JP2000501419A

JP2000501419A - 選択的アシル化方法

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Publication number: JP2000501419A
Application number: JP10505524A
Authority: JP
Inventors: ハンセン、ルイス・ブラマー
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-07-11
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 2000-02-08
Anticipated expiration: 2017-07-04
Also published as: DE69731105D1; AU3255297A; EP0938502A1; ATE278711T1; JP3300368B2; ES2230607T3; PT938502E; WO1998002460A1; EP0938502B1; DE69731105T2

Abstract

(57)【要約】インスリン、インスリン類似化合物またはその前駆体(そこに含まれる Lys 残基の遊離ε-アミノ基、および少なくとも１の遊離α-アミノ基を有する)を選択的にアシル化する方法であり、この方法は、塩基の存在する極性溶媒中で、ε-アミノ基を活性化アミドと反応させることを具備する。

Description

【発明の詳細な説明】選択的アシル化方法発明の分野本発明は、アシル基をペプチドに導入する方法に関する。更に詳しくは、本発明は、天然に存在するインスリンまたはその類似化合物若しくは前駆体に含まれるリジン残基のε-アミノ基をアシル化する改良法に関する。発明の背景ヒトインスリンおよび近縁のインスリン類は、その分子中に３つの第一級アミノ基、即ち、夫々、Gly^A1および Phe^B1のα-アミノ基、並びに Lys^B29のε-アミノ基を有している。保護されていないインスリンの N-アシル化により、(条件に依存して)モノ、ジ、更にトリアシル化された生成物の複合混合物が得られる。しかしながら、多くの場合に特異的位置のアシル化のための一定した優先性が観察されているにも関わらず、所望する生成物の形成は多量の関連した副産物の形成を伴う可能性があることから、前記の優先性のために、前述の直接的なアセチル化がモノアシル化インスリンの製造方法として実用化できるとは、常に十分に断言できるものではない。副産物が形成される場合には、この副産物は、所望する生成物の損失により生じ、且つ所望する生成物の精製上の問題の原因になる可能性があるのである。インスリン分子における 1 または 2 の特異的なアミノ基についてのみのアシル化は、適切に保護された中間体が入手できるのであれば、成し遂げることが可能である。適切な中間体は、アシル化されるべきでないアミノ基(単数または複数)が保護基(アシル化が実施された後に、選択的に取り除ける)でブロックされているインスリン誘導体である。前述の保護された中間体は、特定の方法で 1 若しくは 2 の保護基を導入することが可能な、インスリン前駆体またはインスリン誘導体の何れであってもよい。経済的な理由から、可能であれば特殊な保護基の使用は避けることが非常に望ましい。フリエッセン HJ ら(Friesen HJ ら、半合成ペプチド類およびタンパク類、オックスフォード RE、DiBello C、eds、161-179、1978、ロンドン)は、N-ヒドロキシサクシンイミドエステル類(以下 OHSu - エステル類と称する)、および他の活性化エステル類を用いた、種々の条件下(表 4 および 5 /.c.において概説される)におけるインスリンのアシル化について記述している。一定の選択性は見られるが、A1 モノ置換生成物および B2 モノ置換生成物は、常に、互いを含んだ、またジ置換生成物を含んだ混合物の中で得られる。報告されているモノ置換生成物の最高総収率は 75% であったが、この 85% が A1 異性体であった。他の場合では、モノ置換生成物の総収率は 45-55% の範囲にあり、その 70-72% がε - B29 異性体であった。フリエッセン HJ ら(インスリンおよび関連ホルモン類の化学、構造および機能、第 2 回国際インスリンシンポジウム会報、Brandenbu rg D．Wollmer A．eds、ニューヨーク、1980)により示された通り、反応媒質の pH は、インスリンを ONSu-エステル類または特定の他のアシル化剤でアシル化する場合に、その反応の進行に対して非常に強い影響力を有している。従って、 pH5-6 でのモノアシル化は、好ましくは B1 アミノ基において行われ、且つジアシル化生成物は、A1,B1-ジアシル化インスリンとなるのが好ましいであろう。pH 6.8-9.2 でのモノアシル化は、A1 アミノ基で行われるのが好ましいのに対して、ジアシル化生成物は、A1,B1- または A1,ε-B29 ジアシル化インスリンの何れかとなる可能がある。最終的に、pH10 以上でのモノアシル化は、Lys^B29のε-アミノ基で好ましく起こるのに対し、更なるアシル基は、好ましくは A1 のアミノ基に向かう。プロインスリン、インスリンまたはインスリン類似体（遊離ε-アミノ基を有する）の選択的なアシル化が可能な方法は、EP 0 712 861 A2 およびEP 0 712 8 62 A2(両者ともEliLilly and Company)に開示される。その方法に従うと、非保護インスリンは、可溶性の活性化脂肪酸エステル類、詳しくは ONSu-エステル類により、塩基的条件下にて極性溶媒中においてアシル化される。 EP 0 511 600 A2(Kuraray Co.,Ltd.)は、なかでも、構造式[タンパ][Z]nのタンパク誘導体類に関する。ここで、[タンパク]は、多くのアミノ基を有したタンパクを示し、[Z]は構造式 -CO-W-COOH(ここで、W は、ヘテロ原子も含むことが可能な二価の長鎖炭化水素基である)により表される残基であり、また、n は[Z] と[タンパク]の間のアミド結合の平均数を示す。該誘導体は、親タンパクと長鎖カルボン酸イミドエステルとの間の、所望に応じて有機溶媒も含有する塩水性溶液中における反応によって製造される。前記アシル化の非特異性について言及すると、n は平均値であると規定している事実により、特異性は達成されていないことが示されているように思われる。インスリンは、それから前記発明に従う誘導体が製造できるタンパク類の１つであることは記載されているが、EP 0 511 6 00 には特異的なインスリン誘導体の開示はなく、また、有効なインスリン誘導体を得るための好ましい［Z］または［Z］を導入するべき好ましい位置についての如何なる指摘もないのである。その中に含まれる Lys 残基のε-アミノ基においてアシル化されたインスリン誘導体類の例は、WO 95/07931(ノボ・ノルディスク・A/S)に開示される。その誘導体類は、対応するインスリンを、例えば、di-tert-ブチルジカーボネートと反応し、続いてその保護基を除去することから製造された対応する(A1,B1)-diBoc インスリンをアシル化することにより、並びにその後に更なる処理が必要な単鎖インスリン前駆体をアシル化することにより製造することが可能である。驚いたことに、本発明の方法により、その中に含まれる Lys 残基のε-アミノ基においてモノアシル化されたインスリンが、高収率で得られることが今回明らかとなったのである。発明の概要最も広義な側面において、本発明は、インスリン、インスリン類似体またはその前駆体（その中に含まれる Lys 残基の遊離ε-アミノ基と、少なくとも 1 の遊離α-アミノ基とを有する）を選択的にアシル化する方法であって、該ε-アミノ基を活性化アミドと、塩基の存在する極性溶媒中で反応させることを具備する方法に関する。発明の詳細な説明好ましい態様において、その親インスリン（即ち、本発明の方法を使用しアシル化されるべき天然に存在するインスリン、インスリン類似体またはインスリン前駆体）は des(B30)ヒトインスリンである。他の好ましい親インスリンの例は、ヒトインスリン、ブタインスリンおよび他の天然に存在するインスリンであり、また並びに、遊離ε-アミノ基を有した Lys を少なくとも 1 と、遊離α-アミノ基を有したアミノ酸残基とが存在しているインスリン類似体またはインスリン前駆体も含まれる。特に好ましい親インスリンの 1 つの群は、位置 B1 のアミノ酸残基が欠失したインスリン類似体類である。もう 1 つの特に好ましい親インスリンの群は、位置 B28 に Lys を有し、位置 B29 に Pro を有するインスリン類似体である。この群からの好ましい例は、 Lys^B29Pro^B29ヒトインスリンである。もう１つの特に好ましい親インスリンの群は、位置 B28 に Asp を有するインスリン類似体類である。この群からの好ましい例は、Asp^B28ヒトインスリンである。その他の特に好ましい親インスリン類の群は、その A 鎖および／または B 鎖が N 末端の伸長を有するインスリン類似体と、その A 鎖および／または B 鎖が C 末端の伸長を有するインスリン類似体である。本発明の方法で親インスリン類として有効であり得る更なるインスリン類似体類は、そのアミノ酸残基の１以上、好ましくはそれらの 1、2、または 3 のアミノ酸残基が、別のコード化可能なアミノ酸残基により置換されているような類似体類である。従って、位置 A21 において、親インスリンは Asn に代えて、Ala 、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Typ、Tyr、または Val を含む群から選択されるアミノ酸残基、特に Gly、Ala、Ser および Thr を含む群から選択されたアミノ酸残基を有していてよい。また、本発明の方法における親インスリン類として有益なインスリン類似体は、上記に概説した変更の組合わせにより修飾されていてもよい。ここで使用される「インスリン類似体」は、Cys^A7とCys^B7との間、および Cys^A20 と Cys^B19との間でのジスルフィド架橋、並びに Cys^A6と Cys^A11との間での内部ジスルフィド架橋を含むヒトインスリンと等しい分子構造を有し、且つインスリン活性を有したペプチドを意味する。位置 B1 でアミノ酸が欠失している場合でも、該 B 鎖の残りのアミノ酸の位置の番号は付け替えない。ここで使用される「コード化可能なアミノ酸残基」の表現は、遺伝コード、即ち、ヌクレオチドのトリプレットコドンにより遺伝暗号を指定され得るアミノ酸を表す。好ましい親インスリン類似体 des(B30)ヒトインスリンは、幾つかの方法、例えば、ヒトインスリン、ブタインスリンおよびインスリン誘導体類の酵素的な加水分解により製造することか可能である。この加水分解を促進する酵素は、リシルエンドペプチダーゼ類であり、トリプシンおよびアクロモバクター・リチクス・プロテアーゼ類(Achromobacter lytlcus proteases)等である。更に、des(B30 )ヒトインスリンは、B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)の構造の単鎖インスリン前駆体から酵素的処理により製造することが可能である［ここで、B(1-29)は、ヒトインスリンの B 鎖の位置 1 から位置 29 のアミノ酸配列を示し、A(1-21)は、ヒトインスリンの A 鎖の位置 1 から位置 21 のアミノ酸配列を示す］。この前駆体は、EP 163.529 に記述される通りに得られる。該方法のために適切な酵素は、アクロモバクター・リチクス・プロテアーゼ 1(EC code No.3.4.21.50)である。該酵素は、可溶性形態で、または N-ヒドロキシスクシンイミド活性化セファロースに固定化して使用することが可能である。該反応が完了した後、形成された des(B30)ヒトインスリンは、多くの方法、即ち、亜鉛またはナトリウム塩類を添加することによる沈澱により単離することが可能である。アシル化反応は、通常、反応の開始時に、約 0.1% w/w から約 25% w/w、好ましくは約 2% w/w から約 12% w/w、より好ましくは約 3% w/w から約 8% w/w の親インスリンの濃縮物を用いて実施する。本発明の１つの好ましい態様おいて、Lys 残基のε-アミノ酸基に導入されるべきアシル基は、一般式(I)のモノカルボキシル酸のアシル基である： M-COOH (I) ［ここで M は、長鎖炭化水素基であり、これは酸素原子および硫黄原子からなる群から各々独立して選択される 1 以上の官能基により、任意に割り込まれていてもよい。より好ましい該アシル基は、6 から 24 の炭素原子を有する、枝分れのない、脂肪族モノカルボン酸のアシル基であり、特に、CH₃(CH₂)₈C O-、CH₃(CH₂)₉CO-、CH₃(CH₂)₁₀CO-、CH₃(CH₂)₁₁ CO-、CH₃(CH₂)₁₂CO-、CH₃(CH₂)₁₃CO-、CH₃(CH₂)₁₄CO-、CH₃(CH₂)₁₅CO-、CH₃(CH₂ )₁₆CO-、CH₃(CH₂)₁₇CO-、CH₃(CH₂)₁₈CO-、CH₃(CH₂)₁₉CO-、CH₃(CH₂)₂₀CO-、CH₃( CH₂)₂₁CO-、およびCH₃(CH₂)₂₂CO- を含む群から選択されるアシル基である］。本発明のもう 1 つの好ましい態様において、Lys 残基のε-アミノ基に導入されるべきアシル基は、一般的式(II)のジカルボン酸のアシル基類の 1 つである: HOOC-D-COOH (II) ［ここで D は、長鎖炭化水素であり、これは酸素原子および硫黄原子からなる群から各々独立して選択される 1 以上の官能基により、任意に割り込まれていてもよい。より好ましい該アシル基は、一般式(II)のジカルボン酸のアシル基の 1 つであり、ここで D は、6 から 22 の炭素原子を有する枝分れのない、二価の脂肪族炭化水素基であり、特にHOOC(CH₂)₆CO-、HOOC(CH₂)₈CO-、HOOC (CH₂)₁₀CO-、HOOC(CH₂)₁₂CO-、HOOC(CH₂)₁₄CO-、HOOC(CH₂)₁₆CO-、HOOC(CH₂)₁₈C O-、HOOC(CH₂)₂₀CO- およびHOOC(CH₂)₂₂CO- を含む群から選択されるアシル基である］。本発明の更に好ましい態様において、Lys 残基のε-アミノ基に導入されるべきアシル基は、一般式(III)の置換基である： CH₃(CH₂)_xCONHCH(COOR¹)CH₂CH₂CO- (III) ［ここで X は、8 から 24 の整数であり、R¹は水素、またはアシル化が実施された後に、水素で置換することが可能な置換基、例えば、メチル基、エチル基、若しくは tert-ブチル基である。好ましい X の値は、10、12、および 14 である。アシル化が実施され、且つR¹が水素とは異なる場合に、そのエステル基のR¹は、それ自身公知の方法により、加水分解され、相当する遊離酸およびアルコール R¹OH を得ることが可能な部分である。従って、R¹が、メチル基、若しくはエチル基である場合は、加水分解は、アルカリ性条件下にて実施することが可能な部分である。従って R¹がメチル基またはエチル基である場合には、該加水分解は、アルカリ性条件下で実施することが可能であり、R¹がtert-ブチルである場合には、該加水分解はトリフルオロ酢酸を使用して実施することが可能である］。本発明の更なる好ましい態様は、Lys 残渣のε-アミノ基に導入されるべきアシル基は一般式(IV)の官能基である：リトコーロイル-NHCH(COOR²)CH₂CH₂CO- (IV) ［ここで R²は、水素、または該アシル化を実施した後で水素に置換することが可能である官能基であり、例えばメチル基、エチル基若しくはtert-ブチル基である。該アシル化が実施され、且つ R²が水素と異なる場合には、そのエステル基の R²は、それ自身公知の方法により加水分解され、相当する遊離酸とアルコール R²OH を得られる部分である。従って、R²は、メチル基またはエチル基である場合には、該加水分解は、アルカリ性条件下で実施することが可能であり、R²が tert-ブチルである場合には、該加水分解はトリフルオロ酢酸を使用して実施することが可能である］。親インスリンのアシル化は、活性化アミド、より好ましくは導入されるべきアシル基に相当する該酸のアゾライドであるアシル化剤を使用して実施する。前述のアゾライド類(1-アシラゾール類)は、公知の方法に従って製造することが可能であり、例えば、スタッブ HA(Staab HA Angew．Chem．74(1962)407-423)を参照されたい。本発明のアシル化剤の製造において使用され得るアゾール類の例は、ピラゾール、イミダゾール、1,2,3-トリアゾール、1,2,4-トリアゾール、テトラゾール、フェニルテトラゾール、並びに(可能な位置での)対応するベンザンレート(benzanelated)化合物、例えば、1H-インダゾール、ベンズイミダゾールおよびベンゾトリアゾールである。該アシル化剤の製造に好ましいアゾール類は、1, 2,4-トリアゾール、ベンゾトリアゾールおよび置換されたベンゾトリアゾール類である。任意に、言及されたアゾール類は、アルキル基(C₁-C₅である、枝分れのある、または枝分れのないアルキル基、特にメチル基、プロピル基およびイソプロピル基)、ハロゲン(例えば、フッ素、塩素および臭素、特にフッ素および塩素 )、ニトロ基、アルコキシル基(C₁-C₅である、枝分れのある、または枝分れのないアルコキシル基、特にメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基およびイソプロポキシ基)、ジアルキル化アミノ基(C₁-C₅である、枝分れのある、または枝分れのないジアルキル化アミノ基)、スルホン酸、カルボキシル基、並びにアルコキシカルボニル基(C₁-C₅である、枝分れのある、または枝分れのないアルコキシカルボニル基)からなる群から選択された 1 以上の置換基で、置換することが可能である。アシル化剤の好ましい群は、1-アシルベンゾトリアゾール類であり、好ましいアシル化剤は、1-テトラデカノイルベンゾトリアゾールである。他の好ましい 1 -アシルベンゾトリアゾール類は、モノまたはジ置換ベンゾトリアゾール類等、例えば、5-置換若しくは 6-置換、または 5,6-置換ベンゾトリアゾール類、例えば、5-メチルベンゾトリアゾール、5-クロロベンゾトリアゾール、6-クロロベンゾトリアゾール、5-ニトロベンゾトリアゾール、5,6-ジメチルベンゾトリアゾール、および 5,6-ジクロロベンゾトリアゾール等からの誘導体類である。該アシル化は、極性溶媒中(水と、少なくとも 1 の水混和性有機溶媒との混合物がよい)において実施する。単独または混合物の何れかで使用可能である水混和性溶媒の例は、低級アルコール類(例えば、メタノール、エタノールおよび 2- プロパノール)、低級直鎖および枝分れのあるケトン類(例えば、アセトン)、環状エーテル類(テトラヒドロフランおよびジオキサン)、直鎖および枝分れのあるアミド類(例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミドおよび N-メチル -2-ピロリドン)、ニトリル類(例えば、アセトニトリル)、並びにスルホキシド類 (例えば、ジメチルスルホキシド)である。水混和性溶媒類の中で最も好ましいものは、N-メチル-2-ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、およびジメチルスルホキシドである。反応媒質中の水の量は、一般的に該媒質が約 1% w/w から約 99% w/w の水を含有するように、広範囲に亘り変更してもよい。N-メチル-2-ピロリドンを、水混和性有機溶媒として使用する場合では、該媒質中の水の量は、好ましくは約 1 % w/w から約 90% w/w、より好ましくは約 10% w/w または約 20% w/w から約 7 5% w/w までである。アシル化は、無機塩基または有機塩基の何れかである中強または強塩基が過剰に存在する中で実施する。無機塩基の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、および炭酸カリウムである。有機塩基の例は、三級アミン類 (例えば、エチルジイソプロピルアミン、トリエチルアミンおよびジエチルエタノールアミン)である。好ましくは有機塩基が使用される。使用される塩基の量は、一般的に親インスリンの 1 mol 当たり 5 mol の過剰量であり、例えば、親インスリンの 1 mol 当たり 10 から 30molまたは 100 mol の塩基であってもよい。本質的に、アシル化を実施できる温度の下限は、該媒質の凝固点により決定され、それに対してその上限は、親インスリンまたはアシル化インスリンが劣化するであろう温度により決定される。重ねて、即ちこれは、とりわけ該媒質の組成に依存するであろう。従って、-30℃ から 70℃ の間の温度での該反応を実施することが可能である一方で、一般的には、約 -5℃ から約 30℃ の間の温度で該反応を実施することが最も都合がよい。本発明の方法により製造された生成物の単離および精製は、ゲル濾過およびクロマトグラフィーを含む、それ自身公知の方法により実施することが可能である。本発明を、以下の例により更に説明するが、しかしながら、それらにより保護の範囲が限定されるものであるとは、解釈されるべきものではない。前述の説明および以下の例において開示される特徴が、単独でも、またその何れかの組み合わせの中においても、多様な形態で本発明を実現するためには必須である。例分析本反応混合物(例 4 における混合物を除く)は、RP-HPLC により、ダイオードアレイ検出器(Diode Array Detector)を装備したメルク／日立(Merck/Hitachi) の装置を使用して、以下に記述した通りに分析した。カラム：4.0×125 mm、60℃にて操作する。カラム媒体：ジメチルブチルジメチルシリル置換 100 Å、5 mm シリカ溶出液勾配系：溶出液 A：硫酸アンモニウム(2.0%)を含有する水中のアセトニトリル(7.8%)、pH 2.5 溶出液 B：水中のアセトニトリル(53.9%) 流速：1.0ml/min 検出：280nm での UV 吸収サイクルタイム：65min 規定された収量は、クロマトグラムにおけるピークの面積に基づいている。アシル化インスリン類の識別点は、RP-HPLCにおけるそれらの保持時間により、および単離により決定し、並びに質量分析法／ペプチドマッピングを、アシル化生成物について、1)何れの前処理も行わず、2)ジスルフィド結合を還元するためのジチオスレイトールを用いた前処理の後、および3)ジチオスレイトールと、位置 21 および位置 22 の間で B 鎖を切断するための黄色ブドウ球菌プロテアーゼ V8(Staphylococcus aureus protease V8)とでの前処理の後で行った。出発物質の製造：例１ 1-テトラデカノイルベンゾトリアゾールの製造ベンゾトリアゾール(59.6g、0.50mol)を、20℃で、tert-ブチルメチルエーテル(950ml)中に溶解し、次にトリエチルアミン(50.6g、0.50mol)を添加した。冷却してその温度を 20-30℃に維持しながら、塩化テトラデカノイル(125.0g、0.5 1mol)を 30minに亘り添加した。得られた沈澱物を濾過により除き、60 ℃ で、減圧下で、その濾液を蒸発して乾燥した。その残渣を、60℃ のアセトン(375ml) に溶解した。0 ℃ に冷却した後に、得られた結晶を濾過により単離し、アセトン(120ml)で洗浄し、次に 20 ℃の減圧下で乾燥して一定の重量にした。収量：1-テトラデカノイルベンゾトリアゾールの白色結晶を 142.3g(86%)、58 .0℃(ピーク値)での融解は示差走査熱分析(DSC)により決定した。同様の反応条件において、以下のアシル化トリアゾール類も製造した： 1-テトラデカノイル-1,2,4-トリアゾール、DSC：59.7 ℃(テトラヒドロフランから再結晶)、 5-メチル-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール、DSC：69.5℃(2 -プロパノールから再結晶)、 5-クロロ-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(NMR データにより該生成物が多少の 6-クロロ-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾールも含有していることを示した)、DSC：52.1℃(2-プロパノールから再結晶)、 5-ニトロ-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール、DSC：117.5℃(アセトンから再結晶)、 5,6-ジクロロ-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール、DSC：60.6℃(テトラヒドロフランから再結晶)、 5.6-ジメチル-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール、DSC：61.6℃(アセトンから再結晶)、 1-ドデカノイルベンゾトリアゾール、DSC：43.9℃(n-ヘプタンから再結晶)および1-ヘキサデカノイルベンゾトリアゾール、DSC：62.℃(tert-酢酸ブチルから再結晶)。例２ 1-(19-カルボキシノナデカノイル)ベンゾトリアゾールの製造無水テトラヒドロフラン(200ml)中のエイコサンジオイック酸(3.43g、10.0mmo l)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.06g、10.0mmol)、ベンゾトリアゾール( 1.19g、10.0mmol)およびジメチルアミノピリジン塩酸塩の溶液を室温で 2 日間攪拌した。得られた懸濁液を濾過し、次にその濾液を減圧下にて蒸発して乾燥した。その残渣を、ジクロロメタン(100ml)に懸濁し、不溶性物質を濾過により単離した。乾燥したその濾過ケーク(2.0g)をアセトン(200ml)から再結晶化して、0 .70g(16%)の 1-(19-カルボキシノナデカノイル)ベンゾトリアゾールの白色結晶を得た［111.9℃で融解(DSC ピーク値)］。例３ 1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ベンゾトリアゾールの製造例 2 と同じ反応条件下で、しかし、エイコサンジオイック酸に代えてオクタデカンジオイック酸を使用して、1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)-ベンゾトリアゾールを製造した。該化合物は 105.2 ℃の融点(DSC ピーク値)を有していた。例４単鎖インスリン前駆体からの des(B30)ヒトインスリンの製造構造 B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)［ここで、B(1-29)は、ヒトインスリンの B 鎖の位置 1 から位置 29 までのアミノ酸配列を示し、A(1-21)は、ヒトインスリンの A 鎖の位置 1 から位置 21 までのアミノ酸配列を示す］の単鎖インスリン前駆体を、EP 163.529 に記載の通りに得た。前述した単鎖前駆体の約 1.5g を含有する 5g の湿潤塩ケークを、室温で、25 mM の炭酸水素ナトリウム(350ml)に溶解した。この溶液の pH 値を、1.0M 水酸化ナトリウム(1ml)の添加により 9.0 に調整した。N-ヒドロキシスクシンイミド活性化セファロース(約 1.0mg/l の酵素密度を有した10ml のゲル)上に固定化したアクロモバクター・リチクス・プロテアーゼ 1 を添加した。この反応混合物を 23 時間、室温で攪拌し、続いて固定化酵素を濾過により除去した。濾液を R P-HPLC により以下の記述の通りに分析した。クロマトグラムにおけるピークの面積に基づくと、前記反応混合物中に存在する des(B30)ヒトインスリンの相対量は、95.2％(保持時間：27.7min)であり、出発物質の相対量は、0.1% であった(保持時間：15.0min)。分析反応混合物は、ウォーターズ(Waters)により提供された装置における RP-HPLC により分析した。カラム：4.0×250mm、50℃で操作した。カラム媒体：YMC 120A、5my OdDMe シリレートシリカゲル溶出勾配系：溶出液 A：水中のアセトニトリル(10%)中の 0.20M 硫酸ナトリウム、0.04M リン酸、pH2.3 溶出液 B：水中のアセトニトリル(50%) 運転時間：60min 流速：1.0ml/min 検出：214nm での UV 吸収勾配：00.00min 64% A + 36% B 40.00min 40% A + 60% B 41.00min 64% A + 36% B アシル化インスリン類の製造例５ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.50g、検定成績：約 80%〜0.070mmol)を 20℃で N- メチル-2-ピロリドン(7.0ml)および水(3.5ml)に溶解した。この溶液を 0℃ に冷却した。トリエチルアミン(0.40ml)を添加した。1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 1.50ml)を 30 分間に亘り添加した。混濁した反応混合液を 0℃ で 30 分間、攪拌し、続いて 20℃ で、更に 30 分間攪拌した。この反応混合液を RP-HPLC により分析したところ、以下の結果が得られた：例６ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.50g、検定成績：約 66%〜 0.58mmol)を N-メチル- 2-ピロリドン(7.5ml)および水(1.0ml)に 20℃ で溶解した。トリエチルアミン(0 .40ml)を添加した。1-テトラデカノイル-1,2,4-トリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 1.0ml)を一度に添加した。同質の反応混合物を 20 ℃ で10 分間攪拌し、次に RP-HPLC により分析したところ、以下の結果が得られた：例７ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリン Des(B30)ヒトインスリン(0.50g、検定成績：約 80%〜 0.070mmol)をジメチルスルホキシド(7.0ml)および水(3.5ml)に 20℃ で溶解し、次いでトリエチルアミン(0.40ml)を添加した。1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 1.80ml)を 2 分間に亘り添加した。その混濁した反応混合物を、20℃ で、90 分間、攪拌した。得られた同質の反応混合物を RP- HPLC により分析したところ、収率 59.4% の N^εB29-テトラデカノイル des(B30 )ヒトインスリンが得られた。例８ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.50g、検定成績：約 80%〜 0.070mmol)をジメチルホルムアミド(7.0ml)および 6M 尿素水(2.0ml)に 20℃ で溶解した。その溶液を 0℃ にまで冷却し、次いでトリエチルアミン(0.40ml)を添加した。1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 1.10 ml)を一度に添加した。その混濁した反応混合液を 0℃ で 60 分間攪拌した。得られた僅かに混濁した反応混合液を RP-HPLC により分析したところ、収率 74.2 % の N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンが示された。例９ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.50g、検定成績：80%〜 0.070mmol)を N-メチル-2- ピロリドン(7.0ml)および水(2.0ml)に 20℃ で溶解した。この溶液を 0℃まで冷却した。トリエチルアミン(0.20ml)を添加した。1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10Mの溶液を 1.00ml)を一度に添加した。その混濁した反応混合液を 0℃ で 65 分間攪拌した。得られた反応混合物を RP-HPLC により分析したところ、収率 68.3% の N^εB2９-テトラデカノイル des (B30)ヒトインスリンが示された。例１０ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.50g、検定成績：約 80%〜 0.070mmol)を N-メチル -2-ピロリドン(7.0ml)および 3M 尿素水(3.5ml)に 20℃ で溶解した。エチルジイソプロピルアミン(0.50ml)を添加した。1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 1.50ml)を 2 分間に亘り添加した。その混濁した反応混合物を 20 ℃で 90 分間攪拌した。得られた反応混合物を RP-HPLC により分析したところ、収率 61.9% の N^εB29-テトラデカノイル d es(B30)ヒトインスリンが示された。例１１ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(5.0g、検定成績：34%〜 0.30mmol)を N-メチル-2-ピロリドン(20.0ml)に 20℃ で溶解した。0℃ にまで冷却した後に、トリエチルアミン(1.50ml)を添加した。5-ニトロ-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N- メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 3.20ml)を 10 分間に亘り添加した。その反応混合物を 0℃ で 30 分間攪拌した。得られた反応混合物を RP-HPLC により分析することにより、収量 58.3% の N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンが示された。例１２ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(5.0g、検定成績：約 34%〜 0.30mmol)を N-メチル-2 -ピロリドン(20.0ml)に 20 ℃で溶解した。0℃ に冷却した後に、水(7.5ml)およびトリエチルアミン(1.50ml)を添加した。5-クロロ-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 4.5ml)を 15 分間に亘り添加した。混濁した反応混合物を 0℃ で 3 時間攪拌した。その得られた反応混合物を RP-HPLC により分析したところ、収率 77.7% の N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンが示された。例１３ N^εB29-テトラデカノイルヒトインスリンの合成ヒトインスリン(50mg、0.009mmol)を N-メチル-2-ピロリドン(0.7ml)および水 (0.35ml)に 0℃ で溶解した。トリエチルアミン(0.040ml)を添加した。1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 0. 150ml)を一度に添加した。その混濁した反応混合物を 0℃で 150 分間攪拌した。得られた同質の反応混合物を RP-HPLC により分析したところ、収率 64.0% の N^εB29-テトラデカノイルヒトインスリン(保持時間：27.75min)が示された。例１４ N^εB29-テトラデカノイルブタインスリンの合成ブタインスリン(50mg、0.009mmol)を N-メチル-2-ピロリドン(0.7ml)および水 (0.35ml)に 0℃ で溶解した。トリエチルアミン(0.O40ml)を添加した。1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で0.10M の溶液を 0.1 50ml)を一度に添加した。その混濁した反応混合液を 0℃ で 155 分間攪拌した。得られた同質の反応混合物を RP-HPLC により分析したところ、収率 62.5% の N^εB29-テトラデカノイルブタインスリンが示された(保持時間：28.99min)。例１５ N^εB29-(19-カルボキシノナデカノイル)des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(5.0g、検定成績：約 34%〜 0.30mmol)を N-メチル-2 -ピロリドン(30.0ml)および水(6.9ml)に 20℃ で溶解した。トリエチルアミン(1 .10ml)を添加した。1-(19-カルボキシノナデカノイル)ベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 5ml)を一度に添加した。反応混合液を 20 ℃ で 4.5 時間攪拌した。得られた反応混合物を RP-HPLC により分析したところ、収率 30.0% の N^εB29-(19-カルボキシノナデカノイル)des(B30)ヒトインスリンが示された(保持時間：32.19min)。出発物質量は 57.3% であった。例１６ N^εB29-(17-カルボキシヘプタデカノイル)des(B30)ヒトインスリンの合成例 15 と同じ反応条件下であるが、1-(19-カルボキシノナデカノイル)ベンゾトリアゾールに代えて 1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ベンゾトリアゾールを使用し、得られた反応混合物を RP-HPLC により分析したところ、収率 24.9% のN^εB29-(17-カルボキシヘプタデカノイル)des(B30)ヒトインスリンが示された (保持時間：26.41min)。出発物質量は、68.3% であった。例１７ N^εB29-テトラデカノイルdes(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.50g、検定成績：約 80%〜 0.070mmol)を N-メチル -2-ピロリドン(7.0ml)および 3M 尿素水(3.5ml)を 20℃ で溶解した。トリエチルアミン(0.40ml)を添加し、次いでその溶液を -13℃ に冷却した。1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 1.80 ml)を一度に添加した。得られた懸濁液を -13℃で、47 時間攪拌した。得られた混合物を RP-HPLC により分析したところ、収率 65.2% の N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンが示された。例１８ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.50g、検定成績：約 80%〜 0.070mmol)を N-メチル -2-ピロリドン(7.0ml)および水(2.0ml)に 20℃ で溶解した。その溶液を 0℃ に冷却した。トリエチルアミン(0.40ml)を添加した。5-メチル-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 1.00ml)を一度に添加した。その混濁した反応混合物を 0℃ で 2 時間攪拌した。得られた溶液を RP-HPLC により分析したところ、収率 66.8% の N^εB29-テトラデカノイル des( B30)ヒトインスリンが示された。例１９ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.50g、検定成績：約 80%〜 0.070mmol)を N-メチル -2-ピロリドン(7.0ml)および水(2.0ml)に 20℃ で溶解した。トリエチルアミン( 0.40ml)を添加した。5,6-ジクロロ-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N- メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 1.10ml)を一度に添加した。その混濁した反応混合物を 20℃ で 1 時間攪拌した。得られた溶液を RP-HPLC により分析したところ、収率 68.8% の N^εB29-テトラデカノイルdes(B30)ヒトインスリンが示された。例２０ N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(5.0g、検定成績：約 30%〜 0.26mmol)を N-メチル-2 -ピロリドン(30.0ml)および水(6.0ml)に 20℃ で溶解した。トリエチルアミン(1 .08ml)を添加した。5,6-ジメチル-1-テトラデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 4.00ml)を 15 分間に亘り添加した。その混濁した反応混合物を 20℃ で 1 時間攪拌した。得られた溶液を RP-HPLC により分析したところ、収率 54.6% の N^εB29-テトラデカノイル des(B30)ヒトインスリンが示された。例２１ N^εB29-ドデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.10g、検定成績：約 80%〜 0.014mmol)を N-メチル -2-ピロリドン(1.4ml)および水(0.4ml)に 20℃ で溶解した。その溶液を 0℃ に冷却した。トリエチルアミン(0.08ml)を添加した。1-ドデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 0.20ml)を 3 分間に亘り添加した。その混濁した反応混合物を 0℃ で 40 分間攪拌した。得られた溶液を RP -HPLC により分析したところ、収率 58.9% の N^εB29-ドデカノイル des(B30)ヒトインスリン(保持時間：23.17分)、および 23.7% の出発物質が示された。例２２ N^εB29-ヘキサデカノイル des(B30)ヒトインスリンの合成 Des(B30)ヒトインスリン(0.10g、検定成績：約 80%〜 0.014mmol)を N-メチル -2-ピロリドン(1.4ml)および水(0.4ml)に 20℃ で溶解した。この溶液を 0℃ に冷却した。トリエチルアミン(0.08ml)を添加した。1-ヘキサデカノイルベンゾトリアゾール(N-メチル-2-ピロリドン中で 0.10M の溶液を 0.20ml)を 3 分間に亘り添加した。この混濁した反応混合物を 0℃ で 60 分間攪拌した。尚も混濁している反応混合物を RP-HPLC により分析したところ、収率 32.6% の N^εB29-ヘキサデカノイル des(B30)ヒトインスリン(保持時間：33.41 分)、および 59.2% の出発物質が示された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年７月３０日（１９９８．７．３０）【補正内容】請求の範囲１．インスリン、インスリン類似体またはその前駆体（その中に含まれる Lys 残基の遊離ε-アミノ基と、少なくとも１の遊離α-アミノ基とを有する）を選択的にアシル化する方法であって、塩基の存在する極性溶媒中で、前記ε-アミノ基を活性化アミド（該活性アミドは、導入されるべきアシル基に相当する酸のベンゾトリアゾライドまたは置換されたベンゾトリアゾライドの何れかである）と反応することを具備する方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記ベンゾトリアゾライドが、1-テトラデカノイルベンゾトリアゾールである方法。３．請求項１に記載の方法であって、前記ベンゾトリアゾライドが、C₁-C₄アルキル基、ハロゲンおよびニトロ基を含む群から選択された置換基でモノまたはジ置換されたベンゾトリアゾールから誘導される方法。４．請求項１に記載の方法であって、前記ベンゾトリアゾライドが、5-メチルベンゾトリアゾール、5-クロロベンゾトリアゾール、5-ニトロベンゾトリアゾール、5,6-ジメチルベンゾトリアゾールおよび5,6-ジクロロベンゾトリアゾールを含む群から誘導される方法。５．請求項１に記載の方法であって、前記インスリンがヒトインスリンである方法。６．請求項１に記載の方法であって、前記インスリンがブタインスリンである方法。７．請求項１に記載の方法であって、その親インスリンがインスリン類似体である方法。８．請求項７に記載の方法であって、前記親インスリンが des(B30)ヒトインスリンである方法。９．請求項７に記載の方法であって、前記インスリンが、位置 B28 で Lys を、且つ位置 B29 で Pro を有する方法。１０．請求項７に記載の方法であって、前記インスリンが、Phe^B1の欠失しているインスリン類似体である方法。１１．請求項７に記載の方法であって、前記インスリンが、A 鎖および／または B 鎖の N 末端における伸長を有しているインスリン類似体である方法。１２．請求項７に記載の方法であって、前記インスリンが、A 鎖および／または B 鎖の C 末端における伸長を有しているインスリン類似体である方法。１３．請求項１から１２の何れか１項に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、一般式(I)のモノカルボン酸のアシル基である方法： M-COOH (I) ［ここで、M は長鎖炭化水素基であり、これは酸素原子および硫黄原子からなる群から各々独立して選択された 1 以上の官能基により任意に割り込まれてもよい］。１４．請求項１３に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、6 から 2 4の炭素原子を有する、枝分れのない脂肪族モノカルボン酸のアシル基である方法。１５．請求項１３に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、CH₃ (CH₂)₈CO-、CH₃(CH₂)₁₀CO-、CH₃(CH₂)₁₂CO-、CH₃(CH₂)₁₄CO-、CH₃(CH₂)₁₆CO-、 CH₃(CH₂)₁₈CO-、CH₃(CH₂)₂₀CO-、およびCH₃(CH₂)₂₂CO-からなる群から選択される方法。１６．請求項１５に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、CH₃ (CH₂)₁₂CO-である方法。１７．請求項１および３−１２の何れか１項に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、一般式(II)のジカルボン酸のアシル基の１である方法： HOOC-D-COOH (II) ［ここで D は、長鎖炭化水素であり、これは酸素原子および硫黄原子を含む群から各々独立して選択された 1 以上の官能基により任意に割り込まれていてもよい］。１８．請求項１７に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、一般式(II)［ここで、D は、6 から 22 の炭素原子を有する、枝分れのない、二価の脂肪酸炭化水素である］のジカルボン酸のアシル基の１である方法。１９．請求項１７に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、HO OC(CH₂)₄CO-、HOOC(CH₂)₆CO-、HOOC(CH₂)₈CO-、HOOC(CH₂)₁₀CO-、HOOC(CH₂)₁₂CO -、HOOC(CH₂)₁₄CO-、HOOC(CH₂)₁₆CO-、HOOC(CH₂)₁₈CO-、HOOC(CH₂)₂₀CO-およびH OOC(CH₂)₂₂ CO- からなる群から選択される方法。２０．請求項１および３−１２の何れか１項に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が一般式(III)の官能基である方法： CH₃(CH₂)_xCONHCH(COOR¹)CH₂CH₂CO- (III) ［ここで x は、8 から 24 の整数であり、R¹は水素、またはアシル基が実施された場合に、水素で置換することが可能な置換基である］。２１．請求項２０に記載の方法であって、x が 10、12 または 14 である方法。２２．請求項２０に記載の方法であって、R¹がメチル基、エチル基または ter t-ブチル基である方法。２３．請求項１および３−１２の何れか１項に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、一般式(IV)の置換基である方法：リトコーロイル-NHCH(COOR²)CH₂CH₂CO- (IV) ［ここで R²は、水素、またはアシル化を実施した場合に、水素で置換することが可能な官能基である］。２４．請求項２３に記載の方法であって、R²がメチル基、エチル基または ter t-ブチル基である方法。２５．請求項１から２４に記載の方法であって、前記有機溶媒が、N-メチル-2 -ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミドおよびジメチルスルホキシドからなる群から選択される方法。２６．請求項１から２５に記載の方法であって、前記媒質が約 1% w/w から約 99% w/w の水を含有する方法。２７．請求項１から２６に記載の方法であって、前記溶媒が、約 1% w/w から約 90% w/w、好ましくは約 20% から約 75% w/w の水を含有する N-メチル-2-ピロリドンである方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．インスリン、インスリン類似体またはその前駆体（その中に含まれる Lys 残基の遊離ε-アミノ基と、少なくとも１の遊離α-アミノ基とを有する）を選択的にアシル化する方法であって、塩基の存在下する極性溶媒中で、前記ε-アミノ基を活性化アミドと反応させることを具備する方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記インスリンがヒトインスリンである方法。３．請求項１に記載の方法であって、前記インスリンがブタインスリンである方法。４．請求項１に記載の方法であって、その親インスリンがインスリン類似体である方法。５．請求項４に記載の方法であって、前記親インスリンが des(B30)ヒトインスリンである方法。６．請求項４に記載の方法であって、前記インスリンが、位置 B28 で Lys を、且つ位置 B29 で Pro を有する方法。７．請求項４に記載の方法であって、前記インスリンが、Phe^B1の欠失しているインスリン類似体である方法。８．請求項４に記載の方法であって、前記インスリンが、A 鎖および／または B 鎖の N 末端における伸長を有しているインスリン類似体である方法。９．請求項４に記載の方法であって、前記インスリンが、A 鎖および／または B 鎖の C 末端における伸長を有しているインスリン類似体である方法。１０．請求項１から９の何れか１項に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、一般式(I)のモノカルボン酸のアシル基である方法： M-COOH (I) ［ここで、M は長鎖炭化水素基であり、これは酸素原子および硫黄原子からなる群から各々独立して選択された 1 以上の官能基により任意に割り込まれてもよい］。１１．請求項１０に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、6 から 24 の炭素原子を有する、枝分れのない脂肪族モノカルボン酸のアシル基である方法。１２．請求項１０に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、CH₃ (CH₂)₈CO-、CH₃(CH₂)₁₀CO-、CH₃(CH₂)₁₂CO-、CH₃(CH₂)₁₄CO-、CH₃(CH₂)₁₆CO-、 CH₃(CH₂)₁₈CO-、CH₃(CH₂)₂₀CO-、およびCH₃(CH₂)₂₂CO- を含む群から選択される方法。１３．請求項１２に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、CH₃ (CH₂)₁₂CO- である方法。１４．請求項１から９の何れか１項に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、一般式(II)のジカルボン酸のアシル基の１である方法： HOOC-D-COOH (II) ［ここで D は、長鎖炭化水素であり、これは酸素原子および硫黄原子を含む群から各々独立して選択された 1 以上の官能基により任意に割り込まれていてもよい］。１５．請求項１４に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、一般式(II)［ここで、D は、6 から 22 の炭素原子を有する、枝分れのない、二価の脂肪酸炭化水素である］のジカルボン酸のアシル基の 1 である方法。１６．請求項１４に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、HO OC(CH₂)₄CO-、HOOC(CH₂)₆CO-、HOOC(CH₂)₈CO-、HOOC(CH₂)₁₀CO-、HOOC(CH₂)₁₂CO -、HOOC(CH₂)₁₄CO-、HOOC(CH₂)₁₆CO-、HOOC(CH₂)₁₈CO-、HOOC(CH₂)₂₀CO- および HOOC(CH₂)₂₂CO- を含む群から選択される方法。１７．請求項１から９の何れか１項に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が一般式(III)の官能基である方法： CH₃(CH₂)_xCONHCH(COOR¹)CH₂CH₂CO- (III) ［ここで x は、8 から 24 の整数であり、R¹は水素、またはアシル基が実施された場合に、水素で置換することが可能な置換基である］。１８．請求項１７に記載の方法であって、x が 10、12 または 14 である方法。１９．請求項１７に記載の方法であって、R¹がメチル基、エチル基または ter t-ブチル基である方法。２０．請求項１から９の何れか１項に記載の方法であって、導入されるべき前記アシル基が、一般式(IV)の置換基である方法：リトコーロイル-NHCH(COOR²)CH₂CH₂CO- (IV) ［ここで R²は、水素、またはアシル化を実施した場合に、水素で置換することが可能な官能基である］。２１．請求項２０に記載の方法であって、R²がメチル基、エチル基または ter t-ブチル基である方法。２２．請求項１から２１の何れか１項に記載方法であって、前記アシル化が、導入されるべきアシル基に相当する酸のアゾライドであるアシル化剤を使用して実施される方法。２３．請求項２２に記載の方法であって、前記アゾライドが、ピラゾール、イミダゾール、1,2,3-トリアゾール、1,2,4-トリアゾール、テトラゾールおよびフェニルテトラゾールからなる群から選択されるアゾールから誘導される方法。２４．請求項２２に記載の方法であって、前記アゾライドが、ベンザンレートアゾール(benzanelated azole)から誘導される方法。２５．請求項２２に記載の方法であって、前記アゾライドが、インダゾール、ベンゾイミダゾールおよびベンゾトリアゾールを含む群から選択されるアゾールから誘導される方法。２６．請求項２２に記載の方法であって、前記アシル化剤が、1-テトラデカノイルベンゾトリアゾールである方法。２７．請求項２２に記載の方法であって、前記アゾライドが、C_1-4アルキル基、ハロゲンおよびニトロ基を含む群から選択される置換基によりモノまたはジ置換されたベンゾトリアゾールから誘導される方法。２８．請求項２７に記載の方法であって、前記アゾライドが、5-メチルベンゾトリアゾール、5-クロロベンゾトリアゾール、5-ニトロベンゾトリアゾール、5, 6-ジメチルベンゾトリアゾールおよび 5,6-ジクロロベンゾトリアゾールを含む群から誘導される方法。２９．請求項１から２８の何れか１項に記載の方法であって、前記有機溶媒が、N-メチル-2-ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミドおよびジメチルスルホキシドを含む群から選択される方法。３０．請求項１から２９の何れか１項に記載の方法であって、前記媒質が約 1 % w/w から約 9 9% w/w の水を含有する方法。３１．請求項１から３０の何れか１項に記載の方法であって、前記溶媒が、約 1% w/w から約 90% w/w、好ましくは約 20% から約 75% w/w の水を含有するN- メチル-2-ピロリドンである方法。