JP2000501931A

JP2000501931A - Ｈｉｖ感染を早期に検出する方法

Info

Publication number: JP2000501931A
Application number: JP09520811A
Authority: JP
Inventors: ドナルドアール．ブランチ; デビッドジェイ．フィップス
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-12-05
Filing date: 1996-08-15
Publication date: 2000-02-22
Also published as: US6248515B1; US6235466B1; AU731101B2; AU6653896A; WO1997021102A1; EP0877940A1; CA2239027A1

Abstract

(57)【要約】シグナル形質導入媒介物質、具体的には酵素媒介物質、より具体的にはｓｒｃたんぱく質チロシンキナーゼ系の仲間の活性変化を検出することにより、ＨＩＶ感染を早期に検出する方法。本方法は血清、血漿、血液細胞溶解産物、尿及び唾液媒体を用いたＨＩＶ検出に応用可能である。本方法は、大変早期の、信頼性のある、特異的かつ感受性の高い、また広く利用可能かつ実際的な血清陰性のＨＩＶ感染の検査法を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶ感染を早期に検出する方法発明の分野本発明は、シグナル形質導入媒介物質の活性、特にたんぱく質チロシンキナーゼ活性の変化を判定することによりＨＩＶを早期に検出する方法に関するものである。発明の背景現在、ＨＩＶへの感染は、通常、血清中のＨＩＶ特異抗体をＥＬＩＳＡ又はウェスタン・ブロット法のいずれかを用いて検出することで診断されている。ＨＩＶ特異抗体の発生までには、ＨＩＶ感染について血清陰性と出る「空白期間」があり、この期間の間は、ＨＩＶに感染していても標準的なＥＬＩＳＡ又はウェスタン・ブロット検定を用いるとＨＩＶ陽性とは検出されない。ある研究では、この空白期間は感染日から平均４５日間であり、１４１日間以内に９０％は血清転化するが１０％の人は最高で６カ月まで血清転化しなかったとしている（１）。改良された最新の抗ＨＩＶ抗体検出システムでは、この血清転化の空白期間は感染後およそ２２日間まで減少している。しかしながら、この計算には１０から３４日間という範囲にわたる大きな９５％のＣＶが含まれている（２）。あるカナダの司法報告書は、「（輸血による）ＨＩＶ感染の危険性が残る要因として最も大きなものは、提供者が感染していても検出可能なレベルまで抗体ができていないという空白期間があることである」と述べている（３）。輸血用に提供された単位血液はすべてＨＩＶ特異抗体について検査されているにも関わらず、この空白期間があることで血液供給の安全性が損なわれているが、それはなぜなら、血清陰性のＨＩＶ感染者が検出されずにＨＩＶ感染した単位血液を提供することもあり得るからである。この僅かな、しかし重大な危険性のために、血液採集機関では提供者をふるい分けしてＨＩＶ感染のおそれのある人から提供を受けてしまうことを減らそうとしている。現在のところ、血清陰性の血液単位を原因とする、輸血に関連したＨＩＶ感染率の試算は、１：３６，０００（４）から１：６０，０００（５）、１：１５３，０００（６）、１：２５０，０００（３）とばらつきがある。カナダでは１９９３年から１９９４年の間に、血漿、アフェレーシス血小板、シングル・ドナー（原語：single donor）血小板、赤血球及び低温沈降ＡＨＦを含め、合計１，１４１８，９１６単位の未処置血液成分が輸血された（７）。従ってカナダだけでみると、ＨＩＶに感染した血清陰性の献血による輸血を原因としたＨＩＶ感染の数は１９９３年から１９９４年では最低で６件、最高でも３９件と考えられる。個人献血による血液製剤はプールされるため、ＨＩＶに感染した抗体陰性の血液の単一単位が複数の成分を汚染する可能性もある。輸血で感染した人にＨＩＶ検査をしようという理由がないと、このような人は静脈注による薬品の使用、性交渉又は母体−胎児間伝染を通じてＨＩＶをまき散らしてしまうこととなる。１０から１２年間のＨＩＶ無症状期間にあるこれらの人を原因とする感染数は、計算が不可能である。提供された単位にＨＩＶがあるかどうかを検査するのに現在用いられているウェスタン・ブロット法及びＥＬＩＳＡ抗体検査では血清陰性のＨＩＶ感染は検出されない。抗体に基づいていない三つの検査器具が現在市販されており、血清陰性のＨＩＶ感染を検出することができる。ロッシュ社により市販の定量競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＣ−ＰＣＲ）と、キロン社より市販の分枝鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）は両方とも、ＨＩＶに感染した患者の血漿中のＨＩＶ特異ＲＮＡを検出するものである。これらの器具は血漿又は血清からＨＩＶＲＮＡを捕捉し、異なる増幅系を用いて、存在する少量のＲＮＡを計測可能なシグナルに増幅する（８）。しかしながら、上述の二つの検査器具の方法には大きな限界がある。両ＱＣ −ＰＣＲ及びｂＤＮＡはテスト試料ごとにおよそ１００ドル（米国ドル）かかる。どちらのテスト器具も現在カナダではカナダ健康福祉省からＨＩＶ診断用としては認可を受けていない。二つの米国検査箇所では、ｂＤＮＡは無症状のＨＩＶ抗体陽性患者のうち僅かに６９％及び７５％しか検出できていない（８）。ＨＩＶｐ２４抗原を調べるＥＬＩＳＡ検査は血清ｐ２４抗原を検出するものであり、ＨＩＶ検出の空白期間を感染後１８から２２日まで減少させている。この検査はカナダ及び米国の両方の血液業界で採用されてはいるが、この検査の有効性と空白期間の僅かな短縮では、一般大衆への経済的負担に見合うものではない。従って、広く利用可能かつ実際的な、血清陰性のＨＩＶ感染を調べる信頼性の高い、特異的かつ感受性の高い検査が依然、必要とされている。末梢血リンパ球のＨＩＶ感染、又は細胞株ジャーカットのＨＩＶ感染の結果、ホスホチロシンを含有するたんぱく質のレベルが感染後４、５日で高くなることが実証されている（９）。二つのたんぱく質（ｐｐ９５及びｐｐ５５）にあるホスホチロシンのレベルは、ｇｐ１２０（シンシチウム形成のモデル、細胞にはＨＩＶは感染していない）にトランスフェクトしたジャーカットにジャーカットが暴露した後３０分で増加していた。暴露後４時間でホスホチロシンを含有するたんぱく質のレベルは減少していた。無症状のＨＩＶ感染患者（平均ＣＤ４＝２９５セル／μｌ）のうち、２５分の７人のｆｙｎたんぱく質が増加し、ｌｃｋたんぱく質が減少していたことが報告されている。加えて、ＨＩＶに感染した患者から採った休止Ｔリンパ球のホスホチロシンのレベルに変化がなかったことが実証されている（９）。ジャツェザック氏他は、ｇｐ１２０及びｇｐ１２０由来のペプチドが、正常な休止末梢血リンパ球及びＴリンパ球細胞株ＨＵＴ７８においてチロシンリン酸化及びｐ５６^lCkの活性化を一時的に誘発したことを実証している（１２）。ホスホチロシンのレベル及びｌｃｋ活性は処理後５分で上昇し、１５分で頂点に達し、３０分後に対照レベルに戻っていた。ホラック氏他は、活性化したＴリンパ球のクローンをｇｐ１２０又はＨＩＶのいずれかで処理しても、０．５から１５分間処理した場合、ホスホチロシンを含有するたんぱく質レベルもｐ５６^lCk活性も変化しなかったことを実証している（１３）。ヒブロッツ氏他は、ｇｐ１２０及びｇｐ１２０由来のペプチドが、正常な休止末梢血リンパ球及びＴリンパ球細胞株ＨＵＴ７８においてチロシンリン酸化及びｌｃｋ活性化を一時的に誘発することを実証している（１４）。ホスホチロシンのレベル及びｌｃｋ活性は、ｇｐ１２０又はｇｐ１２０由来のペプチドのいずれかによる処理後５分で上昇し、１５分で頂点に達し、３０分後に対照レベルに戻る。カウフマン氏他は、休止末梢血リンパ球をｇｐ１２０で１時間処理してもホスホチロシン含有たんぱく質、細胞内カルシウム、たんぱく質キナーゼＣ（セリン／トレオニンたんぱく質キナーゼ）又はアラキドン酸代謝物のレベル変化を誘発しなかったことを実証している（１５）。オーロフ氏他は、正常な休止末梢血リンパ球及び活性化したリンパ球芽球をＨＩＶに感染させても、感染後１から１２０分間ではホスホチロシンレベルもｐ５６ｌｃｋ活性も変化しないことを実証している（１６）。フィップ氏他は、ｇｐ１２０由来のペプチドが、活性化した末梢血リンパ球芽球においてｌｃｋ活性を一時的に減少させるがｆｙｎ及びｓｒｃの活性を一時的に高めることを実証している（１７）。現在のキナーゼ検定法には大きな問題がある。標準的な試験管内免疫複合体キナーゼ検定は複雑であり、多くの段階を経る方法であるため数多くの試料を検査するにはなじまず、またオートラジオグラフの濃度計測分析法を用いた半定量的なものにすぎない。更に、これらには既存の定量的キナーゼ検定法と同様の二つの欠点がある。現在入手可能なＵＢＩ定量的ＰＴＫ（たんぱく質チロシンキナーゼ）検定器具は、免疫沈降させたＰＴＫが媒介する、合成アミノ酸ペプチド基質のチロシンリン酸化に依拠するものである。免疫沈降させたＰＴＫをこのペプチド及びγ³²Ｐ −ＡＴＰでインキュベートし、反応を停止させ、アリクオットのキナーゼ混合液をフィルタ・ディスクに移し、洗浄し、乾燥させて、リン酸化の程度を液体シンチレーション計数により調べる。この器具では異なる系統間ではＰＴＫを区別することができるが同じ系統のなかの別々のものは区別することはできない。ピアス社の定量ＰＴＫ又はＰＫＣＥＬＩＳＡを基にした比色検定法では、ビオチニル化チロシンを含有するペプチドをアビジン処理した８ウェルのマイクロタイタ細片に結合させる。ＰＴＫを含有する免疫沈降物を加えてペプチドをリン酸化させ、残留たんぱく質を洗い落とし、ＨＲＰで標識付けした抗ホスホチロシンを加え、残留抗体を洗い落とし、ＨＲＰ基質を加えて、その結果生じた色を分光光度分析法により標準ホスホチロシン含有ペプチドに対して定量化する。この器具は異なるＰＴＫを区別することができない。既存のキナーゼ検定法には以下のように二つの大きな短所がある。１）目的の細胞集団を分離するために血液を高度に処理しなければならないこと。２）免疫沈降に標準化がないこと。１）全血から末梢血単核細胞ＰＢＭＣを分離するための現在の密度勾配を基にした技術には、ａ）バイオハザード物質を何度も取り扱わなければならないこと、ｂ）免疫沈降までに試料を新しい処理用試験管に少なくとも三回移さなければならないため、試料を混合させてしまう危険性が高いこと、ｃ）残留密度勾配媒体を取り除くために細胞を入念に洗浄しなくてはならないことと、試料を無くす危険性があること、ｄ）密度勾配媒体及び血液処理のコストが高いこと、がある。２）研究者は現在のところ、抗ＰＴＫをたんぱく質Ａセファロース（又は同様の固形マトリックス材料）に結合させて、細胞溶解産物からＰＴＫを免疫沈降させるのに用いる免疫結合体を作っている。たんぱく質Ａセファロースは顕微ビードのスラリであり、処理前に免疫結合体と免疫沈降物との両方を洗浄することが必要となる。洗浄と余剰上澄み液の吸引除去とにより処理時間が長くなり、試料を失う危険性が高くなるため、結果的に、キナーゼ反応に異なる量の免疫沈降物を使用することになりテスト間変動性が高くなってしまう可能性がある。参考文献リスト本明細書は以下の出版物を参考とするが、同出版物の各々を参考文献としてここに編入することを明示しておく。１．ピーターセンＬ．Ｒ．、サッテンＧ．Ａ．、ドッドＲ、ブッシュＭ．、グラインマンＳ、グリンドンＡ、レネスＢ及びＨＩＶ血清転化研究グループ著（１９９４）。ヒト免疫不全ウィルス１型感染開始から検出可能な抗体の発生までの期間。輸血３４；２８３−２８９。２．ブッシュＭ．Ｐ．、リーＬ．Ｌ．Ｌ．、サッテンＧ．Ａ．、ヘンラードＤ．Ｒ．、ファーザデガンＨ．、ネルソンＫ．Ｅ．、リードＳ．、ドッドＲ．Ｙ．及びピーターソンＬ．Ｒ．著（１９９５）。ヒト免疫不全ウィルス１型血清転化前のウィルス及び血清マーカ検出の時間経過：血液及び組織ドナーの検査における関連事項。輸血３５：９１−９７。３．ホレース・クレバー判事著、中間報告「カナダにおける血液系に関する質問命令」第４章。４．ドナヒューＪ．Ｇ．、ネルソンＫ．Ｅ．、ミュノスＡ．、マカリスターＨ．Ａ．、ヨーンＤ．Ｈ．、ネスＰ．Ｍ．及びコーエンＮ．Ｄ．著（１９９０）。検査済み血液の輸血によるＨＩＶ伝染。ニューイングランド医学ジャーナル３２３；１７０９。５．ネルソンＫ．Ｅ．、ドナヒューＪ．Ｇ．、ミュノスＡ．、コーエンＮ．Ｄ．、ネスＰ．Ｍ．、ティーグＡ．、スタンボリスＶ．Ａ．、ヨーンＤ．Ｈ．、カリコットＢ．、マカリスターＨ．他著（１９９２）。内科録１１７：５５４−５５９。６．カミングＰ．Ｄ．、ウォーレスＥ．Ｌ．、ショアＪ．Ｂ．及びドッドＲ．Ｙ．著（１９８９）。抗体陰性と判明した血液成分の輸血を通じたヒト免疫不全ウィルスへの患者の暴露。ニューイングランド医学ジャーナル３２１：９４１−９４６。７．ＣＲＣＳ血液提供統計報告書１９９３−１９９４。８．カオＹ．、ホーＤ．Ｄ．、トッドＪ．、コッカＲ．、アーデアＭ．、リフソンＪ．Ｄ．、ピアタックＭ．、チェンＳ．、ハーンＢ．Ｈ．、サーグＭ．Ｓ．及びショーＧ．Ｍ．著（１９９５）。ヒト血漿中のＨＩＶ１型を定量化するための分枝鎖ＤＮＡシグナル増幅の臨床評価。エイズ研究ヒトレトロウィルス１１：３５３−３６１。９．カヨータａ．、ブイラーＦ．、シシリアーノＪ．及びディジエロＧ．著（１９９４）。ＨＩＶ感染した患者から採ったＣＤ４Ｔ細胞中の欠陥的たんぱく質チロシンリン酸化及びｐ５９^fyn及びｐ５６^lckの変化したレベル。Int. Immuno．６：６１１−６２１。１０．ビッケルＰ．Ｍ．著（１９９２）。ＰＰ６０^C-CtC系のたんぱく質チロシンキナーゼ：構造、調節及び機能。Crit.Rev.Oncogenesis３：４０１−４４６。１１．コーエンＤ．Ｉ．、タニＹ．、ティアンＨ．、ブーンＥ．、サムエルソンＬ．Ｅ．及びレーンＨ．Ｃ．著（１９９２）。ヒト免疫不全ウィルス１の細胞食作用におけるチロシンリン酸化の参加。サイエンス２５６：５４２−５４４。１２．ジャツェザックＲ．Ｊ．、ターキンＨ．、トラネーＡ．、カルプＪ．、カシスＳ．著（１９９１）。ヒトＴリンパ球中におけるたんぱく質チロシンキナーゼｐ５６^lCkのＣＤ４との結合に対するヒト免疫不全ウィルスｇｐ１２０糖たんぱく質の作用。生化学ジャーナル２６６：１１１７６−１１１８３。１３．ホラックＩ．Ｄ．、ポポビックＭ．、ホラックＥ．Ｍ．、ルーカスＰ．Ｊ．、グレスＲ．Ｅ．、ジューンＣ．Ｈ．、ボーレンＪ．Ｂ．著（１９９０）。ＣＤ４がＨＩＶ１又はＨＩＶ１ｇｐ１２０に結合後はＴ細胞チロシンたんぱく質キナーゼのシグナリング及びカルシウムの可動化はみられず。ネイチャー３３４８：５５７−５６０。１４．ヒブロッツＣ．、マゼロールズＦ．、スーラＭ．、ファガードＲ．、グレイトンＳ．、メロックＳ．、スカリーＲ．Ｐ．、フィッシャーＡ．著（１９９３）。ヒト免疫不全ウィルスｇｐ１２０及び由来ペプチドはヒトＣＤ４Ｔリンパ球中のたんぱく質チロシンキナーゼｐ５６^lCkを活性化する。ヨーロッパ免疫学ジャーナル２３：６００−６０７。１５．カウフマンＲ．、ラロッシュＤ．、バックナーＫ．、フコーＦ．、ラッドｃ．、リンドシャウＣ．、ルドウィッヒＰ．ホアＡ．、オベルディスＥ．、コップＪ．、コーナーＩ．Ｊ．、レプケＨ．著（１９９２）。ＨＩＶ１表面たんぱく質ｇｐ１２０はＴ細胞中の膜内外シグナル形質導入には作用しない。エイズジャーナル１５：７６０−７７０。１６．オーロフＧ．Ｍ．、ケネディーＭ．Ｓ．、デイソンＣ．、マクダガルＪ．Ｓ．著（１９９１）。ＣＤ４Ｔ細胞に結合しているＨＩＶ−１はＣａ²⁺ の流入を誘発したりたんぱく質チロシンキナーゼの活性化を促したりしない。エイズ研究ヒトレトロウィルス７：５８７−５９３。１７．デイビッドＪ．フィップス、ペネロープリード−ドゥーブ、ダグラスＫ．マクファデン、ジョンＰ．パイオブサン、ゴードンＢ．ミルズ、ドナルドＲ．ブランチ著（１９９５）。ＨＩＶｇｐ１２０のオクタペプチド類似体は活性化した末梢血リンパ球中のたんぱく質チロシンキナーゼ活性を調節する。免疫学臨床実験１００：４１２−４１８。１８．ウェイＸ．、ゴッシュＳ．Ｋ．、テイラーＭ．Ｅ．、ジョンソンＶ．Ａ．、エミニＥ．Ａ．、ドイツＰ．、リフソンＪ．Ｄ．、ボンホーファーＳ．、ナバックＭ．Ａ．、ハーンＢ．Ｈ．、サーグＭ．Ｓ．、ショーＧ．Ｍ．著（１９９５）。ヒト免疫不全ウィルス１型の感染におけるウィルス動態。ネイチャー（１９９５）３７３：１１７−１２２。１９．ペレルソンＡ．Ｓ．、ニューマンＡ．Ｕ．、マーカビッツＭ．、レオナードＪ．Ｍ．、ハッド著（１９９６）。生体：ビリアンクリアランス率、感染した細胞の寿命、及びウィルス生成時間におけるＨＩＶ動態。サイエンス２７１：１５８２−１５８６。発明の概要本発明の目的は、ＨＩＶの大変早期の検出のための新規な診断的及び定量的検定法であって、従来の方法にある前述の制限を克服した検定法を提供することである。従って、本発明はその最も広い態様において、ＨＩＶに感染していない標準的集団に比較したときのシグナル形質導入媒介物質の活性又はレベルの変化を検出するステップを含む、ＨＩＶ感染を早期に検出する方法を提供する。本明細書で用いるときの「シグナル形質導入媒介物質」という表現は、細胞表面から核へシグナルが形質導入され、その結果、遺伝子転写、たんぱく質生成及び発現、細胞増殖又は細胞遊走、エフェクタ分子の遊離、食細胞活動又はエフェクタ機能の発現で計測される細胞活性化が起きるときに、これに関わる分子を意味するものである。シグナル形質導入媒介物質にはキナーゼ及びホスファターゼ等の酵素が含まれる。ある酵素シグナル形質導入媒介物質の活性変化とは、その酵素の触媒機能率が、影響を受けていない対照集団中におけるその酵素の平均触媒機能に比較したときに、増加又は減少していることとして定義される。ある酵素シグナル形質導入媒介物質のレベル変化とは、その酵素の絶対レベル又は量が、影響を受けていない対照集団中におけるその酵素の平均レベルに比較したときに増加又は減少していることとして定義される。本発明の方法は、ＨＩＶの影響下にあるときのチロシンキナーゼ、セリン− トレオニンキナーゼ及びチロシン−セリン−トレオニンキナーゼ、そして特にＳｒｃたんぱく質チロシンキナーゼ系の仲間、つまりＳｒｃ、ｙｅｓ、ｆｙｎ（ｐ５９^fyn）、ｌｃｋ（ｐ５６^lCk)、ｌｙｎ、ｆｇｒ、ｈｃｋ、ｂｌｋ及びｙｒｋや、ｃｓｋたんぱく質チロシンキナーゼ系の仲間、つまりｃｓｋ及びｃｔｋ（ｌｓｋ又はｎｔｋとしても知られる）の活性又はレベルの変化を検出するのに応用可能であると好ましい。本発明の方法は更に、ＨＩＶの影響下にあるときのたんぱく質チロシンホスファターゼ、特にＣＤ４５関連ホスファターゼ及びＳＨＰ−１の活性又はレベルの変化を検出するのに応用可能である。本発明の方法は体液を用いた検出に利用が可能であり、該体液には血清、プラズマ血液細胞溶解産物、尿又は唾液媒体が含まれるがこれらに限定されるものではない。血液細胞溶解産物は、実際には体液中に存在する血液細胞から作成されるが、これに拘らず本明細書及び請求の範囲においては血液細胞溶解産物は体液の定義に含まれるものとする。本発明は、好ましくは、Ｔリンパ球を含む細胞の活性化に関連する酵素であるｓｒｃ系たんぱく質チロシンキナーゼの調節に関連するとよい。驚くべきことに、ＨＩＶ抗体陽性の無症状の患者のｐ５９^fynたんぱく質量は未感染の対照に比較して減少しているにもかかわらず、このような患者のｐ５９^fynキナーゼ活性レベルはＨＩＶ陰性の対照のそれの１２倍であることを我々は発見した。これらの患者の血漿中のＦＹＮキナーゼ活性もまた、未感染の対照に比較して増加している。細胞が試験管内でＨＩＶに感染すると、キナーゼ活性のレベルは感染後３０分以内に増加する。このようなキナーゼ活性の誘発動態はＨＩＶに感染した細胞の初期反応として顕れる。理論に縛られる訳ではないが、ｓｒｃ系のたんぱく質チロシンキナーゼｐ５９^fynの活性はＨＩＶに感染した人のリンパ球においてその血清状態に関係なく上昇すると我々は考える。たんぱく質チロシンキナーゼ活性化を検出するのに試験管内免疫複合体キナーゼ検定を利用すると、血清陰性のＨＩＶ感染者を判別することができる。たんぱく質チロシンキナーゼ活性化はＨＩＶ感染に対する細胞レベルでの反応であるため、ＨＩＶ感染が全身に至った直後に、急性のレトロウィルス症候群と同様、末梢血液でキナーゼ活性が上昇することとなる。この方法をＨＩＶ感染の検査ツールとして用いると、ＨＩＶ感染の検出の空白期間を数日に減少させることができる。我々は、Ｂ型肝炎（ｎ＝６）ウィルス、Ｃ型肝炎（ｎ＝７）ウィルス、ＣＭＶ（ｎ＝５）に感染した患者又は未感染の対照（ｎ＝３４）のいずれにおいてもキナーゼ活性に変化がなかったことを発見している。このデータは、キナーゼ活性の上昇はＨＩＶ感染に対する特異的反応であるという仮説と一致するものである。コーエン氏他は（１１）、試験管内でＨＩＶに感染した細胞のホスホチロシンレベルは、ＰＴＫが活性化した結果として上昇したことを実証している。この分権では、生体内での活性は調べられておらず、また個別のＰＴＫの活性に対するＨＩＶ感染の作用も調べられていない。ＨＩＶ血清陰性感染を検出する現在の方法は血漿中のＨＩＶＲＮＡを検出するものである。リンパ球中で活性化したたんぱく質チロシンキナーゼを検出することは、血漿又は血清中のＨＩＶ量からは独立しているであろうし、また技術的又は学問的にもＱＣ−ＰＣＲやｂＤＮＡ法とは関連していない。ＨＩＶ特異抗体を検出する現在の方法はＥＬＩＳＡ及び／又はウェスタン・ブロット技術を用いており、血清陽性のＨＩＶ感染を検出できるに過ぎない。これらの技術のいずれもリンパ球中の活性化たんぱく質チロシンキナーゼに関係するものではない。本発明で用いられる定量的キナーゼ検定法は従来の検定法の制限を克服するものである。バキュテイナＰＣＴ試験管で分離されたＰＢＭＣを用いたり、又は全血溶解産物を用いたり、あるいは血漿／血清を用いることができるため、密度勾配媒体は不要である。ここで説明する両方の定量的キナーゼ検定とも、顕微ビード又は９６ウェルマイクロタイタ皿に直接結合させた抗ＰＴＫ抗体を用いる。これらの抗体は標準化されたロットで作成されており、免疫沈降で洗い流される可能性がないため、テスト間変動性を防止できる。加えて、これらの工程は既存のキナーゼ検定に比べて少ないため、ふるい分け検査になじむ簡単な方法である。本発明の実施にあたって用いられる方法は、血清陰性のＨＩＶ感染の早期検出だけでなく、抗ＨＩＶ抗体が存在する血清転化後の無症状感染の検出にも利用可能である。本発明の好適な方法はＨＩＶ感染後のシグナル形質導入媒介物質の活性又はレベルの増加を検出するものであるが、本発明には、媒介物質の活性又はレベルの減少を検出する方法も含まれる。ＰＴＫｃｓｋは、すべてのｓｒｃ系ＰＴＫのキナーゼ活性を、Ｃ端にある否定的調節を行なうチロシンをリン酸化することで下方調節することが知られている（Chow LM et al(1992)Nature 365:156;Imamoto A and Sopiano Ｐ(1993)Cell73 :1117-1124）。ここで示すように、ｓｒｃ系ＰＴＫの活性はＨＩＶ感染後増加するため、理論に縛られる訳ではないが、ｃｓｋの活性及びレベルがＨＩＶ感染後変化することで、観察される通りのｓｒｃ系ＰＴＫの活性の増加がもたらされるのではないかと我々は考える。ホスホチロシンホスファターゼＣＤ４５及びＳＨＰ−１は、すべてのｓｒｃ系ＰＴＫを、Ｃ端にある否定的調節を行なうチロシンを脱リン酸化することで活性化する（１０）。ここで示すように、ｓｒｃ系ＰＴＫの活性はＨＩＶ感染後増加するから、理論に縛られる訳ではないが、ＣＤ４５及びＰＴＰ１Ｃの活性及びレベルがＨＩＶ感染後に変化することで、観察されるようなｓｒｃ系ＰＴＫの活性の増加がもたらされるのではないかと我々は考える。本発明のもう一つの重要な態様は、チロシンキナーゼ活性によりＨＩＶ感染を診断する際に血漿及び／又は血清媒体を使用することである。細胞外液におけるＰＴＫ活性を初めて開示していると我々が考えるものの中で、未感染の対照（ｎ＝５）と比較すると、ＨＩＶに感染した患者（ｎ＝５）から採った血漿中のｆｙｎ−ＰＴＫ活性の方が高いことを我々は明らかにしている。ＨＩＶ感染を診断するのに血漿及び／又は血清を使用することで、血液溶解産物を加工する必要がなくなり、従って本発明の方法は今日までに知られたものの中で最もストレートなＰＴＫ検定法となっている。更なる態様では、本発明はヒトの体液中に存在する特異的酵素シグナル形質導入媒介物質を検定する方法を提供するものであり、該方法は、（Ａ）一つ又はそれ以上の前記酵素に対する抗体と、遮断薬、好ましくはたんぱく質、好ましくはエノラーゼとを固形マトリックスに固定するステップと、（Ｂ）前記酵素が前記体液中で結合するように、該固定された抗体を前記体液試料に暴露して免疫複合体を形成させると共に、以下、（ａ）（ｉ）前記免疫複合体を、ＡＴＰ及び標識付けされた抗ホスホチロシン抗体の混合液に暴露し、前記標識が、酵素、蛍光性標識、放射性標識及びこれらの標識のいずれかを用いたアビジン／ビオチン系から選択され、それにより前記免疫複合体及び前記遮断薬のチロシンリン酸化を達成し、（ｉｉ）標識付けされた抗ホスホチロシンをリン酸化したチロシンに結合させ、（ｉｉｉ）結合した抗ホスホチロシン抗体の量を計測するステップか、（ｂ）（ｉ）前記免疫複合体を、チロシンリン酸化ポリペプチドとマラカイトグリーンとの混合液に暴露し、それにより前記リン酸化チロシンからリン酸塩を切り取って遊離したリン酸塩を提供し、（ｉｉ）前記遊離したリン酸塩をマラカイト・グリーンに反応させることで色の変化を行なわせ、（ｉｉｉ）分光光度計で前記色の変化を測定するステップか、（ｃ）（ｉ）前記免疫複合体を、前記免疫複合体中の前記結合した酵素に特異的な標識付けされた抗体に暴露し、前記標識が、酵素、蛍光性標識、放射性標識及びこれらの標識のいずれかを用いたアビジン／ビオチン系から選択され、それにより標識付けされた抗体の抗原に対する結合を達成し、（ｉｉ）結合した標識付けされた抗体の量を測定するステップのうちいずれかから選択される一つ又はそれ以上の処理を行なうステップと、（Ｃ）処理（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）から得られた前記酵素シグナル形質導入媒介物質のレベル及び活性を未感染の対照の標準集団と比較するステップとを特徴とする。更に別の態様では、本発明はヒトの体液中に存在する特異的酵素シグナル形質導入媒介物質を検定するための器具を提供するものであり、前記器具は、一つ又はそれ以上の前述したステップを行なうのに必要な一つ又はそれ以上の試薬を含む。図面の簡単な説明本発明をより良く理解されんために、以下、次の図面を参照しながら例としてのみ好適な実施例を説明するが、図において図１は、ＨＩＶ、Ｂ型及びＣ型肝炎、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）に感染した患者及び未感染の対照から得たＦＹＮチロシンキナーゼ活性の表である。図２は、試験管内ＨＩＶ感染後の、時間経過につれたＦＹＮＰＴＫ活性の表である。図３は、ＨＩＶに感染した患者及び未感染の対照におけるＦＹＮたんぱく質レベルの表である。図４は、無症状のＨＩＶに感染した患者及び未感染の対照における血漿中のＦＹＮ活性の表である。図５は、ジャーカット中のｓｒｃ系キナーゼの活性に対するＨＩＶ感染の影響を示す表である。図６は、本発明に基づく免疫検定法を描いた図である。好適な実施例の詳細な説明免疫複合体キナーゼ検定：全血を採取し、ＰＢＭＣをフィコールハイパークを用いた密度勾配遠心分離法により分離した。洗浄後、分離した細胞を４℃の低温ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１％のＮＰ−４０、０．１％のＳＤＳ、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨは７．３、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５０μＭ、ＺｎＣｌ₂、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＰＭＳＦ）で溶解させた。細胞溶解産物は１．５ｍＬのエッペンドルフ型試験管に移し、１０分間１０，０００ｇで遠心分離して粒子状物質を除去した。この溶解産物を、予め抗ｐ５９^fynにコンプレックスさせた（原語：complexed）たんぱく質Ａ−セファロースＣＬ４Ｂ（ファーマシア社製）と混合した。この混合液を４℃で１時間回転させて、細胞溶解産物中に含まれた問題のたんぱく質を免疫沈降させた。この免疫沈降物をＲＩＰＡで４回、更にキナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨは７．２３、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＭｎＣｌ₂、０．５％のＮＰ−４０）で更に４回洗浄した。次に各免疫沈降物を、５μＣｉの（γ³²Ｐ）ＡＴＰ（カリフォルニア州、アービン、ＩＣＮバイオメディカルズ社製）と共に２０μＬのキナーゼ緩衝液中で、２ μｇの酸処理したエノラーゼを加えて又は加えない状態で３７℃で１０分間インキュベートした。（γ³²Ｐ）ＡＴＰと共にインキュベートした後、還元ＳＤＳゲル試料緩衝液をこの反応混合液に加え、試料を１０分間沸騰させた。試料を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、上澄みの³²Ｐで標識付けされたたんぱく質を、１２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリアクリルアミドを含有するゲルを用いたＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により分離した。ゲル分離したたんぱく質を電気泳動法によりイモビロン・フィルタ（マサチューセッツ州ベッドフォード、ミリポア社製）に移し、１ＭのＫＯＨで５６度で２時間処理し、ホスホセリン及びホスホトレオニンを含むたんぱく質の量を加水分解により減らした後、オートラジオグラフィを行なった。エノラーゼの帯のリン酸化の程度をデンシトメトリにより定量化した。ウェスタン・ブロット分析：（上記のキナーゼ検定から）電気泳動法により³² Ｐで標識付けされたたんぱく質を移したイモビロン・フィルタを、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０１％のＮａＮ₃、ｐＨは８．２（遮断溶液）中において５％のスキムミルク粉末で一晩遮断した。次にこれらのブロットを、単クローン抗ｐ５９^fyn（トランスダクション・ラブズ社製）の遮断溶液中、１：２５０の希釈度で４℃で１時間インキュベートした。このブロットをＴＢＳで洗浄し、ヒツジ抗マウスＩｇＧ・カラシペルオキシダーゼ結合体を４℃ で１時間、最終希釈度１：２５００まで加えた。ＴＢＳを用いた洗浄後、ブロットをエンハンスド化学発光法（アマーシャム社製）で展開させ、ｆｙｎ帯域の強度をデンシトメトリで定量化した。末梢血単核細胞（マクロファージ、Ｂリンパ球及びＴリンパ球）を９人の無症状のＨＩＶ感染患者の血液から分離したが、このときの平均ＣＤ４細胞は６２３ ±６１セル／μｌであった。５×１０⁶ＰＢＭＣから得た溶解産物を、ｐ５９^fyn に対して特異的な抗体で免疫沈降させ、キナーゼ活性の程度を、外来の基質エノラーゼのリン酸化の程度を測定する試験管内免疫複合体キナーゼ検定で調べた。ｆｙｎたんぱく質の量はウェスタン・ブロット法で調べた。キナーゼ活性及びたんぱく質含有量は両方ともデンシトメトリにより定量化し、キナーゼ：たんぱく質の比率を判定し、ＡＩＤＳ患者（ｎ＝４）、ＨＩＶ未感染の対照被験者（ｃｔｒｎ、ｎ＝３４）、Ｂ型肝炎ウィルス感染患者（ｎ＝６）、Ｃ型肝炎感染患者（ｎ＝７）及びＣＭＶ感染患者（ｎ＝５）から採取した５×１０⁶のＰＢＭＣのそれと比較した。１０⁷のジャーカット（ＣＤ４陽性Ｔ細胞株）をＨＩＶ_IIIBに感染させ、示したように感染後さまざまな時点で回収した。細胞を溶解させ、溶解産物をｐ５９^fyn に対する抗体で免疫沈降させてキナーゼ活性の程度を試験管内免疫複合体キナーゼ検定で調べた。キナーゼ活性をデンシトメトリで定量化し、未感染のジャーカットのそれと比較した。図５を参照すると、この表はＨＩＶ感染によりジャーカット中のｓｒｃ系キナーゼの活性が増加することを示すものである。１０⁷ のジャーカット（−）又はＨＩＶに感染してから２４時間のジャーカット（＋）をＲＩＰＡ溶解緩衝液中に溶解させた。抗ｌｃｋ、抗ｆｙｎ、又は抗ｓｒｃ抗体で免疫沈降させた溶解産物を試験管内免疫複合体キナーゼ検定してキナーゼ活性を調べた。図４を特に参照して説明すると、５人の無症状ＨＩＶ感染患者（平均ＣＤ４細胞数は６２３±６１セル／μｌ）と５人のＨＩＶ未感染の対照者の血液から血漿を分離した。この血漿をたんぱく質Ａでインキュベートして免疫グロブリンを取り除き、免疫グロブリンを除かれたこの血漿を、たんばく質Ａ−セファロースに結合させたｐ５９^fyn特異的抗体で免疫沈降させた。外来の基質エノラーゼの（デンシトメトリで定量化した）リン酸化程度を測定する試験管内免疫複合体キナーゼ検定でキナーゼ活性の程度を調べた。無症状の患者と対照被験者との間のキナーゼ活性中間値の差を独立ｔテストで調べると統計学的に著しい差であった（ｐ＜０．０５）。図５は、Ｔ細胞株が試験管内でＨＩＶに感染すると、テストを受けた三つのＰＴＫすべての活性が高まることを示すものである。ＰＴＫの活性化は、ｐ５０^cs ^k 及び、ＳＨＰ−１等のホスファターゼやＣＤ４５に関連したホスホチロシンホスファターゼ等のキナーゼにより調節を受ける（１０）。ＨＩＶ感染により三つのＰＴＫすべてが活性化するために、ＨＩＶにより、ホスファターゼ又はキナーゼ等の調節酵素を活性化することでＰＴＫが活性化することになる。従って、ＣＤ４５及びＳＨＰ−１を含むホスファターゼや、ｐ５６^lck、ｐ５９^fyn、ｐ６０^c ^-src 及びｐ５０^cskを含むキナーゼの活性の変化により、ＨＩＶ感染を診断できることとなる。表１は以下の方法のステップを順に示すものである。（Ａ）はたんぱく質チロシンキナーゼ活性の上昇を調べるべく本発明で用いられる方法の実施例、（Ｂ）及び（Ｃ）は現在利用の可能な従来技術による検出テスト法であり、同表において１は半定量的な結果を出すものであり、２は、当該ステップには研究者による誤差が生じることがあることを示すものである。以下の方法は、本発明をどのように実施できるかについて表１を参照しながらより詳細に指示かつ例示するものである。方法Ａ１．静脈穿刺により全血を採取する。２．密度勾配遠心分離によりＰＢＭＣを分離する。３．分離されたＰＢＭＣを等張液で三回洗浄する。４．界面活性剤を基にした溶解緩衝液でＰＢＭＣを溶解させる。５．遠心分離して粒子状物質を取り除く。６．上記ステップ５で得た上澄み液を、予め作成してあるたんぱく質Ａセファロースビードに結合させたＰＴＫに対する抗体を含む免疫結合体を用いて、４℃ で少なくとも１時間、免疫沈降させる。７．上記ステップ６で得た免疫複合体を（上記ステップ４で得た）溶解緩衝液で４回洗浄する。８．ステップ７で得た免疫複合体をキナーゼ緩衝液で４回洗浄する。９．免疫複合体に（γ³²Ｐ）ＡＴＰ及びエノラーゼを加える。１０．３７℃で１０分間インキュベートする。１１．還元ＳＤＳ−試料緩衝液を加えると共に試料を１０分間沸騰させて反応を停止させる。１２．試料を１０分間遠心分離して粒子状物質を取り除く。１３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（一晩）により問題のたんぱく質を分離する。１４．分離したたんぱく質を電気移動（５時間）によりナイロン膜に移動させる。１５．フィルムを膜に暴露する（時間を変えて）。１６．フィルムを展開させる。１７．問題のたんぱく質帯域を探し出す。１８．デンシトメトリによりスキャンしてキナーゼ活性を半定量化する。１９．膜を５％のスキムミルク中に置いて遮断する（２時間）。２０．単クローン抗体を用いて問題の全たんぱく質についてウェスタン・ブロットを行なう（最低２時間又は一晩）。２１．膜を洗浄し、ＧＡＭ−ＨＲＰでインキュベートする（２時間）。２２．膜を洗浄し、エンハンスド化学発光法を行い、フィルムを暴露して問題のたんぱく質を視覚化する。２３．デンシトメトリを行なって問題のたんぱく質のレベルを半定量化する。２４．キナーゼ活性対たんぱく質レベルの比率を計算する。方法Ｂ７．免疫複合体を４回洗浄して希釈緩衝液中に再懸濁させる。８．５μｌの検定緩衝ストック液、５μｌの基質ペプチドストック液、及び（上記ステップ７で得た）１０μｌの免疫沈降物をポリプロピレン製のエッペンドルフ試験管内で混合して同混合液を氷上に維持する。盲験として基質ペプチドストック液の代わりに５μｌの水を用いる。９．５μｌ（５０μＣｉ）の（γ³²Ｐ）ＡＴＰを加えて反応を開始させ、この反応混合液を最大３０分間、３０℃でインキュベートする。１０．１０μｌの５０％酢酸を加えて反応を停止させる。１１．試料を５分間遠心分離する。１２．各テスト及び盲験から２５μｌの上澄み液を１．５ｃｍ×１．５ｃｍのｐ８１ホスホセルロースフィルタ紙ディスクに滴下する。１３．フィルタ紙ディスクを過剰なリン酸で４回、そして過剰なアセトンで１回洗浄する。１４．ディスクを乾燥させる。１５．ディスクをシンチレーション・バイアルに入れ、シンチレーション・カウンタで放射活性を計測する。方法Ｃステップ１−６は方法Ａ及びＢとまったく同じ。７．免疫沈降物を反応緩衝液で４回洗浄する。８．ステップ１−７の前に、又は同時に、適したビオチニルチロシンキナーゼ基質ペプチドを、ニュートラビジンの被膜を形成し予め遮断したマイクロウェル細片に加える。９．細片を洗浄緩衝液で洗浄する。１０．上記７から得た免疫複合体及び非放射性ＡＴＰを加える。１１．反応を進行させる。ペプチド基質はチロシン残基でリン酸化することとなる。１２．細片を洗浄緩衝液で洗浄する。１３．ＨＲＰで標識付けした抗ホスホチロシン抗体を加える。１４．抗体をホスホチロシンを含有する残基に結合させる。Ｐを展開させる。１６．分光光度分析計を用いて４５０ｎｍで光学密度を測定する。注意：１．この検定はキナーゼ活性を検出する。２．この検定はホスファターゼ活性を検出する。３．この検定は酵素のたんぱく質レベルを検出する。４．標識は酵素、蛍光性、放射性又はこれらの標識のうちのいずれかを用いたビオチン／アビジン結合体系でよいであろう。表２は、キナーゼ及びホスファターゼの活性又はたんぱく質レベルを検定する本発明に基づく酵素シグナル形質導入媒介物質検定の好適な方法を含む概要ステップを示す。遮断薬という用語は、抗体を固定のマトリックス担体に結合させた後に、未結合のまま残った部位を遮断する化合物を意味する。抗体の固定マトリックスへの結合の間、すべてのマトリックス部位が抗体で被膜される訳ではない。遮断薬は、その後使用しようとするテスト試料中の基質の非特異的結合を防ぐ目的でこれらの未結合のマトリックス部位を遮断するために用いられるものである。遮断薬は化合物、好ましくはたんぱく質、より好ましくは酵素シグナル形質導入媒介物質の基質、さらにより好ましくはエノラーゼであるとよい。酵素たんぱく質レベルも計測するが、これは、ＦＹＮたんぱく質のレベルはＨＩＶ感染した患者の細胞中では、増加するＦＹＮのキナーゼ活性とは対照的に減少する（図３）からである。さらに、細胞内キナーゼたんぱく質のレベルが減少するのとは対照的に、ＨＩＶに感染した患者の血漿及び血清中のＦＹＮキナーゼたんぱく質は、血液細胞の抗体が増加するために増加する。ＨＩＶに感染した患者のリンパ球の半減期は未感染の患者のそれよりぐっと短いが、これはＨＩＶの細胞溶解作用のためである（１８，１９）。これらの感染リンパ球は血漿中で溶解し、かつ活性キナーゼ及びホスファターゼを含むそれらの細胞内含有物を蓄積させるため、血漿中の酵素たんぱく質のレベル及び酵素活性が上昇する。酵素活性が血漿中で上昇するのである。表２を参照すると、酵素がキナーゼである場合、キナーゼの免疫沈降に引き続き、０．２５μｍｏｌのＡＴＰ及び１．０μｇの標識付けした抗ホスホチロシン抗体の組合せを、暖かいキナーゼ緩衝液中に加えて１０分間インキュベートすることにより、キナーゼ活性を検出する。この標識は酵素でも、蛍光性、放射性又はこれらの標識を用いたアビジン／ビオチン系でもよい。余分なＡＴＰ及び抗ホスホチロシン抗体を洗い流し、酵素の場合には、適した基質を加える。結果を適した検出モニタ、例えば分光光度計、フルオリメータ又はシンチレーションカウンタで読み取る。酵素がホスファターゼの場合、ホスファターゼの免疫沈降に引き続き、チロシンリン酸化ポリペプチド及びマラカイト・グリーンの混合液を加えて１０分間インキュベートすることでホスファターゼ活性を検出する。ホスホチロシンから切り取られた遊離したリン酸塩を検出したときのマラカイト・グリーンの色の変化を、６５０−６６０ｎｍでプレート／ビードを読み取って評価する。酵素たんぱく質のレベルを検出するには、標準的なＥＬＩＳＡ技術を用いる。免疫沈降後、その酵素に対して特異的な標識付けをされた第二抗体と共にインキュベートすることで酵素を検出する。標識及びそれらの検出方法は上述した通りである。以下、図６を参照しながら説明するが、同図は９６ウェルの検定においてＥ＝エノラーゼＥ−ｐ＝リン酸化エノラーゼを示す。定量的キナーゼ検定この技術は説明したような標準的なＥＬＩＳＡ技術に基づくものである。抗体を０．１Ｍの炭酸塩緩衝液、ｐＨは９．６中に懸濁させ、ポリスチレンの固形の担体と共に室温で一晩インキュベートして抗体をウェルに結合させることで、抗酵素をポリスチレンのマイクロタイタプレート又はビードに結合させる。抗ｆｙｎの結合後、このウェルを炭酸塩緩衝液中で洗浄し、エノラーゼを加えて未結合の部位を遮断するが、これにより、エノラーゼは遮断薬としても、またキナーゼ活性にとっての外来の基質としても作用させることができる。２００μｌの試料をウェル中で１時間、４℃でインキュベートしてｆｙｎをテスト試料から免疫沈降させる。テスト試料。９６ウェルプレート検定又はビード検定のいずれにおいても、血漿及び／又は血清を用いてよい。１０倍のＲＩＰＡ溶液を１：１０の希釈度で全血に混合して全血溶解産物を作成し、ビード検定用のテスト試料として用いる。ベクトン・ディッキンソン社から市販のＰＣＴバキュテイナ試験管を用いて作成したＰＢＭＣをＲＩＰＡ中に溶解させて９６ウェルプレート検定用のテスト試料として用いる。いずれの検定においても尿又は唾液を用いてもよい。血漿中のｆｙｎキナーゼ活性を以下のようにして調べる。１．０ｍｌの血漿（ヘパリン添加静脈血から分離）をまず、細胞表面たんぱく質Ａを含有する黄色ブドウ球菌のスラリと共にインキュベートして血漿中に存在する免疫グロブリンの大半を取り除いた。免疫グロブリン除去した血漿を抗ｆｙｎで免疫沈降させ、エノラーゼのあるところでキナーゼ検定を行なってｆｙｎキナーゼ活性のレベルを調べた。ｆｙｎキナーゼをデンシトメトリで分析してキナーゼ活性を調べた。図４に示すデータは、調査を受けた各患者群、つまりＡｓｎ＝無症状のＨＩＶ感染者、ｃｔｒｌ＝未感染の対照のうちの５人を示すものである。図１では、ＦＹＮチロシンキナーゼ活性が、ＨＩＶに感染した患者では上昇しているのに対し、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎ウィルス、ＣＭＶに感染した患者又は対照では上昇していないことが分かる。末梢血単核細胞（マクロファージ、Ｂリンパ球及びＴリンパ球）を、９人の無症状ＨＩＶ感染患者（平均ＣＤ４細胞数は６２３±６１セル／μｌ）及び４人のＡＩＤＳ患者（平均ＣＤ４細胞数は１５±４セル／μｌ）の血液から分離した。５×１０⁶のＰＢＭＣから得た溶解産物を５９^fynに対して特異的な抗体で免疫沈降させ、キナーゼ活性の程度を、外来の基質エノラーゼのリン酸化の程度を測定する試験管内免疫複合体キナーゼ検定により調べた。ｆｙｎたんぱく質の両派ウェスタン・ブロットで調べた。キナーゼ活性及びたんぱく質含有量は両方ともデンシトメトリで定量化し、ＦＹＮ特異的キナーゼ活性（キナーゼ活性：キナーゼたんぱく質の比）を調べて、ＨＩＶ未感染の対照被験者（ｃｔｒｌ、ｎ＝３４）、Ｂ型肝炎ウィルス（ｎ＝６）又はＣ型肝炎ウィルス（ｎ＝７）に感染した患者、又はサイトメガロウィルス（ＣＭＶ、＝５）に血清陽性と出た患者から採った５×１０⁶のＰＢＭＣのそれと比較した。無症状の患者と対照被験者間（ｐ＝１．３２０×１０^-5）、及びＡＩＤＳ患者と対照被験者間（ｐ＝９．３６６×１０^-5 ）のキナーゼ活性中間値の違いは、独立ｔテストで調べたように、統計学的に大きな違いであった。図２は、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞株がＨＩＶに試験管内で感染すると感染後３０分以内にたんぱく質チロシンキナーゼ活性が上昇することを示す図である。図３は、生体内でＨＩＶに感染するとたんぱく質チロシンキナーゼのレベルが減少することを示す図である。以上、本発明を具体的な実施例を参照しながら詳細に説明したが、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく多様な変更及び改良を行なうことができることは自明であろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１０月２１日（１９９７．１０．２１）【補正内容】請求の範囲（翻訳文）１．体液中のシグナル形質導入媒介物質の活性又はレベルを、ＨＩＶに未感染の標準集団に比較したときの変化を検出するステップを含む、ＨＩＶ感染を早期に検出する方法。２．前記変化が増加である、請求項１に記載の方法。３．前記変化が減少である、請求項１に記載の方法。４．前記媒介物質がキナーゼである、請求項１に記載の方法。５．前記媒介物質がホスファターゼである、請求項１に記載の方法。６．前記キナーゼが、チロシンキナーゼ、セリン−トレオニンキナーゼ、チロシン−トレオニンキナーゼ及びチロシン−セリン−トレオニンキナーゼのいずれかから選択される、請求項４に記載の方法。７．前記媒介物質がｓｒｃ系のチロシンキナーゼである、請求項６に記載の方法。８．前記媒介物質がｃｓｋ系のチロシンキナーゼである、請求項６に記載の方法。９．前記媒介物質がｓｒｃ、ｙｅｓ、ｆｙｎ（ｐ５９^fyn）ｌｃｋ（ｐ５６^lCk )、ｆｇｒ、ｈｃｋ、ｂｌｋ、及びｙｒｋのいずれかから選択される、請求項７に記載の方法。１０．前記体液が血清、血漿、唾液、尿及び血液細胞溶解産物のいずれかから選択される、請求項１に記載の方法。１１．ヒトの体液中に存在する特異酵素シグナル形質導入媒介物質を検定する方法であって、（Ａ）一つ又はそれ以上の前記酵素に対する抗体と遮断薬とを固形マトリックスに固定するステップと、（Ｂ）前記酵素が前記体液中で結合するように、該固定された抗体を前記体液試料に暴露して免疫複合体を形成させると共に、以下、（ａ）（ｉ）前記免疫複合体を、ＡＴＰ及び標識付けされた抗ホスホチロシン抗体の混合液に暴露し、前記標識が、酵素、蛍光性標識、放射性標識及びこれらの標識のいずれかを用いたアビジン／ビオチン系から選択され、それにより前記免疫複合体及び前記遮断薬のチロシンリン酸化を達成し、（ｉｉ）標識付けされた抗ホスホチロシンをリン酸化したチロシンに結合させ、（ｉｉｉ）結合した抗ホスホチロシン抗体の量を計測するステップと、（ｂ）（ｉ）前記免疫複合体を、チロシンリン酸化ポリペプチドとマラカイトグリーンとの混合液に暴露し、それにより前記リン酸化チロシンからリン酸塩を切り取って遊離したリン酸塩を提供し、（ｉｉ）前記遊離したリン酸塩をマラカイト・グリーンに反応させることで色の変化を行なわせ、（ｉｉｉ）分光光度計で前記色の変化を測定するステップと、（ｃ）（ｉ）前記免疫複合体を、前記免疫複合体中の前記結合した酵素に特異的な標識付けされた抗体に暴露し、前記標識が、酵素、蛍光性標識、放射性標識及びこれらの標識のいずれかを用いたアビジン／ビオチン系から選択され、それにより標識付けされた抗体の抗原に対する結合を達成し、（ｉｉ）結合した標識付けされた抗体の量を測定するステップとのうちいずれかから選択される一つ又はそれ以上の処理を行なうステップと、（Ｃ）処理（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）から得られた前記酵素シグナル形質導入媒介物質のレベル及び活性を未感染の対照の標準集団と比較するステップとを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。１２．前記酵素媒介物質がキナーゼである、請求項１１に記載の方法。１３．前記酵素媒介物質がｆｙｎキナーゼである、請求項１２に記載の方法。１４．前記酵素媒介物質が、ｓｒｃ系のたんぱく質チロシンキナーゼの仲間である、請求項１１に記載の方法。１５．前記酵素が、媒介物質ホスファターゼ、特にＣＤ４５及びＳＨＰ−１から選択されたものである、請求項１１に記載の方法。１６．前記遮断薬がたんぱく質である、請求項１に記載の方法。１７．前記遮断薬がエノラーゼである、請求項１に記載の方法。１８．請求項１１に記載したステップのうち一つ又はそれ以上のステップを行なうのに必要な一つ又はそれ以上の試薬を含む、ヒトの体液中に存在する特異的酵素シグナル形質導入媒介物質を検定するための器具。１９．前記酵素媒介物質に特異的な抗体を有する基質を含む、請求項１８に記載の器具。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４５Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４５Ｓ 33/569 33/569 Ｈ 33/573 33/573 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フィップスデビッドジェイ. カナダエム５ジー２エル３オンタリオトロント、ユニバーシティアヴェニュー525、スイート 925

Claims

【特許請求の範囲】１．体液中のシグナル形質導入媒介物質の活性又はレベルを、ＨＩＶに未感染の標準集団に比較したときの変化を検出するステップを含む、ＨＩＶ感染を早期に検出する方法。２．前記変化が増加である、請求項１に記載の方法。３．前記変化が減少である、請求項１に記載の方法。４．前記媒介物質がキナーゼである、請求項１に記載の方法。５．前記媒介物質がホスファターゼである、請求項１に記載の方法。６．前記キナーゼが、チロシンキナーゼ、セリン−トレオニンキナーゼ、チロシン−トレオニンキナーゼ及びチロシン−セリン−トレオニンキナーゼのいずれかから選択される、請求項４に記載の方法。７．前記媒介物質がｓｒｃ系のチロシンキナーゼである、請求項６に記載の方法。８．前記媒介物質がｃｓｋ系のチロシンキナーゼである、請求項６に記載の方法。９．前記媒介物質がｓｒｃ、ｙｅｓ、ｆｙｎ（ｐ５９^fyn）ｌｃｋ（ｐ５６^lCk ）、ｆｇｒ、ｈｃｋ、ｂｌｋ、及びｙｒｋのいずれかから選択される、請求項７に記載の方法。１０．前記体液が血清、血漿、唾液、尿及び血液細胞溶解産物のいずれかから選択される、請求項１に記載の方法。１１．ヒトの体液中に存在する特異酵素シグナル形質導入媒介物質を検定する方法であって、（Ａ）一つ又はそれ以上の前記酵素に対する抗体と遮断薬とを固形マトリックスに固定するステップと、（Ｂ）前記酵素が前記体液中で結合するように、該固定された抗体を前記体液試料に暴露して免疫複合体を形成させると共に、以下、（ａ）（ｉ）前記免疫複合体を、ＡＴＰ及び標識付けされた抗ホスホチロシン抗体の混合液に暴露し、前記標識が、酵素、蛍光性標識、放射性標識及びこれらの標識のいずれかを用いたアビジン／ビオチン系から選択され、それにより前記免疫複合体及び前記遮断薬のチロシンリン酸化を達成し、（ｉｉ）標識付けされた抗ホスホチロシンをリン酸化したチロシンに結合させ、（ｉｉｉ）結合した抗ホスホチロシン抗体の量を計測するステップと、（ｂ）（ｉ）前記免疫複合体を、チロシンリン酸化ポリペプチドとマラカイトグリーンとの混合液に暴露し、それにより前記リン酸化チロシンからリン酸塩を切り取って遊離したリン酸塩を提供し、（ｉｉ）前記遊離したリン酸塩をマラカイト・グリーンに反応させることで色の変化を行なわせ、（ｉｉｉ）分光光度計で前記色の変化を測定するステップと、（ｃ）（ｉ）前記免疫複合体を、前記免疫複合体中の前記結合した酵素に特異的な標識付けされた抗体に暴露し、前記標識が、酵素、蛍光性標識、放射性標識及びこれらの標識のいずれかを用いたアビジン／ビオチン系から選択され、それにより標識付けされた抗体の抗原に対する結合を達成し、（ｉｉ）結合した標識付けされた抗体の量を測定するステップとのうちいずれかから選択される一つ又はそれ以上の処理を行なうステップと、（Ｃ）処理（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）から得られた前記酵素シグナル形質導入媒介物質のレベル及び活性を未感染の対照の標準集団と比較するステップとを特徴とする方法。１２．前記酵素媒介物質がキナーゼである、請求項１１に記載の方法。１３．前記酵素媒介物質がｆｙｎキナーゼである、請求項１２に記載の方法。１４．前記酵素媒介物質が、ｓｒｃ系のたんぱく質チロシンキナーゼの仲間である、請求項１１に記載の方法。１５．前記酵素が、媒介物質ホスファターゼ、特にＣＤ４５及びＳＨＰ−１から選択されたものである、請求項１１に記載の方法。１６．前記遮断薬がたんぱく質である、請求項１に記載の方法。１７．前記遮断薬がエノラーゼである、請求項１に記載の方法。１８．請求項１１に記載したステップのうち一つ又はそれ以上のステップを行なうのに必要な一つ又はそれ以上の試薬を含む、ヒトの体液中に存在する特異的酵素シグナル形質導入媒介物質を検定するための器具。１９．前記酵素媒介物質に特異的な抗体を有する基質を含む、請求項１８に記載の器具。