と命名し、該プラスミドで形質転換されたエシェリ
ヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）をＥＣＭＩ
１２１０２と命名した。

【００８３】〔実施例３〕塩基配列の決定：上記実施例
２の（５）項で得られたマレイン酸異性化酵素遺伝子を
含む長さが約３．７ｋｂのＤＮＡ（ＰｖｕII−ＰｖｕI
I）断片について、その塩基配列を実施例２記載のｐＭ
Ｉ１２１０２を鋳型として用いるダイデオキシヌクレオ
チド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ法）［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，プ
ロシ−デフィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ
・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ）Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３，（１９７７）］
により決定した。反応には、ＰＲＩＳＭ， Ｒｅａｄｙ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉ
ｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉ
ｔ （ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ 社製）を用いた。

【００８４】その塩基配列中のオープンリーデイングフ
レームの存在から、マレイン酸異性化酵素遺伝子は、後
記配列表の配列番号１に示す塩基配列を有し、２７２個
のアミノ酸をコードする８１９塩基対より構成されるこ
とが判明した。

【００８５】尚、この塩基配列の中には、実施例２の
（１）項で決定したアミノ酸配列（配列番号２）から予
想される塩基配列の全てに相当する配列が含まれている
ことが確認された。

【００８６】〔実施例４〕マレイン酸異性化酵素の製造
および活性の確認 実施例３で作製したＥＣＭＩ１２１０２株を、アンピシ
リン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０
ｇ，イーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ）に
植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得
られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０
分間）して菌体を回収後、リン酸緩衝液［組成：２０ｍ
Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭ
ジチオスレイトール］で洗浄した。

【００８７】次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上
記リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器
（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物
を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、
上清を粗酵素液として得た。

【００８８】対照として、外来遺伝子を含まないプラス
ミドｐＵＣ１１８について、実施例２（５）と全く同様
にエシェリヒア・コリＪＭ１０９株に形質転換し、該形
質転換体から上記と同様に粗酵素液を調製し、以下の活
性測定に供した。マレイン酸異性化酵素活性の確認は、
これらの粗酵素液について、前記実施例２の（１）項と
同様に、ブタ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハ
イム社製）存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸
光度変化として測定した［Ｋ．Ｏｔｓｕｋａ， Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５， ７２６ （１
９６１）］。その結果、ＥＣＭＩ１２１０２から調製さ
れた粗酵素液についてのみ２４０ｎｍの吸光度が減少
し、マレイン酸異性化酵素活性を検出し得た。

【００８９】〔実施例５〕マレイン酸異性化酵素を含む
形質転換体によるマレイン酸の異性化反応 実施例４と同様に、実施例２で作製したＥＣＭＩ１２１
０２株を、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む上記Ｌ
Ｂ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養
した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４
℃、２０分間）して菌体を回収後、０．９％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌで洗浄した。

【００９０】次いで、洗浄菌体０．１ｇ（湿重量）を
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ １ｍｌに懸濁し、反応液
［組成：マレイン酸ナトリウム ８４ｇ／Ｌ、Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００ １ｇ／ｌ］１ｍｌを添加後、４５℃で
１時間振とうして反応させた。反応後の反応液を遠心分
離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、得られた上
清液について有機酸カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０
１Ｈカラム）、ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速
液体クロマトグラフィー分析（島津社製、ＬＣ-５Ａ）
に供した。その結果、原料マレイン酸のピークの他にフ
マル酸のピークを検出し得た。また、上記反応により、
原料のマレイン酸が減少していることも確認された。

【００９１】以上の結果より、上記形質転換体が含有す
るマレイン酸異性化酵素の作用によりマレイン酸がフマ
ル酸へと異性化されていることが確認された。

【００９２】

【発明の効果】本発明により、アルスロバクター属の微
生物由来のマレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡ、
該ＤＮＡを有する組換えベクター、及び該組換えベクタ
ーを含有する形質転換体が提供される。

【００９３】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子を含
有する形質転換体により、常温条件下はもちろんのこ
と、高温条件下においても安定に活性を保持するマレイ
ン酸異性化酵素を著量生産することができ、本菌体ある
いは本菌から調製したマレイン酸異性化酵素を利用する
ことにより、マレイン酸からフマル酸を効率よく製造す
ることができる。

【００９４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アルスロバクター・グロビホルミス 株名：ＩＡＭ１２１０２ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１−８１６ 特徴を決定した方法：Ｅ ATG AGC ACC CTC GAA ACC ACC TGC GAA ACC GCG CCG GAA CCC AAG CGC 48 Met Ser Thr Leu Glu Thr Thr Cys Glu Thr Ala Pro Glu Pro Lys Arg 1 5 10 15 CCG GGC TCG TCC AGG GTG GGA CTC ATC GTC CCA AGC TCC AAC ACC ACC 96 Pro Gly Ser Ser Arg Val Gly Leu Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr 20 25 30 ATG GAG ACG GAG CTG CCA GAG CTG TTC CGC CGG CAG GCC GAG GCA ACC 144 Met Glu Thr Glu Leu Pro Glu Leu Phe Arg Arg Gln Ala Glu Ala Thr 35 40 45 GGC CAC AAC TAC ACC TTC CAC TCT GCC CGC GCC GGT ATG AAG AAA GTC 192 Gly His Asn Tyr Thr Phe His Ser Ala Arg Ala Gly Met Lys Lys Val 50 55 60 ACC CGG GAA GAG CTC CTG GCC ATG GTG GGC AAG GCA GCC GAC TGC GCG 240 Thr Arg Glu Glu Leu Leu Ala Met Val Gly Lys Ala Ala Asp Cys Ala 65 70 75 80 GAG GCG GTT TCC GAC GCC GAT GTG GAC GTC ATT GCC TAC GCC TGC CTT 288 Glu Ala Val Ser Asp Ala Asp Val Asp Val Ile Ala Tyr Ala Cys Leu 85 90 95 GTC GCC GTC ATG GCC CAG GGC CCC GGA GCT CAC GAG GGT TCG GAG ACA 336 Val Ala Val Met Ala Gln Gly Pro Gly Ala His Glu Gly Ser Glu Thr 100 105 110 GTG ATT GCA GAC GCC GCA GCC GGA AAC GGG CAC CCT GCC CCG GTG ACC 384 Val Ile Ala Asp Ala Ala Ala Gly Asn Gly His Pro Ala Pro Val Thr 115 120 125 AGC AGC GCC GGT GCC CTG GTC CGC ACC CTG CAG GAA ATC GGC GCA CTC 432 Ser Ser Ala Gly Ala Leu Val Arg Thr Leu Gln Glu Ile Gly Ala Leu 130 135 140 AAA GTG GCC ATG ATC ACC CCA TAC ATG AAG CCG CTC ACC AAG ATG GTG 480 Lys Val Ala Met Ile Thr Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Lys Met Val 145 150 155 160 GTG GAC TAC ATC GAG GGA TCC GGC ATC ACG GTG CTG GAC GCC ATC AGC 528 Val Asp Tyr Ile Glu Gly Ser Gly Ile Thr Val Leu Asp Ala Ile Ser 165 170 175 CTC GAG GTA GCG GAC AAC CTC GAG GTC GGC TGC CTT GAC CCG CAG AAC 576 Leu Glu Val Ala Asp Asn Leu Glu Val Gly Cys Leu Asp Pro Gln Asn 180 185 190 CTC CCC GCG CTT GCC CGC AGC CTG CAG CGC GAA GGC GCG GAC GCC GTC 624 Leu Pro Ala Leu Ala Arg Ser Leu Gln Arg Glu Gly Ala Asp Ala Val 195 200 205 GTG CTT TCA GCC TGT GTC CAG ATG CCG TCA CTG GCT GCG GTC CAG GCG 672 Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Ala Ala Val Gln Ala 210 215 220 GTG GAG GAC GAG CTC GGA CTG CCC GTC ATC ACG GCG GCC ACG GCC ACC 720 Val Glu Asp Glu Leu Gly Leu Pro Val Ile Thr Ala Ala Thr Ala Thr 225 230 235 240 ACC TAC GAG ATC CTC AAG GCG CTC GGA CAC CAG CCC GCC ATC GCC GGA 768 Thr Tyr Glu Ile Leu Lys Ala Leu Gly His Gln Pro Ala Ile Ala Gly 245 250 255 GCG GGC AGC CTG CTC TCC GGC GCC GGC GTC CTC ACC TCC GCC AAC TCC 816 Ala Gly Ser Leu Leu Ser Gly Ala Gly Val Leu Thr Ser Ala Asn Ser 260 265 270 272 TAA 819

【００９５】配列番号：２ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Thr Leu Glu Thr Thr Cys Glu Thr Ala Pro Glu Pro Lys Arg Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Arg Val Gly Leu Ile 20 24

【００９６】配列番号：３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 配列 GARACNACNT GYGARACNGC NCCNGARCC 29

【００９７】配列番号：４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 GARACNGCNC CNGARCCNAA RMGNCCNGG 29

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、
   マレイン酸を異性化してフマル酸を生成する活性を実質
   的に害さないアミノ酸残基の置換、欠失、挿入を有して
   もよいマレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号１に示す塩基配列又はこれと実
   質的に同一な塩基配列を有する請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡがベクター
   に連結されてなる組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項１又は２記載のＤＮＡが導入され
   ることにより形質転換された形質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地で培養
   し、その培養物からマレイン酸異性化酵素を採取するこ
   とを特徴とするマレイン酸異性化酵素の製造法。
6. 【請求項６】 請求項４記載の形質転換体、またはこの
   形質転換体の培養物から採取したマレイン酸異性化酵素
   の粗精製画分もしくは精製酵素をマレイン酸を含有する
   水性溶液に加え、マレイン酸を異性化してフマル酸を生
   成せしめることを特徴とするフマル酸の製造法。