ES2230607T3

ES2230607T3 - Metodo selectivo de acilacion.

Info

Publication number: ES2230607T3
Application number: ES97928139T
Authority: ES
Inventors: Louis Brammer Hansen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-07-11
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2017-07-04
Also published as: DE69731105D1; AU3255297A; EP0938502A1; ATE278711T1; JP3300368B2; JP2000501419A; PT938502E; WO1998002460A1; EP0938502B1; DE69731105T2

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO SELECTIVO DE ALCILACION DE INSULINA, DE UN ANALOGO DE INSULINA Y DE SU PRECURSOR QUE TIENE UN GRUPO EP - AMINA LIBRE DE UN RESIDUO LYS, Y POR LO MENOS UN GRUPO AL - AMINO LIBRE. DICHO PROCEDIMIENTO CONSISTE EN PROVOCAR LA REACCION DEL GRUPO EP AMINA LIBRE CON UNA AMIDA ACTIVADA EN UN DISOLVENTE POLAR EN PRESENCIA DE UNA BASE.

Description

Método selectivo de acilación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de introducción de un grupo acilo en un péptido. De forma más particular, la invención se refiere a un método mejorado para acilar el grupo \varepsilon-amino de un residuo de lisina contenido en una insulina de origen natural o un análogo o un precursor suyo.

Antecedentes de la invención

La insulina humana y las insulinas relacionadas de forma cercana tienen tres grupos amino primarios en la molécula es decir los grupos \alpha-amino de Gly^{A1} y Phe^{B1}, respectivamente, y el grupo \varepsilon-amino de Lys^{B29}. La N-acilación de una insulina desprotegida puede -dependiendo de las condiciones- conducir a una mezcla compleja de productos mono-, di- e incluso triacilados. No obstante, aunque cierta preferencia para la acilación de una posición específica puede a menudo ser observada la preferencia no es siempre lo suficientemente pronunciada para hacer esta acilación directa útil como método para producir insulinas monoaciladas puesto que la formación del producto deseado puede ir acompañada de la formación de cantidades considerables de subproductos relacionados de forma cercana. Cuando se forman los subproductos, esto se produce a expensas del producto deseado y puede conducir a problemas en la purificación del producto deseado.

La acilación de sólo uno o dos grupos amino específicos en la molécula de insulina puede conseguirse si se dispone de un intermediario protegido de forma adecuada. Un intermediario adecuado puede ser un derivado insulínico en el que el(los) grupo(s) amino que no debe ser acilado es(son) bloqueado(s) con un grupo de protección que puede ser eliminado selectivamente después de que se haya producido la acilación. Un intermediario protegido de este tipo puede ser sea un precursor de insulina o un derivado insulínico en el que haya sido posible introducir uno o dos grupos de protección de forma específica. Por cuestiones económicas, es muy atractivo el hecho de evitar el uso de grupos específicos de protección si se puede.

Friesen HJ et al. (Semisynthetic Peptides and Proteins (Offord RE, DiBello C, eds.) 161-179, 1978, Londres) describen la acilación de insulina con ésteres de N-hidroxisuccinimida (a continuación denominados ONSu-ésteres) y otros ésteres activados bajo varias condiciones, según se resume en las tablas 4 y 5 l.c. Se observa cierta selectividad pero se obtienen de forma invariable los productos A1 monosustituídos y B29 monosustituídos mezclados entre sí y con productos disustituídos. La producción total máxima de productos monosustituidos observada es del 75% pero de los cuales el 85% eran el isómero Al. En otros casos la producción total de productos monosustituídos estaban en la gama del 45-55% de los cuales el 70-72% eran el isómero E-B29. [0005] Según está demostrado por Friesen HJ et al. (en: Chemistry, Structure and Function of Insulin and Related Hormones, Proceedings of the Second International Insulin Symposium (Brandenburg D, Wollmer A, eds.), Nueva York, 1980), el pH del medio de la reacción tiene una fuerte influencia en el curso de la reacción cuando se acila la insulina con ONSu- ésteres u otros agentes acilantes. Así, a un pH 5-6 la monoacilación preferiblemente se desarrolla en el grupo amino de B1 y el producto diacilado preferiblemente será insulina A1,B1-diacilada. A un pH 6.8-9.2, la monoacilación preferiblemente se desarrolla en el grupo amino de Al mientras que el producto diacilado puede ser insulina A1,B1- o A1,\varepsilon-B29-diacilada. Finalmente, a un pH superior a 10, la monoacilación preferiblemente se produce en el grupo \varepsilon-amino de Lys^{B29} mientras que otro grupo acilo preferiblemente va al grupo amino de A1.

Un método que permite la acilación selectiva de proinsulina, insulina o un análogo de insulina que tiene un grupo E-amino libre se describe en EP 0 712 861 A2 y EP 0 712 862 A2 (ambos de Eli Lilly and Company). Según el método, las insulinas desprotegidas son aciladas con ésteres de ácido graso soluble, activados, en particular los ONSu-ésteres, bajo condiciones básicas en un solvente polar.

EP 0 511 600 A2 (Kuraray Co., Ltd.) describe i.a. derivados proteínicos de la fórmula [proteína][Z]_{n} donde [proteína] representa una proteína que tiene varios grupos amino, [Z] es un residuo representado por la fórmula -CO-W-COOH donde W es un grupo hidrocarburo de cadena larga bivalente que puede también contener algunos átomos hetero y n representa una media del número de enlaces de amida entre [Z] y [proteína]. Los derivados son preparados por reacción entre la proteína precursora y un éster de imida de ácido carboxílico de cadena larga en una solución acuosa de una sal que contiene también un solvente orgánico de forma opcional. Ninguna especificidad de la acilación está mencionada y el hecho de que n deba ser un número medio parece indicar que no se consigue ninguna especificidad. Se ha mencionado, que la insulina es una de las proteínas a partir de las cuales, según la invención, se pueden hacer derivados, pero ningún derivado insulínico específico está descrito en EP 0 511 600 ni tampoco se encuentra aquí cualquier indicación de una [Z] preferida o una posición preferida en la que [Z] deba ser introducida para obtener un derivado insulínico útil.

Ejemplos de derivados insulínicos, acilados en el grupo \varepsilon-amino del residuo Lys contenido en él, están descritos en WO 95/07931 (NOVO NORDISK A/S). Los derivados pueden ser producidos por acilación de la correspondiente insulina (A1,B1)-diBoc, preparada a partir de la insulina correspondiente por reacción p. ej. con di-tert-butilo dicarbonato y eliminando posteriormente los grupos de protección y por acilación de un precursor de insulina de cadena única que posteriormente tiene que ser procesado adicionalmente. Ahora se ha hallado de forma sorprendente que se pueden obtener altos rendimientos de insulinas, monoaciladas en el grupo \varepsilon-amino de un residuo Lys contenido en él, gracias al método de la presente invención.

Resumen de la invención

En su aspecto más amplio, la presente invención se refiere a un método para acilar una insulina de forma selectiva, un análogo de insulina o un precursor suyo que tiene un grupo \varepsilon-amino libre de un residuo Lys contenido en él y al menos un grupo \alpha-amino libre, método que comprende la reacción del grupo \varepsilon-amino con una amida activada en un solvente polar en presencia de una base, la amida activada siendo sea la benzotriazolida o sea una benzotriazolida sustituida del ácido correspondiente al grupo acilo a introducir.

Descripción detallada de la invención

En una forma de realización preferida, la insulina original (es decir la insulina de origen natural, análogo de insulina o precursor de insulina a acilar usando el método según la invención) es insulina humana des(B30). Ejemplos de otras insulinas originales preferidas son insulina humana, insulina porcina y otras insulinas de origen natural y también análogos de insulina o precursores de insulina en los que al menos un Lys que tiene un grupo \varepsilon-amino libre y un residuo aminoácido que tiene un grupo \alpha-amino libre están presentes.

Un grupo particularmente preferido de insulinas originales son análogos de insulina en los que el residuo aminoácido en la posición B1 ha sido eliminado.

Otro grupo particularmente preferido de insulinas originales son análogos de insulina que tienen Lys en la posición B28 y Pro en la posición B29. Un ejemplo preferido de este grupo es insulina humana Lys^{B28} Pro^{B29}.

Otro grupo particularmente preferido de insulinas originales son análogos de insulina que tienen Asp en la posición B28. Un ejemplo preferido de este grupo es insulina humana Asp^{B28}.

Otros grupos particularmente preferidos de insulinas originales son análogos de insulina en los que en los que la A-cadena y/o la B-cadena tienen una extensión N-terminal y análogos de insulina en los que la A-cadena y/o la B-cadena tienen una extensión C-terminal.

Otros análogos de insulina que pueden ser útiles como insulinas originales en el método de la presente invención son aquellos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos, preferiblemente uno, dos o tres de éstos, han sido sustituidos por otro residuo aminoácido codificable. Así, en la posición A21 una insulina original puede tener en vez de Asn un residuo aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ala, Gln, Glu, Gly, su, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular un residuo aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gly, Ala, Ser y Thr. Análogos de insulina útiles como insulinas originales en el método de la presente invención pueden también ser modificados por una combinación de los cambios subrayados más arriba.

Por "análogo de insulina" según se utiliza en este caso se entiende un péptido que tiene una estructura molecular similar a la de la insulina humana incluyendo los puentes disulfuro entre Cys^{A7} y Cys^{B7} y entre Cys^{A20} y Cys^{B19} y un puente disulfuro interno entre Cys^{A6} y Cys^{A11}, y que tiene actividad insulínica. Cuando el aminoácido en la posición B1 es eliminado, la posición de los aminoácidos restantes de la B-cadena no es renumerada.

La expresión "un residuo aminoácido codificable" según se utiliza en este caso designa un residuo aminoácido que puede ser codificado por el código genético, es decir un triplete ("codón") de nucleótidos.

La insulina humana des(B30) análoga de insulina original preferida puede ser preparada por diferentes métodos, i.a. por hidrólisis enzimática de insulina humana, insulina porcina y derivados insulínicos. Enzimas que facilitan esta hidrólisis son endopeptidasas de lisilo, como tripsina y proteasas de Achromobacter lyticus. Además, la insulina humana des(B30) puede ser preparada en un proceso enzimático de un precursor de insulina de cadena única de la fórmula B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) donde B(1-29) designa la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 29 de la cadena-B de insulina humana y A(1-21) designa la secuencia de amino ácidos de la posición 1 a la posición 21 de la cadena-A de insulina humana. Este precursor puede ser obtenido según se describe en EP 163.529. Una enzima adecuada para el proceso es la proteasa 1 de Achromobacter lyticus, código EC No. 3.4.21.50. La enzima puede ser usada en forma soluble, o inmovilizada en una Sefarosa activada de N-hidroxisuccinimida. Tras la finalización de la reacción, la insulina humana des(B30) formada puede ser aislada de varias formas, i.a. por precipitación por adición de zinc o sales sódicas.

La reacción de acilación es normalmente realizada con una concentración de la insulina original de aproximadamente el 0.1% p/p a aproximadamente el 25% p/p, preferiblemente de aproximadamente el 2% p/p a aproximadamente el 12% p/p, más preferido de aproximadamente el 3% p/p a aproximadamente el 8% p/p al principio de la reacción.

En una forma de realización preferida de la invención, el grupo acilo a introducir en el grupo \varepsilon-amino de un residuo Lys es el grupo acilo de un ácido monocarboxílico de la fórmula general (1):

(I)M-COOH

donde M es un grupo hidrocarburo de cadena larga que puede opcionalmente ser interrumpido por uno o más grupos cada uno independientemente seleccionado del grupo que se compone de un átomo de oxígeno y un átomo de azufre. Más preferido, el grupo acilo es el grupo acilo de un ácido monocarboxílico de cadena recta, alifático que tiene de 6 a 24 átomos de carbono, en particular un grupo acilo seleccionado del grupo que comprende CH_{3}(CH_{2})_{8}CO, CH_{3}(CH_{2})_{9}
CO, CH_{3}(CH_{2})_{10}CO, CH_{3}(CH_{2})_{11}CO, CH_{3}(CH_{2})_{12}CO, CH_{3}(CH_{2})_{13}CO, CH_{3}(CH_{2})_{14}CO, CH_{3}(CH_{2})_{15}CO, CH_{3}(CH_{2})_{16}
CO, CH_{3}(CH_{2})_{17}CO, CH_{3}(CH_{2})_{18}CO, CH_{3}(CH_{2})_{19}CO, CH_{3}(CH_{2})_{20}CO, CH_{3}(CH_{2})_{21}CO y CH_{3}(CH_{2})_{22}CO.

En otra forma de realización preferida de la invención, el grupo acilo a introducir en el grupo \varepsilon-amino de un Lys residuo es uno de los grupos acilo de un ácido dicarboxílico de la fórmula general (II):

(II)HOOC-D-COOH

donde D es un grupo hidrocarburo de cadena larga que puede opcionalmente ser interrumpido por uno o más grupos cada uno independientemente seleccionado del grupo que se compone de un átomo de oxígeno y un átomo de azufre. Más preferido, el grupo acilo es uno de los grupos acilo de un ácido dicarboxílico de la fórmula general (II) donde D es un grupo hidrocarburo alifático de cadena recta, bivalente que tiene de 6 a 22 átomos de carbono, en particular un grupo acilo seleccionado del grupo que comprende HOOC(CH_{2})_{6}CO, HOOC(CH_{2})_{8}CO, HOOC(CH_{2})_{10}CO, HOOC(CH_{2})_{12}CO, HOOC(CH_{2})_{14}CO, HOOC(CH_{2})_{16}CO, HOOC(CH_{2})_{18}CO, HOOC(CH_{2})_{20}CO y HOOC(CH_{2})_{22}CO.

En otra forma de realización preferida de la invención, el grupo acilo que debe ser introducido en el grupo \varepsilon-amino de un residuo Lys es un grupo de la fórmula general (III):

(III)CH_{3}(CH_{2})_{X}CONHCH(COOR^{1})CH_{2}CH_{2}CO

donde x es un número entero del 8 al 24 y R^{1} es hidrógeno o un grupo que puede ser cambiado con hidrógeno después de que la acilación haya sido realizada, por ejemplo metilo, etilo o tert-butilo. Los valores preferidos de x son 10, 12 y 14. Cuando la acilación ha sido realizada y R' es diferente de hidrógeno, el grupo éster del cual R^{1} es una parte puede ser hidrolizado para dar el ácido libre correspondiente y el alcohol R^{1}OH por métodos conocidos per se. Así, cuando R^{1} es metilo o etilo, la hidrólisis puede ser realizada bajo condiciones alcalinas y cuando R^{1} es tert-butilo, la hidrólisis puede llevarse a cabo usando ácido trifluoroacético.

En otra forma de realización preferida de la invención, el grupo acilo que debe ser introducido en el grupo \varepsilon-amino de un residuo Lys es un grupo de la fórmula general (IV):

(IV)litocoloil-NHCH(COOR^{2})CH_{2}CH_{2}CO

donde R^{2} es hidrógeno o un grupo que puede ser cambiado con hidrógeno después de que la acilación haya sido realizada, por ejemplo metilo, etilo o tert-butilo. Cuando la acilación ha sido realizada y R^{2} es diferente de hidrógeno, el grupo éster del cual R^{2} es una parte puede ser hidrolizado para dar el ácido libre correspondiente y el alcohol R^{2}OH por métodos conocidos per se. Así, cuando R^{2} es metilo o etilo, la hidrólisis puede ser realizada bajo condiciones alcalinas y cuando R^{2} es tert-butilo, la hidrólisis puede realizarse usando ácido trifluoroacético.

La acilación de la insulina original se realiza usando un agente acilante que es una amida activada, más particularmente un azólido del ácido correspondiente al grupo acilo a introducir. Estos azólidos (1-acilazolos) pueden ser preparados según métodos conocidos, ver por ejemplo Staab HA Angew. Chem. 74 (1962) 407-423. Ejemplos de azoles que pueden ser usados en la preparación de los agentes acilantes de esta invención son pirazol, imidazol, 1,2,3 triazol, 1,2,4-triazol, tetrazol, feniltetrazol y -donde sea posible- los compuestos con benzanol correspondientes p. ej. 1 H-indazol, bencimidazol y benzotriazol. Azotes preferidos para la preparación del agente acilante son 1,2,4-triazol, benzotriazol y benzotriazoles sustituidos. Opcionalmente, los azoles mencionados pueden ser sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que comprende alquilo (C_{1}-C_{5}, ramificado o de cadena recta, en particular metilo, etilo, propilo e isopropilo), halógeno (p. ej. fluoro, cloro y bromo, en particular fluoro y cloro), nitro, alcoxi (C_{1}-C_{5}, ramificado o de cadena recta, en particular metoxi, etoxi, propoxi y isopropoxi), amino dialquilado (C_{1}-C_{5}, ramificado o de cadena recta), ácido sulfónico, carboxi y alcoxicarbonilo (C_{1}-C_{5}, ramificado o de cadena recta). Un grupo preferido de agentes acilantes son 1-acil benzotriazoles y un agente acilante preferido es 1-tetradecanoil benzotriazol. Otros 1-acilo benzotriazoles preferidos son aquellos que derivan de benzotriazoles mono- o disustituidos, p. ej. benzotriazoles 5-sustituidos o 6-sustituidos o 5,6-disubstituídos como 5-metilbenzotriazol, 5-clorobenzotriazol, 6-clorobenzotriazol, 5-nitrobenzotriazol, 5,6-dimetilbenzotriazol y 5,6-diclorobenzotriazol.

La acilación se realiza en un solvente polar que puede ser una mezcla de agua y al menos un solvente orgánico mezclable en agua. Ejemplos de disolventes mezclables en agua que pueden ser útiles bien solos o mezclados son alcoholes inferiores, p. ej. metanol, etanol y 2-propanol, cetonas de cadena lineal inferior y ramificada, p. ej. acetona, éteres cíclicos, p. ej. tetrahidrofurano y dioxano, amidas de cadena lineal y cíclica, p. ej. dimetilformamida, dimetilacetamida y N-metil-2-pirrolidona, nitrilos p. ej. acetonitrilo y sulfóxidos, p. ej. dimetilsulfóxido. Muy preferidos entre los disolventes orgánicos mezclables en agua son N-metil-2-pirrolidona, dimetilformamida, dimetilacetamida y dimetilsulfóxido.

La cantidad de agua en el medio de reacción puede variar dentro de una gama amplia de modo que el medio en general contiene de aproximadamente el 1% p/p a aproximadamente el 99% p/p de agua. Cuando N-metil-2-pirrolidona se usa como solvente orgánico mezclable en agua la cantidad de agua del medio es preferiblemente de aproximadamente el 1% p/p a aproximadamente el 90% p/p, más preferiblemente de aproximadamente el 10% p/p o aproximadamente el 20% p/p a aproximadamente el 75% p/p.

La acilación se realiza ante un exceso de un medio fuerte o base fuerte que puede ser bien una base inorgánica o una base orgánica. Ejemplos de bases inorgánicas son hidróxido sódico, hidróxido potásico, carbonato sódico y carbonato potásico. Ejemplos de bases orgánicas son aminas terciarias, p. ej. etildiisopropilamina, trietilamina y dietiletanolamina. Preferiblemente, se usa una base orgánica. La cantidad de base usada es generalmente más de 5 mol por mol de insulina original, p. ej. 10 a 30 mol o incluso 100 mol de base por mol de insulina original.

Básicamente, el límite inferior de la temperatura a la que la acilación puede llevarse a cabo está determinada por el punto de congelación del medio mientras que el límite superior está determinado por la temperatura en la que la insulina original o la insulina acilada será deteriorada. Esto nuevamente dependerá i.a. de la composición del medio. Así, mientras que puede ser posible llevar a cabo la reacción a temperaturas entre -30°C y 70°C es normalmente más conveniente llevar a cabo la reacción a una temperatura entre aproximadamente -5°C y aproximadamente
30°C.

El aislamiento y purificación de los productos preparados por el método de la presente invención pueden realizarse por métodos conocidos per se, incluyendo la filtración en gel y cromatografía.

La presente invención se ilustra con más detalle mediante los ejemplos siguientes que, no obstante, no deben ser construidos como limitadores del objetivo de protección. Las características descritas en la descripción precedente y en los ejemplos siguientes pueden, bien separadamente o en cualquier forma combinada, ser un material para realizar la invención de varias maneras.

Ejemplos Analítica

Las mezclas de reacción -excepto en el ejemplo 4- fueron analizadas por RP-HPLC según se describe abajo usando un aparato Merck/Hitachi equipado con un Diode Array Detector.

Columna: 4.0 X 125 mM, accionada a 60°.

Material de columna: dimetil butil dimetil silil sustituido 100 \ring{A}, 5 mM de sílice.

Sistema gradiente eluyente:

Eluyente A: acetonitrilo (7.8%) en agua que contiene sulfato amónico (2.0%) a un pH 2.5.

Eluyente B: acetonitrilo (53.9%) en agua.

Velocidad de flujo: 1.0 ml/min.

Detección: Absorción de UV a 280 nm.

Duración del ciclo: 65 minutos.

Los rendimientos expuestos están basados en el área de los valores máximos en los cromatogramas.

La identidad de las insulinas aciladas fue determinada por su duración de retención en RP-HPLC y por aislamiento y espectrometría de masas/cartografía peptídica que se realizó en los productos acilados 1) sin pretratamiento, 2) después del pre-tratamiento con ditiotreitol para reducir los enlaces de disulfuro y 3) después del pretratamiento con ditiotreitol y proteasa V8 de Staphylococcus aureus para la disociación de la cadena-B entre la posición 21 y la posición 22.

Preparación de precursores Ejemplo 1 Preparación de 1-tetradecanoilbenzotriazol

Benzotriazol (59.6 g, 0.50 mol) fue disuelto en tert-butil metil éter (950 ml) a 20° y se añadió trietilamina (50.6 g, 0.50 mol). Se añadió cloruro de tetradecanoilo (125.0 g, 0.51 mol) en un periodo de 30 minutos, manteniéndose la temperatura a 20-30°C para su enfriamiento. El precipitado resultante fue extraído por filtración, y el filtrado concentrado por evaporación con presión reducida a 60°C. El residuo fue disuelto en acetona (375 ml) a 60°C. Tras el enfriamiento a 0°C, los cristales resultantes fueron aislados por filtración, lavados con acetona (120 ml) y secados a peso constante con presión reducida a 20°C.

Producción: 142.3 g (86%) de 1-tetradecanoilbenzotriazol blanco cristalino, fusión a 58.0°C (valor máximo) determinado por Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC).

Bajo condiciones de reacción similares, los triazoles acilados siguientes fueron también preparados:

1-tetradecanoil-1,2,4-triazol, DSC: 59.7°C (recrist. de tetrahidrofurano),

5-metil-1-tetradecanoilbenzotriazol, DSC: 69.5°C (recrist. de 2-propanol),

5-cloro-1-tetradecanoilbenzotriazol (datos de RMN parecen indicar que el producto también contenía algún 6-cloro-1-tetradecanoilbenzotriazol), DSC: 52.1°C (recrist. de 2-propanol),

5-nitro-1-tetradecanoilbenzotriazol, DSC: 117.5°C (recrist. de acetona),

5,6-dichloro-1-tetradecanoilbenzotriazol, DSC: 60.6°C (recrist. de tetrahidrofurano),

5,6-dimetil-1-tetradecanoilbenzotriazol, DSC: 61.6°C (recrist. de acetona),

1-dodecanoilbenzotriazol, DSC: 43.9°C (recrist. de n-heptano) y

1-hexadecanoilbenzotriazol, DSC 62.4°C (recrist. de acetato de tert-butilo).

Ejemplo 2 Preparación de 1-(19-carboxinonadecanoil)benzotriazol

Una solución de ácido eicosanodioico (3.43 g, 10.0 mmol), diciclohexilcarbodimida (2.06 g, 10.0 mmol), benzotriazol (1.19 g, 10.0 mmol) e hidrocloruro dimetilamino-piridina en tetrahidrofurano anhídrico (200 ml) fue agitada durante dos días a temperatura ambiente. La suspensión resultante fue filtrada, y el filtrado concentrado por evaporación con presión reducida. El residuo fue suspendido en diclorometano (100 ml), y el material no disuelto fue aislado por filtración. La torta de filtro seca (2.0 g) fue recristalizada a partir de acetona (200 ml) dando 0.70 g (16%) de 1-(19-carboxinonadecanoil)benzotriazol cristalino blanco, fusión a 111.9°C (valor máximo de DSC).

Ejemplo 3 Preparación de 1-(17-carboxiheptadecanoil)benzotriazol

Bajo condiciones de reacción similares a las del ejemplo 2, pero usando ácido octadecanodioico en vez de ácido eicosanodioico, se preparó 1-(17-carboxiheptadecanoil)-benzotriazol. El compuesto tiene un punto de fusión de 105.2°C (valor máximo de DSC).

Ejemplo 4 Preparación de insulina humana des(B30) de un precursor de insulina de cadena única

Precursor de insulina de cadena única de la fórmula B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) donde B(1-29) designa la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 29 de la cadena-B de insulina humana y A(1-21) designa la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 21 de la cadena-A de insulina humana se obtuvo según se describe en EP 163.529.

5 g de torta de sal mojada que contiene aproximadamente 1.5 g del precursor de cadena única mencionado arriba fueron disueltos en 25 mM de hidrogenocarbonato de sodio (350 ml) a temperatura ambiente. El valor de pH de la solución fue ajustado a 9.0 por adición de 1.0 M de hidróxido sódico (1 ml). Se añadió proteasa 1 de Achromobacter lyticus, inmovilizada en Sefarosa activada de N-hidroxisuccinimida (10 ml de gel con una densidad de enzima de aproximadamente 1.0 mg/I). La mezcla reactiva fue agitada durante 23 horas a temperatura ambiente y la enzima inmovilizada fue luego eliminada por filtración. El filtrado fue analizado por RP-HPLC según se describe
abajo.

En base al área de los valores máximos en el cromatograma, la cantidad relativa de insulina humana des(B30) encontrada en la mezcla reactiva fue del 95.2% (tiempo de retención: 27.7 minutos) y la cantidad relativa de material precursor fue del 0.1% (tiempo de retención: 15.0 minutos).

Analítica

La mezcla reactiva fue analizada por RP-HPLC en un equipo proporcionado por Waters.

Columna: 4.0 x 250 mM, accionado a 50°.

Material de columna: YMC 120 A, 5 my OdDMe gel de sílice sililado.

Sistema gradiente eluyente:

Eluyente A: 0.20 M de sulfato de sodio, 0.04 M de ácido fosfórico en acetonitrilo (10%) en agua, pH 2.3.

Eluyente B: acetonitrilo (50%) en agua.

Tiempo transcurrido: 60 minutos

Velocidad de flujo: 1.0 ml/min

Detección: Absorción de UV a 214 nm

gradiente: 00.00 minutos 64% A + 36% B

\hskip1.4cm

40.00 minutos 40% A + 60% B

\hskip1.4cm

41.00 minutos 64% A + 36% B Preparación de insulinas aciladas Ejemplo 5 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30)

Se disolvió Insulina humana des(B30) (0.50 g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (7.0 ml) y agua (3.5 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C. Se añadió trietilamina (0.40 ml). 1-Tetradecanoilbenzotriazol (1.50 ml de un 0.10 M solución en N-metil-2-pirrolidona) fue añadido en un periodo de 30 minutos. La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 30 minutos, luego a 20°C durante otros 30 minutos.

La mezcla reactiva fue analizada por RP-HPLC con los resultados siguientes:

Tiempo de retención, min	Compuesto	% de producción
11.00	material precursor	7.3
25.20	insulina humana N^{A1}-tetradecanoil des(B30)	1.8
29.66	insulina humana NE^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30)	71.0
49.85	insulina humana diacilada des(B30)	7.7
>50	total de productos desconocidos	10.4

Ejemplo 6 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30)

Se disolvió nsulina humana des(B30) (0.50 g, ensayo: aproximadamente 66% \sim 0.58 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (7.5 mi) y agua (1.0 ml) a 20°C. Se añadió trietilamina (0.40 ml). En una parte se añadió 1-Tetradecanoil-1,2,4-triazol (1.0 ml de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona). La mezcla reactiva homogénea fue agitada a 20°C durante 10 minutos y luego analizada por RP-HPLC con los resultados siguientes:

\newpage

Tiempo de retención, min	Compuesto	% de producción
11.43	material precursor	30.0
25.89	insulina humana N^{AT}-tetradecanoil des(B30)	8.4
30.37	insulina humana NE^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30)	43.8
50.20	insulina humana diacilada des(B30)	8.7
>50.20	total de productos desconocidos	3.8

Ejemplo 7 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50 g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en dimetil sulfóxido (7.0 ml) y agua (3.5 ml) a 20°C y se añadió trietilamina (0.40 ml). Se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol (1.80 ml de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona) durante un periodo de 2 minutos. La mezcla reactiva turbia fue agitada a 20°C durante 90 minutos. La mezcla reactiva homogénea resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 59.4% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30).

Ejemplo 8 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50 g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en dimetilformamida (7.0 ml) y 6M de úrea acuosa (2.0 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C, y se añadió trietilamina (0.40 ml). Se añadió en una parte 1-tetradecanoilbenzotriazol (1.10 ml de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona. La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 60 minutos. La mezcla reactiva resultante ligeramente turbia fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 74.2% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30).

Ejemplo 9 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50 g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (7.0 ml) y agua (2.0 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C. Se añadió trietilamina (0.20 ml). En una parte se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol (1.00 ml de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona). La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 65 minutos. La mezcla reactiva resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 68.3% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30).

Ejemplo 10 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50 g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (7.0 ml) y 3M de úrea acuosa (3.5 ml) a 20°C. Se añadió etildiisopropilamina (0.50 ml). Se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol (1.50 mI de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona) durante un periodo de 2 minutos. La mezcla reactiva turbia fue agitada a 20°C durante 90 minutos. La mezcla reactiva resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 61.9% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30).

Ejemplo 11 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (5.0 g, ensayo: aproximadamente 34%\sim0.30 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (20.0 ml) a 20°C. Tras el enfriamiento a 0°C, se añadió trietilamina (1.50 ml). 5-nitro-1-tetradecanoilbenzotriazol (3.20 ml de una solución de 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona) fue añadida en un periodo de 10 minutos. La mezcla reactiva fue agitada a 0°C durante 30 minutos. La mezcla reactiva resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 58.3% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoii des(B30).

Ejemplo 12 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (5.0 g, ensayo: aproximadamente 34%\sim0.30 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (20.0 ml) a 20°C. Tras el enfriamiento del agua a 0°C (7.5 ml) y se añadió trietilamina (1.50 ml). Se añadió 5-Cloro-1 tetradecanoilbenzotriazol (4.5 ml de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona) durante un periodo de 15 minutos. La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 3 horas. La mezcla reactiva resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 77.7% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30).

Ejemplo 13 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil

Se disolvió nsulina humana (50 mg, 0.009 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (0.7 ml) y agua (0.35 ml) a 0°C. Se añadió trietilamina (0.040 ml). En una parte se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol (0.150 mi de una solución 0.10 M en N-metil-2 pirrolidona). La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 150 minutos. La mezcla reactiva homogénea resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 64.0% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil (tiempo de retención: 27.75 minutos).

Ejemplo 14 Síntesis de insulina porcina N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil

Se disolvió insulina porcina (50 mg, 0.009 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (0.7 ml) y agua (0.35 ml) a 0°C. Se añadió trietilamina (0.040 ml). En una parte se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol (0.150 mI de una solución 0.10 M en N-metil-2 pirrolidona). La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 155 minutos. La mezcla reactiva homogénea resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 62.5% de insulina porcina N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil (tiempo de retención: 28.99 minutos).

Ejemplo 15 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(19-carboxinonadecanoil) des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (5.0 g, ensayo: aproximadamente 34%\sim0.30 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (30.0 ml) y agua (6.9 ml) a 20°C. Se añadió trietilamina (1.10 ml). En una parte se añadió 1-(19-carboxinonadecanoil)benzotriazol (5.0 mI de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona). La mezcla reactiva fue agitada a 20°C durante 4.5 horas. La mezcla reactiva resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 30.0% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(19-carboxinonadecanoil) des(B30) (tiempo de retención: 32.19 minutos). La cantidad de material precursor fue del 57.3%.

Ejemplo 16 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(17-carboxiheptadecanoil) des(B30)

Bajo condiciones de reacción similares a las del ejemplo 15, pero usando 1-(17-carboxiheptadecanoil)benzotriazol en vez de 1-(19-carboxinonadecanoil)benzotriazol, la mezcla reactiva resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 24.9% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-(17-carboxiheptadecanoil) des(B30) (tiempo de retención: 26.41 minutos). La cantidad de material precursor fue del 68.3%.

Ejemplo 17 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50 g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (7.0 ml) y 3M de úrea acuosa (3.5 ml) a 20°C. Se añadió trietilamina (0.40 ml), y la solución fue enfriada a -13°C. En una parte se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol (1.80 ml de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona). La suspensión resultante fue agitada a -13°C durante 47 horas. La mezcla reactiva fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 65.2% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30).

Ejemplo 18 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50 g, ensayo aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (7.0 ml) y agua (2.0 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C.

Se añadió trietilamina (0.40 ml). En una parte se añadió 5-metil-1-tetradecanoilbenzotriazol (1.00 mI de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona). La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 2 horas. La solución resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 66.8% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30).

Ejemplo 19 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50 g, ensayo aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (7.0 ml) y agua (2.0 ml) a 20°C. Se añadió trietilamina (0.40 ml). En una parte se añadió 5,6-Dicloro-1-tetradecanoilbenzotriazol (1.10 mI de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona). La mezcla reactiva turbia fue agitada a 20°C durante 1 hora. La solución resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 68.8% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30).

Ejemplo 20 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (5.0 g, ensayo aproximadamente 30%\sim0.26 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (30.0 ml) y agua (6.0 ml) a 20°C. Se añadió trietilamina (1.08 ml). Se añadió 5,6-Dimetil-1-tetradecanoilbenzotriazol (4.00 ml de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona) durante un periodo de 15 minutos. La mezcla reactiva turbia fue agitada a 20°C durante 1 hora. La solución resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 54.6% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30).

Ejemplo 21 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-dodecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (0.10 g, ensayo aproximadamente 80%\sim0.014 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (1.4 ml) y agua (0.4 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C. Se añadió trietilamina (0.08 ml). Se añadió 1-dodecanoilbenzotriazol (0.20 ml de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona) en un periodo de 3 minutos. La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 40 minutos. La solución resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 58.9% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-dodecanoil des(B30) (tiempo de retención: 23.17 minutos), y del 23.7% de material precursor.

Ejemplo 22 Síntesis de insulina humana N^{\varepsilon B29}-hexadecanoil des(B30)

Se disolvió insulina humana des(B30) (0.10 g, ensayo aproximadamente 80%\sim0.014 mmol) en N-metil-2-pirrolidona (1.4 ml) y agua (0.4 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C. Se añadió trietilamina (0.08 ml). Se añadió 1 hexadecanoilbenzotriazol (0.20 ml de una solución 0.10 M en N-metil-2-pirrolidona) durante un periodo de 3 minutos. La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 60 minutos. La mezcla reactiva todavía turbia fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción del 32.6% de insulina humana N^{\varepsilon B29}-hexadecanoil des(B30) (tiempo de retención: 33.41 minutos), y del 59.2% de material precursor.

Claims

1. Un método para acilar selectivamente una insulina, un análogo de insulina o un precursor de ésta que tiene un grupo \alpha-amino libre de un residuo Lys contenido en él y al menos un grupo \alpha-amino libre, dicho método comprende la reacción del grupo \varepsilon-amino con una amida activada en un solvente polar en presencia de una base, la amida activada siendo sea la benzotriazolida o una benzotriazolida sustituida del ácido correspondiente al grupo acilo a introducir.

2. El método según la reivindicación 1, donde la benzotriazolida es 1-tetradecanoil benzotriazol.

3. El método según la reivindicación 1, donde la benzotriazolida está derivada de un benzotriazol mono- o disustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que comprende C_{1}-C_{4} alquilo, halógeno y nitro.

4. El método según la reivindicación 1, donde la benzotriazolida está derivada del grupo que comprende 5-metilbenzotriazol, 5 clorobenzotriazol, 5-nitrobenzotriazol, 5,6-dimetilbenzotriazol y 5,6-diclorobenzotriazol.

5. El método según la reivindicación 1 donde la insulina es insulina humana.

6. El método según la reivindicación 1 donde la insulina es insulina porcina.

7. El método según la reivindicación 1 donde la insulina original es un análogo de insulina.

8. El método según la reivindicación 7 donde la insulina original es insulina humana des(B30).

9. El método según la reivindicación 7 donde la insulina tiene Lys en la posición 828 y Pro en la posición B29.

10. El método según la reivindicación 7 donde la insulina es un análogo de insulina en el que Phe^{81} ha sido eliminado.

11. El método según la reivindicación 7 donde la insulina es un análogo de insulina en el que la cadena-A y/o la cadena-B tiene una extensión N-terminal.

12. El método según la reivindicación 7 donde la insulina es un análogo de insulina en el que la cadena-A y/o la cadena-B tiene una extensión C-terminal.

13. El método de según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el grupo acilo a introducir es el grupo acilo de un ácido monocarboxílico de la fórmula general

(I)M-COOH

donde M es un grupo hidrocarburo de cadena larga que puede opcionalmente ser interrumpido por uno o más grupos cada uno independientemente seleccionado del grupo que se compone de un átomo de oxígeno y un átomo de azufre.

14. El método según la reivindicación 13 donde el grupo acilo a introducir es el grupo acilo de un ácido monocarboxílico alifático de cadena recta que tiene de 6 a 24 átomos de carbono.

15. El método según la reivindicación 13 donde el grupo acilo a introducir está seleccionado del grupo que comprende CH_{3}(CH_{2})_{8}CO, CH_{3}(CH_{2})_{10}CO, CH_{3}(CH_{2})_{12}CO, CH_{2}(CH_{2})_{14}CO , CH_{3}(CH_{2})_{16}CO, CH_{3}(CH_{2})_{19}CO, CH_{3}
(CH_{2})_{20} CO y CH_{3}(CH_{2})_{22}CO.

16. El método según la reivindicación 15 donde el grupo acilo a introducir es CH_{2}(CH_{2})_{12}CO.

17. El método según cualquier las reivindicaciones 1 y 3-12 donde el grupo acilo a introducir es uno de los grupos acilo de un ácido dicarboxílico de la fórmula general:

(II)HOOC-D-COOH

donde D es un grupo hidrocarburo de cadena larga que puede opcionalmente ser interrumpido por uno o más grupos cada uno independientemente seleccionado del grupo que se compone de un átomo de oxígeno y un átomo de azufre.

18. El método según la reivindicación 17 donde el grupo acilo a introducir es uno de los grupos acilo de un ácido dicarboxílico de la fórmula general (II) donde D es un grupo hidrocarburo alifático de cadena recta, bivalente que tiene de 6 a 22 átomos de carbono.

19. El método según la reivindicación 17 donde el grupo acilo a introducir está seleccionado del grupo que comprende HOOC(CH_{2})_{4}CO, HOOC(CH_{2})_{6}CO, HOOC(CH_{2})_{8}CO, HOOC(CH_{2})_{10}CO, HOOC(CH_{2})_{12}CO, HOOC
(CH_{2})_{14}CO, HOOC(CH_{2})_{16}CO, HOOC(CH_{2})_{5}CO, HOOC(CH_{2})_{20}CO y HOOC(CH_{2})_{22}CO.

20. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-12 donde el grupo acilo a introducir es un grupo de la fórmula general (III):

(III)CH_{2} (CH_{2})_{X}CONHCH(COOR^{1})CH_{2}CH_{2}CO

donde x es un número entero de 8 a 24 y R^{1} es hidrógeno o un grupo que puede ser cambiado con hidrógeno cuando la acilación haya sido realizada.

21. El método según la reivindicación 20 donde x es 10, 12 ó 14.

22. El método según la reivindicación 20, donde R^{1} es metilo, etilo o tert-butilo.

23. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-12 donde el grupo acilo a introducir es un grupo de la fórmula general (IV):

(IV)litocoloil-NHCH(COOR^{2})CH_{2}CH_{2}CO

donde R^{2} es hidrógeno o un grupo que puede ser cambiado con hidrógeno cuando la acilación haya sido realizada.

24. El método según la reivindicación 23 donde R^{2} es metilo, etilo o tert-butilo.

25. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el solvente orgánico está seleccionado del grupo que comprende N-metil-2-pirrolidona, dimetilformamida. dimetilacetamida y dimetilsulfóxido.

26. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el medio contiene de aproximadamente el 1% p/p a aproximadamente el 99% p/p de agua.

27. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el solvente es N-metil-2-pirrolidona que contiene de aproximadamente el 1% p/p a aproximadamente el 90% p/p, preferiblemente de aproximadamente el 20% p/p a aproximadamente el 75% p/p de agua.