JPH104967A - マレイン酸異性化酵素をコードするｄｎａおよびその利用 - Google Patents
マレイン酸異性化酵素をコードするｄｎａおよびその利用Info
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- JPH104967A JPH104967A JP8159851A JP15985196A JPH104967A JP H104967 A JPH104967 A JP H104967A JP 8159851 A JP8159851 A JP 8159851A JP 15985196 A JP15985196 A JP 15985196A JP H104967 A JPH104967 A JP H104967A
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- isomerase
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- acid
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 マレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡを
得、それを用いてフマル酸を効率よく製造する。 【解決手段】 バチルス・サーキュランスに属する微生
物が産生するマレイン酸異性化酵素のＮ末端配列をもと
にプローブを合成し、該プローブと該菌体の染色体ＤＮ
Ａ断片とのサザンハイブリダイゼーションで目的断片を
有するλＤＮＡライブラリーを作成し、プラ−クハイブ
リダイゼ−ション等の操作を行い、目的のＤＮＡ断片を
得、その塩基配列を決定する。
得、それを用いてフマル酸を効率よく製造する。 【解決手段】 バチルス・サーキュランスに属する微生
物が産生するマレイン酸異性化酵素のＮ末端配列をもと
にプローブを合成し、該プローブと該菌体の染色体ＤＮ
Ａ断片とのサザンハイブリダイゼーションで目的断片を
有するλＤＮＡライブラリーを作成し、プラ−クハイブ
リダイゼ−ション等の操作を行い、目的のＤＮＡ断片を
得、その塩基配列を決定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、マレイン酸異性化酵素
をコードするＤＮＡ及びその利用に関し、詳しくは、バ
チルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃ
ｕｌａｎｓ）由来であり、マレイン酸を異性化してフマ
ル酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、
このＤＮＡを保持する形質転換体、及びこの形質転換体
を用いた前記酵素の製造法並びにフマル酸の製造法に関
する。マレイン酸の異性化物であるフマル酸は、アスパ
ラギン酸、リンゴ酸等の各種ファインケミカルズの原料
として利用できる有用な有機酸である。
をコードするＤＮＡ及びその利用に関し、詳しくは、バ
チルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃ
ｕｌａｎｓ）由来であり、マレイン酸を異性化してフマ
ル酸を生成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、
このＤＮＡを保持する形質転換体、及びこの形質転換体
を用いた前記酵素の製造法並びにフマル酸の製造法に関
する。マレイン酸の異性化物であるフマル酸は、アスパ
ラギン酸、リンゴ酸等の各種ファインケミカルズの原料
として利用できる有用な有機酸である。
【０００２】
【従来の技術】マレイン酸を異性化してフマル酸を製造
する方法としては、主に化学的方法が提案されているが
（米国特許第２，８１６，９２３号、同第２，９５５，
１３６号、同第２，３３２，９９２号）、反応平衡によ
りフマル酸への変換率が制約を受けること、この方法は
高温反応であるためにマレイン酸あるいはフマル酸の劣
化が起こり、副生物を生成するため収率が低下するなど
の問題点を有している。
する方法としては、主に化学的方法が提案されているが
（米国特許第２，８１６，９２３号、同第２，９５５，
１３６号、同第２，３３２，９９２号）、反応平衡によ
りフマル酸への変換率が制約を受けること、この方法は
高温反応であるためにマレイン酸あるいはフマル酸の劣
化が起こり、副生物を生成するため収率が低下するなど
の問題点を有している。
【０００３】一方、酵素反応によるフマル酸の製造に関
しては、マレイン酸異性化酵素（ｍａｌｅａｔｅ ｃｉ
ｓ−ｔｒａｎｓ −ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）がマレイン酸
をフマル酸へと異性化することが知られている。マレイ
ン酸異性化酵素を産生する微生物としては、例えばシュ
ードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ
ｐ．）［Ｋ． Ｏｔｓｕｋａ， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５， Ｎｏ．９， ｐ．
７２６ （１９６１）］、アルカリゲネス・フェカリス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＢ−
１４ ［Ｔａｋａｍｕｒａ， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．３３，ｐ．７１８（１９
６９）］、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ
２３７２８ ［Ｓｃｈｅｒ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．， Ｖｏｌ．２４４， ｐ．１８７８ （１９６
９）］が知られているものの、これらにより産生される
マレイン酸異性化酵素は、酵素学的性質の一部が報告さ
れているに過ぎず、該酵素の正確な分子量、サブユニッ
ト構造、全アミノ酸配列、全ＤＮＡ塩基配列などの詳細
については未だ明かではない。また、工業的に用いるに
は従来のマレイン酸異性化酵素そのままでは活性が低
く、高活性な形質転換体を得る必要があり、該酵素をコ
ードするＤＮＡを単離するが望まれていた。
しては、マレイン酸異性化酵素（ｍａｌｅａｔｅ ｃｉ
ｓ−ｔｒａｎｓ −ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）がマレイン酸
をフマル酸へと異性化することが知られている。マレイ
ン酸異性化酵素を産生する微生物としては、例えばシュ
ードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ
ｐ．）［Ｋ． Ｏｔｓｕｋａ， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５， Ｎｏ．９， ｐ．
７２６ （１９６１）］、アルカリゲネス・フェカリス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＢ−
１４ ［Ｔａｋａｍｕｒａ， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．３３，ｐ．７１８（１９
６９）］、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ
２３７２８ ［Ｓｃｈｅｒ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．， Ｖｏｌ．２４４， ｐ．１８７８ （１９６
９）］が知られているものの、これらにより産生される
マレイン酸異性化酵素は、酵素学的性質の一部が報告さ
れているに過ぎず、該酵素の正確な分子量、サブユニッ
ト構造、全アミノ酸配列、全ＤＮＡ塩基配列などの詳細
については未だ明かではない。また、工業的に用いるに
は従来のマレイン酸異性化酵素そのままでは活性が低
く、高活性な形質転換体を得る必要があり、該酵素をコ
ードするＤＮＡを単離するが望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】マレイン酸異性化酵素
遺伝子を取得し、これを適当なベクターを用いて微生物
に導入し、菌体内に同遺伝子を多コピー保持する形質転
換体を得ることができれば、微生物の触媒能力を従来の
方法に比して飛躍的に増大させることが可能となる。
遺伝子を取得し、これを適当なベクターを用いて微生物
に導入し、菌体内に同遺伝子を多コピー保持する形質転
換体を得ることができれば、微生物の触媒能力を従来の
方法に比して飛躍的に増大させることが可能となる。
【０００５】本発明は、微生物由来のマレイン酸異性化
酵素をコードするＤＮＡ、及びそれを用いたフマル酸の
製造方法を提供することを課題とする。
酵素をコードするＤＮＡ、及びそれを用いたフマル酸の
製造方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、バチルス
・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａ
ｎｓ）種の微生物からマレイン酸異性化酵素をコードす
る遺伝子ＤＮＡ断片の単離を目的として鋭意研究を重ね
た結果、同遺伝子ＤＮＡ断片を単離し、これをベクター
に組み込んで組換えベクターとし、更にこの組換えベク
ターで微生物を形質転換して、マレイン酸異性化酵素活
性が向上した形質転換体を調製し、これを使用してフマ
ル酸あるいはフマル酸を原料とした各種誘導体を効率的
に製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａ
ｎｓ）種の微生物からマレイン酸異性化酵素をコードす
る遺伝子ＤＮＡ断片の単離を目的として鋭意研究を重ね
た結果、同遺伝子ＤＮＡ断片を単離し、これをベクター
に組み込んで組換えベクターとし、更にこの組換えベク
ターで微生物を形質転換して、マレイン酸異性化酵素活
性が向上した形質転換体を調製し、これを使用してフマ
ル酸あるいはフマル酸を原料とした各種誘導体を効率的
に製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】かくして本発明によれば、（ａ）配列番号
１に示すアミノ酸配列を有し、マレイン酸を異性化して
フマル酸を生成する活性を実質的に害さないアミノ酸残
基の置換、欠失、挿入を有してもよいマレイン酸異性化
酵素をコードするＤＮＡ、（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡが
ベクターに連結されてなる組換えベクター、（ｃ）上記
（ａ）のＤＮＡが導入されて形質転換された形質転換
体、（ｄ）上記（ｃ）の形質転換体を培地で培養し、そ
の培養物からマレイン酸異性化酵素を採取することを特
徴とするマレイン酸異性化酵素の製造法、および（ｅ）
上記（ｃ）の形質転換体、またはこの形質転換体の培養
物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗精製画分もし
くは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に加え、
マレイン酸を異性化してフマル酸を生成せしめることを
特徴とするフマル酸の製造法が提供される。
１に示すアミノ酸配列を有し、マレイン酸を異性化して
フマル酸を生成する活性を実質的に害さないアミノ酸残
基の置換、欠失、挿入を有してもよいマレイン酸異性化
酵素をコードするＤＮＡ、（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡが
ベクターに連結されてなる組換えベクター、（ｃ）上記
（ａ）のＤＮＡが導入されて形質転換された形質転換
体、（ｄ）上記（ｃ）の形質転換体を培地で培養し、そ
の培養物からマレイン酸異性化酵素を採取することを特
徴とするマレイン酸異性化酵素の製造法、および（ｅ）
上記（ｃ）の形質転換体、またはこの形質転換体の培養
物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗精製画分もし
くは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に加え、
マレイン酸を異性化してフマル酸を生成せしめることを
特徴とするフマル酸の製造法が提供される。
【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の「マレイン酸異性化酵素（ｍａｌｅａｔｅ ｃｉ
ｓ−ｔｒａｎｓ −ｉｓｏｍｅｒａｓｅ； ＥＣ５．
２．１．１）」とは、マレイン酸（シス型）を異性化し
てフマル酸（トランス型）を生成する反応を触媒する酵
素を意味する。また、本明細書では、マレイン酸異性化
酵素をコードするＤＮＡを、便宜上「マレイン酸異性化
酵素遺伝子」ということがある。
発明の「マレイン酸異性化酵素（ｍａｌｅａｔｅ ｃｉ
ｓ−ｔｒａｎｓ −ｉｓｏｍｅｒａｓｅ； ＥＣ５．
２．１．１）」とは、マレイン酸（シス型）を異性化し
てフマル酸（トランス型）を生成する反応を触媒する酵
素を意味する。また、本明細書では、マレイン酸異性化
酵素をコードするＤＮＡを、便宜上「マレイン酸異性化
酵素遺伝子」ということがある。
【０００９】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子の塩
基配列としては、配列番号１のアミノ酸配列中のアミノ
酸番号１〜アミノ酸番号２５１に示すアミノ酸配列をコ
ードし得る塩基配列が挙げられる。また、本発明のＤＮ
Ａは、この配列に限定されるものではなく、前記アミノ
酸配列のうち、マレイン酸を異性化してフマル酸を生成
する活性を実質的に害さない限り、アミノ酸残基の置
換、欠失、挿入又は転移を有するマレイン酸異性化酵素
をコードするＤＮＡ、更にまた、これらのＤＮＡにハイ
ブリダイズし得るマレイン酸異性化酵素をコードするＤ
ＮＡのいずれもが本発明の遺伝子ＤＮＡに包含されるも
のである。
基配列としては、配列番号１のアミノ酸配列中のアミノ
酸番号１〜アミノ酸番号２５１に示すアミノ酸配列をコ
ードし得る塩基配列が挙げられる。また、本発明のＤＮ
Ａは、この配列に限定されるものではなく、前記アミノ
酸配列のうち、マレイン酸を異性化してフマル酸を生成
する活性を実質的に害さない限り、アミノ酸残基の置
換、欠失、挿入又は転移を有するマレイン酸異性化酵素
をコードするＤＮＡ、更にまた、これらのＤＮＡにハイ
ブリダイズし得るマレイン酸異性化酵素をコードするＤ
ＮＡのいずれもが本発明の遺伝子ＤＮＡに包含されるも
のである。
【００１０】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子の塩
基配列としてより具体的には、配列番号１に示す塩基配
列が挙げられる。
基配列としてより具体的には、配列番号１に示す塩基配
列が挙げられる。
【００１１】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子は、
バチルス・サーキュランスからクローニングすることに
より、初めて得られたものであるが、本発明によりその
塩基配列が決定されたので、この配列に基づいて合成す
ることも可能である。
バチルス・サーキュランスからクローニングすることに
より、初めて得られたものであるが、本発明によりその
塩基配列が決定されたので、この配列に基づいて合成す
ることも可能である。
【００１２】バチルス・サーキュランスとしては、バチ
ルス・サーキュランス ＭＩ−１１３株が挙げられる。
本菌株は、後記実施例１に示すようにして本発明者らに
より単離された株であり、通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５６４５の受託番号
で寄託されている。
ルス・サーキュランス ＭＩ−１１３株が挙げられる。
本菌株は、後記実施例１に示すようにして本発明者らに
より単離された株であり、通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５６４５の受託番号
で寄託されている。
【００１３】以下に、上記微生物からマレイン酸異性化
酵素遺伝子を取得する方法、該遺伝子産物であるマレイ
ン酸異性化酵素の製造法、及びマレイン酸を異性化しフ
マル酸を生成させる方法の一例を説明する。
酵素遺伝子を取得する方法、該遺伝子産物であるマレイ
ン酸異性化酵素の製造法、及びマレイン酸を異性化しフ
マル酸を生成させる方法の一例を説明する。
【００１４】マレイン酸異性化酵素遺伝子は、通常上記
の供給源微生物の染色体上に存在し、染色体由来のＤＮ
Ａライブラリーから以下に述べるハイブリダイゼーショ
ン法により分離・取得することができる。
の供給源微生物の染色体上に存在し、染色体由来のＤＮ
Ａライブラリーから以下に述べるハイブリダイゼーショ
ン法により分離・取得することができる。
【００１５】（１）マレイン酸異性化酵素の精製及びそ
のアミノ酸配列の部分的決定とそれに基づくＤＮＡプロ
ーブの作製：バチルス・サーキュランス ＭＩ−１１３
株の菌体からマレイン酸異性化酵素を抽出・精製する方
法は、公知の酵素の精製に関するいずれの方法も使用で
きる。
のアミノ酸配列の部分的決定とそれに基づくＤＮＡプロ
ーブの作製：バチルス・サーキュランス ＭＩ−１１３
株の菌体からマレイン酸異性化酵素を抽出・精製する方
法は、公知の酵素の精製に関するいずれの方法も使用で
きる。
【００１６】例えば菌体の破壊法としては、超音波破
砕；フレンチプレス、ホモジナイザーなどを用いた機械
的破壊法；リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を用い
ることができる。マレイン酸異性化酵素は、この菌体破
壊物より可溶性画分を分離することにより、粗酵素液と
して得ることができる。
砕；フレンチプレス、ホモジナイザーなどを用いた機械
的破壊法；リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を用い
ることができる。マレイン酸異性化酵素は、この菌体破
壊物より可溶性画分を分離することにより、粗酵素液と
して得ることができる。
【００１７】得られた粗酵素液からのマレイン酸異性化
酵素の精製法としては、通常、（イ）沈澱法による分
離、例えば硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラフィーによ
る分離法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティ吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグ
ラフィー等、（ハ）電気泳動による分離法等を組み合わ
せることによって実施することができ、その一例を実施
例２に詳述する。
酵素の精製法としては、通常、（イ）沈澱法による分
離、例えば硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラフィーによ
る分離法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティ吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグ
ラフィー等、（ハ）電気泳動による分離法等を組み合わ
せることによって実施することができ、その一例を実施
例２に詳述する。
【００１８】上記精製過程におけるマレイン酸異性化酵
素画分の検出は、マレイン酸異性化酵素活性を大塚らの
方法［Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏ
ｌ．２５， ｐ．７２６ （１９６１）］に従い、ブタ
心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）存
在下、マレイン酸異性化酵素活性による基質マレイン酸
の減少を２４０ｎｍの吸光度減少として測定することに
より、行うことができる。
素画分の検出は、マレイン酸異性化酵素活性を大塚らの
方法［Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏ
ｌ．２５， ｐ．７２６ （１９６１）］に従い、ブタ
心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）存
在下、マレイン酸異性化酵素活性による基質マレイン酸
の減少を２４０ｎｍの吸光度減少として測定することに
より、行うことができる。
【００１９】精製されたマレイン酸異性化酵素を、Ｄａ
ｖｉｓ法［Ｂ． Ｊ． Ｄａｖｉｓ， Ａｎｎ． Ｎ．
Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．１２１，
ｐ．４０４ （１９６４）］またはＬａｅｍｍｌｉ法
［Ｕ． Ｋ． Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖ
ｏｌ．２２７， ｐ．６８０ （１９７０）］によるポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブルー
色素液［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアン
トブルーＲ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０
％（ｖ／ｖ）酢酸］、あるいは銀染色キット（和光純薬
製）等を用いて酵素タンパク質を染色することにより、
精製純度およびマレイン酸異性化酵素の分子量等を知る
ことができる。
ｖｉｓ法［Ｂ． Ｊ． Ｄａｖｉｓ， Ａｎｎ． Ｎ．
Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．１２１，
ｐ．４０４ （１９６４）］またはＬａｅｍｍｌｉ法
［Ｕ． Ｋ． Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖ
ｏｌ．２２７， ｐ．６８０ （１９７０）］によるポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブルー
色素液［組成：０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアン
トブルーＲ２５０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０
％（ｖ／ｖ）酢酸］、あるいは銀染色キット（和光純薬
製）等を用いて酵素タンパク質を染色することにより、
精製純度およびマレイン酸異性化酵素の分子量等を知る
ことができる。
【００２０】精製されたマレイン酸異性化酵素のアミノ
酸配列の部分的決定は、同酵素をこれを構成するサブユ
ニットに分離後、各サブユニットのＮ末端からのアミノ
酸配列、あるいは適当なタンパク質分解酵素により各サ
ブユニットを消化して得られるペプチド断片のＮ末端か
らのアミノ酸配列を、エドマン分解法によるアミノ酸シ
ーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製、４７３
Ａ型）を用いて決定することにより、行うことができ
る。
酸配列の部分的決定は、同酵素をこれを構成するサブユ
ニットに分離後、各サブユニットのＮ末端からのアミノ
酸配列、あるいは適当なタンパク質分解酵素により各サ
ブユニットを消化して得られるペプチド断片のＮ末端か
らのアミノ酸配列を、エドマン分解法によるアミノ酸シ
ーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製、４７３
Ａ型）を用いて決定することにより、行うことができ
る。
【００２１】次いで、得られたアミノ酸配列から予想さ
れる塩基配列を持ったプローブをＤＮＡ合成装置（アプ
ライドバイオシステムズ社製、３９４型）を用いて合成
する。
れる塩基配列を持ったプローブをＤＮＡ合成装置（アプ
ライドバイオシステムズ社製、３９４型）を用いて合成
する。
【００２２】上記のようにして得られたマレイン酸異性
化酵素の部分アミノ酸配列の一例を、配列番号２に示し
た。また、該アミノ酸配列より推定されるプローブＤＮ
Ａの配列の一例を配列番号３及び４に示した。
化酵素の部分アミノ酸配列の一例を、配列番号２に示し
た。また、該アミノ酸配列より推定されるプローブＤＮ
Ａの配列の一例を配列番号３及び４に示した。
【００２３】（２）マレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
染色体ＤＮＡ断片の単離：バチルス・サーキュランス
ＭＩ−１１３株の菌体から、マレイン酸異性化酵素遺伝
子を含む染色体ＤＮＡを単離する方法は、遺伝子の単離
に関する公知のいずれの方法もが使用できる。以下にそ
の一例を説明する。
染色体ＤＮＡ断片の単離：バチルス・サーキュランス
ＭＩ−１１３株の菌体から、マレイン酸異性化酵素遺伝
子を含む染色体ＤＮＡを単離する方法は、遺伝子の単離
に関する公知のいずれの方法もが使用できる。以下にそ
の一例を説明する。
【００２４】（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培
地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、
培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用す
ることも可能である。
上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培
地で培養した該菌株の菌体を使用することができるが、
培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用す
ることも可能である。
【００２５】得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、
例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主
−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作
製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えば
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）等のラムダファージ
ベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２
（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。
例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主
−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作
製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えば
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）等のラムダファージ
ベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２
（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。
【００２６】上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ
断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクター
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な
制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部
分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮ
Ａライブラリーが得られる。
断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクター
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な
制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部
分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮ
Ａライブラリーが得られる。
【００２７】（Ｂ）マレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
ベクターの選別：上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡ
ライブラリーからマレイン酸異性化酵素遺伝子を含むベ
クターを選別するには、この染色体ＤＮＡライブラリー
を用いて宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形
質転換を行い、得られる形質導入体あるいは形質転換体
から、適当な手段によりマレイン酸異性化酵素遺伝子を
保持するクローンを選別すればよい。
ベクターの選別：上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡ
ライブラリーからマレイン酸異性化酵素遺伝子を含むベ
クターを選別するには、この染色体ＤＮＡライブラリー
を用いて宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形
質転換を行い、得られる形質導入体あるいは形質転換体
から、適当な手段によりマレイン酸異性化酵素遺伝子を
保持するクローンを選別すればよい。
【００２８】具体的には、上記ファージベクターをエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、例えばＰ２３９２株［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏ
ｌ．７， ｐ．１５１３ （１９７９）］に感染させ、
これを寒天培地上に重層することによりプラークを形成
させる。
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、例えばＰ２３９２株［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏ
ｌ．７， ｐ．１５１３ （１９７９）］に感染させ、
これを寒天培地上に重層することによりプラークを形成
させる。
【００２９】次いでこのプラーク中のファージＤＮＡを
ニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを
該ニトロセルロース膜に固定し、前記（１）項で作製し
たプローブ、例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を
有する合成オリゴヌクレオチドを用いたプラークハイブ
リダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）］を行う。
ニトロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを
該ニトロセルロース膜に固定し、前記（１）項で作製し
たプローブ、例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を
有する合成オリゴヌクレオチドを用いたプラークハイブ
リダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）］を行う。
【００３０】こうして、バチルス・サーキュランス の
染色体ＤＮＡ由来のマレイン酸異性化酵素遺伝子を有す
るファージベクターを含む形質導入体を検出し、選別す
ることが可能である。
染色体ＤＮＡ由来のマレイン酸異性化酵素遺伝子を有す
るファージベクターを含む形質導入体を検出し、選別す
ることが可能である。
【００３１】あるいは上記プラスミドベクターを用いて
染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このラ
イブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質
転換し、得られた形質転換体から前記（１）で作製した
プローブ、例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を有
する合成オリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブリ
ダイゼーション法［Ｒ． Ｂｒｕｃｅ Ｗａｌｌａｃ
ｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．９， ｐ．８７９ （１９８
１）］を行うことによっても選別可能である。
染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このラ
イブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質
転換し、得られた形質転換体から前記（１）で作製した
プローブ、例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を有
する合成オリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブリ
ダイゼーション法［Ｒ． Ｂｒｕｃｅ Ｗａｌｌａｃ
ｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．９， ｐ．８７９ （１９８
１）］を行うことによっても選別可能である。
【００３２】更に、上記のようにして選別された形質導
入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいは
プラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵
素、例えばＨｉｎｄＩＩＩでベクターから切り出すこと
で本発明のＤＮＡを取得することができる。
入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいは
プラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵
素、例えばＨｉｎｄＩＩＩでベクターから切り出すこと
で本発明のＤＮＡを取得することができる。
【００３３】上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片
につき、前記（１）で作製したプローブ、例えば配列番
号３及び４に示す塩基配列を有するプローブを用いてサ
ザンハイブリダイゼーション［Ｅ． Ｍ． Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．９
８， ｐ．５０３ （１９７５）］を行うことにより、
マレイン酸異性化酵素遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在
することを再確認できる。
につき、前記（１）で作製したプローブ、例えば配列番
号３及び４に示す塩基配列を有するプローブを用いてサ
ザンハイブリダイゼーション［Ｅ． Ｍ． Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．９
８， ｐ．５０３ （１９７５）］を行うことにより、
マレイン酸異性化酵素遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在
することを再確認できる。
【００３４】このようにして得られるＤＮＡ断片の１つ
として、上記バチルス・サーキュランス ＭＩ−１１３
株染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩの完全分解により切
断して得られる、大きさが約４ｋｂのＤＮＡ断片を挙げ
ることができる。
として、上記バチルス・サーキュランス ＭＩ−１１３
株染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩの完全分解により切
断して得られる、大きさが約４ｋｂのＤＮＡ断片を挙げ
ることができる。
【００３５】（３）塩基配列の決定：前記（２）項で得
られたＰｓｔＩの４ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配列は、
例えばプラスミドｐＵＣ１１８ベクタ−（宝酒造（株）
製）を用いるダイデオキシヌクレオチド酵素法［ｄｉｄ
ｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法、Ｓ
ａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ， Ｖｏｌ．７４， ｐ．
５４６３ （１９７７）］により決定することができ
る。
られたＰｓｔＩの４ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配列は、
例えばプラスミドｐＵＣ１１８ベクタ−（宝酒造（株）
製）を用いるダイデオキシヌクレオチド酵素法［ｄｉｄ
ｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法、Ｓ
ａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ， Ｖｏｌ．７４， ｐ．
５４６３ （１９７７）］により決定することができ
る。
【００３６】このようにして決定された上記約４ｋｂの
ＤＮＡ断片の塩基配列には、オープンリーデイングフレ
ームの存在が確認され、バチルス・サーキュランス Ｍ
Ｉ−１１３株のマレイン酸異性化酵素遺伝子は、後記配
列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号
１〜２５１の２５１個のアミノ酸配列をコードする７５
３塩基対から構成されることがわかった。また、得られ
た塩基配列（配列番号１）には、前記（１）で決定した
配列番号２に示すアミノ酸配列から予想される塩基配列
に相当する配列を含むことが再確認された。
ＤＮＡ断片の塩基配列には、オープンリーデイングフレ
ームの存在が確認され、バチルス・サーキュランス Ｍ
Ｉ−１１３株のマレイン酸異性化酵素遺伝子は、後記配
列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号
１〜２５１の２５１個のアミノ酸配列をコードする７５
３塩基対から構成されることがわかった。また、得られ
た塩基配列（配列番号１）には、前記（１）で決定した
配列番号２に示すアミノ酸配列から予想される塩基配列
に相当する配列を含むことが再確認された。
【００３７】上記の塩基配列を包含する本発明のマレイ
ン酸異性化酵素遺伝子は、天然のバチルス・サーキュラ
ンスの染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通
常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて
合成されたものであってもよい。
ン酸異性化酵素遺伝子は、天然のバチルス・サーキュラ
ンスの染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通
常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて
合成されたものであってもよい。
【００３８】（４）マレイン酸異性化酵素遺伝子を有す
る組換えベクター及びこの組換えベクターを保持する形
質転換体の作製：
る組換えベクター及びこの組換えベクターを保持する形
質転換体の作製：
【００３９】本発明のマレイン酸異性化酵素遺伝子はま
たはこれを含むＤＮＡ断片は、これらを適当なベクター
に連結して組換えベクターを調製し、この組換えベクタ
ーで適当な宿主微生物を形質転換することにより、発現
させることができる。組換えベクターを調製する際に
は、通常、マレイン酸異性化酵素遺伝子を宿主微生物に
適したプロモーターとともに、このプロモーターの下流
に該遺伝子のコード領域の５’末端側が連結されるよう
にして、ベクターに挿入する。あるいはプロモーターを
含む発現ベクターを用い、これにマレイン酸異性化酵素
遺伝子を挿入してもよい。
たはこれを含むＤＮＡ断片は、これらを適当なベクター
に連結して組換えベクターを調製し、この組換えベクタ
ーで適当な宿主微生物を形質転換することにより、発現
させることができる。組換えベクターを調製する際に
は、通常、マレイン酸異性化酵素遺伝子を宿主微生物に
適したプロモーターとともに、このプロモーターの下流
に該遺伝子のコード領域の５’末端側が連結されるよう
にして、ベクターに挿入する。あるいはプロモーターを
含む発現ベクターを用い、これにマレイン酸異性化酵素
遺伝子を挿入してもよい。
【００４０】このような発現ベクターを用いた発現方法
の他に、プロモーターを連結したマレイン酸異性化酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物の染色体中に直
接導入する相同組換え技術［Ａ． Ａ． Ｖｅｒｔｅ
ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．５７，
ｐ．２０３６ （１９９３）、等］、あるいはトランス
ポゾンや挿入配列等を用いて導入する技術［Ａ． Ａ．
Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１１， ｐ．７３
９ （１９９４）、等］によっても発現させることがで
きる。
の他に、プロモーターを連結したマレイン酸異性化酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物の染色体中に直
接導入する相同組換え技術［Ａ． Ａ． Ｖｅｒｔｅ
ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．５７，
ｐ．２０３６ （１９９３）、等］、あるいはトランス
ポゾンや挿入配列等を用いて導入する技術［Ａ． Ａ．
Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１１， ｐ．７３
９ （１９９４）、等］によっても発現させることがで
きる。
【００４１】発現ベクターとしては、宿主微生物内で複
製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プ
ラスミドベクター、ファージベクターのいずれかを用い
ることができる。具体的なプラスミドベクターとして
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造
（株）から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＰＬ−
Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（以上は、例えばファルマシア社か
ら購入できる）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ３ＫＸ（米国特許第５，１８５，２６２号）、ある
いはこれらの誘導体等を挙げることができる。
製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プ
ラスミドベクター、ファージベクターのいずれかを用い
ることができる。具体的なプラスミドベクターとして
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造
（株）から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＰＬ−
Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（以上は、例えばファルマシア社か
ら購入できる）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ３ＫＸ（米国特許第５，１８５，２６２号）、ある
いはこれらの誘導体等を挙げることができる。
【００４２】また、ファージベクターとしては、（λＦ
ｉｘＩＩベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入で
きる）等を挙げることができる。本発明のマレイン酸異
性化酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿
主微生物が保有するプロモーターを一般に用いることが
できるが、それに限られるものではなく、マレイン酸異
性化酵素遺伝子の転写を開始させるための原核生物由来
の塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良
い。具体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、
トリプトファンオペロンのプロモーター、λファージ由
来のＰＬプロモーター、トリプトファンラクトース雑種
（ｔａｃ）プロモーター［Ｈ． Ａ． Ｂｏｓｅ ｅｔ
ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， Ｖｏｌ．８０， ｐ．２
１（１９８３）］等が挙げられる。また、バチルス属細
菌由来のプロモーターが機能可能な微生物を宿主として
用いる場合には、得られたマレイン酸異性化酵素遺伝子
固有のプロモーターを使用してもよい。さらに、プロモ
ーターの塩基配列が分かっている場合には、通常用いら
れるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステ
ムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３
９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成された
ものであってもよい。
ｉｘＩＩベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入で
きる）等を挙げることができる。本発明のマレイン酸異
性化酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿
主微生物が保有するプロモーターを一般に用いることが
できるが、それに限られるものではなく、マレイン酸異
性化酵素遺伝子の転写を開始させるための原核生物由来
の塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良
い。具体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、
トリプトファンオペロンのプロモーター、λファージ由
来のＰＬプロモーター、トリプトファンラクトース雑種
（ｔａｃ）プロモーター［Ｈ． Ａ． Ｂｏｓｅ ｅｔ
ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， Ｖｏｌ．８０， ｐ．２
１（１９８３）］等が挙げられる。また、バチルス属細
菌由来のプロモーターが機能可能な微生物を宿主として
用いる場合には、得られたマレイン酸異性化酵素遺伝子
固有のプロモーターを使用してもよい。さらに、プロモ
ーターの塩基配列が分かっている場合には、通常用いら
れるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステ
ムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３
９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成された
ものであってもよい。
【００４３】これらのプローモーターのうち、発現効率
を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用
することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンの
プロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加すること
により遺伝子発現を誘導することができる。
を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用
することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンの
プロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加すること
により遺伝子発現を誘導することができる。
【００４４】マレイン酸異性化酵素遺伝子を導入する宿
主としては、特に限定されるものではないが、エシェリ
ヒア（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ）属細菌、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）
属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属細菌等を好適に用いることができる。
主としては、特に限定されるものではないが、エシェリ
ヒア（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ）属細菌、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）
属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属細菌等を好適に用いることができる。
【００４５】具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セラチア・マーセッ
センス（Ｓｅｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シ
ュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コリネバク
テリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・
フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
ｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎ
ｔｕｍ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、サーマス
・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチル
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）等を用いることがで
きる。
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セラチア・マーセッ
センス（Ｓｅｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シ
ュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コリネバク
テリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・
フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
ｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎ
ｔｕｍ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、サーマス
・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチル
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）等を用いることがで
きる。
【００４６】上記宿主微生物への遺伝子の導入法として
はコンピテントセル法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．
１５９ （１９７０）］、パルス波通電法［Ｊ． Ｉｎ
ｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．５，
ｐ．１５９ （１９９０）］等による形質転換法、ファ
ージを用いた形質導入法［Ｅ． Ｏｈｔｓｕｂｏ， Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ．６４， ｐ．１８９ （１
９７０）］、接合伝達法［Ｊ． Ｇ． Ｃ．Ｏｔｔｏ
ｗ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
Ｖｏｌ．２９，ｐ．８０ （１９７５） ］、細胞融合
法［Ｍ． Ｈ． Ｇａｂｏｒ， Ｊ．ｃｔｅｒｉｏ
ｌ．， Ｖｏｌ．１３７， ｐ．１３４６ （１９７
９）］等を用いることができる。
はコンピテントセル法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．
１５９ （１９７０）］、パルス波通電法［Ｊ． Ｉｎ
ｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．５，
ｐ．１５９ （１９９０）］等による形質転換法、ファ
ージを用いた形質導入法［Ｅ． Ｏｈｔｓｕｂｏ， Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ．６４， ｐ．１８９ （１
９７０）］、接合伝達法［Ｊ． Ｇ． Ｃ．Ｏｔｔｏ
ｗ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
Ｖｏｌ．２９，ｐ．８０ （１９７５） ］、細胞融合
法［Ｍ． Ｈ． Ｇａｂｏｒ， Ｊ．ｃｔｅｒｉｏ
ｌ．， Ｖｏｌ．１３７， ｐ．１３４６ （１９７
９）］等を用いることができる。
【００４７】（５）本発明の形質転換体を用いたマレイ
ン酸異性化酵素の製造、及びマレイン酸異性化酵素を用
いたマレイン酸のフマル酸への異性化反応：上記（４）
のようにして得られる形質転換体またはこの形質転換体
の培養物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗精製画
分もしくは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に
加えることにより、マレイン酸を異性化してフマル酸を
生成せしめることができる。ここで培養物とは、形質転
換体の菌体又は／及び培養後の培地（培養に液体培地を
用いた場合にはその培養上清）をいう。
ン酸異性化酵素の製造、及びマレイン酸異性化酵素を用
いたマレイン酸のフマル酸への異性化反応：上記（４）
のようにして得られる形質転換体またはこの形質転換体
の培養物から採取したマレイン酸異性化酵素の粗精製画
分もしくは精製酵素をマレイン酸を含有する水性溶液に
加えることにより、マレイン酸を異性化してフマル酸を
生成せしめることができる。ここで培養物とは、形質転
換体の菌体又は／及び培養後の培地（培養に液体培地を
用いた場合にはその培養上清）をいう。
【００４８】上記形質転換体の培養は、炭素源、窒素
源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行
うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ
糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等
のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機
塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。
源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行
うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ
糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等
のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機
塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。
【００４９】培養は、通常、通気撹拌、振とう等の好気
条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温
度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨにつ
いても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限は
ない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加し
て行うことができる。
条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温
度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨにつ
いても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限は
ない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加し
て行うことができる。
【００５０】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、マレイン酸異性化酵素遺
伝子の発現産物、すなわちマレイン酸異性化酵素を含有
する菌体を取得することができる。
より菌体を集めることにより、マレイン酸異性化酵素遺
伝子の発現産物、すなわちマレイン酸異性化酵素を含有
する菌体を取得することができる。
【００５１】本発明のフマル酸の製造法に用いられる形
質転換体としては、該形質転換体を培養した培養液から
分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体の破砕
物、抽出物、形質転換体より得られる粗酵素標品、精製
した酵素標品を使用してもよい。さらに、上記形質転換
体、その破砕物、抽出物または精製酵素を担体に固定化
したものも使用することができる。
質転換体としては、該形質転換体を培養した培養液から
分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体の破砕
物、抽出物、形質転換体より得られる粗酵素標品、精製
した酵素標品を使用してもよい。さらに、上記形質転換
体、その破砕物、抽出物または精製酵素を担体に固定化
したものも使用することができる。
【００５２】形質転換体を担体に固定化する場合には、
培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例
えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜
１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。ま
た、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手
段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出し
て得られるマレイン酸異性化酵素を含有する抽出物、該
抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の
処理を行って得られるマレイン酸異性化酵素の部分精製
成分等を担体に固定化したものも、本発明のフマル酸の
製造に使用することができる。
培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例
えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜
１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。ま
た、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手
段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出し
て得られるマレイン酸異性化酵素を含有する抽出物、該
抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の
処理を行って得られるマレイン酸異性化酵素の部分精製
成分等を担体に固定化したものも、本発明のフマル酸の
製造に使用することができる。
【００５３】これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精
製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている
方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、ま
たはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させ
る方法により行うことができる。
製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている
方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、ま
たはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させ
る方法により行うことができる。
【００５４】反応に用いる水性溶液は、マレイン酸を含
有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜
０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とするこ
とができる。この水性溶液には、更に菌体の細胞膜の物
質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシ
レン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２％（ｗ／
ｖ）添加することもできる。
有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜
０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とするこ
とができる。この水性溶液には、更に菌体の細胞膜の物
質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシ
レン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２％（ｗ／
ｖ）添加することもできる。
【００５５】水性溶液中の反応原料となるマレイン酸濃
度は、０．１〜２Ｍ程度が適当である。マレイン酸の形
態は、酸あるいは塩の形態のみならず、その無水物を用
いることもできる。無水マレイン酸は水溶液とすること
により容易にマレイン酸に変換する。マレイン酸の塩と
しては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等を挙げるこ
とができる。
度は、０．１〜２Ｍ程度が適当である。マレイン酸の形
態は、酸あるいは塩の形態のみならず、その無水物を用
いることもできる。無水マレイン酸は水溶液とすること
により容易にマレイン酸に変換する。マレイン酸の塩と
しては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等を挙げるこ
とができる。
【００５６】上記の水性溶液における酵素反応温度およ
びｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ま
しくは１５〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５
〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。ま
た、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。かくして得られるフマル酸を含有する水性
溶液は、そのままリンゴ酸、アスパラギン酸等の製造原
料として用いることができる。以上に本発明を説明して
きたが、下記の実施例により更に具体的に説明する。し
かしながら、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助
とみなすべきのものであり、本発明の範囲を限定するも
のではない。
びｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ま
しくは１５〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５
〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。ま
た、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。かくして得られるフマル酸を含有する水性
溶液は、そのままリンゴ酸、アスパラギン酸等の製造原
料として用いることができる。以上に本発明を説明して
きたが、下記の実施例により更に具体的に説明する。し
かしながら、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助
とみなすべきのものであり、本発明の範囲を限定するも
のではない。
【００５７】
〔実施例１〕マレイン酸異性化酵素活性を有する微生物
の分離 （１）マレイン酸資化性微生物の分離 自然界から採取した土壌試料を、培地Ａ［組成：マレイ
ン酸二ナトリウム ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．７ｇ、Ｋ2
ＨＰＯ4 １．４ｇ、ＮＨ4ＮＯ3 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、ビオチン ０．２ｍｇ、チアミン・
塩酸塩 ０．２ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、
ＭｎＳＯ4 ２０ｍｇ、蒸留水 １Ｌ（ｐＨ７．２）］
１０ｍｌに投入し、４０℃にて２日間、好気的に振とう
培養する。この培養物１ｍｌを、上記培地Ａ１０ｍｌに
植え継ぎ、更に２日間培養した。この集積培養の操作を
２回行った後、寒天２％を含む上記培地Ａの組成を有す
る平板培地に塗抹し、４０℃にて２〜４日培養した。こ
の平板培地上に生育したコロニーを単離した。
の分離 （１）マレイン酸資化性微生物の分離 自然界から採取した土壌試料を、培地Ａ［組成：マレイ
ン酸二ナトリウム ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．７ｇ、Ｋ2
ＨＰＯ4 １．４ｇ、ＮＨ4ＮＯ3 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、ビオチン ０．２ｍｇ、チアミン・
塩酸塩 ０．２ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、
ＭｎＳＯ4 ２０ｍｇ、蒸留水 １Ｌ（ｐＨ７．２）］
１０ｍｌに投入し、４０℃にて２日間、好気的に振とう
培養する。この培養物１ｍｌを、上記培地Ａ１０ｍｌに
植え継ぎ、更に２日間培養した。この集積培養の操作を
２回行った後、寒天２％を含む上記培地Ａの組成を有す
る平板培地に塗抹し、４０℃にて２〜４日培養した。こ
の平板培地上に生育したコロニーを単離した。
【００５８】（２）マレイン酸異性化酵素活性を有する
微生物の選定 上記（１）で単離された微生物を前記培地Ａ５ｍｌを用
い、４０℃にて１日振とう培養し、遠心分離（３，００
０×ｇ、４℃、２０分間）により菌体を回収した。次い
で得られた菌体を、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含
有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに懸濁
し、超音波破砕器（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ
ＵＣＤ−２００Ｔ）により、菌体を破砕し（４℃、１５
分間）、破砕物を遠心分離した上清を回収し酵素液とし
た。
微生物の選定 上記（１）で単離された微生物を前記培地Ａ５ｍｌを用
い、４０℃にて１日振とう培養し、遠心分離（３，００
０×ｇ、４℃、２０分間）により菌体を回収した。次い
で得られた菌体を、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含
有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに懸濁
し、超音波破砕器（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ
ＵＣＤ−２００Ｔ）により、菌体を破砕し（４℃、１５
分間）、破砕物を遠心分離した上清を回収し酵素液とし
た。
【００５９】マレイン酸異性化酵素活性の検出は、上記
で得られた酵素液を、反応液Ａ［組成：マレイン酸ナト
リウム ５０ｍＭ、ジチオスレイトール １ｍＭ、トリ
ス塩酸緩衝液 １００ｍＭ（ｐＨ８）］０．５ｍｌに添
加し、４０℃にて２４時間反応させた。得られた反応液
について、有機酸分析カラム［ＳｅｑｕｅＴａｇＴＭ
（０．５ｘ２５ｃｍ ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａ
ｒｃｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．］、ＵＶ検出器（２４０ｎｍ）
を用いた高速液体クロマトグラフィー分析（島津社製、
ＬＣ−５Ａ）に供した（移動相：５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4及
び５ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を含む３５％メタノール溶液）。上
記（１）で分離された微生物の内、マレイン酸異性化酵
素活性を有する微生物は、原料マレイン酸のピークの他
にフマル酸のピークが生じている微生物として選出し
た。上記分離操作により得られたマレイン酸異性化酵素
活性を有する微生物１株、ＭＩ−１１３を取得した。こ
の分離菌株について、前期の如く更に菌学的諸性質を調
べた結果、新規菌株であることが判明し、バチルス・サ
ーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎ
ｓ）ＭＩ−１１３株と命名した。本菌は生命工学工業技
術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５６４５として
寄託されている。
で得られた酵素液を、反応液Ａ［組成：マレイン酸ナト
リウム ５０ｍＭ、ジチオスレイトール １ｍＭ、トリ
ス塩酸緩衝液 １００ｍＭ（ｐＨ８）］０．５ｍｌに添
加し、４０℃にて２４時間反応させた。得られた反応液
について、有機酸分析カラム［ＳｅｑｕｅＴａｇＴＭ
（０．５ｘ２５ｃｍ ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａ
ｒｃｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．］、ＵＶ検出器（２４０ｎｍ）
を用いた高速液体クロマトグラフィー分析（島津社製、
ＬＣ−５Ａ）に供した（移動相：５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4及
び５ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を含む３５％メタノール溶液）。上
記（１）で分離された微生物の内、マレイン酸異性化酵
素活性を有する微生物は、原料マレイン酸のピークの他
にフマル酸のピークが生じている微生物として選出し
た。上記分離操作により得られたマレイン酸異性化酵素
活性を有する微生物１株、ＭＩ−１１３を取得した。こ
の分離菌株について、前期の如く更に菌学的諸性質を調
べた結果、新規菌株であることが判明し、バチルス・サ
ーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎ
ｓ）ＭＩ−１１３株と命名した。本菌は生命工学工業技
術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５６４５として
寄託されている。
【００６０】１．形態学的性質 形態：桿菌 胞子 ：形成せず（非典型性状） グラム染色性：陽性 運動性：なし
【００６１】２．生理的性質（＋：陽性、−：陰性） 酸素に対する態度 ：通性嫌気性 嫌気下での生育 ：＋ カタラーゼ ：＋ Ｖ−Ｐ反応 ：− Ｖ−ＰブロスでのｐＨ：５．７ 酸の生成： ・グルコース ：＋ ・アラビノース ：＋ ・キシロース ：＋ ・マンニトール ：＋ グルコースからのガスの生成：− ゼラチンの液化 ：＋ デンプンの分解 ：＋ クエン酸塩の利用 ：＋ プロピオン酸塩の利用：− 卵黄反応 ：− 硝酸塩の還元 ：＋ ｐＨ６．８での生育（ニュートリエントブロス）：＋ ｐＨ５．７での生育 ：− ５％ＮａＣｌ存在下での生育：− ７％ＮａＣｌ存在下での生育：− １０℃での生育 ：− ３０℃での生育 ：＋ ４０℃での生育 ：＋ ５０℃での生育 ：− マレイン酸異性化酵素活性 ：＋ ３．菌体成分の特徴 菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）：３９％ 細胞壁のジアミノ酸 ：ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸 キノン系 ：ＭＫ−７
【００６２】〔実施例２〕バチルス・サーキュランス
ＭＩ−１１３株由来のマレイン酸異性化酵素遺伝子を含
むＤＮＡ断片のクローン化 （１）マレイン酸異性化酵素の精製及びアミノ酸配列の
部分的決定とそれに基づくＤＮＡプローブの作製： 培地Ａ［組成：マレイン酸二ナトリウム ５ｇ、ＫＨ2
ＰＯ4 ０．７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １．４ｇ、ＮＨ4ＮＯ3
１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、ビオチン
０．２ｍｇ、チアミン塩酸塩 ０．２ｍｇ、ＦｅＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ２０ｍｇ、蒸留水
１Ｌ（ｐＨ７．２に調整）］１００ｍｌを５００ｍｌ容
の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌処理
したものに、バチルス・サーキュランス ＭＩ−１１３
株を植菌し、４０℃にて２４時間振とう培養した。
ＭＩ−１１３株由来のマレイン酸異性化酵素遺伝子を含
むＤＮＡ断片のクローン化 （１）マレイン酸異性化酵素の精製及びアミノ酸配列の
部分的決定とそれに基づくＤＮＡプローブの作製： 培地Ａ［組成：マレイン酸二ナトリウム ５ｇ、ＫＨ2
ＰＯ4 ０．７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １．４ｇ、ＮＨ4ＮＯ3
１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、ビオチン
０．２ｍｇ、チアミン塩酸塩 ０．２ｍｇ、ＦｅＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ２０ｍｇ、蒸留水
１Ｌ（ｐＨ７．２に調整）］１００ｍｌを５００ｍｌ容
の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌処理
したものに、バチルス・サーキュランス ＭＩ−１１３
株を植菌し、４０℃にて２４時間振とう培養した。
【００６３】次いで、上記と同様の培地１０００ｍｌを
３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０
分間滅菌処理したものに、上記培養物３０ｍｌを接種
し、４０℃にて２４時間通気撹拌培養した。培養後の培
養液を遠心分離（３，５００×ｇ、４℃、２０分間）し
菌体を回収した。
３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０
分間滅菌処理したものに、上記培養物３０ｍｌを接種
し、４０℃にて２４時間通気撹拌培養した。培養後の培
養液を遠心分離（３，５００×ｇ、４℃、２０分間）し
菌体を回収した。
【００６４】得られた菌体からのマレイン酸異性化酵素
の抽出は、菌体を０．５ｍＭジチオスレイトールを含む
リン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．２）に懸濁し、超音
波破砕器（ブランソン社製）により菌体を破砕すること
により行った。菌体破砕物を遠心分離（１０，０００×
ｇ、４℃、３０分間）し、上清の可溶性画分を粗酵素液
として得た。
の抽出は、菌体を０．５ｍＭジチオスレイトールを含む
リン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．２）に懸濁し、超音
波破砕器（ブランソン社製）により菌体を破砕すること
により行った。菌体破砕物を遠心分離（１０，０００×
ｇ、４℃、３０分間）し、上清の可溶性画分を粗酵素液
として得た。
【００６５】次に、この粗酵素液を硫安分画（３５〜７
０％）し、上記リン酸緩衝液中に対して４℃で一夜透析
した。次いで、この透析液をＤＥＡＥセファロース（フ
ァルマシア社製）カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過
（セファクリルＳ−２００、ファルマシア社製）カラム
クロマトグラフィー、モノＱ（ファルマシア社製）カラ
ムクロマトグラフィーにかけ、マレイン酸異性化酵素の
活性画分を得た。
０％）し、上記リン酸緩衝液中に対して４℃で一夜透析
した。次いで、この透析液をＤＥＡＥセファロース（フ
ァルマシア社製）カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過
（セファクリルＳ−２００、ファルマシア社製）カラム
クロマトグラフィー、モノＱ（ファルマシア社製）カラ
ムクロマトグラフィーにかけ、マレイン酸異性化酵素の
活性画分を得た。
【００６６】マレイン酸異性化酵素の活性の検出は、大
塚らの方法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖ
ｏｌ．２５， ｐ．７２６ （１９６１）］に従い、ブ
タ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸光度変化と
して測定した。
塚らの方法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖ
ｏｌ．２５， ｐ．７２６ （１９６１）］に従い、ブ
タ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸光度変化と
して測定した。
【００６７】上記マレイン酸異性化酵素の精製画分をポ
リアクリルアミドゲル（４〜２０％グラジエントゲル）
電気泳動［２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシンからな
る緩衝液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電流で１時
間泳動］により分離し、クマシーブルー色素［組成：
０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＲ２５
０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢
酸］によって染色したところ、分子量約６０ｋＤａの単
一バンドが検出された。更に同精製画分をドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）処理液［組成：６２．５ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロ
ール、５％２−メルカプトエタノール、０．００１％ブ
ロモフェノールブルー（ＢＰＢ）］に溶解し、９５℃に
て３分間熱変性処理後、ポリアクリルアミドゲル（１０
〜２０％グラジエントゲル）電気泳動［２５ｍＭトリス
−１９２ｍＭグリシン−０．１％ＳＤＳからなる緩衝液
（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電流で１時間泳動］
により分離し、上記と同様に染色したところ、分子量約
３０ｋＤａのバンドのみを検出した。これらの結果よ
り、該マレイン酸異性化酵素の構成は、分子量約３０ｋ
Ｄａのサブユニットから成る分子量約６０ｋＤａの２量
体であることが推定された。
リアクリルアミドゲル（４〜２０％グラジエントゲル）
電気泳動［２５ｍＭトリス−１９２ｍＭグリシンからな
る緩衝液（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電流で１時
間泳動］により分離し、クマシーブルー色素［組成：
０．２％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＲ２５
０、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢
酸］によって染色したところ、分子量約６０ｋＤａの単
一バンドが検出された。更に同精製画分をドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）処理液［組成：６２．５ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロ
ール、５％２−メルカプトエタノール、０．００１％ブ
ロモフェノールブルー（ＢＰＢ）］に溶解し、９５℃に
て３分間熱変性処理後、ポリアクリルアミドゲル（１０
〜２０％グラジエントゲル）電気泳動［２５ｍＭトリス
−１９２ｍＭグリシン−０．１％ＳＤＳからなる緩衝液
（ｐＨ８．４）中にて、４０ｍＡ定電流で１時間泳動］
により分離し、上記と同様に染色したところ、分子量約
３０ｋＤａのバンドのみを検出した。これらの結果よ
り、該マレイン酸異性化酵素の構成は、分子量約３０ｋ
Ｄａのサブユニットから成る分子量約６０ｋＤａの２量
体であることが推定された。
【００６８】この精製異性化酵素のＮ末端からのアミノ
酸配列をアミノ酸シーケンサー（アプライドバイオシス
テムズ社製、４７３Ａ型）を用いて決定し、その結果を
配列番号２に示した。次いで、得られたアミノ酸配列か
ら予想される配列番号３及び４に示した塩基配列を有す
るプローブＤＮＡをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオ
システムズ社製、３９４型）を用いて合成した。
酸配列をアミノ酸シーケンサー（アプライドバイオシス
テムズ社製、４７３Ａ型）を用いて決定し、その結果を
配列番号２に示した。次いで、得られたアミノ酸配列か
ら予想される配列番号３及び４に示した塩基配列を有す
るプローブＤＮＡをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオ
システムズ社製、３９４型）を用いて合成した。
【００６９】（２）マレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
染色体ＤＮＡ断片の調製：バチルス・サーキュランス
ＭＩ−１１３株を前記培地Ａを用いて４０℃で対数増殖
期後期まで振とう培養し、菌体を集めた。
染色体ＤＮＡ断片の調製：バチルス・サーキュランス
ＭＩ−１１３株を前記培地Ａを用いて４０℃で対数増殖
期後期まで振とう培養し、菌体を集めた。
【００７０】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、リゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ（宝酒
造（株）社製）を最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよ
うに添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が０．５％にな
るように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌させた。
この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を
添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を
遠心分離（５，０００×ｇ，２０分間，１０〜１２℃）
し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを
０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールを
ゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在する
ＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄
した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５
ｍｌを加え、４℃で一晩静置し染色体ＤＮＡ溶液を得
た。
るよう、リゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ（宝酒
造（株）社製）を最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよ
うに添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が０．５％にな
るように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌させた。
この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を
添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を
遠心分離（５，０００×ｇ，２０分間，１０〜１２℃）
し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを
０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールを
ゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在する
ＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄
した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５
ｍｌを加え、４℃で一晩静置し染色体ＤＮＡ溶液を得
た。
【００７１】次に、染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限
酵素ＰｓｔＩ、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で
１時間反応させ完全分解し、アガロース電気泳動に供し
た。このアガロースゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移
し取り、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）及
び［γ−32Ｐ］ＡＴＰを用いて５’末端リン酸基をラジ
オアイソトープラベル［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１５８，３０７−３１５（１９８６）］した配列番号３
及び４に示した合成プローブを用い、常法［Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）］に従ってサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。
酵素ＰｓｔＩ、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で
１時間反応させ完全分解し、アガロース電気泳動に供し
た。このアガロースゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移
し取り、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）及
び［γ−32Ｐ］ＡＴＰを用いて５’末端リン酸基をラジ
オアイソトープラベル［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１５８，３０７−３１５（１９８６）］した配列番号３
及び４に示した合成プローブを用い、常法［Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）］に従ってサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。
【００７２】その結果、上記ナイロン膜上の約４ｋｂの
位置に、上記合成プローブが強くハイブリダイズするＤ
ＮＡ断片の存在を確認した。
位置に、上記合成プローブが強くハイブリダイズするＤ
ＮＡ断片の存在を確認した。
【００７３】（３）染色体ＤＮＡのベクターへの挿入：
上記（２）項で得たバチルス・サーキュランスＭＩ−１
１３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反応さ
せて部分分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮＡ
と、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼク
レノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ）を用いてＴ（チミジン）、Ｃ（デオキシシトシン）
を埋めたファージベクターλＦＩＸＩＩ（λＦＩＸＩＩ
／ＸｈｏＩ−ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｔｒｅ
ａｔｅｄ ＤＮＡ：東洋紡績（株）社製）とを混合し、
５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添加
し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時
間反応させて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、
染色体ＤＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。
上記（２）項で得たバチルス・サーキュランスＭＩ−１
１３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓａｕ
３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反応さ
せて部分分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮＡ
と、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼク
レノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ）を用いてＴ（チミジン）、Ｃ（デオキシシトシン）
を埋めたファージベクターλＦＩＸＩＩ（λＦＩＸＩＩ
／ＸｈｏＩ−ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｔｒｅ
ａｔｅｄ ＤＮＡ：東洋紡績（株）社製）とを混合し、
５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添加
し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時
間反応させて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、
染色体ＤＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。
【００７４】（４）形質転換体の作製及び目的組換え体
ＤＮＡの選別：上記（３）で作製したλＤＮＡライブラ
リーファージ溶液（２〜５×１０4ｐｆｕ；ＳＭ緩衝液
希釈）と、エシェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当
量混合し、３７℃で１５分間保温した。これに５０℃に
て保温しておいた ３〜４ｍｌのλ培地（１％ Ｔｒｙ
ｐｔｏｎ，０．５％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，０．
５％ＮａＣｌ，０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．５
％Ａｇａｒ）を加え、λプレート（１％ Ｔｒｙｐｔｏ
ｎ，０．５％ ＮａＣｌ，０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ，１％Ａｇａｒ）に均一に塗布し、３７℃で１２〜１
６時間培養した。この培地上にニトロセルロースフィル
ターを載せ、培地上に形成されたプラークをフィルター
に吸着させ、順次５分間ずつ以下イ）〜ハ）の試薬に浸
した濾紙上にフィルターをのせて処理した。
ＤＮＡの選別：上記（３）で作製したλＤＮＡライブラ
リーファージ溶液（２〜５×１０4ｐｆｕ；ＳＭ緩衝液
希釈）と、エシェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当
量混合し、３７℃で１５分間保温した。これに５０℃に
て保温しておいた ３〜４ｍｌのλ培地（１％ Ｔｒｙ
ｐｔｏｎ，０．５％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，０．
５％ＮａＣｌ，０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．５
％Ａｇａｒ）を加え、λプレート（１％ Ｔｒｙｐｔｏ
ｎ，０．５％ ＮａＣｌ，０．２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ，１％Ａｇａｒ）に均一に塗布し、３７℃で１２〜１
６時間培養した。この培地上にニトロセルロースフィル
ターを載せ、培地上に形成されたプラークをフィルター
に吸着させ、順次５分間ずつ以下イ）〜ハ）の試薬に浸
した濾紙上にフィルターをのせて処理した。
【００７５】イ）０．５Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ ロ）０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１．
５Ｍ ＮａＣｌ，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ ハ）２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３
ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留
水１Ｌに溶解）
Ｃｌ ロ）０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１．
５Ｍ ＮａＣｌ，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ ハ）２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３
ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留
水１Ｌに溶解）
【００７６】上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時
間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。前記（１）で作製
した配列番号３及び４に示したプローブを用い、上記で
作製したフィルターにつきプラークハイブリダイゼーシ
ョンを常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従って行った。
この結果、両方のプローブについてハイブリダイゼーシ
ョン陽性のプラークを選択し、そこからファージＤＮＡ
を抽出して、制限酵素ＰｓｔＩで切り出される長さ約４
ｋｂの挿入断片をアガロースゲル電気泳動により確認し
た。
間乾熱処理をしてＤＮＡを固定した。前記（１）で作製
した配列番号３及び４に示したプローブを用い、上記で
作製したフィルターにつきプラークハイブリダイゼーシ
ョンを常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従って行った。
この結果、両方のプローブについてハイブリダイゼーシ
ョン陽性のプラークを選択し、そこからファージＤＮＡ
を抽出して、制限酵素ＰｓｔＩで切り出される長さ約４
ｋｂの挿入断片をアガロースゲル電気泳動により確認し
た。
【００７７】（５）組換え体ＤＮＡの制限酵素地図の作
製：上記（４）で得られた長さが約４ｋｂのＤＮＡ（Ｐ
ｓｔＩ−ＰｓｔＩ）断片上に存在するマレイン酸異性化
酵素遺伝子の位置をさらに特定するために、該ＤＮＡ断
片を下記のようにプラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造
（株）社製）へサブクローニングした。
製：上記（４）で得られた長さが約４ｋｂのＤＮＡ（Ｐ
ｓｔＩ−ＰｓｔＩ）断片上に存在するマレイン酸異性化
酵素遺伝子の位置をさらに特定するために、該ＤＮＡ断
片を下記のようにプラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造
（株）社製）へサブクローニングした。
【００７８】上記ＰｓｔＩで切り出されるＤＮＡ断片
と、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）
製）を、各々制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、脱リン酸
化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１
ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度で
ある）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＰｓｔＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片とベクターを連結させた。
と、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）
製）を、各々制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、脱リン酸
化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１
ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度で
ある）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＰｓｔＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片とベクターを連結させた。
【００７９】得られた連結反応液を用い、塩化カルシウ
ム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７
０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキスト
ラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留
水１Ｌに溶解］に塗抹した。
ム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７
０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキスト
ラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留
水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００８０】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＰｓｔＩにより切断し、ハイブリダイゼー
ション法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミド
ｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長
さ約４ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。上記で得られた
プラスミドをｐＭＩ１１３と命名し、該プラスミドで形
質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造
（株）製）をＥＣＭＩ１１３と命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＰｓｔＩにより切断し、ハイブリダイゼー
ション法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミド
ｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長
さ約４ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。上記で得られた
プラスミドをｐＭＩ１１３と命名し、該プラスミドで形
質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造
（株）製）をＥＣＭＩ１１３と命名した。
【００８１】〔実施例３〕塩基配列の決定：実施例２の
（５）項で得られたマレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
長さが約４ｋｂのＤＮＡ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ）断片に
ついて、その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社
製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅ
ｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）［Ｓａ
ｎｇｅｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．７４，ｐ．
５４６３，（１９７７）］により決定した。その塩基配
列中のオープンリーデイングフレームの存在から、マレ
イン酸異性化酵素遺伝子は、後記配列表の配列番号１に
示す塩基配列を有し、２５１個のアミノ酸をコードする
７５３塩基対より構成されることが判明した。尚、この
塩基配列の中には、実施例２の（１）項で決定したアミ
ノ酸配列（配列番号２）から予想される塩基配列の全て
に相当する配列が含まれていることが確認された。
（５）項で得られたマレイン酸異性化酵素遺伝子を含む
長さが約４ｋｂのＤＮＡ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ）断片に
ついて、その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造（株）社
製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅ
ｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）［Ｓａ
ｎｇｅｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．７４，ｐ．
５４６３，（１９７７）］により決定した。その塩基配
列中のオープンリーデイングフレームの存在から、マレ
イン酸異性化酵素遺伝子は、後記配列表の配列番号１に
示す塩基配列を有し、２５１個のアミノ酸をコードする
７５３塩基対より構成されることが判明した。尚、この
塩基配列の中には、実施例２の（１）項で決定したアミ
ノ酸配列（配列番号２）から予想される塩基配列の全て
に相当する配列が含まれていることが確認された。
【００８２】〔実施例４〕マレイン酸異性化酵素の製造
および活性の確認 実施例２で作製したＥＣＭＩ１１３株を、アンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０ｇ，
イーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ）に植菌
し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られ
た培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分
間）して菌体を回収後、リン酸緩衝液［組成：２０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭジ
チオスレイトール］で洗浄した。次いで、洗浄菌体０．
５ｇ（湿重量）を上記リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷
冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕
物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４
℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。
および活性の確認 実施例２で作製したＥＣＭＩ１１３株を、アンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０ｇ，
イーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ）に植菌
し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られ
た培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分
間）して菌体を回収後、リン酸緩衝液［組成：２０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭジ
チオスレイトール］で洗浄した。次いで、洗浄菌体０．
５ｇ（湿重量）を上記リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷
冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕
物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４
℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。
【００８３】対照として、外来遺伝子を含まないプラス
ミドｐＵＣ１１８について、実施例２（５）と全く同様
にエシェリヒア・コリＪＭ１０９株に形質転換し、該形
質転換体から上記と同様に粗酵素液を調製し、以下の活
性測定に供した。マレイン酸異性化酵素活性の確認は、
これらの粗酵素液について、前記実施例２の（１）項と
同様に、ブタ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハ
イム社製）存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸
光度変化として測定した［Ｋ．Ｏｔｓｕｋａ，Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５，７２６（１９６
１）］。その結果、ＥＣＭＩ１１３から調製された粗酵
素液についてのみ２４０ｎｍの吸光度が減少し、マレイ
ン酸異性化酵素活性を検出し得た。
ミドｐＵＣ１１８について、実施例２（５）と全く同様
にエシェリヒア・コリＪＭ１０９株に形質転換し、該形
質転換体から上記と同様に粗酵素液を調製し、以下の活
性測定に供した。マレイン酸異性化酵素活性の確認は、
これらの粗酵素液について、前記実施例２の（１）項と
同様に、ブタ心臓由来フマラーゼ（ベーリンガーマンハ
イム社製）存在下、マレイン酸の減少を２４０ｎｍの吸
光度変化として測定した［Ｋ．Ｏｔｓｕｋａ，Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５，７２６（１９６
１）］。その結果、ＥＣＭＩ１１３から調製された粗酵
素液についてのみ２４０ｎｍの吸光度が減少し、マレイ
ン酸異性化酵素活性を検出し得た。
【００８４】〔実施例５〕マレイン酸異性化酵素を含む
形質転換体によるマレイン酸の異性化反応 実施例４と同様に、実施例２で作製したＥＣＭＩ１１３
株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む上記ＬＢ培地
に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。
得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２
０分間）して菌体を回収後、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣ
ｌで洗浄した。
形質転換体によるマレイン酸の異性化反応 実施例４と同様に、実施例２で作製したＥＣＭＩ１１３
株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む上記ＬＢ培地
に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。
得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２
０分間）して菌体を回収後、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣ
ｌで洗浄した。
【００８５】次いで、洗浄菌体０．１ｇ（湿重量）を
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ １ｍｌに懸濁し、反応液
［組成：マレイン酸ナトリウム ８４ｇ／Ｌ、Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００ １ｇ／ｌ］１ｍｌを添加後、４５℃で
１時間振とうして反応させた。反応後の反応液を遠心分
離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、得られた上
清液について有機酸カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０
１Ｈカラム）、ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速
液体クロマトグラフィー分析（島津社製、ＬＣ−５Ａ）
に供した。その結果、原料マレイン酸のピークの他にフ
マル酸のピークを検出し得た。また、上記反応により、
原料のマレイン酸が減少していることも確認された。以
上の結果より、上記形質転換体が含有するマレイン酸異
性化酵素の作用によりマレイン酸がフマル酸へと異性化
されていることが確認された。
０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ １ｍｌに懸濁し、反応液
［組成：マレイン酸ナトリウム ８４ｇ／Ｌ、Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００ １ｇ／ｌ］１ｍｌを添加後、４５℃で
１時間振とうして反応させた。反応後の反応液を遠心分
離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、得られた上
清液について有機酸カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０
１Ｈカラム）、ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速
液体クロマトグラフィー分析（島津社製、ＬＣ−５Ａ）
に供した。その結果、原料マレイン酸のピークの他にフ
マル酸のピークを検出し得た。また、上記反応により、
原料のマレイン酸が減少していることも確認された。以
上の結果より、上記形質転換体が含有するマレイン酸異
性化酵素の作用によりマレイン酸がフマル酸へと異性化
されていることが確認された。
【００８６】
【発明の効果】本発明により、バチルス・サーキュラン
ス由来のマレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを有する組換えベクター、及び該組換えベクター
を含有する形質転換体が提供される。本発明のマレイン
酸異性化酵素遺伝子を含有する形質転換体により、常温
条件下はもちろんのこと、高温条件下においても安定に
活性を保持するマレイン酸異性化酵素を著量生産するこ
とができ、本菌体あるいは本菌から調製したマレイン酸
異性化酵素を利用することにより、マレイン酸からフマ
ル酸を効率よく製造することができる。
ス由来のマレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを有する組換えベクター、及び該組換えベクター
を含有する形質転換体が提供される。本発明のマレイン
酸異性化酵素遺伝子を含有する形質転換体により、常温
条件下はもちろんのこと、高温条件下においても安定に
活性を保持するマレイン酸異性化酵素を著量生産するこ
とができ、本菌体あるいは本菌から調製したマレイン酸
異性化酵素を利用することにより、マレイン酸からフマ
ル酸を効率よく製造することができる。
【００８７】
配列番号：１ 配列の長さ：７５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：バチルス・サーキュランス 株名：ＭＩ−１１３ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１−７５３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG AGT AAG AAT TAT CGA GTA GGC CTT ATC GTA CCA AGC TCT AAC ACA 48 Met Ser Lys Asn Tyr Arg Val Gly Leu Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr 1 5 10 15 ACG ATG GAA ACA GAA ATT CCG GCT ATG CTT CAT TCC AGA ATG CAG ACT 96 Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu His Ser Arg Met Gln Thr 20 25 30 AAA CCA GAA GAA ACC TTT ACA TTC CAT TCT GCA CGT ATG CGG ATG ATG 144 Lys Pro Glu Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Ala Arg Met Arg Met Met 35 40 45 CAT GTA AAT CCG GAT GAA TTA AAG AAA ATG GAT GTA GAT AGT GAC CGT 192 His Val Asn Pro Asp Glu Leu Lys Lys Met Asp Val Asp Ser Asp Arg 50 55 60 TGT GCA GTG GAG CTT TCC GAT GCA CGA TGT GAT GTG CTG GCT TAT GCA 240 Cys Ala Val Glu Leu Ser Asp Ala Arg Cys Asp Val Leu Ala Tyr Ala 65 70 75 80 TGT CTA GTT GCC ATT ATG TGT CAG GGT CCG GGA TAT CAT CAC ATT TCT 288 Cys Leu Val Ala Ile Met Cys Gln Gly Pro Gly Tyr His His Ile Ser 85 90 95 GAA GAA CGC TTA GGA AAG GTT ACA GTC AGC AAT GGT GGT CCA GCT CCA 336 Glu Glu Arg Leu Gly Lys Val Thr Val Ser Asn Gly Gly Pro Ala Pro 100 105 110 ATT GTC AGC AGT GCA GGA GCA TTA ATT GAG GGC CTT GAA ACG ATT GGG 384 Ile Val Ser Ser Ala Gly Ala Leu Ile Glu Gly Leu Glu Thr Ile Gly 115 120 125 GCG AAA AAG GTT TCC ATT ATT ACA CCA TAT ATG AAG CCA TTG ACT AAA 432 Ala Lys Lys Val Ser Ile Ile Thr Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Lys 130 135 140 ACG GTA ATT GAA TAT TTA AAT GCT GCT GGT ATT GAA GTC ATT GAT TCA 480 Thr Val Ile Glu Tyr Leu Asn Ala Ala Gly Ile Glu Val Ile Asp Ser 145 150 155 160 ATC AGC CTC GAA GTT GCG GAT AAC CTA GAG GTT GGC CGT TTG GAT CCG 528 Ile Ser Leu Glu Val Ala Asp Asn Leu Glu Val Gly Arg Leu Asp Pro 165 170 175 GAA AAC CTA ATA GGC CAT GCA GAC CGT TTG AAT ATT AAA GGA GCA GAT 576 Glu Asn Leu Ile Gly His Ala Asp Arg Leu Asn Ile Lys Gly Ala Asp 180 185 190 GCA GTT GTC CTA TCT GCA TGC GTT CAG ATG CCT TCT CTT CCA GCT ATT 624 Ala Val Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Pro Ala Ile 195 200 205 CAG GCT GTT CAA GAC CGT TTG GGA ATT CCA GTC TTG TCT GCC GGA GTT 672 Gln Ala Val Gln Asp Arg Leu Gly Ile Pro Val Leu Ser Ala Gly Val 210 215 220 GCA ACA GTT TTT AAA ATt CTC AAG GAA TTA AAC CTT TCA ACA GAG GTA 720 Ala Thr Val Phe Lys Ile Leu Lys Glu Leu Asn Leu Ser Thr Glu Val 225 230 235 240 CCA AAT GCA GGA CAT TTA CTA TCC GGT AAA TTT TAG 756 Pro Asn Ala Gly His Leu Leu Ser Gly Lys Phe 245 250
【００８８】配列番号：２ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Lys Asn Tyr Arg Val Gly Leu Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr 1 5 10 15 Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met 20 24
【００８９】配列番号：３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す 配列 AARAAYTAYC GYCTNGGNCT NATYGTNCC 29
【００９０】配列番号：４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：Ｎはイノシンを表す。 AARACNACNA TGGARACNGA RATNCCNGCN ATG 33
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:09） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 小林 幹 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、
マレイン酸を異性化してフマル酸を生成する活性を実質
的に害さないアミノ酸残基の置換、欠失、挿入を有して
もよいマレイン酸異性化酵素をコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号１に示す塩基配列で示される請
求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡがベクター
に連結されてなる組換えベクター。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載のＤＮＡが導入され
ることにより形質転換された形質転換体。 - 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地で培養
し、その培養物からマレイン酸異性化酵素を採取するこ
とを特徴とするマレイン酸異性化酵素の製造法。 - 【請求項６】 請求項４記載の形質転換体、またはこの
形質転換体の培養物から採取したマレイン酸異性化酵素
の粗精製画分もしくは精製酵素をマレイン酸を含有する
水性溶液に加え、マレイン酸を異性化してフマル酸を生
成せしめることを特徴とするフマル酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8159851A JPH104967A (ja) | 1996-06-20 | 1996-06-20 | マレイン酸異性化酵素をコードするｄｎａおよびその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8159851A JPH104967A (ja) | 1996-06-20 | 1996-06-20 | マレイン酸異性化酵素をコードするｄｎａおよびその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH104967A true JPH104967A (ja) | 1998-01-13 |
Family
ID=15702627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8159851A Pending JPH104967A (ja) | 1996-06-20 | 1996-06-20 | マレイン酸異性化酵素をコードするｄｎａおよびその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH104967A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01128936A (ja) * | 1987-11-14 | 1989-05-22 | Tatsuaki Yamaguchi | ２個の炭素原子を有する炭化水素の製造方法 |
| US6133014A (en) * | 1997-10-08 | 2000-10-17 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Maleate isomerase gene |
-
1996
- 1996-06-20 JP JP8159851A patent/JPH104967A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01128936A (ja) * | 1987-11-14 | 1989-05-22 | Tatsuaki Yamaguchi | ２個の炭素原子を有する炭化水素の製造方法 |
| US6133014A (en) * | 1997-10-08 | 2000-10-17 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Maleate isomerase gene |
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