JP2000500054A - タンパク質溶液の消毒のためのヨウ素化ゲル濾過媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ゲル濾過材料として作用するヨウ素化有機ポリマー床に溶液を流すことによるタンパク質溶液の消毒方法。ゲル濾過材料の好ましいタイプは、セファデックスの商標の架橋デキストランＧ−２５またはＡ−２５（ＤＥＡＥセファデックス）である。種々のタイプの架橋デキストランが、使用前に、高めた温度、例えば３７℃でヨウ素元素と乾燥混合することにより容易にヨウ素化される。セファデックスの商標の架橋でキストランは、デキストランの重要の50重量％またはそれ以上まで容易にヨウ素化できる。好ましいヨウ素化レベルは、３０〜４０％である。使用前に、水性媒体で膨潤し、その後クロマトグラフカラムに注ぐ。膨潤した３０％ヨウ素セファデックスＡ−２５は、５％ヒトＩｇＧ少なくとも１リットル中のウイルスを有効に死滅させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質溶液の消毒のためのヨウ素化ゲル濾過媒体 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、消毒物質としてのヨウ素の使用に関し、より詳しくは、ゲル濾過ク ロマトグラフィーに使用される高分子ゲルをヨウ素で処理して新規な消毒物質を 製造する方法に関する。 ２．関連する技術の記載 本出願は、1994年６月９日に出願され、現在は放棄されている先のアメリカ合 衆国特許第08/255,616号の継続出願である、1995年11月27日に出願された先のア メリカ合衆国特許出願第081562,795号の一部継続出願である。 空気の消毒剤としてのヨウ素の使用は、少なくとも1926年から提唱されており 、空気の消毒についての実験は、主に第二次世界大戦中に行われた。インフルエ ンザに対する予防法として、防空壕の空気の消毒が推奨され、新たに噴霧された 唾液中の生物を即時に殺すのに充分な“比較的許容性のある”濃度は、0.1mg/ft³ (3.5mg/ml)であることが見出された。 ヨウ素は、皮膚の殺菌のためのヒトの医薬として広く使用されている(例えば 、手術前の皮膚の消毒剤、手術のための手の消毒、分娩の前の会陰の消毒、及び 輸血の前の皮膚の消毒)。ヨウ素製剤は、治療の目的、例えば感染した皮膚及び 火傷した皮膚の治療にも使用されているが、ヨードフォールと組み合わせない限 り刺激性である。ヨウ素は、医療用器具、例えば腸線、カテーテル、ナイフの刃 、アンプル、プラスチック品、ゴム製品、ブラシ、多剤投与バイアル及び温度計 の消毒にも使用されている。 種々の著者が、文献を再検討し、既存のデータを分析することにより、ヨウ素 及び他のハロゲンの消毒作用の要約を試みてきた。ヨウ素の主な用途の一つは、 飲料水の消毒であった。文献によると、ヨウ素は、重量を基準として他のハロゲ ンと比べると、より広い範囲の水質にわたってウイルスをより完全に不活性化す ることができる。有機及び無機の窒素化合物の存在下では、ヨウ素は、作用する 前に消毒剤を消費してしまう副反応に関与することが少ないため、特に優れた殺 のう虫剤である。Ｇottardi，Ｗ.,Ｉodine and Ｉodine Ｃompounds in Ｄisinf ection，Ｓterilization，and Ｐreservation，3d Ｅd.,Ｂlock,Ｓeymour Ｓ., Ｅd.,Ｌea＆Ｆebiger，Ｐhiladelphia(1983)。ここに引用された文献は、上記で 論じた背景に関するより詳細な情報を提供する。 本発明の発明者は、ヨウ素を血液及びそれから誘導される種々の分屑及び成分 を消毒するために使用することについて長期にわたり研究してきた。他の情報に ついては、本明細書に参考文献として挿入される、アメリカ合衆国特許第5,360, 605号及び第5,370,869号を参照されたい。厄介な問題の一つは、血液凝固因子及 び他の血液由来のタンパク質をヨウ素で有効に消毒するのが困難であることであ る。知られている全ての病原体を死滅させるのに十分な量のヨウ素を適用すると 、タンパク質の多くが不安定であり、変性することが証明される。 本発明の発明者は、ヨウ素を溶液として添加するよりも、固体ヨウ素担体から 活性ヨウ素を提供する方が、重要なタンパク質の変性を制限しながら、病原体を 破壊するのに有効であることを見出した。例えば、ヨウ素化された不溶のポリビ ニルピロリドン床（ヨードフォール）が、タンパク質及び／または細胞もしくは 細胞成分を含有する種々の溶液を消毒するのに有用な手段であることが見出され た。ヨウ素を除去することにより（例えばヨウ素結合材料を添加することにより ）またはヨウ素を中和することにより(例えば有効な還元剤を添加することによ り)、添加されたヨウ素の作用の範囲を制御することが有利であることも見出さ れた。これらの改良にもかかわらず、なお、ヨウ素を血液、血液分屑及び同様の タンパク質含有溶液の消毒に適用する理想的な手段が必要とされている。 発明の目的及び要約 本発明の目的は、消毒用ヨウ素を血液、血液から精製した成分及びタンパク質 溶液に適用するための単純で信頼性の高い方法及び組成物材料を提供することに ある。 本発明の別の目的は、消毒用ヨウ素を血液、血液から精製した成分及びタンパ ク質溶液に使用するための、信頼性が高く、商業的に入手可能なヨウ素消毒材料 を提供することにある。 本発明のさらに別の目的は、消毒される血液、血液から精製した成分及びタン パク質溶液を破壊することなく、一定範囲のウイルス及び他の病原体を破壊する ことのできる信頼性の高いヨウ素消毒材料を提供することにある。 これらの及び他の目的は、消毒すべきタンパク質溶液をヨウ素化ゲル濾過材料 床に流す方法により達成される。好ましいタイプのゲル濾過材料は、セファデッ クス(Ｓephadex)Ｇ-25またはＡ-25(ＤＥＡＥ 変性セファデックス)である。種々 のタイプのセファデックスが、使用前に、高めた温度、例えば37℃でヨウ素元素 と乾燥混合することにより容易にヨウ素化される。セファデックスは、セファデ ックスの重量に対して50重量％またはそれ以上のヨウ素量まで容易にヨウ素化さ れ得る。好ましいヨウ素化レベルは30-40％である。使用前に、セファデックス を水性媒体中で膨潤させ、その後クロマトグラフィーカラムに注ぐ。膨潤させた 30％ヨウ素セファデックス６mlで、５％のヒトＩgＧ少なくとも１リットル中の ウイルスを有効に撲滅できる。 図面の簡単な説明 本発明の目的及び特徴は、新規であると信じられ、添付の請求の範囲により特 定される。本発明は、その機構、及び操作方法、さらには他の目的及び効果につ いて、下記の説明を、添付の図面と関連させて参照することにより理解されうる 。 図１は、本発明のヨウ素化ゲル濾過材料の製造を示す流れ図を表し、 図２は、該ヨウ素化ゲル濾過材料を用いてタンパク質含有溶液を消毒する方法 の流れ図である。 好ましい実施態様の詳細な説明 下記の説明は、当業者が本発明を使用できるように提供されるものであり、発 明者が発明を実施するためのベストモードと考えるものである。しかしながら、 種々の変形がなされることは当業者に明らかであろう。何故ならば、本発明の一 般的な原理は、本明細書に具体的に記載されているように、タンパク質溶液の消 毒剤として使用されるヨウ素化有機ポリマーゲル濾過材料を製造し使用すること にあるからである。 プラスチック材料及び種々の関連する有機ポリマーは、適当な時間、ヨウ素蒸 気を含有する環境に維持することによりヨウ素化され得る。そのような露呈時間 は、(a)処理すべき材料に要求されるヨウ素の量、(b)材料の浸透性、及び(c)環 境におけるヨウ素の蒸気圧の関数である。 蒸気圧は、アントワンの式によると、温度の関数である(標準的な化学ハンド ブック、例えばＬag's Ｈandbook of Ｃhemistry，Ｊohn Ａ.Ｄean，Ｅd.,14th edition，ＭcＧraw-Ｈill，Ｉnc.,Ｎew Ｙorkを参照)。表１は、本発明に想定さ れる方法のための温度−蒸気圧関係についての十分な情報を提供する。 所望の温度における蒸気圧は、所望により容易に計算される。しかしながら、 計算よりも単純な実験の方が満足すべきものであることが見出された。何故なら ば、種々の有機ポリマーの透過性及び透過率は非常に多様であると信じられてい るからである。 有機ポリマーの透過率は温度の関数であり、温度が増加すると透過性も増加す る。しかしながら、ポリマーに対するヨウ素の透過性を一般的に予測する理論的 または経験的方法は知られていない。しかしながら、与えられた材料について、 単純な実験を行えば、迅速且つ容易に蒸気相処理パラメーターが確立できる。表 １からわかるように、殆ど全ての有機ポリマーの劣化温度より十分に低い温度で 、 高いヨウ素蒸気圧が得られる。 ヨウ素蒸気圧及び有機ポリマーの透過性についての上記の議論は、種々の有機 ポリマーで形成された"ビーズ"が、年化学的精製におけるクロマトグラフ材料と して広く使用されているため、特に重要である。 特に興味深いのは、“タンパク質除去”またはゲル濾過クロマトグラフィーに 使用される材料である。これらの材料は、有機ポリマーの“ビーズ”として水和 型で広く使用されている(架橋ポリアクリルアミド及び架橋グルコースポリマー （デキストラン）が一般的であるが、同様の性質を有する他の有機ポリマーも適 している)。これらのゲルを水和すると、水を吸収してポリマーが膨潤するが、 ポリマー構造内の共有結合の架橋が、水和ゲル内の水で満たされた孔の大きさを 制限する。これらの孔は、透析膜における孔のように機能し、孔の大きさに依存 して異なる大きさの溶質を排除する。孔の大きさが小さい場合は、水及び単純な 溶質はビーズのマトリックス内に浸透することができるが、タンパク質のような より大きな溶質分子は排除される。タンパク質溶液が、そのような水和ビーズ床 にタンパク質の溶液が注がれると、タンパク質は急速に通過し、溶液中の他のよ り小さな分子は、ビーズ内に入り、床内の通過に遅れを来す。これにより、タン パク質から小さな溶質を除去することが可能になる。より大きな孔が存在する場 合は、ビーズはより小さく、しかし大きくはないタンパク質を認め、その結果、 タンパク質混合物は分画され、精製される。 ゲル濾過材料がヨウ素を有する場合は、制御されたヨウ素源を製造することが できる。血液または血液成分が、そのような材料の床を通過するとき、ヨウ素は 常にビーズの表面に移行し(水が満たされた孔を通って)、通過する流体に寄与す る。しかしながら、変化を起こしやすいタンパク質は、ゲルに浸透することがで きず(孔が小さすぎるので)、従って、ビーズ内の大量のヨウ素との接触が防がれ る。このようにして、制御された量の消毒ヨウ素が、溶液に量り出され、溶液中 のタンパク質の変化を避けながら消毒を行うことができる。 任意の多くのゲルクロマトグラフィー材料を本発明に適用することができるが 、Ｐharmacia-Ｕpjohnにより製造されている“セファデックス(登録商標)”とし て知られる、高分子化、架橋デキストラン（グルコースポリマー）ゲルが特に好 ましい。これらのセファデックス製品は広範囲のものがあり、製品名に付された 番号が、そのゲルにより排除されるタンパク質の分子量（即ち、架橋ポリマーの 孔径の指標）を示す。より大きな番号は、より大きな孔でゲルが開口することを 示す。ゲルの開口が多いと、ビーズが変形しやすく、流れる液体の速度が遅くな る。使用するセファデックスの孔が大きすぎると、重要なタンパク質がゲル内に 浸透し、ヨウ素化され過ぎてしまう。また、全体の流れが遅すぎると、ビーズ床 内のタンパク質の滞留時間が延長され、ヨウ素化され過ぎる結果となる。“25” または“50”の材料（即ち、各々25または50キロダルトン分子量より大きいタン パク質を排除するゲル）が、重要な血液タンパク質を排除する材料として適して いる。しかしながら、流速を、“25”材料において約10倍大きくすると、非常に 好ましい材料となる。 セファデックスの最も単純な型は、“Ｇ”型セファデックス(即ち、セファデ ックスＧ−２５またはＧ−５０)として知られるものである。架橋ポリマーが種 々の化学基により誘導され、付加的な性質、例えばイオン交換能がポリマーに付 与されている他のタイプのセファデックスも利用し得る。ＤＥＡＥ（ジエチルア ミノエチル）セファデックスは、ヨウ素ドナーとして非変性セファデックスより も幾分優れている。これは、ＤＥＡＥのヨウ素結合能によるものであり、ヨウ素 イオンの濃度が局所的に高くなることが、吸着したヨウ素の少なくとも水が充填 された孔における溶解を容易にするのに役立つものと考えられる(ヨウ素とヨウ 化物からなるルゴール液のように)。現在好ましいとされるＤＥＡＥ材料は、セ ファデックスＡ−２５及びＡ−５０であり、前者が流動性が優れているためより 好ましい。 今までのところ、セファデックスまたは同様の材料は、通常の処理によるヨウ 素化が容易でないため、ヨウ素ドナーとしては使用されていなかった。一般的に 、ヨウ素供与材料は、ヨウ素を結合し、ヨウ素水溶液により容易にヨウ素化され うる不溶性ヨードフォールである。この点は、ヨウ素を弱く結合するかまたは全 く結合しないセファデックスとは異なる。しかしながら、本発明の発明者は、彼 が以前にプラスチックのような他の有機ポリマーをヨウ素化するために開発した 方法を用いることにより、セファデックスのヨウ素化に成功した。 セファデックス材料は、ヨウ素の昇華により、セファデックスの重量に対して 10重量％〜60重量％のヨウ素まで、容易にヨウ素化できることが見出された。10 ％より低いと、一般的に最終製品のヨウ素供与率が不適当である。乾燥セファデ ックス材料は、10〜50％のヨウ素化レベルでは、通常、自由流動粉体として挙動 する。50〜60％またはそれ以上のヨウ素化レベルでは、セファデックスは、粘着 性となり、水性懸濁液としては処理できるが、乾燥状態では注ぐことが困難にな る。60％以上のヨウ素のセファデックスは、通常は常に水に膨潤せず、通常は使 用不可能である。従って、ヨウ素化の最適レベルは、30〜40％であると考えられ る。 図１は、セファデックスのヨウ素化のための単純な方法を図示する。第一の工 程は、乾燥セファデックス材料のアリコートを気密に封じられるガラスまたはプ ラスチック容器（即ち遠心管）に入れる工程である。その後、必要量の乾燥ヨウ 素元素を容器内に入れ、容器を密封する。密封された容器をミキサー、例えば“ Ｆerris wheel”ミキサーに入れ、37℃の炉内で容器を回転する(好ましくは転倒 型で)。約６時間以内にヨウ素元素の全てがセファデックスに吸着される。上記 で表１を参照して説明したように、温度が高いと、ヨウ素の蒸気圧が増加し、こ の工程が促進される。しかしながら、上記の方法では、セファデックス材料は、 約55℃を遙かに超える温度では凝集または他の損傷の兆候を示す。従って、37℃ が安全で有用な温度であると思われる。テフロンコートのマグネチックスターラ ーバーのような小さい重量のものを挿入すると、混合工程に役立つことが見出さ れた。大きすぎる重量のものを用いないように注意すべきである。その場合、セ ファデックスが破壊され、“微粉”を形成することになるからである。通常のガ ラスマーブルも、少なくとも比較的小さなバッチのセファデックスについては良 好に作用する。 ヨウ素化セファデックスは、安定して乾燥状態にあり、密封容器中で長期間( 少なくとも何ヶ月もの間)効力を失うことなく維持される。図２は、ヨウ素化さ れたセファデックスの使用を図示する。この材料は、使用の数時間前に膨潤（水 和）させなければならない。このポリマーは、淡水、塩水、または適当な緩衝液 中で膨潤させうる。ヒスチジンベースまたはイミダゾールベースの緩衝液のよう な有 機緩衝液は使用しないように注意すべきである。これらの化合物は、それ自体が 容易にヨウ素化され、ヨウ素の供給を消費することになるからである。他の有機 緩衝液のいくつかは、弱いヨードフォールとなり、カラムから過剰量のヨウ素を 溶出する傾向がある。このタイプの緩衝液によると、カラムがヨウ素を放出する のが早すぎることになる。新しい緩衝液を用いて少量のヨウ素化セファデックス を試験し、緩衝液がヨウ素をカラムから除去するか判定するのはかなり単純であ る。緩衝液がヨウ素色を呈するか、またはセファデックスが目に見えるほど脱色 されれば、緩衝液は適さない。ホスフェート及びアセテートの緩衝液はいずれも 有効であることが証明された。アルカリ性のpＨではヨウ素化反応が促進される ので、アセテート緩衝液を用いてpＨ5.5〜6.0のような幾分酸性の状態でカラム を操作することによりセファデックスの寿命が延び、ヨウ素化反応が制御される 。 比較的小容量のヨウ素化セファデックスを使用して、かなり大量のタンパク質 含有溶液を処理することができる。カラムの構成(即ち、カラムの幅と床の高さ) は、流速及びヨウ素化すべき材料によって最適化するべきである。５重量・容量 ％のヒトＩgＧを用い多々試験において、約６ｍｌの30％ヨウ素セファデックス で少なくとも１リットルの溶液を処理することができた。ヨウ素の供与は、流速 及びカラム形状の両方に影響された。yaku17cmの高さの薄いカラム(0.7cm)では 、３cmの高さの熱いカラム(1.6cm)に比べて均一な結果を得られなかった。深す ぎる床は、セファデックスと溶液の接触時間が長くなるため、材料が過剰にヨウ 素化されやすくなるようである。過剰にヨウ素化されると、カラムの一部からヨ ウ素が放出され、不均一な結果をもたらす。同様に、流速が速いと(即ち、６ml/ 分対２ml分)、より大容量のタンパク質溶液をより均一にヨウ素化することがで きる。 ヨウ素化セファデックスを用いる目的は、有効な殺ウイルス作用の消毒剤を提 供することにある。ヨウ素化セファデックスの有効性を試験するために、５％ヒ トＩgＧ溶液を、ヨウ素化セファデックスで処理する前に、ウイルスでスパイク した。ヒトパルボウイルスＢ19は不活性化が非常に困難なため、ブタパルボウイ ルス(ＰＰＶ)をモデルとして選択した。パルボウイルスは、遺伝物質として一重 鎖ＤＮＡを有する非エンベロープウイルスである(即ち、エンベロープウイルス のように界面活性剤でで不活性化できない)。ヨウ素化処理の後、処理された材 料を、集密的単層組織培養細胞を含有するペトリ皿に添加し、活性ウイルスの存 在を分析した。 ＰＰＶを含むまたは含まない５％ＩgＧ溶液800ml(ＩgＧ40g)を、平行して同一 のカラムで処理した。各々のカラムは、上記で製造された２gの40％ヨウ素化Ｄ ＥＡＥセファデックスＡ-25(セファデックス1.2g+ヨウ素0.8g)を含んでいた。22 ℃で、流速６ml/分で行った。37℃で２４時間インキュベートした後に処理され た溶液を試験したところ、検出可能なウイルスは全て排除された。処理されたＩ gＧにゲル濾過及び他の試験を行ったところ、ヨウ素処理により、ＩgＧの単量体 対二量体の含量がわずかに変化しただけであることがわかった。これらの小さな 変化はＩgＧの最終的な用途には影響を及ぼさない。 ヨウ素化されたセファデックスは新規且つ有効なタンパク質溶液の消毒方法で ある。驚くべきことに、大量のヨウ素元素を、昇華方法により、セファデックス の通常のゲル濾過性質を変化させることなく、セファデックスに導入することが できる。タンパク質に富む溶液中のＰＰＶのような非常に強いウイルスを、タン パク質に損傷を与えることなくまたは僅かな損傷で、有効に死滅させることがで きる。通常、ＰＰＶは死滅させることが非常に困難であると考えられているので 、他の病原体ウイルスについても同様の条件で死滅させることができると予測さ れる。 当業者は、ここに記載した好ましい実施態様の種々の最適化及び変更を、本発 明の範囲及び趣旨から逸脱することなく行いうる。従って、添付の請求の範囲の 範囲内で、本発明は個々に具体的に記載した方法以外の方法でも実施できるもの と理解されたい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非水和炭化水素ポリマーゲル濾過材料を密封可能な容器に入れること、 該ゲル濾過材料の少なくとも10重量％に相当するヨウ素元素を溶媒を用いずに 前記容器に添加すること、 前記容器を密封し、該容器をヨウ素とゲル濾過材料が完全に混合するように攪 拌する混合装置に入れること、及び ゲル濾過材料を、ヨウ素元素の全てが昇華し、ゲル濾過材料に付着して、ヨウ 素が少なくとも10重量％のゲル濾過材料を生成するように、ゲル濾過材料を混合 し続けること を含むタンパク質含有容器の消毒のためのヨウ素供与材料の製造方法。 ２．前記ゲル濾過材料がセファデックスの商標の架橋デキストランである請求項 １記載の方法。 ３．前記ゲル濾過材料が架橋されたデキストランを含む請求項１記載の方法。 ４．前記架橋されたデキストランがセファデックスの商標の架橋デキストランで ある請求項３記載の方法。 ５．前記セファデックスの商標の架橋デキストランがＤＥＡＥセファデックスで ある請求項４記載の方法。 ６．前記ヨウ素元素の重量が前記ゲル濾過材料の10〜60重量％である請求項１記 載の方法。 ７．前記ヨウ素元素の重量が前記ゲル濾過材料の30〜50重量％である請求項６記 載の方法。 ８．ゲル濾過材料を水性媒体に混入することにより炭化水素ポリマーゲル濾過材 料を水和し、前記ゲル濾過材料が少なくとも10重量％に相当するヨウ素元素を含 有すること、 前記水和ゲル濾過材料を容器に注ぎ、水和ゲル濾過材料のヨウ素化床を製造す ること、及び タンパク質含有溶液を前記ヨウ素化床に流すこと を含み、これにより、前記ゲル濾過材料に保持されたヨウ素元素を前記タンパク 質溶液に移行させ、その中のウイルスを死滅させることを含むタンパク質含有溶 液の消毒方法。 ９．前記ヨウ素化されたゲル濾過材料がヨウ素化されたセファデックスの商標の 架橋デキストランである請求項８記載の方法。 １０．前記セファデックスの商標の架橋デキストランがＤＥＡＥセファデックス である請求項９記載の方法。 １１．炭化水素ポリマーが分解する温度より低い温度で、非水和状態で、溶媒を 用いずに、ヨウ素をポリマー中に昇華させることにより、炭化水素ポリマーの重 量の少なくとも10重量％に対応するヨウ素元素が添加された、ゲル濾過材料の性 質を有する架橋された炭化水素ポリマーを含むタンパク質含有溶液を消毒するた めの材料。 １２．ゲル濾過材料の性質を有し、非水和状態で、溶媒を用いずに、ヨウ素をデ キストランポリマー中に昇華させることにより、有機ポリマーの重量の10〜20重 量％に対応するヨウ素元素が添加された、セファデックスの商標の架橋デキスト ランポリマーを含むタンパク質含有溶液の消毒のための材料。 １３．ゲル濾過材料を水性媒体に混入することにより炭化水素ポリマーゲル濾過 材料を水和し、前記ゲル濾過材料が少なくとも10重量％に相当するヨウ素元素 を含有すること、 前記水和ゲル濾過材料を容器に注ぎ、水和ゲル濾過材料のヨウ素化床を製造す ること、及び タンパク質含有溶液を前記ヨウ素化床に流し、これにより、ゲル濾過材料に保 持されたヨウ素元素が溶液中のタンパク質を著しく変性することなく、ウイルス を死滅させることを含むタンパク質含有溶液の消毒方法。 １４．前記ヨウ素化された炭化水素ポリマーゲル濾過材料が更に陰イオン交換基 を含む請求項８記載の方法。