JP2000344681A

JP2000344681A - Ｈｇｆ含有医薬

Info

Publication number: JP2000344681A
Application number: JP11152578A
Authority: JP
Inventors: Takehisa Ishii; 健久石井; Masanori Sato; 眞紀佐藤; Jiro Sugimoto; 次郎杉本; Hideko Mizuno; 英子水野; Yoshifumi Uno; 芳文宇野; Masae Kakubari; 雅江角張
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2000-12-12

Abstract

(57)【要約】【課題】肝実質細胞増殖因子の腎毒性を軽減する手段
を提供する。【解決手段】肝実質細胞増殖因子を有効成分として含
む医薬であって、肝実質細胞増殖因子に由来する腎毒性
を軽減ないし排除するために十分な休薬期間（例えば1
日以上）を投与期間中に少なくとも１つ設けて間歇投与
するための医薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、肝実質細胞増殖因
子を有効成分として含む医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】肝実質細胞増殖因子（Hepatocyte growt
h factor：以下、本明細書において「ＨＧＦ」と略す場
合がある。）は肝実質細胞の増殖活性を有するタンパク
質であり、種々の動物種においてその存在が知られてお
り、異なったアミノ酸配列を有するものが報告されてい
る。ヒト肝実質細胞増殖因子（以下、本明細書において
「ｈＨＧＦ」と略す場合がある。）は、大工原らにより
劇症肝炎患者血漿より見出され（特開昭63-22526号公
報）、その後、喜多村らによりｈＨＧＦタンパク質のア
ミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）配
列が明らかにされた（特開平3-72883号公報）。さらに
このｃＤＮＡを用いたｈＨＧＦタンパク質の生産方法及
び形質転換体が報告されるにいたり（特開平3-285693号
公報）、ｈＨＧＦタンパク質の大量生産が可能となり医
薬品としての応用が期待されている。

【０００３】ｈＨＧＦは糖タンパク質の一種であり、分
子量は非還元状態では約80〜90 KDa、還元状態では約52
〜56 KDaのαサブユニットと約30〜36 KDaのβサブユニ
ットからなるヘテロダイマーである。ｈＨＧＦは、肝細
胞増殖因子としての活性のほか、スキャター因子（scat
ter factor；SF）活性、腎臓尿細管上皮細胞増殖因子活
性、損傷組織修復因子活性、血管内皮細胞増殖因子活性
など多様な生物活性を有しており、肝臓疾患治療薬、腎
臓疾患治療薬、脳神経障害治療剤、育毛促進剤、創傷治
療薬、抗腫瘍治療薬などの医薬としての開発が期待され
ている。しかしながら、ＨＧＦは腎臓の糸球体への毒性
を有することが知られており、ＨＧＦの臨床適用に際し
て、腎毒性を回避する方法の開発が求められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明の課題は、ＨＧＦの腎毒性を軽減する手
段を提供することにある。本発明者らは、ＨＧＦ投与時
に惹起される腎毒性の発生メカニズムについて鋭意研究
を行った結果、ＨＧＦを少なくとも１日以上の休薬期間
を設けて投与すると、ＨＧＦを連日投与した場合に比べ
て腎毒性の発生が顕著に抑制され、しかも所望の薬効が
十分に発現されることを見出した。本発明は、上記の知
見を基にして完成されたものである。

【０００５】すなわち、本発明は、肝実質細胞増殖因子
を有効成分として含む医薬であって、肝実質細胞増殖因
子に由来する腎毒性を軽減ないし排除するために十分な
休薬期間を投与期間中に少なくとも１つ設けて間歇投与
するための医薬を提供するものである。上記の休薬期間
は、通常は１日以上、好ましくは１日であり、典型的に
は上記医薬は１日おきに投与することができる。本発明
の医薬は、肝実質細胞増殖因子に由来する腎毒性、とり
わけ腎臓の糸球体への毒性を軽減することができ、所望
の薬効を十分に発揮できるという特徴がある。本発明に
より、上記医薬の製造のための肝実質細胞増殖因子の使
用が提供される。

【０００６】別の観点からは、上記の医薬の製造のため
の肝実質細胞増殖因子の使用、及び腎毒性を軽減ないし
排除した肝実質細胞増殖因子の投与方法であって、肝実
質細胞増殖因子に由来する腎毒性を軽減ないし排除する
ために十分な休薬期間を投与期間中に少なくとも１つ設
けて間歇投与する方法が提供される。さらに別の観点か
らは、本発明により、肝実質細胞増殖因子を有効成分と
して含む医薬であって、肝実質細胞増殖因子に由来する
腎毒性を軽減ないし排除するために十分な休薬期間を投
与期間中に少なくとも１つ設けて肝実質細胞増殖因子を
間歇投与する投与計画；上記投与計画において使用する
ための肝実質細胞増殖因子を有効成分として含む医薬；
肝実質細胞増殖因子を有効成分として含む医薬の上記投
与計画のための使用が提供される。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の医薬の有効成分として用
いられるＨＧＦの種類は特に限定されない。例えば、Ｈ
ＧＦを含有することの知られているヒトやラット等のほ
乳動物由来の体液や組織、または自発的にＨＧＦを産生
する細胞から天然のＨＧＦを単離してもよいが、遺伝子
組換え法により該増殖因子ｃＤＮＡを細胞に導入して得
られる組換えＨＧＦを用いてもよい。組換えＨＧＦを産
生させる宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状
菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。
具体例には、組換えＨＧＦとして、例えば、上記ほ乳動
物由来の胎盤、肝障害患者肝組織及び血液、MRC-5 細
胞、IMR-9 細胞などの線維芽細胞株、あるいは特開平3-
285693号公報に記載された方法に従いｈＨＧＦをコード
するｃＤＮＡを含む発現ベクターをＣＨＯ細胞等の宿主
に導入した産生株などから得られたものを挙げることが
できる。

【０００８】また、ＨＧＦとしては、シグナル配列を有
する蛋白質などの前駆体蛋白質や、肝実質細胞を増殖さ
せる活性を損なわない範囲において一部のアミノ酸を置
換、欠失、及び／又は挿入した修飾蛋白質や糖類を欠失
又は置換した改変体を用いてもよい。改変体としては、
例えば、特開平2-288899号公報、WO90/10651号公報、特
開平3-130091号公報、同3-255096号公報、同4-30000 号
公報、Nature, 342, 440-443(1989)等に記載されたもの
を挙げることができる。

【０００９】本発明の医薬の有効成分として好適に用い
られるＨＧＦとして、以下の理化学的性質を有する蛋白
性因子を挙げることができる。またＨＧＦはヒト由来の
ものであることが好ましく、特に好ましいＨＧＦとし
て、特開平3-72883 号公報及び特開平4-89499 号公報に
記載のアミノ酸配列で表されるものを挙げることができ
る。 1) ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件下）による推定分子
量が約７６，０００〜９２，０００である、 2) 肝実質細胞を増殖させる活性を有する、及び 3) ヘパリンに対して強い親和性を有する。さらに、好
ましいＨＧＦは、上記の理化学的性質に加えて、 4) ８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活
する、及び 5) トリプシンによる消化処理及びキモトリプシンによ
る消化処理により上記活性が失活する、を有する。

【００１０】ＨＧＦはスキャター因子（scatter facto
r；SF）活性、腎臓尿細管上皮細胞増殖因子活性、損傷
組織修復因子活性、血管内皮細胞増殖因子活性など多様
な生物活性を有しており、肝臓疾患治療薬、腎臓疾患治
療薬、肺障害治療剤、脳神経障害治療剤、育毛促進剤、
創傷治療薬、抗腫瘍治療薬、低蛋白血漿治療剤などの医
薬として有用である。もっとも、投与期間中にわたって
１日１回以上の投与を毎日継続する投与方法（連日投
与）では腎毒性を惹起する可能性があり、腎臓の糸球体
にＨＧＦに起因する病変（糸球体上皮の肥大／変性、癒
着、半月体形成、糸球体増殖性病変）が生じる場合があ
る。

【００１１】本発明の医薬は、肝実質細胞増殖因子に由
来する腎毒性を軽減ないし排除するために休薬期間を設
けて肝実質細胞増殖因子を間歇投与する投与計画におい
て用いられ、肝実質細胞増殖因子に由来する腎毒性を軽
減ないし排除するために十分な休薬期間を設けて間歇投
与される。本発明の医薬は、肝実質細胞増殖因子に由来
する腎毒性、とりわけ腎臓の糸球体への毒性を軽減する
ことができ、所望の薬効を十分に発揮できるという特徴
がある。上記の休薬期間は、投与期間中に少なくとも１
つ設ければよく、休薬期間は、通常は少なくとも１日以
上、好ましくは１日である。例えば、連日投与を行う投
与期間中に１日の休薬期間を１回設けてもよい。典型的
には、本発明の医薬は１日おきに投与することができ
る。投与量は、患者の年齢、性別、症状、体重等により
適宜調整されるが、成人一回あたり有効成分重量１μg/
kg体重〜10 mg/kg体重、より好ましくは10〜1000μg/kg
体重の範囲で投与される。

【００１２】本発明の医薬としては、ＨＧＦを有効成分
として含む従来公知の医薬組成物を用いることができ
る。例えば、水溶液の形態の注射剤や点滴剤、凍結乾燥
製剤などの非経口投与形態の医薬を好適に用いることが
できる。ＨＧＦの製剤については、例えば、WO90/10651
公報、特開平6-247872号公報、及び特開平9-25241号公
報に記載がある。また、腎毒性を軽減する目的で、特開
平10-324638号公報に記載されたデキストラン硫酸など
の硫酸化多糖類を添加した組成物も好ましい。硫酸化多
糖類としては、ＨＧＦとの結合親和性が高いもの（例え
ばＫｄ値が１．０×１０^-8未満）が好適であり、特に好
ましい硫酸化多糖類はＨＧＦとの結合親和性が高いヘパ
リンである。上記の硫酸化多糖類は、上記の投与計画に
おいてＨＧＦを含む本発明の医薬とは別の製剤として投
与することができるが、硫酸化多糖類を含む製剤を連日
投与又は間歇投与することにより腎毒性をさらに低減な
いし回避することが可能である。

【００１３】本発明の医薬の形態は特に限定されない
が、一般には非経口的投与に適する剤型が望ましく、好
ましくは注射用アンプル剤や注射用凍結乾燥粉末剤（バ
イアル）として調製することができる。組成物や製剤の
調製は、当業界で利用可能な適宜の手段を用いることが
できる。製剤用添加物は製剤形態に応じて当業者が適宜
選択可能であるが、例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、
精製された前記ＨＧＦの有効量を、例えば、蒸留水、生
理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤に溶解し、必要
に応じてカルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナト
リウムなどの賦形剤、ポリエチレングリコール、デキス
トラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミン
などの安定化剤、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコ
ニウム、フェノールなどの保存剤、ブドウ糖、グルコン
酸カルシウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、塩酸、
酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムなどのｐＨ調節剤、
塩化ナトリウムなどの溶解補助剤、アミノ酸類などの安
定化剤、塩化ナトリウムなどの等張化剤などを加え、常
法に従って凍結乾燥することにより調製することができ
る。

【００１４】また、注射用アンプル剤は、前記ＨＧＦの
有効量を、例えば、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液な
どの希釈剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウ
ム、マンニトールなどの溶解補助剤、クエン酸ナトリウ
ム、グリセリンなどの緩衝剤、ブドウ糖、添加糖、塩化
ナトリウムなどの等張化剤、上記安定化剤、上記保存
剤、上記無痛化剤、上記ｐＨ調節剤、塩化ナトリウムな
どの溶解補助剤、アミノ酸類などの安定化剤などの製剤
用添加剤を加え、得られた溶液を通常の加熱滅菌、無菌
濾過などにより無菌化して調製することができる。な
お、外用剤として使用する場合は、特開平5-213721号公
報、特開平5-279230号公報に記載されているような剤型
で使用することが可能である。

【００１５】本発明の医薬を凍結乾燥製剤として調製す
る場合には、ＨＧＦ、安定化剤、塩化ナトリウム、及び
緩衝剤を含有することが好ましく、肝実質細胞増殖因子
を５ mg/mL以下の濃度で含有し、注射剤として望ましい
ｐＨと浸透圧を有する水溶液を製造できるように調製す
ることが好ましい。このような製剤は、ＨＧＦを５ mg/
mL以下の濃度で含有する水溶液を凍結乾燥して得ること
が好ましい。安定化剤としては、例えば、アルギニン、
リジン、ヒスチジン、グルタミン、プロリン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸、及びこれらの薬理上許容される
塩からなる群から選ばれる安定化剤を用いることがで
き、緩衝剤としてはリン酸塩を用いることができる。こ
のような凍結乾燥製剤から調製した水溶液は保存安定性
に優れており、また、注射剤として望ましいｐＨ（例え
ば６．０から７．０の範囲）及び生体とほぼ等張又は注
射剤の浸透圧比として許容される浸透圧比（１〜２）を
有するので、上記の投与計画を実施するために好まし
い。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定される
ことはない。なお、以下の実施例において、ＨＧＦとし
て、特開平3-285693号公報に記載された方法に従って製
造された組換えヒトＨＧＦを使用した。

【００１７】実施例１：ＤＭＮ（ジメチルニトロソアミ
ン）肝硬変ラットに対するＨＧＦ間歇投与の効果＜使用動物＞Wistar系雄性ラット６週齡を用いた。＜群構成＞Ａ群：無処置（N=10）Ｂ群：ＤＭＮ処置、Ｃ群の対照（N=13）Ｃ群：ＤＭＮ処置＋HGF 0.03 mg/kg毎日投与 (N=15) Ｄ群：ＤＭＮ処置、Ｅ、Ｆ群の対照 (N=12) Ｅ群：ＤＭＮ処置、HGF 0.03 mg/kg間歇投与 (N=15) Ｆ群：ＤＭＮ処置、HGF 0.1 mg/kg間歇投与 (N=13)

【００１８】＜実験方法＞動物への処置：６週齡のラット（約170 g）に１％ＤＭ
Ｎ溶液（生理食塩水にて希釈）を1 ml/kg、３日連日／
週、４週間に渡り腹腔内投与した。A群には同様に生理
食塩水を投与した。ＨＧＦは希釈バッファー（0.14 M N
aCl, 0.005% Tween80, 10 mM phosphate buffer pH7.
4）中に0.03 mg/ml(Ｃ、Ｅ群)又は0.1 mg/ml（Ｆ群）と
なるように溶解し、Ｃ群は27日間毎日、Ｅ、Ｆ群は隔日
３日／週で４週間、1 ml/kg体重、一日一回、尾静脈内
投与した。Ａ、Ｂ群およびＤ群には、同様に希釈バッフ
ァーのみを投与した。27日間の投与終了後、絶食下にて
下行大静脈よりの採血を行った。血清アルブミン濃度測
定：血清アルブミンは、アルブミンB-テストワコー（和
光純薬、ブロムクレゾールグリーン法）を使用した。

【００１９】＜結果＞図１に血清中アルブミン濃度の結
果を示す。血清アルブミンは、臨床上肝機能の重要な指
標の１つであり、肝硬変患者においても低下することが
知られている。血清中アルブミン濃度は、ＤＭＮ処置に
よりＡ群に比してＤＭＮコントロールのＢ群が有意に低
下しており、Ｂ群に比してＨＧＦ毎日投与のＣ群では有
意に増加していた。また、間歇投与群のコントロールで
あるＤ群の血清中アルブミン濃度はＡ群に比して有意に
低下していたが、ＨＧＦをそれぞれ0.03、0.1 mg/kg間
歇投与したＥ、Ｆ群では、Ｄ群に比して用量依存的に増
加が認められた。特にＦ群では有意に改善されていた。

【００２０】実施例２：間歇投与による腎毒性軽減効果＜使用動物＞SD系雄性ラットを購入し、6日間以上の検
疫・馴化期間後、健康状態が良好である24匹（５週齢）
を試験に用いた。＜群構成＞ＨＧＦ単独試験対照群：無処置動物 (n=4) ＨＧＦ 1 mg/kg連日投与(n=10) ＨＧＦ 1 mg/kg間歇投与(n=10) ＨＧＦは希釈バッファー（140 mM NaCl, 0.005% Tween8
0, 10 mMリン酸緩衝液, pH7.5)中に0.2 mg/mLの濃度とな
るように調製した。

【００２１】＜投与方法＞上記被験物質を投与至近日の
体重に基づき5 mL/kgの容量で、ラットの尾静脈内に連
日または間歇（３回／週）投与を２週間実施した。対照
群は無処置動物とした。＜検査項目＞尿検査：投与前日および投与２週に絶食下
で各検査時投与後5時間の畜尿を行い、クレアチニンはJ
affe法にて、アルブミンはラットアルブミン測定キット
（パナテストAシリーズラットアルブミン、(株)パナフ
ァーム・ラボラトリーズ)を用い、EIA法にて測定し、尿
アルブミン/クレアチニン比を算出した。病理組織検
査：最終投与後の翌日麻酔下で屠殺し、腎臓を摘出して
10%中性ホルマリン液で固定した。その後パラフィン包
埋病理標本を作製し、薄切、ヘマトキシリン・エオジン
染色後光学顕微鏡にて病理組織学的評価を実施した。

【００２２】＜結果＞無処置群には、腎病変として糸球
体上皮細胞の肥大／変性は認められなかったが、HGF 1m
g/kg連日投与群では10例中７例に糸球体上皮細胞の肥大
／変性が認められた。一方、HGF 1mg/kg間歇投与群で
は、10例とも糸球体上皮細胞の肥大／変性は認められな
かった。また、ＨＧＦ連日投与群に比べ、間歇投与群で
はアルブミン/クレアチニン比も低値を示した（図
２）。これらの結果より、ＨＧＦを間歇投与することで
ＨＧＦに由来する腎毒性が連日投与に比べて大幅に軽減
されることが示された。

【図面の簡単な説明】

【図１】ジメチルニトロソアミン肝硬変ラットに対す
るＨＧＦ間歇投与の効果を示した図である。図中、ＮＴ
は無処置群、ＤＭＮはジメチルニトロソアミン処置群
（ＨＧＦ非投与）の結果を示し、ＨＧＦ０．０３及びＨ
ＧＦ０．１はそれぞれＨＧＦ投与量0.03 mg/kg群及び0.
1 mg/kg群の結果を示す。##はＮＴ群に対してp＜0.01
（Student's t-test）で有意差あり；*はＤＭＮ群
（Ｂ）に対してp＜0.05（Student's t-test）で有意差
あり；††はＤＭＮ群（Ｄ）に対してp＜0.01（Dunnett
test）で有意差ありを示す。ｄａｉｌｙは連日投与、i
ntermittentは間歇投与の結果を示す。

【図２】ＨＧＦ間歇投与による腎毒性軽減効果を示し
た図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 17/02 17/14 17/14 25/28 25/28 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ０７Ｋ 14/475 (72)発明者杉本次郎神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地三菱化学株式会社横浜総合研究所内 (72)発明者水野英子神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地三菱化学株式会社横浜総合研究所内 (72)発明者宇野芳文神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地三菱化学株式会社横浜総合研究所内 (72)発明者角張雅江東京都千代田区丸の内２丁目５番２号三菱化学株式会社医薬カンパニー内Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 BA34 CA53 DB62 MA66 NA07 ZA152 ZA512 ZA592 ZA752 ZA812 ZA892 ZA922 ZB262 4H045 AA10 CA40 DA01 EA20 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】肝実質細胞増殖因子を有効成分として含
む医薬であって、肝実質細胞増殖因子に由来する腎毒性
を軽減ないし排除するために十分な休薬期間を投与期間
中に少なくとも１つ設けて間歇投与するための医薬。
【請求項２】上記の休薬期間が１日以上である請求項
１に記載の医薬。
【請求項３】肝実質細胞増殖因子を有効成分として含
む医薬の投与計画であって、肝実質細胞増殖因子に由来
する腎毒性を軽減ないし排除するために十分な休薬期間
を投与期間中に少なくとも１つ設けて肝実質細胞増殖因
子を間歇投与する投与計画。
【請求項４】請求項３に記載の投与計画に使用するた
めの肝実質細胞増殖因子を有効成分として含む医薬。
【請求項５】肝実質細胞増殖因子を有効成分として含
む医薬の請求項３に記載の投与計画のための使用。