JP2000346843A - 免疫学的多項目測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】１試料から二種以上の免疫反応体の検定が一連
の操作により行うことができる多項目検定方法を提供す
ること。 【解決手段】試料中に存在する二種以上の免疫反応体
（抗原又は抗体）を、磁性粒子に固定された二種以上の
相補的免疫反応体と容器内で液体媒体中において反応さ
せ、各免疫反応体ごとに異なる標識を用いて順次各免疫
反応体を検定する多項目検定方法。この方法では、Ｂ／
Ｆ分離を、容器に磁場を印加して磁性粒子を容器内壁面
に吸引、分離することにより行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に含まれる
２種以上の抗原又は抗体を同一試料から一連の操作で検
定することができる免疫学的多項目検定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】同一の試料に含まれる二種以上の抗原又
は抗体を検定するには、従来、各抗原又は各抗体ごとに
検定作業を行う必要があった。一つの試料から一連の操
作により簡便、迅速に測定することができる検定方法は
知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、固相法において不溶性固相として磁性粒子を使用す
ることにより、一つの試料液から一連の操作で複数の抗
原又は抗体を検定することができる免疫学的多項目検定
方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記の
目的は、次の方法により達成される。試料中に存在する
免疫反応体を、不溶性固相に固定され前記免疫反応体と
特異的に結合する相補的免疫反応体と容器内で液体媒体
中において反応させる段階と、該反応に関与した免疫反
応体を標識物質を用いて検定する段階とを有する、固相
法により免疫反応体検定する方法において、（ｉ） 前
記試料が検定対象として二種以上の免疫反応体を含有
し、（ii） 該二種以上の免疫反応体のそれぞれと特異
的に結合する二種以上の相補的免疫反応体を用いるこ
と、（iii） 前記不溶性固相として磁性粒子が用いら
れ、前記二種以上の相補的免疫反応体が別々に磁性粒子
に固定されていること、（iv） 前記の免疫反応体と相
補的免疫反応体との反応により得られた複合体を反応液
体からの分離、洗浄を、前記容器外から磁場を印加し、
該複合体を容器内壁に磁気分離し保持して行うこと、
（v） 上記二種以上の免疫反応体ごとに異なる標識物
質とを用いること、（vi） 前記の標識物質を用いる検
定段階が、各免疫反応体ごとに順次行われること、を特
徴とする、免疫学的多項目検定方法。

【０００５】

【発明の実施の形態】本明細書において、「免疫反応
体」とは抗原又は抗体を意味し、「相補的免疫反応体」
とは当該免疫反応体（抗原又は抗体）と特異的に結合す
る対応する免疫反応体（抗体又は抗原）を意味する。以
下、本発明をより具体的に説明する。

【０００６】本発明の方法は、不溶性固相として磁場の
印加により液体試料から容易に分離することができる磁
性粒子を使用してＢ／Ｆ分離をおこない、かつ検定対象
である免疫反応体ごとに標識を使い分けることにより、
一試料の多項目を簡便、迅速に行うことができる方法で
ある。具体的には、従来公知のサンドイッチ法、ワンス
テップサンドイッチ法、競合法に応用することが可能で
ある。さらにビオチン標識抗体または抗原を用いた場合
はビオチンアビジンシステムを用い、酵素や蛍光物質、
化学発光物質を標識したアビジンも反応に用いることも
できる。

【０００７】本発明の一形態においては、前記の不溶性
固相として前記容器の内壁面が一つの免疫反応体を固定
化するのに使用される。

【０００８】シグナルの測定はマイクロプレートのウェ
ルに残った酵素に基質を加えて一定時間反応させた後、
測定する。加える基質を変えることで比色、蛍光、化学
発光、生物発光等の測定方法と検出感度を選ぶことがで
きる。以下、代表的な実施形態について説明するが、本
発明の方法はこれらに限定されるものではない。

【０００９】競合法の場合：公知のように、前記の方法
において、免疫反応体と固定化相補的免疫反応体とを反
応させる前記の段階において、該免疫反応体とともに一
定量の標識免疫反応体とを共存させる。複数種の免疫反
応体ごとにそれに対応する相補的免疫反応体が共存させ
られる。したがって、各免疫反応体ごとに磁性粒子−相
補的免疫反応体−免疫反応体の結合体が生じる。これ
は、容器への磁場の印加により容器内壁に容易に分離で
きる。磁力で壁面に保持したまま、液体試料の廃棄、容
器内の洗浄を行うことができる。こうして、Ｂ／Ｆ分離
が行われる。次は、免疫反応体ごとにそれに用いられた
標識物質により検定を順次行う。各免疫反応体について
の検定方法は定法に従えばよい。一つの検定を行った後
に、容器内の洗浄等は前記磁性粒子−相補的免疫反応体
（標識体と非標識体の混合状態）−免疫反応体の結合体
を磁場の印加で容器内壁に分離、保持して行えばよい。

【００１０】サンドイッチ法の場合：前記本発明の方法
において、公知のように、免疫反応体と固定化相補的免
疫反応体とを反応させる前記の段階の後で、得られた反
応生成物と、一定量の標識相補的免疫反応体とを反応さ
せる。この場合は、磁性粒子−相補的免疫反応体−免疫
反応体（標識体と非標識体の混合状態）の結合体が得ら
れる以外は、上記競合法と同様である。

【００１１】ワンステップサンドイッチ法の場合：該方
法は、免疫反応体と固定化相補的免疫反応体とを反応さ
せる前記の段階において、該免疫反応体とともに一定量
の標識相補的免疫反応体とを共存させて反応させる点以
外は上記のサンドイッチ法と同様である。

【００１２】本発明の方法により測定される免疫反応体
（抗原又は抗体）は特に限定されず、いずれの抗原又は
抗体も測定することができる。

【００１３】免疫反応体が担持される磁性粒子としては
公知のいずれのものも使用することができ、例えば市販
の磁性粒子あるいは高分子被覆磁性体含有粒子としてダ
イナル社製 Dynabeads、ＰＥバイオシステムズ社製 B
ioMag、コルテックス社製 MagaBeads、ポリサイエンス
社製 Magnetizable Polystyrene Particles、スフェロ
テック社製 Magnetic Polystyrene Particle等が使用
可能である。また、磁性細菌ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５４５８）、磁性細菌ＲＳ−１（ＦＥＲＭＰ−１３
２８３）、磁性細菌ＭＧＴ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６
１７）等の菌体内に磁性粒子を生成する細菌より分離し
た磁性粒子等が挙げられる。磁性粒子の粒度は約５０ｎ
ｍ〜１００μｍ程度が好ましい。

【００１４】本発明の方法の好ましい一形態として、前
記の容器がマイクロタイタープレートに設けられたウェ
ルであり、前記の容器外からの磁場の印加を、下記の磁
気分離治具をマイクロタイタープレートの上面又は底面
に装着させ、磁石を各ウェルの側方に隣接させて配置す
ることにより行うことが挙げられる。

【００１５】使用されるマイクロタイタープレートは通
常使用される９６穴タイプのものでよいが、特にこれに
限定されるものではない。ウェルの並び方は通常縦横の
両方向に直線状で格子の交差点に配置される形である
が、この点も限定されない。後述する磁気分離治具の形
態によっては若干の改造が必要なこともある。

【００１６】磁気分離器具は、マイクロタイタープレー
トが有する多数のウェルに側方から磁場を印加するため
に用いられるもので、マイクロタイタープレートの上面
又は底面と当接する平坦なベースと、該ベースのマイク
ロタイタープレートと当接する側の片面上に、マイクロ
タイタープレートに挿入される複数の磁石とを有してな
り、前記の磁石の各々はマイクロタイタープレートの隣
接するウェルの側方に隣接して挿入されるように設けら
れている分離治具である。

【００１７】この治具の使用により、磁性粒子を磁力に
よりウェルの内側壁に保持させたまま、マイクロタイタ
ープレートを通常のようにして光学的測定に供する。即
ち、マイクロタイタープレートの各ウェルに生じた上清
液に垂直方向に測光を通し、透過度、吸光度、蛍光、化
学発光、生物発光等の光学的特性を測定する。このと
き、磁性粒子は内側壁に集められ保持されているので光
路を妨害することはない。

【００１８】以下、図面に即して具体的に説明する。図
1は本発明の方法に使用する磁気分離治具１であって、
マイクロタイタープレートの底側に装着するタイプの一
例を示す斜視図である。図２は同分離治具の平面図であ
る。図３はこの分離治具１をマイクロタイタープレート
２の底面に当接して装着した状態を、図２のＡ−Ａ線で
切断したときの部分断面図である。通常マイクロタイタ
ープレートはプラスチック成型品であるので底側から見
ると、ウェルに対応する突起の間に磁石を挿入すること
ができる間隙ができている。

【００１９】治具１は、ベース３と、該ベース３の片面
に垂直に設けられた棒状磁石４とから構成されている。
ベース３は磁石４を支持するとともにヨークの役割を兼
ねている。ベース３を磁化し得る金属材料で作ることで
マイクロプレートリーダーのマイクロタイタープレート
を設置するトレー面（金属面）への磁気的な結合を防ぐ
ことができ、操作性の向上と機器への悪影響を防ぐこと
ができる。実用的には、例えば、ステンレスのような金
属から機械製作される。

【００２０】磁石４は強力磁場を発生する材料から作製
され、好ましくは永久磁石である。磁石は可能な限り体
積が大きいことが好ましく、該治具をマイクロタイター
プレートに装着した際に液体媒体の液面に近い高さであ
ることが好ましい。また、磁石の形状は棒状ないし円筒
状であることが好ましい。磁場が強いほど、かつ磁場勾
配が大きいほど、分離は良好に行われ、かつその分離は
迅速である。

【００２１】磁石はこれに隣接するウェルに対して磁場
を印加することが好ましく、最も好ましくは一つの磁石
はそれを取り巻く周囲の、通常４個のウェルに対して磁
場を印加する。各磁石はいずれかの方向に着磁されてお
り、好ましくは、ベース面に対して平行又は垂直な方向
に、より好ましくは平行な方向に着磁されている。さら
に好ましくは、図６に示すようにベース面と平行な方向
（即ち、使用時の水平方向）である。最も好ましくは、
図７のＡに例示するように隣接する一対の磁石は、ベー
ス面に対して平行に、かつ相互に同一磁極を対向させる
ように（即ち、反発方向に）着磁されている。このよう
に配置することにより、ウェル内に印加される磁場勾配
が増大し、かつ、全てのウェルに対する印加条件が等し
くなる。

【００２２】図３に戻って、ベース３はマイクロタイタ
ープレート２の底面の範囲に収容されるような寸法であ
ることが好ましく、例えば標準的な96ウェルマイクロタ
イタープレート（縦85mm×横127mm）の場合、縦75mm以
下で横115mm以下であることが好ましい。ベース３に
は、光学測定のために測光が通過するようにマイクロタ
イタープレート２のウェル５に対応する位置に穴６を有
する。標準的なマイクロタイタープレートの場合、この
穴の寸法は直径4mm以上であることが好ましく、特に好
ましくは直径7〜8mmである。

【００２３】磁石４は各ウェルに対して隣接する磁石が
少なくとも１個あるように設ける必要がある。図８は、
４個のウェルに１個の磁石の割合で設けられ、各磁石は
４個のウェルで囲まれて存在するように配置された例
（４ウェル印加タイプ）である。この型の配置の場合、
１個のウェルには１個の磁石が隣接することになる。図
９は任意の隣接する４個のウェルに囲まれた位置(通
常、中央)すべてに磁石が配置された例（フルセットタ
イプ）である。フルセットタイプでは、１個のウェルの
周りに４個の磁石が隣接することになる。

【００２４】磁石４の長さは、図３に示すように、マイ
クロタイタープレート２に装着した時にその高さがウェ
ル５に入れられた液７の水位７ａとほぼ同じ程度である
ことが望ましい。

【００２５】さて、本発明に用いられる治具はマイクロ
タイタープレートの上面に装着するタイプでもよく、図
４はこの種の形態をマイクロタイタープレートに装着し
た状態の部分的断面図である。この場合、マイクロタイ
タープレートには、磁石を挿入するための穴８がプレー
ト上面の所定位置に穿たれている。磁石の長さは、その
先端が図４に示すように、ウェル５の底とほぼ同じ高さ
となることが好ましい。短すぎるとウェルに入れた試料
液に磁場が効果的に作用しない。

【００２６】図５はマイクロタイタープレートの上面側
に装着するタイプの治具であって、磁石の変形例を示す
部分断面図である。この例では、ベースに円筒状の支持
部４ａが設けられ、その先端に磁石４ｂが固着されてい
る。支持部４ａは例えば合成樹脂、セラミック等の材料
でよい。治具をマイクロタイタープレートに執着した時
に図５に示すように支持部４ａと磁石４ｂとの接続部が
ウェル５内の試料液７の液面７ａとほぼ同じ高さである
ことが好ましい。

【００２７】本発明の方法は、Ｂ／Ｆ分離を伴う、固相
法のいずれのバリエーションにも適用可能であり、サン
ドイッチ法、ワンステップサンドイッチ法、競合法によ
る検定のほか、ビオチン標識抗体または抗原を用いた場
合はビオチンアビジンシステムを用い、酵素や蛍光物
質、化学発光物質を標識したアビジンも反応に用いるこ
ともできる。

【００２８】シグナルの測定はマイクロプレートのウェ
ルに残った酵素に基質を加えて一定時間反応させた後、
測定する。加える基質を変えることで比色、蛍光、化学
発光、生物発光等の測定方法と検出感度を選ぶことがで
きる。

【００２９】比色による測定は酵素標識抗体の発色基質
の吸光度もしくは透過率を測定する最も一般的な手法で
あり種々の発色基質が市販されている。通常のエンザイ
ムイムノアッセイで用いる酵素であるアルカリフォスフ
ァターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β-ガラクトシダーゼ等の酵素が抗体または抗原に
標識されたものを用いることができる。

【００３０】蛍光による測定は抗体または抗原に標識さ
れた酵素により基質と反応させ溶液中に生成される蛍光
物質の蛍光を測定する。アルカリフォスファターゼに対
し4-メチルウンベリフェリルリン酸、ペルオキシダーゼ
に対しｐ-ヒドロキシフェニルプロピオン酸+過酸化水
素、β-ガラクトシダーゼに対し4-メチルウンベリフェ
リル-β-Ｄ-ガラクトシド等の酵素と基質の組み合わせ
として用いる。また希土類元素であるEu, Tb, Sm, Dt等
の錯体が標識された抗体または抗原を用いることもでき
る。これらの希土類錯体は蛍光寿命が長く、バックグラ
ンドが消失してから測定することができるため高感度に
測定が行える。蛍光測定においては抗原抗体反応により
磁性粒子に結合せず溶液中に残存した蛍光標識物を測定
することでホモジニアスイムノアッセイも行うことがで
きる。ＦＩＴＣ等のそれ自体が蛍光を発する物質で標識
された抗体または抗原の場合、磁性粒子をウェル側面に
磁気分離することで溶液中に未結合の蛍光標識物質を残
すことが可能であり、洗浄によるB/F分離を行わずに測
定も可能である。

【００３１】化学発光による測定は化学発光物質とし
て、例えばルミノール誘導体、ルシゲニン、アクリジニ
ウム誘導体、ジオキタセン誘導体、シュウ酸誘導体等を
標識した抗体または抗原を用いることができる。

【００３２】生物発光による測定は、例えばルシフェラ
ーゼで標識された抗体または抗原に基質であるルシフェ
リンとＡＴＰ、酸素、マグネシウムイオンの添加するこ
とにより発光で測定できる。またエクオリンで標識され
た抗体または抗原はカルシウムイオンの添加により発光
を測定できる。

【００３３】

【実施例】

［実施例１］ １ステップサンドイッチ法による多項目
免疫測定 （試薬の調製）96穴マイクロタイタープレートに抗ヒト
Fc抗体（A-h-Fc）を吸着させた後、１％牛血清アルブミ
ン／リン酸緩衝液（pH7.4）でブロッキング処理を行っ
た。磁性粒子に抗ヒトFab抗体（A-h-Fab）を化学固定
し、１％牛血清アルブミン／リン酸緩衝液（pH7.4）で
ブロッキング処理を行った。

【００３４】（操作） （1）抗ヒトFc抗体（A-h-Fc）を固定化した96穴マイク
ロタイタープレートの各ウェルに、種々の濃度に希釈し
た抗原（h-Fabとh-Fc）各50μｌ、抗ヒトFab抗体（A-h-
Fab）固定化磁性粒子50μg、アルカリフォスファターゼ
標識抗ヒトFab抗体（ALP-A-h-Fab）50μｌ、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトFc抗体（POD-A-h-Fc）50μｌを分注し
た。各ウェルに入れたものを室温で60分間振とうして反
応させた。その後、図１に示す磁気分離治具をマイクロ
タイタープレートの下部より装着し、２分程度磁気分離
を行った。磁性粒子をウェルの内側壁に吸引、保持した
まま、マイクロタイタープレートをマイクロプレートウ
ォッシャー（日本バイオ・ラッド社製1575）に移し、上
清液を除去後、0.05%Tween20／リン酸緩衝液（pH7.4）
で５回洗浄した。一旦、磁気分離治具をマイクロタイタ
ープレートから外し、各ウェルにアルカリフォスファタ
ーゼ発色基質（Moss社製p-NPP）を100μｌ加え、30分間
振とうし、発色させた。その後、磁気分離治具を装着し
て磁気分離を行い、磁性粒子を内側壁に吸引、保持した
ままマイクロプレートリーダー（東ソー社製MPR-A4i）
に移し、波長405nmで吸光度を測定した。その結果を図
１０に示す（黒四角）。

【００３５】(２)次に、このマイクロタイタープレート
を磁気分離治具を装着したままマイクロプレートウォッ
シャーに移し、0.05%Tween20／リン酸緩衝液（pH7.4）
で５回洗浄した。磁気分離治具を外し、各ウェルにペル
オキシダーゼ発色基質（VECTOR社製TMB）を100μｌ加え
て10分間振とうし発色させた後、磁気分離治具を装着し
て磁気分離を行い、磁性粒子を内側壁に保持したままマ
イクロプレートリーダーに移し、波長650nmで吸光度を
測定した。さらに各ウェルに0.5NHCl（発色停止液）を1
00μｌずつ添加し、波長450nmで吸光度を測定した。そ
の結果を図１１に示す（黒丸）。

【００３６】（３）次に、磁性粒子をウェルの内側壁に
吸引、保持したまま、マイクロタイタープレートをマイ
クロプレートウォッシャー（日本バイオ・ラッド社製15
75）に移し、上清液を除去後、0.05%Tween20／リン酸緩
衝液（pH7.4）で５回洗浄した。一旦、磁気分離治具を
マイクロタイタープレートから外し、各ウェルにアルカ
リフォスファターゼ発色基質（Moss社製p-NPP）を100μ
ｌ加え、30分間振とうし、発色させた。その後、磁気分
離治具を装着して磁気分離を行い、磁性粒子を内側壁に
吸引、保持したままマイクロプレートリーダー（東ソー
社製MPR-A4i）に移し、波長405nmで吸光度を測定した。
その結果を図１０に示す（白四角）。（１）で得られた
結果と良く近似しており、再現性が良好であった。

【００３７】なお、通常ペルオキシダーゼを用いる発色
反応は硫酸や塩酸を用いて停止させるが、上記（２）に
おいてはこのような酸を用いなかった。酸を用いると、
（３）における再現性が著しく低下することがわかっ
た。

【００３８】（４）また、上記とは順序を変えて、先に
（２）で行ったペルオキシダーゼを対象とするヒトFc抗
原の検定を（２）と同様に行い、次にアルカリフォスフ
ァターゼを対象とする（１）のヒトFab検定を行い、再度
（２）と同様にヒトFc抗原の検定を行ったところ、図１
１に示す結果が得られた（白丸）。

【００３９】 ［実施例２］ １ステップサンドイッチ法による多項目
免疫測定 （試薬の調製）磁性粒子に抗ヒトFab抗体（A-h-Fab）を
化学固定し、１％牛血清アルブミン／リン酸緩衝液（pH
7.4）でブロッキング処理を行った。別の磁性粒子に抗
ヒトFc抗体（A-h-Fc）を化学固定し、１％牛血清アルブ
ミン／リン酸緩衝液（pH7.4）でブロッキング処理を行
う。

【００４０】（操作） （１）１％牛血清アルブミン／リン酸緩衝液（pH7.4）
によってブロッキング処理を行った96穴マイクロタイタ
ープレートの各ウェルに、任意の濃度に希釈した抗原
（h-Fab，h-Fc）各50μｌ、抗ヒトFab，Fc抗体（A-h-Fa
b，A-h-Fc）付き磁性粒子各50μg、アルカリフォスファ
ターゼ標識抗ヒトFab抗体（ALP-A-h-Fab）50μｌ、ペル
オキシダーゼ標識抗ヒトFc抗体（POD-A-h-Fc）50μｌを
分注した。室温で60分間振とうして反応させた後、磁気
分離治具をマイクロタイタープレートの下部より装着
し、２分程度磁気分離を行った。マイクロタイタープレ
ートを装着したままマイクロプレートウォッシャー（日
本バイオ・ラッド社製1575）に移し、上清液を除去後、
0.05%Tween20／リン酸緩衝液（pH7.4）で５回洗浄し
た。一旦、磁気分離治具を外し、各ウェルにアルカリフ
ォスファターゼ発色基質（Moss社製p-NPP）を100μｌ加
えて30分間振とうし発色させた後、磁気分離治具を装着
して磁気分離を行い、治具を装着したままマイクロプレ
ートリーダー（東ソー社製MPR-A4i）に移し、波長405nm
で吸光度を測定した。結果を図１２に示す（黒四角）。

【００４１】（２）次に、このマイクロタイタープレー
トを磁気分離治具を装着したままマイクロプレートウォ
ッシャーに移し、0.05%Tween20／リン酸緩衝液（pH7.
4）で５回洗浄した。磁気分離治具を外し、各ウェルに
ペルオキシダーゼ発色基質（VECTOR社製TMB）を100μｌ
加えて10分間振とうし発色させた。その後、磁気分離治
具を装着して磁気分離を行い、マイクロプレートリーダ
ーに移し、波長650nmで吸光度を測定した。結果を図１
３に示す（黒丸）。

【００４２】（３）再度、（１）と同様にしてヒトFab
抗原を測定したところ、図１２に示す結果を得た（白四
角）。（１）で得られた結果と良く一致し、再現性の高
いことが確認された。

【００４３】（４）上記（１）〜（３）とは逆に、初め
に上記（２）と同様にヒトFc抗原の検定をペルオキシダ
ーゼ標識により行い、次に（１）と同様にヒトFab抗原
の検定をアルカリフォスファターゼ標識により行い、再
度ヒトFc抗原の検定をペルオキシダーゼ標識により行っ
た。こうして得られた結果を図１3に示す（白丸）。上
の（２）で得られた結果と良く一致し再現性が良好であ
った。

【００４４】なお、この実施例でも、ペルオキシダーゼ
標識による検定の際に発色反応を酸により停止させたに
ちにアルカリフォスファターゼを標識として用いる検定
を行うとアルカリフォアスファターゼ標識による検定の
再現性が著しく低下することがわかった。したがって、
アルカリフォスファターゼとペルオキシダーゼとを標識
として用い、ペルオキシダーゼの発色反応の停止を酸を
用いて行う場合には、検定反応の順序を考慮する必要が
あることがわかった。

【００４５】

【発明の効果】上記実施例により示されるように、本発
明の方法によれば、１試料から二種以上の免疫反応体の
検定が一連の操作により行うことができる。マイクロタ
イタープレートを用いる形態では、免疫反応の後ウェル
の内壁側面に磁気微粒子を凝集させることができ、しか
もそのままマイクロタイタープレートごと測定治具にセ
ットし、上清の吸光度を測定することができるので、簡
便に免疫学的測定を行うこともできる。さらに具体的に
述べると、次の利点を挙げることができる。 1.マイクロタイタープレートのウェルという同一の反応
容器内で、反応から測定まで行うことが可能である。 2.一般的に普及している分光光度計あるいはマイクロプ
レートリーダーを使用し、磁気分離を維持したまま測定
が可能である。 3.上清液の吸光度を測定するため、測定値が磁性粒子の
懸濁状態に影響されないという利点がある。 4.隣接する磁石を水平方向かつ反発方向に配置し、さら
に４ウェル印加型の配置とすると、印加する磁力および
磁場勾配が大きくすることが容易であり、迅速かつ確実
な磁気分離が可能である。 6.全てのウェルにおいて同一条件の磁場印加が可能であ
る。 7.磁石を固定するベースがヨークとしての機能を兼ねる
ため、治具底面への磁界の漏れがほとんど無い。 8.材質は全て金属とした場合には、堅牢で破損の心配が
なく半永久的に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に使用する磁気分離治具であっ
て、マイクロタイタープレートの底側に装着するタイプ
の一例を示す斜視図である。

【図２】同分離治具の平面図である。

【図３】図２のＡ−Ａ線で切断した部分断面図である。

【図４】本発明の方法に使用する磁気分離治具であっ
て、マイクロタイタープレートの上面側から装着するタ
イプの一例を示す断面図である。

【図５】マイクロタイタープレートの上面側に装着する
タイプの磁気分離治具の磁石部分の一形態を説明する部
分断面図である。

【図６】磁石の着磁方向を示す斜視図である。

【図７】磁石の配置方向を説明する図で、Ａは反発方向
配置を示し、Ｂは同一方向配置を示す。

【図８】４個のウェルに１個の磁石が隣接するように磁
石が配置された、４ウェル印加タイプの配置を説明する
図である。

【図９】任意の隣接する４個のウェルに囲まれた中央す
べてに磁石が配置された、フルセットタイプの配置を説
明する図である。

【図１０】実施例１で得られた、ヒトＦａｂ濃度−吸光
度の検量線を示す。

【図１１】実施例１で得られた、ヒトＦｃ濃度−吸光度
の検量線を示す。

【図１２】実施例２で得られた、ヒトＦａｂ濃度−吸光
度の検量線を示す。

【図１３】実施例２で得られた、ヒトＦｃ濃度−吸光度
の検量線を示す。

【符号の説明】

１．磁気分離治具 ２．マイクロタイタープレート ３．ベース ４．磁石 ５．ウェル ６．穴 ７．液 ８．穴

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料中に存在する免疫反応体を、不溶性固
   相に固定され前記免疫反応体と特異的に結合する相補的
   免疫反応体と容器内で液体媒体中において反応させる段
   階と、該反応に関与した免疫反応体を標識物質を用いて
   検定する段階とを有する、固相法により免疫反応体検定
   する方法において、（ｉ） 前記試料が検定対象として
   二種以上の免疫反応体を含有し、（ii） 該二種以上の
   免疫反応体のそれぞれと特異的に結合する二種以上の相
   補的免疫反応体を用いること、（iii） 前記不溶性固
   相として磁性粒子が用いられ、前記二種以上の相補的免
   疫反応体が別々に磁性粒子に固定されていること、（i
   v） 前記の免疫反応体と相補的免疫反応体との反応に
   より得られた複合体を反応液体からの分離、洗浄を、前
   記容器外から磁場を印加し、該複合体を容器内壁に磁気
   分離し保持して行うこと、（v） 上記二種以上の免疫
   反応体ごとに異なる標識物質とを用いること、（vi）
   前記の標識物質を用いる検定段階が、各免疫反応体ごと
   に順次行われること、を特徴とする、免疫学的多項目検
   定方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の方法であって、免疫反応
   体と固定化相補的免疫反応体とを反応させる前記の段階
   において、該免疫反応体とともに一定量の標識免疫反応
   体とを共存させて、競合法により行うことを特徴とする
   方法。
3. 【請求項３】請求項１に記載の方法であって、免疫反応
   体と固定化相補的免疫反応体とを反応させる前記の段階
   の後で、得られた反応生成物と、一定量の標識相補的免
   疫反応体とを反応させるサンドイッチ法により行うこと
   を特徴とする方法。
4. 【請求項４】請求項１に記載の方法であって、免疫反応
   体と固定化相補的免疫反応体とを反応させる前記の段階
   において、該免疫反応体とともに一定量の標識相補的免
   疫反応体とを共存させて、ワンステップサンドイッチ法
   により行うことを特徴とする方法。
5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
   において、 前記の容器がマイクロタイタープレートの各ウェルであ
   り、前記の容器外からの磁場の印加を、下記の磁気分離
   治具をマイクロタイタープレートの上面又は底面に装着
   させ、磁石を各ウェルの側方に隣接させて配置すること
   により行うことを特徴とする方法：マイクロタイタープ
   レートが有する多数のウェルに側方から磁場を印加する
   ための治具であって、 マイクロタイタープレートの上面又は底面と当接する平
   坦なベースと、 該ベースのマイクロタイタープレートと当接する側の片
   面上に、マイクロタイタープレートに挿入される複数の
   磁石とを有してなり、前記の磁石の各々はマイクロタイ
   タープレートの隣接するウェルの側方に隣接して挿入さ
   れるように設けられている。
6. 【請求項６】請求項５に記載の方法であって、前記のベ
   ース上に設けられたすべての磁石がベースに対して平行
   又は垂直方向に着磁されていることを特徴とする方法。
7. 【請求項７】請求項６に記載の方法であって、磁石がベ
   ース面に平行に着磁されていて、さらに任意の磁石が隣
   接する少なくとも一つの磁石と同一磁極が対向するよう
   に配されていることを特徴とする方法。
8. 【請求項８】請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法
   であって、前記の不溶性固相として前記容器の内壁面が
   一つの免疫反応体を固定化するのに使用される方法。