JP2000500022A - タイプｉｘコラーゲン及びそのフラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は新しい蛋白質をコード表現する新しい蛋白質及びポリヌクレオチドに関するものである。本発明はさらに、特殊なコラーゲン及びその誘導物、特にα３（ＩＸ）コラーゲンを遺伝子組換え三組みタイプＩＸコラーゲン蛋白質に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 タイプＩＸコラーゲン及びそのフラグメント １．序 本発明は新しいヒト・コラーゲン蛋白質及びこれら新しいコラーゲン蛋白質を コード表現するポリヌクレオチド配列に関するものである。 本発明はさらに具体的にはヒトαｑ（ＩＸ）コラーゲンをコード表現するポリ ヌクレオチドとその誘導物、ヒト・タイプ（ＩＸ）コラーゲン蛋白質、及び／又 はタイプＩＸコラーゲン・サブユニット及びその誘導物に関するものである。 ２．背景 コラーゲン原繊維、プロテオグリカン団粒、及び糖蛋白質は軟骨細胞外基盤の 重要な成分で、それらは全体で関節運動中に発生する圧縮、引っ張り、及び剪断 力に対して抵抗している。Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ及びＯｌｄｅｂｅｒｇ、ＦＡＳＥ Ｂ Ｊ．３：２０４２−２０５１ （１９８８）；Ｍａｙｎｅ及びＢｒｏｗｔｏ ｎ， Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ； Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ （Ｗｏｅｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ及びＨｏｗｅｌ ｌ，Ｄ．Ｓ．，） Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ，ｐｐ．８１−１０８ （１９９８）。これら種々の基盤成分間の生合成、集合 、あるいは相互作用をもたらす軟骨基盤遺伝子における突然変異は軟骨基盤の劣 化及び正常な軟骨機能の喪失に関与している可能性がある。 ヒト・コラーゲンにおける突然変異は致死的な胎仔性軟骨異常形成タイプＩＩか らステックラー間接眼炎（ａｒｔｈｒｏｏｐｈｔｈａｌｐａｔｈｙ）及び早期発 生家族性関節炎などの一連の軟骨発達不良を引き起こすことが示されている（Ｓ ｐａｎｇｌｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｒｉａｔｒ．１５３−５６−６５ （１９ ９４）；Ｖｉｋｋｕｌａら、Ａｎｎ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２６：１０７−１１４ （１９９４）：Ｐｒｏｃｋｏｐ及びＫｉｖｉｒｉｋｋｏ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：４０３−４３４ （１９９５）らによって検討）。 タイプＩＸコラーゲンの分析は、この分子が硝子質軟骨及び硝子体液を含むそ の他の組織内のタイプＩＩ含有原繊維の表面に配置されていることを示している （Ｂｒｅｗｔｏｎ及びＭａｙｎｅ、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，Ｐ．Ｄ．，Ｂｉｒｋ， Ｄ．Ｅ．，Ｍｅｃｈａｍ． Ｒ．Ｐ．，編） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ， Ｓａｎｇｉｅｇｏ．ｐｐ．１２９−１７０ （１９９４））。タイプ ＩＸコラーゲンはそれぞれ別の遺伝子による生成物であり、交互に現れる非三重 らせんあるいは非コラーゲン性領域（ＮＣ１−４）と三重らせんあるいはコラー ゲン性領域（ＣＯＬ１−３）を含む３つのポリペプチド・サブユニット：α（Ｉ Ｘ）、α２（ＩＸ）及びα（ＩＸ）によって構成されたヘテロトリマーである。 これら３つのポリペプチド・サブユニッ トは構造α１（ＩＸ）、α２（ＩＸ）、α３（ＩＸ）を有する成長したコラーゲ ン分子に集合化される（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ及びＭａｙｎｅ，Ｓｔｒｕｃ ｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅｓ（ Ｍａｙｎｅ，Ｒ及びＢｕｒｇｅｓｏｎ，Ｒ編） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆ１，ｐｐ．１９５−２２１ （１９８７）。タイプＩＩ及 びタイプＩＸコラーゲンに加えて、種々の供給源からの硝子質軟骨はかなりの量 の少なくとも３つの他のコラーゲン分子、タイプＶＩ、Ｘ及びＸＩを含んでいる 。Ｔｈｏｍａｓら、Ａｎｎ．ｒｅｕｍａｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５３：４８８− ４９６ （１９９４）：Ｍａｙｎｅ及びＢｒｅｗｔｏｎ， Ｃａｒｔｌａｇｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ； Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅ ｃｔｓ （Ｗｏｅｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ及びＨｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，編） Ｍａｒ ｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．８１０１０８ （ １９９８）。タイプＸＩコラーゲンはタイプＩＸコラーゲンと同様、３つの異な ったポリペプチド・サブユニット、α１（ＸＩ）、α２（ＸＩ）、α３（ＸＩ） で構成されたヘテロトリマーである。コラーゲンＸＩＩおよびＸＩＶは仔ウシ関 節軟骨からも単離された。Ｗａｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ， ２６７：２ ００９３−２００９９ （１９９２）。 天然タイプのＩＸコラーゲン分子はタイプＩＩコラーゲン 分子と、領域ＮＣ１、ＣＯＬ１、ＮＣ２、ＣＬＯ２及びＮＣ３がコラーゲン原繊 維の表面にそって並ぶように、高度に特殊な形で相互作用する。タイプＩＸ及び タイプＩＩ間の相互作用は特殊なリシン残基から誘導される多重共有架橋によっ て行われる。ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｏｓｔ及びＭａｙｎｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ，２６３：１６１６−１６１８ （１９８８）；Ｓｈｉｍｏｋｏｍａｋｉら、 Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃｏｄ．Ｓｃｉ． ５８０：１−７ （１９９０）；Ｗｕら 、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６７：２３００７−２３０１４（１９９２）参照 。タイプＩＩコラーゲン原繊維に沿ってのタイプＩＸコラーゲンの周期的局在化 は、コラーゲン性領域ＣＯＬ３及び大型球状領域ＮＣ４がその原繊維から突起し ているので、回転造影によって簡単に視覚化することができる。Ｖａｕｇｈａｎ ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ。１０９：９９１−９９７ （１９８８）；Ｓｈｉ ｍｏｍａｋｉら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃｏｄ．Ｓｃｉ．６８０：１−７ （１９ ９０）。 タイプＩＸコラーゲンのこれら３つの鎖をコード表現する遺伝子は、タイプＩ Ｘコラーゲンがこれら両方の組織の重要な構造的分子であるところから、関節及 び／又は硝子体液に影響を及ぼす軟骨発達不良および劣化性不全の有力な候補で ある。従って、これら３つのタイプＩＸコラーゲン・サブユニットをコード表現 する遺伝子のクローニングについて、現在集中的な研究が行われている。Ｍｕｒ ａｇａｋｉら、Ｅｕ ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ。１９８：７０３−８（１９９０）はヒトα１（ＩＸ） 遺伝子からの両方の交互転写の完全なｃＤＮＡ配列を提出した。ヒトα２（ＩＸ ）コラーゲンｃＤＮＡ配列の過半についてはＰｅｒａｌａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ ｔ．８１９：１７７−８０ （１９９３）によって報告されており、その配列は Ｗａｒｍａｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８３：１５８０６２（１９９４）によって 完全な形で示された。α９（ＩＸ）に関する完全なヒトの遺伝子配列はまだ分か っていない。 遺伝子交配マウスを用いた実験はタイプＩＸコラーゲンが硝子質軟骨の一体性 保持において重要な役割を果していることを示している。α１（ＩＸ）鎖に欠失 を有しているミニ遺伝子（Ｎａｋａｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２８７０−２８７４（１９９３））を表現したり、あ るいは中断されたα１（ＩＸ）遺伝子（Ｆａｅｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：５０７０−５０７４（１９９４）を有 する動物はヒトの関節炎に似た劣化性関節疾患を起こす。ヒトの疾患におけるタ イプＩＸコラーゲンの重要性はエクソン３のスキッピングをもたらし、そして多 重エピフィシール発達不良（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ Ｄｙｓ ｐｌａｓｉａ）（ＥＤＭ２）を起こすＣＯＬ９ＡＳ（Ｍｕｒａｇａｋｉら、出版 用に提出（１９９５））の確認によって確認された。 チキン・タイプＩＸコラーゲンのα３サブユニットをコード表現する全長ｃＤ ＮＡクローンが数年前に報告されたが（Ｂｒｅｗｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．２０５：４４９−４４９（１９９２））、ヒトα９（ＩＸ）コラーゲ ン・サブユニット遺伝子配列の完全な構造を得ようとする試みはまだ成功してい ない。実際、いくつかの出版物がヒトα９（ＩＸ）コラーゲン遺伝子配列の利用 不能性と必要性について触れている。Ｐａｒａｌａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、３ １９：１７７−１８０（１９９３）；Ｐｅｒａｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．，２６９：５０６４−７１（１９９４）；Ｗａｒｍａｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：１５８−６２（１９９４）参照。ヒトにおけるコラーゲンに関連した疾 患がα３（ＩＸ）コラーゲン蛋白質サブユニット配列あるいはその生成における 変化によって引き起こされるのかどうかについて判定するためには、コーディン グ配列及びα３（ＩＸ）遺伝子の染色体の位置の特定が必要であった。さらに、 このコラーゲンの一次アミノ酸配列なしで治療目的のために遺伝子組換えヒトα ３（ＩＸ）コラーゲンおよび三組みタイプのＩＸコラーゲン蛋白質を表現するこ とは不可能である。 ３．発明の要約 本発明は新しいコラーゲン誘導蛋白質とそれらをコード表現するポリヌクレオ チド配列に関するものである。完全なヒトα３（ＩＸ）コラーゲン蛋白質をコー ド表現する完全なヌクレオチド配列は新しいもので、ここに開示されている。こ の新しい配列は以下に述べられる発明のいくつかの側面の基礎も提供する。 本発明のひとつの側面は、ヒトα３（ＩＸ）コラーゲン蛋白質サブユニット全 体、及び好ましくは少なくともアミノ酸端末２５アミノ酸を含むヒトα３（ＩＸ ）コラーゲンの誘導体を生成するためのこの新しい配列の使用である。 本発明はまた、部分的には、活性のあるヒト・タイプＩＸコラーゲン蛋白質は ここに開示されているヒトα３（ＩＸ）コラーゲンと、そしてヒトα１及びα２ （ＩＸ）コラーゲン・サブユニットに関する公知の配列を用いて遺伝子組換え適 に初めてつくり出すことができるという発見に基づいている。 本発明はまた、部分的に、活性のあるヒト・タイプＩＸコラーゲン蛋白質、ヒ トα９（ＩＸ）コラーゲン、及びヒトα３（ＩＸ）コラーゲンの誘導体をコード 表現するヌクレオチド配列及び表現ベクターとも関連している。 本発明の実施の形態において、ヒトα３（ＩＸ）コラーゲンの遺伝子配列及び 染色体位置がコラーゲン性疾患を有する家系を遺伝子的に選別するために用いら れている。ここで開示されているヒトα３（ＩＸ）コラーゲン・コード表現配列 は細胞内でのα３（ＩＸ）コラーゲンｍＲＮＡのレベルを検出、定量するために 用いることができ、さらに細胞内でのα３（ＩＸ）コラーゲンの表現を検出する ための診断目的で用いることも可能である。例えば、α３（ＩＸ）コラーゲン・ コード表現配列は形質変換されたフェノタイプに関連した遺伝子表現における異 常性を診断するために生体組織検査される組織のハイブリダイゼーション・アッ セイで用いることができる。 ４．図面の簡単な説明 図１：ヒトα８（ＩＸ）ＬＭＷペプチドの逆相ＨＰＬＣ分割 （１Ｂ）ここに述べられているような分離条件を用いたヒトＬＭＷの分割 （１Ｃ）ピークＡから作成されるトリプチック・ペプチドの分割 図２：ヒトα３（ＩＸ）鎖トルプチック・ペプチドから得られたアミノ酸 ヒトの配列をチキンα９（ＩＸ）鎖のそれと対応させて比較している。トリプ チック・ペプチドはＴ_VI-2およびＴ_VI-2とラベルされている二重配列をつくりだ した。他のすべてのペプチドは単一アミノ酸配列をつくりだした。ヒドロキシプ ロリン類はＰ^Xで示してある。Ｔ_H1及びＴ_Ivの９番目の蛋白質に存在しているア ミノ酸は判定されなかったので、？によって示してある。非コラーゲン性領域Ｎ Ｃ１及びＮＣ２は線で囲んである。 図３：ヒトα３（ＩＸ）コラーゲンｃＤＮＡに対するクローニング戦略 最上部：ポリメラーゼ鎖反応によって増幅されたｃＤＮＡフラグメントの重複 ；中央：キロベース（Ｋｂ）単位のヒト α３（ＩＸ）コラーゲンｃＤＮＡ；一番下：種々の放射能でラベルした生成物に 対するハイブリダイゼーションでヒト軟骨細胞ｃＤＮＡライブラリ内で確認され たｃＤＮＡクローンＲＢ１４４、ＲＢ１９１及びＲＢ４１０の相対的な位置を示 している。ゲノム性クローンｇＲＢ３５は太線で示す。 図４：ノーザン・ブトットおよびゲノム性ＰＣＲによるヒトα３（ＩＸ）の分析 （Ａ）ヒト軟骨細胞（８．０１μｇ／レーン）を１％アガロース／ホルムアル デヒド／ゲル上で分離して、降流アルカリ性転送でＮｙｔｒａｎフィルターに移 した。ＲＮＡマーカーの位置はキロベースで示してある。 （Ｂ）１．８％アガロース電気泳動によるゲノム増幅の分析。エキソン３およ び４のプライマーを用いてＰＣＲ生成物による７５０、つまりｐ７５０を生成し て、それをサブクローニングして、その生成物がヒト遺伝子ＣＯＬ９Ａ３からの 誘導物であることを確認するために配列決定を行った。 図５：完全なヌクレオチド配列及び対応するヒトα３（ＩＸ）コード表現配列 ５．詳細な説明 本発明はヒトα３（ＩＸ）コラーゲン・サブユニット、遺伝子組換えでつくら れたヒトα３（ＩＸ）コラーゲン及び遺伝子組換えでつくられた全長α３（ＩＸ ）コラーゲン・サブユニットを含むヒト・タイプＩＸコラーゲンをコード表現す るポルニクレオチド配列に関するものである。 ５．１ 定義 『コラーゲン・サブユニット』という用語はひとつの遺伝子でコード表現され るコラーゲン蛋白質、および欠失誘導物および保存置換基などを含む誘導物のひ とつのサブユニットのアミノ酸配列を示している。 『活性ヒト・タイプＩＸコラーゲン』とは天然の 蛋白質複合体を意味し ており、遺伝子組換えでつくられる場合もある。 ここで使われているヒトα３（ＩＸ）コラーゲンとは、自然、合成、あるいは 遺伝子組換えのいずれを問わずいずれかの供給源からの自然発生的配列、あるい はその変種形態を意味し、好ましくはアミノ酸末端分泌信号配列を含んでいる。 好ましいヒトα３（ＩＸ）コラーゲンの変種は自然発生のヒトα３（ＩＸ）コラ ーゲンと少なくとも８５％のアミノ酸相同性を有しているものである。特に好ま しいヒトα３（ＩＸ）コラーゲン変種は自然発生のヒトα３（ＩＸ）コラーゲン と少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有しているものである。さらに好ましい ヒトα３（ＩＸ）コラーゲン変種は自然発生のヒトα３（ＩＸ）コラーゲンと少 なくとも９５％のアミノ酸相同性を有しているものである。また、ヒトα３（Ｉ Ｘ）コラーゲン変種をコード表現する配列は刺激性条件の下でヒトα３（ＩＸ） コラーゲン配列とハイブリダイズするその能力によって識別することができる。 ここで用いられている『刺激性条件』という表現は、（１ ）例えば、５０°Ｃで０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍくえん酸ナトリ ウム／０．１％ＳＤＳを洗浄するために低イオン強度および高温を用いるか、（ ２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド、例えば、０．１％仔ウシ血清ア ルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリｄｏｎｎ／５０ｍＭ のｐＨ６．５のりん酸ナトリウム緩衝液を含んだ５０％（体積／体積）ホルムア ミドなどの変性剤を４２°Ｃの温度で７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭくえん酸 ナトリウムと共に用いるか、あるいは（３）５０％ホルムアミド５ｘＳＳＣ（０ ．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．７５Ｍりん酸ナトリウム、５ｘＤｅｈａｒｄｔ溶液、 超音波処理したサケの精液ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ，及び１０ ％硫酸デキストランを４２°Ｃで用いて、０．２ｘＳＳＣ及び０。１％ＳＤＳ内 で４２°Ｃの温度下で洗浄するハイブリグイジング条件を意味する。 本発明によれば、ヒトα３（ＩＸ）コラーゲン遺伝子生成物のアミノ酸配列を コード表現するいずれのヌクレオチド配列でも、ヒトα３（ＩＸ）コラーゲンの 表現を支持する遺伝子組換え分子を発生させるために用いることができる。 コラーゲンに関連してここで用いられている『精製された』という用語は指示 された分子が、例えばポリヌクレオチド、蛋白質などの他の生物学的分子が存在 しない状態で存在していることを意味する。ここで用いられている『精製された 』という用語は、指示された生物学的分子が少なくとも９５ 重量％、より好ましくは９９．８重量％存在していることを意味する（ただし、 水、緩衝液、その他の小さな分子、特に分子量が１０００ドルトン以下の分子は 存在していても差し支えない）。ここで用いられる『単離された』という用語は その蛋白質の自然の供給源内に存在しているたの蛋白質だけから分離されている ばかりでなく、他の蛋白質からも分離されていることを意味し、好ましくはその 溶液中に通常に存在する溶剤、緩衝液、あるいは他の成分だけが存在している状 態で見いだされる蛋白質を意味している。『単離された』あるいは『精製された 』という用語はその自然の供給源内に存在している蛋白質は含まない。 ５．２ ヒトα３（ＩＸ）コラーゲン・サブユニットのクローニング ここに述べられているひとつの具体的な実施の形態で、完全なヒトα３（ＩＸ ）コラーゲン遺伝子配列が単離された。第一に、タイプＩＸコラーゲンがヒト硝 子質軟骨および消化されたペプシンから単離された。残っているタイプＩＸコラ ーゲン消化成分から推定されるα３（ＩＸ）ペプチドを分離するための方式が考 案された。生成されたα３（ＩＸ）コラーゲンペプチドのトリプチック（ｔｒｙ ｐｔｉｃ）ペプチドをＮ末端アミノ酸配列分析にかけた。α３（ＩＸ）遺伝子の ｇ末端をこのヒト・アミノ酸配列に基づいて設計した二つの劣化性オリゴヌクレ オチド・プライマーを用いてのペリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって得た。追 加的配列を、ヒト軟 骨細胞ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためにＰＣＲフラグメントを用 いると同時に仔ウシおよびチキンα３（ＩＸ）鎖からのアミノ酸配列に基づいて 追加的な劣化性プライマーを設計することによって得た。 しかしながら、信号ペプチド配列及び５’未翻訳配列を含むその遺伝子の５’ 末端を得るために繰り返し行われた試みは成功しなかった。従って、α３（ＩＸ ）遺伝子のゲノム性クローンを得るための方式が考案された。この方式はッポリ メラーゼ鎖反応におけるゲノム性ＤＮＡからの介入イントロン（ｉｎｔｒｏｎ） を単純化するために異なったエキソン内にある（ヒトｃＤＮＡに固有の）α３（ ＩＸ）プライマーを用いる試みを伴っていた。この方式の開発を難しくしたのは ヒトα３（ＩＸ）ｃＤＮＡのエキソン境界の位置が不明であることだった。 繊維性コラーゲンにおいて、三重らせん領域をコード表現するエキソン（例え ば、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙアミノ酸リピートを含む蛋白質領域をコード表現するエキソ ン）はグリシンの完全なコドンで始まり、Ｙ位置での完全なコドンで終わる。さ らに、繊維性コラーゲンにおいて、ほとんどのエキソンは長さが５４塩基対で、 その他は４５、９９、１０８及び１６２塩基対などの９の倍数の塩基対のサイズ を有している。しかしながら、タイプＩＸコラーゲンは多重非コラーゲン性領域 とＧｌｙ−Ｘ−Ｙアミノ酸リピート・モチーフに短い中断部分を含み非繊維性コ ラーゲンである。 α１（ＩＸ）及びα２（ＩＸ）コラーゲン鎖をコード表現する遺伝子に関して 利用できる限定的なゲノム情報は多くのエキソンのサイズが９の倍数の塩基対で はないことを示した。実際、グリシンのい関する分割コドンがエキソン接合部に 存在する場合が時々ある。さらに、チキンのタイプＩＸコラーゲンのｃＤＮＡ配 列はα１（ＩＸ）、α２（ＩＸ）及びα３（ＩＸ）鎖のいくつかのコラーゲン性 及び非コラーゲン性領域のいくつかがサイズにおいて同じでないことを示した（ Ｂｒｅｗｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：４４３−４９（１９ ９２）で検討されている）。従って、種々のタイプＩＸコラーゲンにおける多様 性はこれら３つの鎖をコード表現している遺伝子の構造が違っている可能性があ ることを示唆した。残念ながら、α３（ＩＸ）鎖（ＣＯＬ９ＡＳ）をコード表現 する遺伝子の構造に関する情報はいずれの種に関しても特徴付けがまだ行われて いなかった。 今日までに特徴付けが行われているいくつかのタイプＩＸ遺伝子においては、 イントロンのサイズが大幅に変化する。例えば、チキンα１（ＩＸ）遺伝子は２ ０キロ塩基を越える単一イントロンを含んでいる。Ｎｉｎｏｍｉｙａら、”Ｅｘ ｔｒａｃｅｌｌｕｒａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｅｎｅｓ” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ ｒｅｓｓ、ｐｐ．７９−１１４（１９９０）。哺乳動物のタイプＩＸコラーゲン 鎖に関して最も良く特徴付けが行われている遺伝子はマウスα２（ＩＸ）鎖をコ ード表現する遺伝子である。Ｐｅｒａｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．８６９：５０６４−７１（１９９４）。マウスα２（ＩＸ）遺伝子 のゲノム組織との比較に基づいて、ヒト・コード表現配列に対する二つの異なっ たプライマーが異なったエキソン、特にエキソン８と４に発生することが予測さ れた。オリゴヌクレオチド・プライマーの合成はＣＯＬ９Ａ３の真正のイントロ ン−エキソン構造の不確実性だけでなく、コラーゲン性領域をコード表現するポ リヌクレオチド配列のＧＣ含有量が非常に高いことによっても複雑になっている 。 これらヒト・プライマーはＣＯＬ９Ａ３遺伝子からの推定イントロンを含んで いる生成物を発生させるためにヒト・ゲノムＤＮＡ上でのポリメラーゼ鎖反応に おいて用いられた。同じポリメラーゼ鎖反応がヒト・ゲノムＤＮＡライブラリを スクリーニングするための放射能でラベルしたプローブを発生させるためにも用 いられた。転写された遺伝子配列の５’末端を含むゲノム性クローンが最終的に 確認された。その後にＣＯＬ９Ａ３のゲノム構造を分析したところエキソン３に あることが予測されたセンス・プライマーが実際にエキソン２および３の境界上 にまたがって存在していることが示された。２０のヌクレオチドのうち１３だけ が実際にエキソン３内の配列に対して相補性を示したが、この方式は驚くべき成 功を収めた。 ５．３ 本発明によるα３（ＩＸ）コラーゲンの表現 本発明によれば、タイプＩＸコラーゲン蛋白質、あるいは機能的に同様のもの をコード表現するポリヌクレオチド配列を用いて適切な宿主細胞内でα３（ＩＸ ）コラーゲン蛋白質サブユニット及びその誘導物、タイプＩＸコラーゲン蛋白質 あるいはその機能的相当物の表現を指示する遺伝子組換えＤＮＡ分子を発生させ ることができる。そうしたコラーゲン・ポリヌクレオチド配列、及び少なくとも そうしたポリヌクレオチドあるいはその補完物の一部と選択的にハイブリダイズ する他のポリヌクレオチドは核酸ハイブリダイゼーション・アッセイ、サザーン 及びノーザン・プロット・アッセイなどにおいて用いることができる。 遺伝子コードは自然に劣化するので、本発明の実施にあたっては、同じ、ある いは機能的に同じアミノ酸配列をコード表現する他のＤＮＡ配列をこれらコラー ゲン蛋白質のクローニング及び表現のために用いることができる。そうしたＤＮ Ａ配列としては、刺激性条件の下で適切なヒト・コラーゲン配列とハイブリダイ ズすることができるものがある。 本発明によって用いることができる変性ＤＮＡ配列としては同じ、あるいは機 能的に同等の遺伝子生成物をコード表現する配列をもたらす異なった残基の欠失 、追加、あるいは置換などがある。遺伝子生成物自体がコラーゲン配列内に、内 的な変化を引き起こして機能的に同等のコラーゲンを発生させるアミノ酸残基の 欠失、追加、あるいは置換を含んでいてもよい。こうしたアミノ酸置換基は関与 する残基の多孔性、 電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両性的性質などに基づいてつくるこ とができる。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸 があり、正に荷電したアミノ酸にはリシンやアルギニンがあり、同様の親水性値 を有する非荷電極頭基を有するアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、ヴァリン ；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェ ニルアラニン、チロシンなどがある。 遺伝子生成物の処理と表現を修正する変更などを含めて、種々の目的のために コラーゲンをコード表現する配列を変性させるために、本発明によるＤＮＡ配列 を加工することができる。例えば、代替分泌信号（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓ ｅｃｒｅｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌ）を天然ヒト分泌信号を置き換えたり、あるい は例えばサイト指向突然変異生成などこの技術分野で良く知られている手法を用 いて突然変異を導入し、新しい制限サイトを導入したり、グリコシル化パターン を変えたり、ホスホリル化などを行ったりすることができる。さらに、ヒト以外 の細胞において表現する場合は、本発明のコラーゲンをコード表現するポリヌク レオチドを、特定の宿主生物のコドン優先性とより良く一致させるためにいずれ かの三組みアミノ酸コドンの無症状位置で修正することができる。 本発明の別の実施の形態においては、本発明によるコラーゲンのコーディング 配列が、この技術分野で公知の科学的な 方法を用いて、全体的あるいは部分的に合成することができる。例えば、Ｃａｒ ｕｔｈｅｌａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７：２１５ −２３３（１９８０）；Ｃｒｅａ及びＨｏｒｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ． ９（１０）：２３８１ （１９８０）；Ｍａｔｔｅｕｃｉ及びＣａｒｕｔｈｅｒ ｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１：７１９（１９８０）；及 びＣｈｏｗ及びＫｅｍｐｅ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９（１２）：２８ ０７−２８１７（１９８１）参照。また、その蛋白質自体は少なくとも部分的に でも望ましいコラーゲン・アミノ酸配列を合成するための化学的な方法を用いて 合成することができた。例えば、ペプチドは固相技術で合成して、樹脂から切り 離し、予備的高性能液体クロマトグラフィーで精製することができる（例えば、 Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏ． ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．５０−６０（１９８３）参照）。合成ペプチドの構成はアミ ノ酸分析あるいは配列決定によって確認することができる（例えば、ｔｈｅ Ｅ ｄｍａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏ．， Ｎ．Ｙ．，， ｐｐ．３４−４９（１９８３）参照）。 本発明によるコラーゲンを表現するためには、そのコラーゲンをコード表現す るヌクレオチド配列か、あるいはその機能的相当物を適切な表現ベクター、つま り、挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳のために必要な要素を含んだベ クターに挿入する。 ５．３．２ 表現システム 本発明によるコラーゲンに対するコラーゲン・コーディング配列および適当な 転写／翻訳制御信号を含んだ表現ベクターを構成するために、当業者に公知の方 法を用いることができる。これらの方法はイン・ビトロ遺伝子組換えＤＮＡ技術 、合成技術、及びイン・ビボ組換え／遺伝子組換え技術を含んでいる。例えば、 Ｍａｎｉｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅ ｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ ＷｉｌｅｙＩｎ ｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ． （１９８８）参照。 コラーゲン・コーディング配列を表現するためには、種々のホスト表現ベクタ ー・システムを用いることができる。これらにはそれぞれコラーゲン・コーディ ング配列を含んだ遺伝子組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、 あるいはコスミドＤＮＡ表現ベクターで形質変換されたバク テリアなどの微生物；コラーゲン・コーディング配列を含んだ遺伝子組換えイー スト表現ベクター；本発明によるコラーゲンをコード表現する配列を含んだ遺伝 子組換えウイルス表現ベクター（例えばバクロウイルス）を感染させた昆虫細胞 系；コラーゲン・コーディング配列を含んだ遺伝子組換えウイルス表現ベクター を感染させた植物細胞系（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス，ＣａＭ Ｖ；タバコ・モザイク・ウイルス，ＴＭＶ）、あるいは遺伝子組換えプラスミド 表現ベクタ（例えば，Ｔｉプラスミド）で形質変換された植物細胞系；あるいは 動物細胞系。さらに、本発明によるコラーゲンはその内部で望ましいコラーゲン 生成物が遺伝子交雑動物の乳から回収できるような遺伝子交雑された非ヒト動物 で表現することも可能である。これらのシステムの表現要素はその強さや特殊性 がそれぞれ異なっている。用いられるホスト／ベクター・システムに応じて、構 成的及び誘導的プロモータを含めいずれの数の適切な転写および翻訳要素でもそ の表現ベクターで用いることができる。例えば、バクテリア系でクローニングを 行う場合、例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａ ｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッド・プロモータ）などを用いることができ、昆 虫細胞系でクローニングを行う場合は、バキュロウィルス・ポリヘドロン・プロ モータを用いることができ、植物細胞系でクローニングする場合は、植物細胞の ゲノムから誘導されたプロモータ（例えば、熱ショック・プロモータ；ＲＵＢＩ ＳＣＯの小サブユニットに対するプロモータ；クロロフィルａ／ｈ結合蛋白質に 対するプロモータ）あるいは植物ウィルスからのもの（例えば、ＣａＭＶの３５ Ｓ ＲＮＡプロモータ；ＴＭＶのコート蛋白質プロモータ）を用いることができ 、哺乳動物の細胞系でクローニングを行う場合は、哺乳動物のゲノムから誘導さ れたプロモータ（例えば、メタロチオネイン・プロモータ）あるいは哺乳動物の ウイルスからのプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクチニ ア・ウイルス７．５Ｋプロモータ）を用いることができ、コラーゲンＤＮＡの多 数のコピーを含んだ細胞系を発生させる場合は、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−系ベクタ ーを適切な選択的マーカーと共に用いることができる。 バクテリア系では、表現されるコラーゲンに対して意図される使用法に基づい て多数の表現ベクターを好適に選択することができる。例えば、大量の本発明に よるコラーゲンを抗体発生のためにつくりださねばならない場合、簡単に生成さ れる高レベルの生成物の表現を指示するベクターが望ましい。こうしたベクター には、その内部でコラーゲン・コーデイング配列をｌａｃ Ｚコーディング領域 を有するフレームでベクターと結合させてハイブリッドＡＳ−ｌａｃ Ｚ蛋白質 をつくりだすことができる大腸菌表現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、 ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３）：ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ及び Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄａ Ｒｅｓ． １３：３１０１−３ １０９ （１９８５））、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ．Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９（１９８９）などがある。 好ましい表現系はイースト表現系である。イースト菌においては、構成的ある いは誘導的プロモータを含む多数のベクターを用いることができる。Ｃｕｒｒｅ ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏ ｌ．２ Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ ．＆．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈ．１３（１９８８）；Ｇｒ ａｎｄら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｅ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｓｙｍｏｌｏｇ ｙ，Ｅｄ．Ｗｕ ＆ Ｇｒｏｓｓｍａｎｄ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１ ５８：５１６−５４４（１９８７）；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌ．ＩＩ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，ｃｈ．３ （１ ９８６）；及びＢｉｔｔｅｒ．ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｓｙｍｏｌｏｇ ｙ，Ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ ．１５２：６７３−６８４ （１９８７）；及びＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ＹＥａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｒｅｓ，Ｅ ｄｓ，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ及びＩＩ（１９８２）参照。 本発明によるコラーゲン蛋白質のクローニング及び表現のために特に好ましい システムはイースト菌Ｐｉｃｈｉａからのホスト細胞を用いる。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなど非サッカロマイセス・イースト菌の種はスケール・アップ 手順で高い収率で遺伝子組換え蛋白質を生成する場合に特に利点を有しているよ うに思われる。さらに、Ｉｎｖｉｓｔｒｏｇｅｎ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ）からのＰｉｃｈｉａ表現キットも利用できる。 ピッチア・パストリスなどのメチロトロピック・イースト菌には多数のメタノ ーツ応答性遺伝子が存在しており、そのぞれぞれの表現はメタノール応答性調節 領域（プロモータと表現される場合もある）によって制御される。こうしたメタ ノール応答性プロモータのいずれも本発明を実施する際の使用に適している。具 体的な調節領域の実例としてはＰｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ１から の一次アルコール・オキシダーゼ遺伝子に対するプロモータ、ｐ．ｐａｓｔｏｒ ｉｓ ＡＸＯ２からの二次アルコール・オキシグーゼ遺伝子の対するプロモータ 、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのジヒドロキシアセトン・シンターゼ遺伝子に対す るプロモータ（ＤＡＳ）、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのＰ４０遺伝子に対するプ ロモータ、そしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのカタラーゼ遺伝子に対するプロモ ータなどがある。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける典型的な表現は強く規制されたＡＯ Ｘ１遺伝子からのプロモータによって得られる。Ｅｌｌｉｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ，５：１１１１（１９８５）及び米国特許Ｎｏ．４，４８５，２３ １参照。このプロモータは培地にメタノールを付加した後に高いレベルの遺伝子 組換え蛋白質をつくりだすために誘導することができる。その後同じ細胞を操作 することによって、ここに述べられている発明によるコラーゲンのための遺伝子 の表現が、遺伝子組換え蛋白質がプロリル ４−ヒドロクシラーゼによって十分 にヒドロキシル化され、従って原繊維を形成する際の蛋白質の通常の生物学的機 能に必要な安定したらせん構造に組み込むことができる。 別の特に好ましいイースト菌表現システムはメチロトロフィック・イースト菌 Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを利用する。メタノール上で成長さ れるとメタノール代謝の重要な酵素、つまり、ＭＯＸ（メタノール・オキシグー ゼ）、ＤＡＳ（ジヒドロキシアセトン・シンターゼ）及びＦＭＨＤ（ホルメート ・デヒドロゲナーゼ）の誘導をもたらす。これらの酵素は総細胞蛋白質の最大３ ０−４０％を占める場合がある。ＭＯＸ、ＤＡＳ、及びＦＭＤＨ生成をコード表 現する遺伝子はメタノール上で成長させることによって誘導され、グルコース上 で成長させることによって抑制される非常に強力なプロモータによって制御され る。これらおプロモータのすべて、あるいはいずれかを用いてＨ．ｐｏｌｙｍ ｏｒｐｈａにおいて高レベルの異種遺伝子表現を得ることができる。本発明によ るコラーゲンをコード表現する遺伝子は誘導可能Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａプロ モータの制御下で表現ベクター内にクローンされる。その生成物の分泌が必要な 場合、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプリプロ−メーティング・ファクターα１など イースト菌内での分泌のための信号配列をコード表現するポリヌクレオチドを本 発明のコラーゲンに対するコーディング配列を有するフレーム内に融合される。 表現ベクターは好ましくは栄養要求ホストの不足を補うために用いることができ るＵＲＡ９あるいはＬＥＵ２などの栄養要求マーカー遺伝子を含んでいる。 この表現ベクターは、次に、当業者に公知の技術を用いてＨ．ｐｏｌｙｍｏｒ ｐｈａホスト細胞を形質変換させるために用いられる。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ ａ形質変換の興味深い、あおして有益な特徴は最大１００までの表現ベクターの コピーがゲノム内に自発的に取り込まれることである。ほとんどの場合、取り込 まれたＤＮＡは頭部から末端までの係合を示すマルチマーを形成する。融合され た外来ＤＮＡは非選択的な条件の下でも、いくつかの遺伝子組換え株において安 定して有糸分裂することが示されている。この高コピー・インテグレーションと いう現象はこのシステムの高生産性ポテンシャルをさらに向上させる。 植物表現ベクターが用いられる場合は、本発明によるコラーゲンをコード表現 する配列の表現はいずれか数のプロモー タでも促進することができる。例えば、ＣａＭＶの８５ＳＲＮＡ及び１９Ｓ Ｒ ＮＡプロモータなどのウイルス性プロモータ（Ｂｒｉｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４（１９８４）、あるいはＴＭＶのコート蛋白質プロモ ータ（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１（１９８７） ）を用いることができ、あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕ ｓｓｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７−１６８０（１９８４）；Ｂｒｏｇｌｉａ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３（１９８４）；あるいは熱ショッ ク・プロモータ、例えば大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅあるいはｈｓｐ１７．３−Ｂ（ Ｇｕｒｌｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５（１９８６ ）などの植物プロモータを用いることもできる。これらの構成物はＴｉプラスミ ド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルス・ベクター、直接ＤＮＡ形質変換、ミクロ注 入、電気泳動などを用いて植物細胞に導入することができる。こうした技術に関 しては、例えば、Ｗｅｉｓｅｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｅｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍ ｉｃ Ｐｒｅｓｓ．ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ、ｐｐ．４２１−４６３（ １９８８）；及びＧｒｉｅｒｓｏｎ ＆ Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄＥｄ．， Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｃ ｈ．７．９（１９８８）参照。 本発明のコラーゲンを表現させるために用いる可能性のある別の表現系は昆虫 系である。そうしたひとつの系で、オートグラファ・カリフォリニア（Ａｕｔｏ ｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）核ポリヒドロシス・ウイルス（ＡｘＮＰ Ｖ）が異種遺伝子を表現するためのベクターとして用いられる。このウイルスは スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ） 細胞内で成長する。本発明のコラーゲンのためのコーディング配列はそのウイル スの非基本領域（例えばポリヘドロン遺伝子）内にクローンされ、ＡｃＮＰＶ（ 例えば、ポリヘドロン・プロモータ）のコントロール下に置かれる。コラーゲン ・コーディング配列をうまく挿入すると、そのポリヘドロン遺伝子が不活性化さ れ、閉じ込められていない遺伝子組換えウイルス（つまり、ポリヘドロン遺伝子 によってコード表現された蛋白質性コートを持っていないウイルス）がつくられ る。これらの遺伝子組換えウイルスを用いて挿入された遺伝子が表現されている スポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染する（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ４６：５８４（１９８３）； Ｓｍｉｔｈ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４， ２１５，０５１参照）。 哺乳動物の宿主細胞において、多数のウイルスに基づく表現系を用いることが 可能である。アデノウイルスを表現ベクターとして用いる場合、本発明のコラー ゲンに対するコーディング配列はアデノウイルス転写／翻訳コントロール復号 体、例えば後期プロモータ及び三分割リーダー配列につなげることができる。こ のキメラ遺伝子は次にイン・ビトロあるいはイン・ビボ遺伝子組換えによってア デノウイルス・ゲノムに挿入することができる。ウイルス・ゲノムの非基本領域 （例えば、領域Ｅ１あるいはＥ８）への挿入は成長可能で、感染された宿主内で コラーゲンを表現できる遺伝子組換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈａｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎｏｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８１ ：３６５５−３６５９（１９８４）参照）。また、ワクチニア７．５Ｋプロモー タも用いることができる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ７９：７４１４−７４１９（１９８２）：Ｍａｃ ｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７−８６４（１９８４）；Ｐａｎｉｃ ａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９．４９２７−４９３１ （１９８２）参照）。 挿入されたコラーゲン・コーディング配列を効率的に行わせるためには特殊な 開始信号が必要とされる場合もある。これらの信号にはＡＴＧ開始コドン及び隣 接配列がある。それ自体の開始コドン及び隣接配列を含めてコラーゲン遺伝子全 体が適切な表現ベクターに挿入された場合、追加的な翻訳制御信号は必要とされ ない。しかしながら、コラーゲン・コーディング配列の一部だけを挿入する場合 、ＡＴＧ開始コドンを含め外因性翻訳制御信号を提供する必要がある。さらに、 開始コドンは挿入物全体の翻訳を確実に行わせるように、コラーゲン・コーディ ング配列の読み取りフレームを持ったフェーズになければならない。これらの外 因性翻訳制御信号と開始コドンは天然であれ、合成のものであれ、種々の由来の ものであってよい。表現の効率は適切な転写エンハンサ要素、転写ターミネータ などを含めることによって向上させることができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら 、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５８：５１６−５４４（１９８７ ）参照）。 本発明のコラーゲンを遺伝子組換えでつくるためのひとつの好ましい表現系は 、望ましいコラーゲンがその遺伝子交雑動物の乳から回収できる遺伝子交雑され たヒト以外の動物である。こうした系は本発明によるコラーゲンをコード表現す るＤＮＡ配列を操作的にプロモータおよびその他の必要なオプション可能な哺乳 動物の乳腺内で表現を起こさせることができる調節配列に結合させることで構成 される。同様に、必 要な、あるいはオプション可能な翻訳後酵素も、例えば、米国特許出願Ｎｏ．０ ８／０３７，７２８などで開示されているような、そして標的とされる哺乳動物 乳腺細胞をつくりだす乳蛋白質において操作可能な適切な表現系を用いて、標的 とされる細胞内で同時につくりだすことができる。 乳内で表現させるために好適なプロモータは、例えば、アルファＳ１−カゼイ ン、あるいはβ−ラクトグロブリンなどの豊富な乳固有蛋白質からのものであろ う。例えば、アルファＳ１−カゼインの５’及び３’調節配列はヒト・ラクトフ ェリンｃＤＮＡの表現のためにうまく使われているし、同様に、β−ラクトグロ ブリン・プロモータはヒツジ乳生成細胞においてヒト抗トリプシン遺伝子フラグ メントの表現を起こさせている。Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８３０−８３３（１９９２）。遺伝子交雑されたヤギで、ヒト組織プラス ミノゲン・アクチベータの表現のために乳漿酸プロモータが用いられており、そ の交雑種の乳内でのヒト組織プラスミノゲン・アクチベータの分泌がもたらされ ている、Ｅｂｅｒｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８３５−８３８（１ ９９１）。こうした表現系を用いて、本発明のコラーゲンを乳内に分泌する動物 が得られる。この技術領域の当業者に公知の手順を用いて、望ましいコラーゲン 鎖を選ばれた動物種の乳腺細胞内で機能する適切な制御配列に簡単につけげるこ とができる。必要な翻訳後酵素をコード表現する遺伝子のための表現系も同様に 構成することができ る。 好ましくは、本発明によるコラーゲンは分泌された蛋白質として表現される。 蛋白質の表現のために用いられる遺伝子工学的に操作された細胞が非ヒト宿主細 胞である場合、そのコラーゲン蛋白質のヒト分泌信号ペプチドを宿主細胞の分泌 性向標的メカニズムによってより効率的に識別される別の分泌性信号ペプチドと 置換する方が好適である場合が多い。適切な分泌性信号配列は哺乳動物遺伝子を 菌内で最適に表現させる際に特に重要である。例えば、メチロトロフィックなイ ースト菌においては、インリーディング・フレーム：Ｓクレビシアス（Ｓ．ｃｒ ｅｖｉｓｉａｓ）α−メイティング・ファクター・プリ・プロ配列をコード表現 するＤＮＡ配列をコーディング配列のアミノ末端に挿入することができる。αＭ ＭＦプリ−プロ配列はαＭＦ前駆体分詞内に含まれているリーグー配列であり、 蛋白質分解処理および分泌に必要なｌｙｓ−ａｒｇコード表現配列を含んでいる （例えば、Ｂｒａｋｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１：４ ６４２（１９８４）参照）。 加えて、挿入された配列の表現を調節したり、あるいは望ましい特定のやり方 で遺伝子生成物を修正したり処理したりする宿主細胞株を用いることもできる。 こうした蛋白質生成物の修正（例えばグリコシル化）及び処理（例えば、切断） は蛋白質の機能にとって重要性を持つ場合がある。異なった宿主細胞は蛋白質の 翻訳後処理及び修正に対してそれぞれ異 なった特種なメカニズムを持っている。適切な細胞株あるいは宿主系を表現され る外来蛋白質の正しい修正と処理を確実に行わせるために選ぶことができる。こ うした目的のために、遺伝子生成物の一次転写、グリコシル化、及びホスホリル 化の適切な処理のための細胞メカニズムを有する真核宿主細胞を用いることがで きる。こうした哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ，ＨｅＬａ、ＣＯ Ｓ，ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩＳＥなどを含む。さらに、宿主細胞はコラーゲン分 子の適切な処理を確実に行わせるために種々の酵素を表現するために遺伝子操作 的に加工することができる。例えば、プロリル−４−ヒドロキシラーゼに対する 遺伝子は宿主細胞内でコラーゲン遺伝子と共に共表現させることができる。 遺伝子組換え蛋白質の長期的で、収率の高い生産のためには、安定した表現が 好ましい。例えば、本発明のコラーゲンを暗転して表現する細胞株を遺伝子操作 することができる。ウイルス由来の複製を含む表現ベクターを用いるより、宿主 細胞を適切な表現制御要素（例えば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ター ミネータ、ポリアデニル化サイトなど）と洗濯可能なマーカーによって制御可能 なコラーゲン・コード表現ＤＮＡによって形質変換させることができる。外来Ｄ ＮＡの導入に続いて、遺伝子操作された細胞を栄養を豊富にした培養液内で１− ２日間成長させ、その後選択的な培養液に切り換える。遺伝子組換えプラスミド 内の選択可能なマーカーは選択に対する抵抗性をもたらすと同時に、細胞がその プラスミドをそのクロモソーム内に安定的に融合、成長させてフォーカスを形成 され、そのフォーカスが細胞株内にクローンされ拡張されるようにする。この方 法は望ましいコラーゲンを表現する細胞株を遺伝子操作するために好適に用いる ことができる。 ヘルペス・シンプレックス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら 、Ｃｅｌｌ １１：２２８（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホ リボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２６（１９６２））、 及びアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２ ８：８１７（１９８０））遺伝子をｔｋ、ｈｇｒｔ，あるいはａｐｒｔ細胞でそ れぞれ用いることができる。また、メトトレクセイトに対して抵抗性を付与する 抗代謝抵抗をｄｈｆｒに対しての選択性の基礎として用いることができ（Ｗｉｇ ｌｅｒら、Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３６７５（１９８０）） ；Ｏ’Ｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１５ ２７（１９８１））；マイコフェニル酸に抵抗性を伝えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇ ｅｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８： ２０７２（１９８１））；アミノグリコシドに対して抵抗性を示すｎｅｏ（Ｃｏ ｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒｓｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６０：１（１９８ １））、及びヒグ ロミシンに対して抵抗性を伝えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））を用いることができる。最近、細胞がトリプトファ ンに代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐβ、細胞がヒスチジンの 代わりにヒスチノールを使えるようにするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎｎ ＆ Ｍ ｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８０ ４７（１９８８）及びオルニシン・デルボキシラーゼ・インヒビタ、２−（ジフ ルオロメチル）−ＤＬ−オルニシン、ＤＦＭＯに対して抵抗性を伝えるＯＤＣ（ オルニシン・デカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ Ｌ，Ｉｎ：Ｃｕｒ ｒｅｎｔ ＣＯｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｄ．）（１９８７）など、さらに別の選択性遺伝子も発表されている。 ５．４ 本発明のコラーゲンを表現するトランスフェクタントあるいはトランス フォーマントの識別と表現された蛋白質の精製 コーディング配列を含み生物学的に活性のある遺伝子生成物を表現する宿主細 胞は少なくとも一般的な方式：つまり（Ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡあるいはＤＮＡ−Ｒ ＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）『マーカー』遺伝子機能の存在あるいは不 在、（ｃ）宿主細胞におけるコラーゲンｍＲＮＡ転写物の表現によって測定され る転写のレベルの評価、及び（ｄ）免疫 アッセイ又はその生物学的活性によって測定された遺伝子生成物の検出、によっ て識別することができる。 第一の方式で、表現ベクター内に挿入されたコラーゲン・コーディング配列の 存在はそれぞれそのコラーゲン・コーディング配列と相同のヌクレオチド配列、 あるいはその誘導物の位置で構成されるＤＮＡ−ＤＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡ ハイブリダイゼーションによって検出することができる。 第二の方式で、遺伝子組換え表現ベクター／宿主系は一定の『マーカー』遺伝 子機能（例えば、チミジン・キナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、メトトレ キサンに対する抵抗性、形質変換表現型、バクロウイルスにおける閉塞体形成な ど）の存在、あるいは不在を手がかりに識別及び選別できる。例えば、コラーゲ ン・コーディング配列がソノベクターのマーカー遺伝子配列に挿入されると、コ ラーゲン・コーディング配列を含む遺伝子組換え細胞はマーカー遺伝子機能の不 在によって識別できる。また、コラーゲン・コーディング配列の表現を制御する ために用いられる同じ、あるいは異なったプロモータの制御下で、コラーゲン配 列と並べて配置することができる。誘導あるいは選別に対応してのマーカーの表 現はコラーゲン・コーディング配列の表現を示す。 第三の方式では、コラーゲン・コーディング配列の転写活性はハイブリダイゼ ーション・アッセイで評価することができる。例えば、コラーゲン・コーディン グ配列あるいはその特定の部分と相同のプローブを用いるノーザン・ブロットに よってＲＮＡを単離、分析することができる。また、宿主細胞の総核酸を抽出し て、そうしたプローブとのハイブリダイゼーションに関して評価を行うことがで きる。 第四の方式では、コラーゲン蛋白質の表現は、例えばウェスターン・アッセイ 、放射線免疫沈殿などの免疫アッセイ、酵素結合免疫アッセイなどによって免疫 的に評価することができる。 好ましくは培養液内に分泌される表現された本発明の蛋白質はクロマトグラフ ィによって均一に精製される。ひとつの実施の形態で、遺伝子組換えコラーゲン 蛋白質はサイズ排除クロマトグラフィによって精製される。しかしながら、イオ ン交換クロマトグラフィ、及び逆相クロマトグラフィなどのこの分野で公知の他 の精製方法も用いることができる。 ５．５ α３（ＩＸ）コラーゲン・ポリヌクレオチドの使用 診断及び／又は診断目的のためにα３（ＩＸ）コラーゲン・ポリヌクレオチド を用いることができる。診断目的のために、α３（ＩＸ）コラーゲン遺伝子表現 あるいは疾患状態のα３（ＩＸ）コラーゲン遺伝子表現、例えばリューマチ性関 節炎、骨関節炎、反応性関節炎、自己免疫疾患、バクテリアあるいはウイルス性 感染症による初期炎症（例えば、ライム病）、寄生病、粘液嚢炎、角膜病、及び 骨膠着脊椎炎（突起の融合）を検出するためにα３（ＩＸ）コラーゲン・ポリヌ クレオチドを用いることができる。 ５．５．１ α３（ＩＸ）コラーゲン・ポリヌクレオチドの 診断的利用 α３（ＩＸ）コラーゲン・ポリヌクレチドはα３（ＩＸ）コラーゲンの異常な 表現からもたらされる疾患の多数の利用法を有している。例えば、α３（ＩＸ） コラーゲンＤＮＡ配列は劣化性軟骨及び眼球疾患の病歴を有する家族を遺伝子的 に選別するために用いることができる。別の診断的応用において、α３（ＩＸ） こげんＤＮＡ配列はα３（ＩＸ）コラーゲン表現の異常を診断するためのバイオ プシーのハイブリダイゼーション・アッセイ、例えば、当該箇所でのハイブリダ イゼーション・アッセイを含むサザーンあるいはノーザン分析において用いるこ とができる。こうした技術はこの技術分野では良く知られており、そして実際に 多くの商業的に利用可能な診断キットの基礎として用いられている。 ５．５．２ α３（ＩＸ）コラーゲン・ポリヌクレオチドの診断的使用 α３（ＩＸ）コラーゲン・ポリヌクレチドは種々の異常状態の措置で有用であ る可能性がある。遺伝子配列を細胞内に導入することにより、細胞が正常なα３ （ＩＸ）コラーゲンを少ししか表現しなかったり、あるいは異常な／あるいは不 活性なα３（ＩＸ）コラーゲンを表現する状態を措置するために遺伝子治療を用 いることができる。いくつかの例で、α３（ＩＸ）コラーゲンをコード表現する ポリヌクレオチドが機能的に不全な外因性遺伝子と置換あるいはその機能を果た す目的で使われる。また、過剰増殖で特徴づけられる異常な 状態をα３（ＩＸ）コラーゲン・コーディング配列の抗センスを用いる措置する ことができる。ウイルス・ベクターなどの遺伝子組換え遺伝子治療ベクターをα ３（ＩＸ）コラーゲンを表現するように遺伝子的に操作することができる。従っ て、遺伝子組換え遺伝子治療ベクターはα３（ＩＸ）コラーゲンの異常な表現あ るいは活性から生じる疾患の措置のために治療的に用いることができる。 レトロウイルス、ワクチン・ウイルス、アデノ解合ウイルス、ヘルペス・ウイ ルス、あるいは仔ウシ・パリローマ・ウイルスを標的細胞群内に行くα３（ＩＸ ）コラーゲンを伝達するために用いることができる。この技術分野の当業者に良 く知られた方法を用いて、α３（ＩＸ）コラーゲン・ポリヌクレオチド配列を含 んだ遺伝子組換えウイルス・ベクターを用いることができる。例えば、Ｍａｎｉ ａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ ｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭＯｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕ ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ 及びＷｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．（１９９ ０）に述べられている技術参照。また、遺伝子組換えα３（ＩＸ）コラーゲン分 子は標的細胞に伝達するためにリポゾーム内に再構成することができる。 そうした細胞や組織内にポリヌクレオチドを導入する方法 は組織内への裸のポリヌクレオチドの挿入などイン・ビボでのポリヌクレオチド の導入、自己移植細胞地用で用いるためのエクス・ビボでの細胞内へのα３（Ｉ Ｘ）コラーゲン・ポリヌクレオチドの導入、ウイルス、レトロウイルス、ファー ジあるいはプラスミドなどのベクターの使用、あるいはイン・ビボあるいはエク ス・ビボで用いることができるエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒ ａｔｉｏｎ）などがある。 ５．６ 本発明によるコラーゲン及び遺伝子的に操作した細胞系の利用 ５．６．１ 抗体生産およびスクリーニング 遺伝子組換えでつくられたコラーゲンのエピトープに対する抗体の生産のため にこの技術分野で知られている種々の手順を用いることができる。こうした抗体 にはポリクローナル、モノクローナル、キメラ性、単一鎖、Ｆａｂフラグメント 及びＦａｂ表現ライブラリーでつくりだされたフラグメントなどがある。 抗体を生産するためには、ウサギ、マウス、ラットなど種々の宿主動物をコラ ーゲン蛋白質の注射で免疫化することができる。フロイド（完全及び不完全）、 アルミニウム水酸化物あんどの鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニック・ポリオ ール、ポリアニオン、ペプチド、オイル・エマルジョン、ケイーホール・リンペ ット・ヘモシアニン、及びＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｇａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅ ｒｉｎ）などの有用 である可能性のあるアジュバンドなど表面活性剤などの種々のアジュバンドを用 いて、免疫反応を増大させるために用いることができる。 コラーゲンに対するモノクローナル抗体を培地内での抗体分子の生産を可能に するいずれかの方法を用いてつくることができる。これらの方法にはＫｏｅｈｌ ｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎが最初に述べた（Ｎａｔｕｒｅ，２５６−４９７（１ ９７５））ハイブリドーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｓｂｏｒ ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４：７２（１９８３））；Ｃｏｔｅ ら、Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０（１９８３））、 及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｅ ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６（１９８５））などがある。加えて、『キメラ性抗 体』の生産のために、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に適 切な抗原特性を有するマウス抗体分子からの遺伝子をスプライスすることによる 『キメラ性抗体』の生産に対する手法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１−６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒ ｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ．３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ら、ｎａｕｔｒｅ３１６：４５２−４５４（１９８５））も用いることができる 。また、単一鎖抗体の生産のために述べられている手法（ 米国特許Ｎｏ．４，９４６，７７８）もコラーゲン固有単一鎖抗体をつくるため に用いることができる。 特定の結合サイトの欠失を含む抗体フラグメントは公知の技術で発生させるこ とができる。例えば、こうしたフラグメントは抗体分子のペプシン消化によって つくりだすことができるＦ（ａｂ’）₂フラグメント及びＦ（ａｂ’）₂フラグメ ントのジスルフィド・ブリッジを還元することによって発生させられるＦａｂフ ラグメントなどがある。また、問題のコラーゲンに対する望ましい固有性を有す るモノクローナルＦａｂフラグメントを短時間で、しかも簡単に確認できるよう にするＦａｂ表現ライブラリを構成することもできる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８１））。 ５．７ 実施例 純粋に本発明の具体例を示すことだけを意図している以下の実施例を参照する ことによって、本発明がさらに理解できるであろう。 実施例１：ヒト・タイプＩＸコラーゲン・ペプチドの精製 ヒトの新生胸骨及び肋骨から取り出した軟骨を４Ｍグアニジン−ヒドロクロラ イドで抽出して、組織ペレットをＲｅｅｓｅ及びＭａｙｎｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ２０：５４４−５４４８（１９８１）に述べれらているようにペプシ ンで消化した。ヒト・コラーゲンのペプシンに抵抗性のある フラグメントを０．５Ｍ酢酸内で差分塩沈殿で単離した。天然タイプのＩＸコラ ーゲン・フラグメントＨＭＷ及びＬＭＷ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｅｔ及びＭａ ｙｎｅ）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇ ｅｎｎ Ｔｙｐｅｓ （Ｍａｙｎｅ，Ｒ及びＢｕｒｇｅａｏｎ，Ｒ編） Ａｃａ ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｏｒｌａｎｄｏ．ＦＬ，ｐｐ１９５−２２１（１９８ ７））を１Ｍ ＣａＣｌ₂ ５０ｍＭトリスＫＣｌ、ｐＨ７．４で均衡させたＢ ｉｏ−Ｇｅｌ Ａ １．５Ｍカラム上で分子ふるいクロマトグラフィで分画した 。天然のフラグメントＬＭＷを構成する３つのペプチドを１００ｍＭ ２−メル カプトメタノール、５Ｍ尿素、０．０５ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０内で還元し た。ヨード酢酸アミドで４２°Ｃの温度下で４時間アルキル下した後、ＬＭＷペ プチドをＣ１８ Ｖｙｄａｃ ＴＰ １０４カラム（４．６ｘ２６０ｍｍ）にか けて、１０ｍＭヘプタフルオロブチル酸を含むアセトアニリル０−６５％勾配で 分離した。 二つのピークが得られ、Ａ及びＢとラベルされた（図１Ａ）。ピークＡはヒト α３（ＩＸ）ペプチドと思われるものと同じような相対的運動性を持ってＳＤＳ −ＰＡＧＥゲルに移行したした単一蛋白質バンドを含んでいた。ピークＢは紫外 線吸収に基づいてピークＡより約二倍の蛋白質を含んでおり、ヒトα１（ＩＸ） 及びα２（ＩＸ）蛋白質と同じ相対的運動性をもって移行したＳＤＳ−ＰＡＧＥ による二重のハン ドを発生した。 実施例２：トリプチック・ペプチドの単離と分析 ピークＡからの蛋白質であるα３（ＩＸ）鎖を集めて、０．２Ｍ （ＮＨ₄） ＨＣＯ₃ ｐＨ８．０内に溶解し、Ｍａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ６８−９３８１−９３８５（１９９３）に述べられている方法でＰＲＣＫ−トリ プシン（Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニチル・クロロメチル・ケトン処理ト リプシン、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）で 消化した。トリプチック・ペプチドを４５％アセトニトリル含有９ｍＭトリフル オロアセチル酸の０−９９％勾配上で１６９分かけて、Ｃ１８ Ｖｙｄａｃ Ｔ Ｐ １０４カラム上で分離した（図１Ｂ）。１０個のピーク（Ｉ−Ｘとラベル） が得られた。選ばれたピークを含む画分を凍結乾燥し、Ｍａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９３８１−９３８６（１９９３）に述べられているよ うにＮ末端孔サイズ配列決定を行った。 図２はこれら１０個のトリプチック・ペプチドから得られたアミノ酸配列を示 している。チキンα３（ＩＸ）鎖のアミノ酸配列を揃えると、ヒト・アミノ酸配 列は８１％同一であり、明らかにヒトα３（ＩＸ）鎖のものであった。我々はＮ Ｃ２からの７つの残基、ＮＣ１からの５つの残基、そしてＣＯＬ１の１１２の残 基から３つの残基を除いたものを含む１２４の継続アミノ酸を判定した。ペプチ ドＴ_IH及びＴ_IVの９ 番目の残基は確認できなかった。チキンα３（ＩＸ）配列と比較した場合、Ｔ_IH の９番目の残基はＣＯＬ１の５番目のＧｌｙ−Ｘ−ＹリピートのＸ位置のプロラ イン残基に対応する。Ｔ_IVの９番目の残基はＣＯＬ１の１８番目のＧｌｙ−Ｘ− ＹリピートのＹ位置内のリシン残基に対応する。我々の予想では、リシン残基の カルボニル基でトリプシンによる切断が起き、この位置のすぐ後にグリシンで始 まるアミノ酸配列をペプチドＴ_Vから得たので、ヒトα３（ＩＸ）鎖がこの位置 でリシンを含んでいると予想している（図２）。判別されなかった最終的なアミ ノ酸もチキン配列内のリシンに対応しており、この位置でトリプシンによる切断 が起きることもペプチドＴ_Xから得られたアミノ酸配列とも一致している。 実施例３：ＲＮＡの単離及びポリメラーゼ鎖反応によるｃＤＮＡの増幅 一昼夜のコラーゲンによる消化で青年および成人の肋骨の軟骨からコンドロサ イトを得て（Ｂｒｅｗｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０５：４４５ −４４９ （１９９２））、総ＲＮＡを酸グアジニン法（Ｃｈｏｍｏｚｙｎｓｋ ｉ及びＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ。１６８：１５６−１５９（１ ９８７））によって細胞ペレットから得た。総あるいはポリ（Ａ）−リッチＲＮ Ａを６ｍＭ水酸化メチル水銀の存在下で変性し、ランダム・ヘクサメータあるい はＢｒｅｗｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：４４５−４４９（ １９９２）に述べられている方法で合成 されたオリゴ（ｄＴ）及び第一ストランドｃＤＮＡでプライムした。 ＰＣＲサイクリング・パラメータは通常９４°Ｃで２分間、７２°Ｃで２分間 の割合で９０あるいは３５サイクルである。反応混合物は通常生成物の収率と効 率を向上させるために反応混合物には通常１０％グリコールが含まれた（Ｐｏｍ ｐ及びＭｅｄｒａｎｏ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：５８−５９（１９ ８１）：Ｂｒｅｗｔｏｎら、ＥＵＲ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：４４３−４ ４９（１９９２））。結果を１．８％ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース・ゲル（Ｆ ＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）上で分析した。１． ０−１．５％低融点アガロース・ゲル（Ｂｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ．ＭＤ）からＤＮＡハンドを切除して、ＱＬＡＥＸ^TM樹脂（ＱＬＡＧＥ Ｎ社、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）あるいはＧＥＬａｓｅ^TM（Ｅｐｉｎｃｅｎ ｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて精製した 。 すべてのＰＣＲ生成物を後で特徴付け及び配列決定を行うためにｐＣＲＩＩベ クター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）にサブクローン した。アルカリ変性あるいはサイクル−シーケンシング（ｆｍｏｌ ＤＮＡシー ケンシング・システム、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を行った後、 二重ストランド・プラスミドを両方のストランド上でシーケナーゼｖ２．０（Ｕ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａ ｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて十分 に配列決定した。 ＣＯＬ１及びＮＣ１から得られたα３（ＩＸ）トリプチック・ペプチドのアミ ノ酸配列を用いて２０ｍｅｒヌクレオチド劣化オリゴヌクレオチドを設計した。 センス・プライマーＨ１ ［５’−ＣＡＩＧＧＩＧＡ（ＣＴ）ＡＧＧＧ（ＴＣＧ ＣＡ）ＧＡ（ＴＣ）ＡＡ−８’］は配列ＱＧＤＲＧＫに基づいており、逆プライ マー Ｈ２［６’−ＡＴＩＣＡＧＣＩＧＡ（ＴＧＣＡ）ＧＴ（ＧＡ）ＴＣ（ＧＡ ）ＣＡ−３’］は配列ＣＤＴＳＡＣＭに基づいていた。最初のストランドｃＤＮ Ａはオリゴ ｄＴ−プライム化総ヒト軟骨細胞ＲＮＡから合成され、プライマー Ｈ１及びＨ２は２１２ｂｐ ＰＣＲ生成物（ｐ２１２）を発生させるために用い られた。ＤＮＡの配列決定でｐ２１２がＣＯＬ１及びＮＣ１にまたがるヒトα３ （ＩＸ）配列をコード化することが確認された。２１２をプローブとして用いて 、クローンＲＢ１４４をｃＤＮＡライブラリ（以下の実施例４参照）から得た。 ５’からＲＢ１４４までの配列を得るために、新しい劣化プライマーＨ１０ ［５’ＧＡＩＧＧＵＧＡＵＡＡ（ＧＡ）ＧＧ（ＴＧＧＡ）ＧＡ（ＧＡ）ＧＡ−３ ’］を仔ウシα３（ＩＸ）鎖のＣＯＬ２領域内のアミノ酸配列ＤＧＥＫＧＥＡに 基づいて設計した。劣化性を減らすためにいくつかの位置にイノシンを組み込ん だ。Ｈ１０を逆プライマーＨ２と対合させて１０６１ｂｐＰＣＲ生成物、ｐ１０ ６１（図３ を増幅 し、サブクローンし、十分な配列決定を行った。 仔ウシ及びチキンα３（ＩＸ）コラーゲン鎖からのアミノ酸配列に基づく劣化 オリゴヌクレオチド・プライマーを利用して別のｃＤＮＡ配列を発生させた。信 号ペプチド内に発生し、３つのアミノ酸ＮＣ４領域、ＱＲＶ、及びＣＯＬ３の最 初のグリシンを含むチキンα３（ＩＸ）配列ＴＳＱＲＶＧに基づいてセンス・プ ライマーＨ３３、［５’−ＡＣＡ（ＴＡ）ＧＩＧＣＩＡ（ＧＣ）（ＣＡ）ＧＩＧ ＴＩＧＧ−３’］を設計した。仔ウシ・ペプチドＰＣＦＫＧＰＴＧＹＫＧＥＰＧ ＥＶＧ（Ｅｙｒｅら、Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｄ Ｏｓ ｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ（Ｋｕｅｔｎｅｒ，Ｋ．Ｅ．Ｓｃｈｌｅｙｅｒｂａｃ ｈ，Ｒ．，Ｐｅｙｔｏｎ Ｊ．Ｇ．＆Ｈａｃａｌｌ，Ｖ．Ｃ編） ｐｐ．１１９ −１３１，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｗｕら、 Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：２３００７−２３０１４（１９９２））に基づ いて設計した。第一のプライマー、Ｈ３０［５’−ＡＣ（ＴＣ）ＴＣＩＣＣＩＧ Ｇ（ＴＣ）ＴＣＩＣＯ（ＴＣ）ＴＴ−３’］はアミノ酸ＫＧＰＴＧＹＫに基づい ていた。第二のプライマー、Ｈ３１ ［５’−ＴＴ（ＧＡ）ＴＡＩＣＣＩＧＴＩ ＣＧＩＣＣ（ＴＣ）ＴＩ−３’］はアミノ酸ＫＧＥＰＧＥＶに基づいていた。プ ライマー対Ｈ３３→Ｈ３０及びＨ３３→Ｈ３１はそれぞれ５２７及び５４５ヌク レオチドのＰＣＲ生成物を増幅することが予想された。プライマーＨ３３及びＨ ３０内部で予想より 大きな５４５ヌクレオチド（ｐ５４５）のＰＣＲ生成物がつくられた。配列分析 の結果、逆プライマーＨ３０がアミノ酸ＫＧＥＰＧＥＶをコード表現する３’核 酸配列に変性したことを裏づけた。ｐ１０６１及びｐ５４５は重複していないの で、ＮＣ４領域からポリーＡ末尾までの領域に広がっている継続的ヌクレオチド 配列を得るために、センス・プライマーＨ３４ ［５’−ＧＧＧＣＴＡＧＴＧＡ ＣＣＴＴＣＡＧＴＣＧ−８’］及び逆プライマーＨ２５ ［５’−ＴＧＧＡＣＧ ＡＧＣＧＧＧＧＴＣＣＡＡＡＣ−３’］を用いてＰＣＲ生成物ｐ６２５を発生さ せた。 実施例４：ｃＤＮＡスクリーニング及びｃＤＮＡクローンの特徴付け ユニザップ（Ｕｎｉｚａｐ）ＸＲベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊ ｏｌｌａ，ＣＡ）内で単方向ヒト軟骨細胞ｃＤＮＡライブラリを構成して、³²Ｐ でラベルしたＰＣＲ生成物によってスクリーニングした。 ３Ｘ ＳＳＣ（１Ｘ ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５ Ｍくえん 酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％Ｎ−ラウリルアルコシン、及び１００ｍ ｇ／ｍｌ変性ニシン精液ＤＮＡ内で６５°Ｃの温度下で一昼夜かけてハイブリダ イゼーションを行わせた。フィルターをＳＸ ＳＳＣ，０．５％Ｎ−ラウリルサ クシンで６５°Ｃの温度下で洗浄して、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィル ムに露出させた。ポジティブな主要斑点を予想されたサイズのプローブのバンド がつくられることを確認するために内部プライマーを用いたＰＣＲによって分析 した。別のＣＰＲ反応をポジティブ・プライマー斑点上で行って、それによって 内部センス及び抗センス・プライマーをベクター・プライマーを対合させて挿入 物の方向とサイズを判定した。最大の挿入物を含んだユニークな斑点をクラーン してさらに特徴付けを行った。すべてのｃＤＮＡクローンを両方のストランドで 完全に配列決定した。 放射能でラベルしたｐ２１２を用いてこのヒト軟骨細胞ｃＤＮＡライブラリを スクリーニングし、２つのｃＤＮＡクローンを得た。ＲＢ１４４は９１３ヌクレ オチド長であり９’未翻訳配列内に延びているが、ポリＡ末尾を欠いている。Ｒ Ｂ１９１は８４７ヌクレオチド長でポリ・アデニル化末尾を含むＣＯＬ９Ａ３の ８’未翻訳配列全体を含んでいる。α３（ＩＸ）鎖の領域構造に対するこれら３ つのクローンの位置を図３に示す。 複製物ライブラリ・フィルターを放射能でラベルしたｐ５４５及びｐ６２５で プローブしたところ、単一の斑点，ＲＢ４１０が両方のプローブとハイブリダイ ズしていることが確認された。ＲＢ４１０は長さが１９３４ヌクレオチドでＮＣ ３とＣＯＬ３の接合部まで延びているが、ＣＯＬ３あるいは信号ペプチドは含ん でいなかった。 実施例５：ノーザン・ハイブリダイゼーション 総ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒド・ゲル上で 電気泳動によって分離した。ＲＮＡを下方アルカリ伝送によってＭａｘｉｍｕｍ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｎｙｔｒａｎ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄＳｃｈｕ ｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移して、紫外線でその膜に架橋させた。フィルタ ーを５ｘ ＳＳＣ、１％Ｎ−ラウリル・サルコシンと０．５ｍｇ／ｍｌニシン精 液ＤＮＡ内でビオチニル化された単一鎖プローブで一昼夜かけてハイブリダイズ し、０．５％Ｎ−ラウリル・サルコシンを含んだ３Ｘ ＳＳＣ内で２度、さらに ３Ｘ ＳＳＣ内で２度、いずれも６５°Ｃの温度下で洗浄した。ＰｏｌａｒＰｌ ｅｘ検査手順（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）を用いて化学蛍光検査を行っ た。１０１２ｂｐ単一ストランド相補プローブを、単一の抗センス・プライマー Ｈ１４ ［５’−ＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴ−３’］と１０６ １ｂｐ二重ストランド生成物をテンプレートを用いた線形ＤＮＡ増幅によって発 生させた。最終反応条件は以下の通りであった：２０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ ８．４、５０ ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、それぞれ１００μＭ のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，及びｄＧＴＰ、６５μＭ ｄＴＴＰ、３５μＭビオチン −１６−ｄＵＴＰ、４００μＭプライマーＨ１４、４００ｎｇテンプレート、５ ０μｌ反応体積内での２−５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃ ｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。プライマーを２分間、９５°Ｃ、１分 間、４５°Ｃ、２分、７２°Ｃで５０サイクル延長させた。組み込まれなか ったヌクレオチドをエタノール沈殿で取り出した。予備的な実験を行ったところ 、この単一ストランド抗センス・プローブ手順はＧ／Ｃ−リッチ継続プローブの ｒＲＮＡへのクロス・ハイブリダイゼーションをなくす上で極めて効果的であっ た。α３（ＩＸ）プローブは３．３ｋｂチキンα３（ＩＸ）転写物より小さいが α３（ＩＸ）鎖をコード表現するのに必要な転写物サイズの条件は満たしている ２．５５ｋｂの単一バンドとハイブリダイズした（図４Ａ）。α３（ＩＸ）転写 物に関して推定されたサイズの違いは、一部にはヒトおよびチキンｍＲＮＡの３ ’−未翻訳配列の長さの違いによって起こされている。全長チキンα３（ＩＸ） ｃＤＮＡクローンは８３６ヌクレオチドの３’未翻訳配列を含んでいたが、ポリ −Ａ末尾は欠いていた。ヒトα３（ＩＸ）ｃＤＮＡクローンＲＢ１９１内で識別 された最長の８’−未翻訳配列は長さが３８０ヌクレオチドであった。 実施例６：ゲノム性クローンの単離 ５’−ＲＡＣＥ（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８９９８−９０２２（１９８８））による単一ペプチド及 び５’未翻訳配列を得る試みを繰り返し行ったがうまくいかなかったので、ヒト α３（ＩＸ）鎖の５’ヌクレオチド配列を完成させるために、我々はＣＯＬ９Ａ ３をコード表現するゲノム性クローンを単離して、その特徴付けを行った。マウ スα２（ＩＸ）遺伝子、Ｃｏｌ９ａ２（Ｐａｒａｌら、（１９９４）、のゲノ ム組織に基づいてヒト・プライマーがつくられ、それぞれエキソン８及び４内部 に存在すると推定された。エクソン３内に存在しているセンス・プライマーＨ３ ６ ［５’−ＣＡＴＴＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣ−３’］とエクソン ４内に存在している逆プライマー Ｈ４４ ［５’−−ＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴＴ ＴＣＣＣＣＧＧＣＴ−３］を用いて総ヒト・ゲノムＤＮＡを単純化した。サイズ が約７５０ｂｐの一次ＰＣＲ生成物が得られた（図４Ｂ）。ＰＣＲ生成物、ｐ７ ５０をｐＣＲ ＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローンして、挿 入物の末端がＣＯＬ３をコード表現するヒトα３（ＩＸ）ｃＤＮＡ配列を含んで いること、及びコンセンサス・スプライス・サイトが存在することを確認するた めに配列決定を行った。放射能でラベルしたｐ７６０を用いてヒトＥＭＢＬ３Ｓ Ｐ６／Ｔ７ゲノム・ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をスクリーニングし、１３ｋｂ挿入物 を含んだクローンｇＲＢ３５を単離して、部分的な特徴付けを行った。ｇＲＢ３ ５から得られたエクソンの配列は５’−ｐＲＢ４１０の間に広がり、ＰＣＲ生成 物ｐ５４５から最初に得られたヌクレオチド配列と完全に一致した。単一ペプチ ド及び５’核酸配列はプライマー・ウォーキングによって得られた。 実施例７：配列分析 ＰＣＲ生成物を重複させ、ｃＤＮＡとゲノム性クローンを 重複させると図５に示されているヒトＩＸコラーゲンのα３鎖（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ４１１６２）の完全な一次構造を提供する。α ３（ＩＸ）転写物は典型的な疎水性信号ペプチド・リーダー配列を表現させる。 Ａｌａ₃₅とＧｉｎ₂₆との間の信号ペプチダーゼ切断サイトと思われるものは（− １、−３）ルール（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｉｎｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：４６８３−４６９０ （１９８６））と一致する。より大きな非継続領 域ＮＣ１、ＮＣ２、ＮＣ３及びＮＣ４に加えて、ヒトα３（ＩＸ）鎖は三重らせ ん領域内に３つのより短い中断箇所を含んでいる。ＣＯＬ３に見られるひとつの 中断箇所とＣＯＬ１内に見られる２つの中断箇所は位置的にチキンα３（ＩＸ） 鎖内に見られる中断箇所を正確に対応している。しかしながら、チキンα３（Ｉ Ｘ）鎖のＣＯＬ２内にある追加中断箇所（Ｂｒｅｗｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ，２０５：４４３−４４９（１９９２）；ＨａｒＥｌら、Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１００７０−１００７６（１９９２））はヒトα３（Ｉ Ｘ）鎖では見られない。 ３つのポリアデニレーション信号、ＡＡＴＡＡＡが３’未翻訳配列で識別され た。ｃＤＮＡクローンＲＢ４１０は第二のＡＡＴＡＡＡから１８ヌクレオチド下 流から始まるポリ−Ａ末尾を含んでいたので、少なくともこれらのサイトのうち の２つは一定の機能を果たしている。クローンＲＢ１９１は３’ＡＴＡＡＡの大 部分を使ったので、遺伝子バンクに預託 された配列はＲＢ１９１からの完全な３’−未翻訳配列である。ｐ１０６１の異 なったクローンに存在しており、また、ｃＤＮＡクローンＲＢ１４４、ＲＢ１９ １、あるいはＲＢ４１０のひとつあるいは複数にも存在している塩基変化を識別 することによってふたつの多形性がＣＯＬ１にも特定された。第一の多形性ＧＧ^O _/c はグリシン₈₇₅をコード表現するコドンの第三の位置に存在する。第二の多形 性ＣＣ^T _/cはプロライン₈₅₀をコード表現するコドンの第三の位置に存在する。こ の多形性はＳＳＣＰ分析で別個に識別され、結合に関する情報を含んでいること が示された（以下参照）。いずれの塩基変化もＣＯＬ１のアミノ酸配列を変化さ せない。 実施例８：クロモゾーム性結合の分析 マウスＣｏ１９Ａ２遺伝子（Ｐａｒａｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６ ９：５０６４−５０７１（１９９４））の公知の遺伝子構造に基づいて、それぞ れセンスおよび逆相補配列（ｂｐ１６１５から１６８３とｂｐ１７５６から１７ ７４）を示しているエクソン内プライマー対 ［５’ＣＡＧＴＴＡＧＣＣＧＣＧ ＣＡＣＣＴＡＡ−３’］と９Ａ３−２［５’ＧＧＴＣＴＣＣＣＡＤＣＴＣＣＣＣ ＡＧＴ−３’］を用いてＰＣＲでヒト・ゲノムＤＮＡを増幅した。反応は３０ｎ ｇのＤＮＡ、各プライマー０．５μｍ、各ｄＮＴＰ２００ｐｍ、そして０．２Ｕ Ｔａｑポリメラーゼを含む１０μｌ体積内で、最初に９５°Ｃの温度で４分間 の変性ステップを行い、次に９５°Ｃで３０秒間、６９°Ｃで３０秒間、そして ７２°Ｃで４０秒間を１サイクルとして３５サイクル行い、最後に７２°Ｃで７ 分間最終的な延長を行わせる方式で実施した。生成物を４０％ホルマリンの存在 下で変性させて、単一ストランド立体配座多形性（ＳＳＣＰ）分析を行うために 各サンプル２μｌをＭＤＥゲル（ＡＴ ＢｉｏＣｈｅｍ）上で分離した。Ｏｒｉ ｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：２７６６ −２７７０（１９８９）。生成物を９Ａ３−１プライマーをｙ−⁵²ＡＴＰでラベ ルして、げるを標準Ｘ線フィルムに露出させて視覚化させた。ヒト・ゲノムＤＮ Ａをこれらプライマーを用いて増幅させ、１５９ｂｐの生成物を得た。これはサ イズにおいてｃＤＮＡからの生成物と同一であり、二つのプライマー間でイント ロニック（ｉｎｔｒｏｎｉｃ）配列が不在であることも一致している。ＰＣＲに よるヒト−ハムスター体細胞ハイブリッド・パネルをスクリーニングしたところ 、ＣＯＬ９Ａ３はヒトクロモソーム１６、１９、あるいは２０のいずれかにある ことが示された（データ示さず）。 比較対象ＤＮＡサンプルのＳＳＣＰ分析からＰＣＲにおける二対立遺伝子多形 性の存在が明らかにされ、遺伝子型系統付けに用いられた。Ｊｕｒｇ Ｏｒｔ博 士（Ｌａｔｈｒｏｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８ １：３４４３−３４４６（１９８４））の好意で提供されたＬＩＮＫＡＧＥプロ グラム（バージョン５．１０）のＣＬＯＤＳＣＯＲＥ部分を用いて、ＣＥＰＨ（ Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’ Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ）のＣＯＬ９Ａ ３と遺伝子座間の対全体にわたる結合分析が行われた。雄及び雌に対する性固有 遺伝子組換え率は２ポイント分析を行うために等しくなるように設定された（ｍ^mx ＿ｔ）。 対立遺伝子頻度は０．６２及び０．３８で異種接合体頻度は０．４７（計算） と０．５１（観察）であり、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ均衡と一致していた 。ＣＬＯＤＳＣＯＲＥを用いた２ポイント分析はＣＯＬ９Ａ３とヒト・クロモソ ーム２０上のいくつかのマーカーとの間の結合を示した（表１）。最も密接に結 合されたマーカーはＤ２０Ｓ１９（Ｚ＝２８．２で＿＝０．０５）であり、強い 結合は２０ｑ１３．３−ｑｔｅｒに物理的に分布している（Ｒｏｕｙｅｒら、（ １９９０））Ｄ２０Ｓ２４（Ｚ＝１０．３で＿＝０．０６）でも観察された。 実施例：ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓにおける遺伝子組換えα３（ＩＸ） コラーゲン・サブユニットの表現 プラスミドｐ６４５及びｃＤＮＡライブラリ・クローンＲＢ４１０からのα３ （ＩＸ）コラーゲンｃＤＮＡコーディング配列を増幅するためのプライマーを作 成した。これらのプライマーはα３（ＩＸ）コラーゲン・コーディング配列の５ ’及び３’末端にＥｃｏ ＲＩサイトを導入するように設計され、これら２つの クローン内に見いだされるコーディング配列の二つの半分体を結合させるために 独自の制限サイトが用いられた。 Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）に述べられているような標準的 なＰＣＲ条件を用いて、プラスミドｐ５４５からのα３（ＩＸ）コラーゲンの関 する成熟したアミノ末端コーディング配列を増幅するためにプライマー１及びプ ライマー２が用いられる。上に述べたようなｃＤＮＡクローンＲＢ４１０からの 停止コドンを含む残りのｃＤＮＡコーディング配列を増幅するためには、プライ マー３とプライマー４が用いられる。その結果生じるＰＣＲ生成物を選ばれた独 自の制限エンドヌクレアーゼとＥｃｏＲ１によって消化した。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉａ内で分布される表現を制御する市販の表現ベ クターｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を制限 エンドヌクレアーゼ ＥｃｏＲ．Ｉで消化して、その後仔ウシ腸ホスホターゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） で消化して、最後に７０°Ｃの温度で５分間変性させた。消化されたＰＣＲ生成 物とｐＰＩＣ９ベクターを実施例３で述べたようにゲル精製して、三方向結紮を 行った。生きている大腸菌内に形質導入した後、正しく結紮されたプラスミドを 制限分析で識別して、市販のＰｉｃｈｉａ配列決定プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏ ｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて配列決定を行って確認した。 α３（ＩＸ）Ｐｉｃｈｉａ表現ベクターを直線化して、プロピル−４−ヒドロ キシラーゼも表現するｈｉｓ４ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株の球状芽腫 を形質導入するために用いた。ヒスチジン欠損媒体上に形質転換因子が認められ 、メタノール培地上でゆっくり成長させてＡＯＸ１遺伝子の喪失に関するアッセ イを行って確認された。α３（ＩＸ）遺伝子の表現は唯一の炭素供給源としての メタノール上で細胞を成長させることで誘発させる。α３（ＩＸ）コラーゲン・ サブユニットは成長培地内に分泌され、標準的な遠心分離、ろ過、及びクロマト グラフィ技術を用いて精製される。 実施例１０：Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ内での三組みヒト・タイプＩコ ラーゲンの表現 同様の方法で、α３（ＩＸ）コラーゲンサブユニットをつくりだすＰｉｃｈｉ ａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、同じ細胞内でα１（ＩＸ）及びα２（ＩＸ）コラー ゲン・サブユニットを共表現するように遺伝子操作する。 ここに図示、説明したものに加えて、本発明の種々の修正形態は上記の説明を 参照すれば同業者には明らかであろう。こうした修正は添付される特許請求の範 囲に含まれるものとする。なお、ヌクレチドに関して述べられたすべての塩基対 サイズはおおよそのものであって、説明の目的で使われているものである。 ここに引用されているすべての引例は全体として本明細書に組み込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 メイネ，リチャード アメリカ合衆国 アラバマ，ベスタビア ヒルズ，アルタデナ ロード 2484

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ヒトα３（ＩＸ）コラーゲン蛋白質をコード表現する単離されたポリヌク レオチド。 ２． 図５に示すヌクレオチド配列を有する請求項１の単離ッポリヌクレチド。 ３． ヒトα３（ＩＸ）コラーゲン蛋白質をコード表現するポリヌクレチド配列 を含む遺伝子組換えＤＮＡベクター。 ４． 請求項３の遺伝子組換えＤＮＡベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞 。 ５． 単離された遺伝子組換えα３（ＩＸ）コラーゲン。 ６． 図５に示されたアミノ酸配列を含む請求項５の単離された遺伝子組換えα ３（ＩＸ）コラーゲン。 ７． 単離された遺伝子組換えタイプＩＸコラーゲン蛋白質。 ８． （ａ）α３（ＩＸ）コラーゲンを表現する請求項３の遺伝子組換えＤＮＡ 表現ベクターで形質変換された宿主細胞を培養するステップと、そして （ｂ）上記細胞培養からα３（ＩＸ）コラーゲン遺伝子を回収するステッ プ とで構成される遺伝子組換えヒトα３（ＩＸ）コラーゲンをつくるための方法。