JP2000502357A

JP2000502357A - 血管内皮増殖因子活性の新規阻害剤、それらの使用法および製造法

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Publication number: JP2000502357A
Application number: JP9542429A
Authority: JP
Inventors: デイビス―スマイス，テリー・リン; チェン，ヘレン・シフェイ; プレスタ，レナード; フェラーラ，ナポレオン
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-05-07
Filing date: 1997-05-06
Publication date: 2000-02-29
Anticipated expiration: 2017-05-06
Also published as: EP2336322A1; US20090010933A1; US6897294B2; US20110300577A1; US8268313B2; US7771721B2; US20070128695A1; US6383486B1; US8273353B2; ES2267143T3; US9273113B2; DE69735942D1; DK0907733T3; US20050281831A1; US20030092604A1; EP1710254A3; EP1666499A3; ATE327327T1; JP3457330B2; EP0907733A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、血管内皮増殖因子（VEGF）レセプターflt-1およびKDR（ヒトKDRレセプターのネズミ相同体FLK-1を含む）に由来するアミノ酸配列を含む新規キメラVEGFレセプタータンパク質に向けられ、該キメラVEGFレセプタータンパク質はVEGFに結合し、その内皮細胞増殖および血管新生活性に拮抗する。また本発明は、それらキメラVEGFレセプタータンパク質をコードする核酸と発現ベクター、それら発現ベクターを保有する宿主細胞、それらタンパク質を含む医薬的に許容できる組成物、それらタンパク質の製造法、および望ましくない脈管形成と関係する状態の治療にそれらのタンパク質を使用する方法にも向けられる。

Description

【発明の詳細な説明】血管内皮増殖因子活性の新規阻害剤、それらの使用法および製造法発明の分野本発明は、血管内皮増殖因子（VEGF）レセプターflt-1、KDRおよびヒトKDRレセプターのネズミ相同体FLK-1に由来するアミノ酸配列を含む新規キメラVEGFレセプタータンパク質に向けられ、該キメラVEGFレセプタータンパク質はVEGFに結合し、その内皮細胞増殖および血管新生活性に拮抗する。本発明はそれらキメラ VEGFレセプタータンパク質をコードする核酸と発現ベクター、それら発現ベクターを保有する宿主細胞、それらタンパク質を含む医薬的に許容できる組成物、それらタンパク質の製造法、および望ましくない脈管形成と関係する状態の治療にそれらのタンパク質を使用する方法にも向けられる。発明の背景哺乳類血管系の二つの主要細胞成分は内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞は哺乳動物の全血管の内面の裏打ちを形成し、血液と組織の間に非血栓形成性界面を構成している。したがって内皮細胞の増殖は新しい毛細管と血管の発達にとって重要な成分であり、そしてまたそのような発達は哺乳類組織の成長および/ または再生にとって必須の過程である。内皮細胞増殖と血管新生の促進に極めて重要な役割を果たすことが示されている一タンパク質は、血管内皮増殖因子（VEGF）である。VEGFはもともとはウシ下垂体濾胞細胞または濾胞星（folliculostellate; FS）細胞の培養培地から同定精製されたヘパリン結合性内皮細胞増殖因子である。FerraraおよびHenzel,Bioc hem．Biophys．Res．Comm．161:851-858 (1989)。VEGFは見かけ上の分子量が約4 6kDaの二量体で、各サブユニットはそれぞれ約23kDaの見かけ上の分子量をもっている。ヒトVEGFは様々な組織で、それぞれが単一のRNA転写物の選択的スプライシングの結果として生じる複数のホモ二量体型（単量体あたり121、165、189 および206アミノ酸）として発現する。VEGF₁₂₁はヘパリンを結合しない可溶性分裂促進因子であるが、これより長いVEGFは長いものほどより強い親和力でヘパリンを結合する。生化学的分析から、VEGFが血管内皮細胞に強い分裂促進特異性を示すことがわかっている。例えばヒトVEGF cDNAによってトランスフェクトされた細胞の培養培地は毛細管内皮細胞の増殖を促進したが、対照細胞の培養培地はこれを促進しなかった。Leungら，Science 246:1306 (1989)。このようにVEGFは血管内皮細胞増殖と、既存の内皮からの新しい血管の形成を伴う過程である血管新生を促進することが知られている。したがってVEGFは、血管内皮細胞に対する増殖促進活性が重要な数多くの状態、例えば潰瘍、血管損傷および心筋梗塞などの治療に役立ちうる。しかし血管内皮増殖は一定の状況では望ましいのだが、その一方で、血管内皮増殖と血管新生は、腫瘍の増殖と転移、慢性関節リウマチ、乾癖、アテローム硬化、糖尿病性網膜症、水晶体後部線維増殖症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性、血管腫、移植された角膜その他の組織の免疫拒絶反応、および慢性炎症を含む種々の疾患と障害の重要な成分でもある。これらの障害に冒された個体の場合はいずれも、VEGFタンパク質の内皮増殖活性を阻害すること、もしくは少なくともこれを実質的に低下させることが望まれるのは明らかである。具体的に腫瘍細胞増殖の場合について述べると、血管新生は過形成から新形成への移行と、増殖する充実性腫瘍への栄養の提供にとって、極めて重要であると思われる。Folkmanら，Nature 339:58 (1989)。また血管新生は腫瘍が宿主の血管床と接触することを可能にし、その宿主の血管床は腫瘍細胞の転移経路になりうる。腫瘍転移における血管新生の役割は、例えばヒト浸潤性乳がんの組織切片中の微小血管の数および密度と、実際に遠隔転移が存在することとの相関を示す研究によって立証されている。Weidnerら，New Eng1．Ｊ．Med 324:1 (1991)。したがって新形成性腫瘍の効果的治療法として考えうる一つの方法は、VEGFタンパク質の内皮増殖および血管新生活性を阻害または実質的に低下させることである。 VEGFの内皮増殖活性は、血管内皮細胞の表面だけに存在する2つの高親和性チロシンキナーゼレセプターflt-1とKDRによって媒介されることが知られている。 DeVriesら，Science 225:989-991 (1992)およびTermanら，Oncogene 6:1677-1 683(1991)。flt-1チロシンキナーゼレセプターとKDRチロシンキナーゼレセプターは共に、そのレセプターの細胞外リガンド結合領域を形成する7つの免疫グロブリン様（Ig様）ドメイン、そのレセプターをそれが発現した細胞の表面に固定する役割を果たす膜貫通領域、および「キナーゼインサート」によって分断された細胞内触媒チロシンキナーゼドメインを持つ。KDRレセプターはVEGFタンパク質だけを高い親和力で結合するが、flt-1レセプターはVEGFと有意な構造上の相同性を持つ分子である胎盤増殖因子（PLGF）をも結合する。細胞外リガンド結合領域に7つの Ig様ドメインを持つレセプターチロシンキナーゼ群のもう1つの要素としてFLT4があるが、これはVEGFまたはPLGFのレセプターでなく、別のリガンドVH1.4.5に結合する。VH1.4.5リガンドはVEGF関連タンパク質（VRP）またはVEG F-Cとして文献に報告されている。最近の遺伝子ノックアウト研究によって、flt-1レセプターとKDRレセプターが内皮細胞の増殖と分化に果たす役割はそれぞれ異なるようであるが、これらが共に哺乳類血管系の正常な発達には不可欠であることが証明された。すなわち、 VEGFタンパク質の内皮増殖および血管新生活性は、血管内皮細胞表面のflt-1 レセプターとKDRレセプターの細胞外リガンド結合領域への結合によって媒介される。 VEGFが血管内皮増殖と血管新生に果たす役割およびこれらの過程が多種多様な疾患と障害に果たす役割を考えると、VEGFの生理活性の1つまたはそれ以上を低下させる手段または阻害する手段を持つことが望ましい。したがって本発明は、VEGFタンパク質への結合を媒介するflt-1およびKDRレセプター細胞外リガンド結合領域の1または複数のIg様ドメインを同定し、その1または複数のドメインを別のタンパク質に由来するアミノ酸配列に挿入もしくは融合して「キメラVEGFレセプタータンパク質」を作出することを目的とする研究に基いている。本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質は内因性VEGFに結合し、それを不活化するので、内因性VEGF活性を低下させる手段もしくは阻害する手段となり、ひいては内皮細胞増殖と血管新生を縮小または阻止する手段となる。したがって本発明の目的は、flt-1レセプターとKDRレセプターの細胞外リガンド結合領域に由来するアミノ酸配列を含む新規キメラVEGFレセプタータンパク質であって、VEGFに結合しかつその活性を阻害しうるものを提供することである。本発明のさらなる目的は、本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質をコードする核酸、それらキメラタンパク質を発現させうる複製可能な発現ベクター、それら発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞、本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質を含む医薬組成物、それらキメラタンパク質を製造する方法、およびその必要がある個体の治療にそれらキメラタンパク質を使用する方法を提供することである。発明の要約上に広く定義した本発明の目的は、VEGFに結合しかつそれに対する阻害作用を発揮しうるキメラVEGFレセプタータンパク質を提供することによって達成される。ここに該キメラVEGFレセプタータンパク質は、flt-1および/またはKDRレセプター（またはKDRレセプターのネズミ相同体FLK-1）のIg様ドメイン1、2および3 もしくはそれらの機能的均等物を含む。好ましい態様として、本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質は、当該細胞外リガンド結合領域のIg様ドメイン1、2および3だけに相当するflt-1またはKDR レセプターアミノ酸配列を含有し、各Ig様ドメインは同じVEGFレセプターに由来する。しかし別の態様として本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質は、flt-1またはKDRレセプターの細胞外リガンド結合領域のIg様ドメイン1、2および3と、当該領域の残り4つの免疫グロブリン様ドメインの1またはそれ以上とを含む。使用されるIg様ドメインは好ましくは同じレセプターに由来するが、flt-1レセプターとKDRレセプターの両方に由来するIg様ドメインの組み合せにも用途があるだろう。本発明のもう1つの態様として、本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質は、少なくともFLT4レセプターのIg様ドメイン2がflt-1またはKDRレセプターのIg 様ドメイン2で置換されているFLT4レセプターの細胞外リガンド結合領域を含む。好ましくはFLT4レセプターのIg様ドメイン2だけをflt-1またはKDRレセプター由来の対応するIg様ドメインで置換するが、他のドメインも同様に置換できる。本発明のさらなる側面は、ここに記述するキメラVEGFレセプタータンパク質をコードする核酸配列とその機能的均等物に向けられる。そのような核酸には遺伝暗号の縮重ゆえに変種が存在しうることは当業者によく知られており、そのような核酸変種もまた本発明に包含される。さらなる別態様として本発明は、上述した種々のキメラVEGFレセプタータンパク質をコードする複製可能な発現ベクター、それら発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞、および製薬上許容できる賦形剤と混合された上述のキメラ VEGFレセプタータンパク質を含む組成物に関する。さらなる別態様として本発明は、所望のキメラタンパク質をコードする発現ベクターを適当な発現系に導入し、該タンパク質の発現を達成することによって上述のキメラVEGFレセプタータンパク質を製造する方法に関する。本発明のもう1つの側面は、不適当な脈管形成と関係する状態であって脈管形成と血管新生の阻止が望ましい場合の治療における本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質の使用を規定する。図面の簡単な説明図1は、flt-1、KDRおよびFLT4レセプターの細胞外リガンド結合領域のアミノ酸配列の整列を示している。アミノ酸は標準的な一文字指定で表わされている。 7つのIg様ドメインの整列が最もよく一致するようにダッシュ記号が挿入されている。記載した各レセプターの各細胞外リガンド結合領域の7つのIg様ドメインは、四角で囲まれた領域として表わされている。図2は、flt-1レセプターの細胞外リガンド結合領域内に存在する7つのIg様ドメインのそれぞれをオリゴヌクレオチド特異的突然変異導入法で欠失させる際に使用したオリゴヌクレオチドを表わしている。DNA配列中に作成した制限部位には下線が引いてあり、各制限部位はその下線付き配列上に記載されている。アミノ酸は標準的な一文字指定で表わされている。場合により、制限部位をオリゴヌクレオチド中に設計した時にアミノ酸が変化した。それらのアミノ酸変化には下線が引いてあり、その位置にあった元のアミノ酸がその下の括弧内に記載されている。図3は、無傷のflt-1/IgGキメラVEGFレセプタータンパク質と種々のflt-1/IgG ドメイン欠失キメラタンパク質の、VEGFリガンドに特異的に結合する能力を示している。結合効率は免疫活性（ir）F_c 5gあたりの総結合cpmとして表わされている。「wt」は無傷のflt-1/IgGキメラVEGFレセプタータンパク質を指す。「d1」〜「d7」はflt-1/IgGドメイン欠失キメラを指し、数字は欠失したIg様ドメインに対応する。図4は、無傷のflt-1/IgGキメラVEGFレセプタータンパク質と種々のflt-1/IgG ドメイン欠失キメラタンパク質の、VEGFリガンドに特異的に結合する能力を示している。結合効率は免疫活性（ir）F_c4.5ngあたりの総結合cpmとして表わされている。「flt-wtは無傷のflt-1/IgGキメラタンパク質を指す。「flt(1,2)」はIgG のF_cに融合したflt-1 Ig様ドメイン1および2だけを持つキメラタンパク質である。「flt(2)」はIgGのF_cに融合したflt-1 Ig様ドメイン2だけを持つキメラタンパク質である。「flt(2,3)」はIgGのF_cに融合したflt-1 Ig様ドメイン2および3だけを持つキメラタンパク質である。「flt(1,2,3)」はIgGのF_cに融合したflt-1 I g様ドメイン1、2および3だけを持つキメラタンパク質である。最後に「KDR(2)」は、KDRレセプターの細胞外リガンド結合領域のIg様ドメイン2だけがIgGのF_cに融合しているキメラVEGFレセプタータンパク質である。図5は、非標識VEGF競合剤の量を増やしながら測定した、無傷のflt-1/IgGキメラVEGFレセプタータンパク質とflt(1,2,3)欠失キメラに対するVEGFリガンドの結合率(%)を示している。「●」はflt(1,2,3)欠失キメラによる結合を表わす。「 ◆」は無傷のflt-1/IgGキメラタンパク質による結合を表わす。図6は、無傷のflt-1/IgGキメラVEGFレセプタータンパク質と種々のIg様ドメイン2「スワップ（交換）」突然変異体の、VEGFリガンドに特異的に結合する能力を示している。結合効率は免疫活性（ir）F_c 1ngあたりの総結合cpmとして表わされている。「flt-1」は元のflt-1/IgGキメラタンパク質を指す。「flt.d2」は Ig様ドメイン2が欠失しているflt-1/IgGキメラタンパク質を指す。「flt.K2」は、flt-1/IgGタンパク質のIg様ドメイン2がKDRレセプターのIg様ドメイン2に置き換えられている「スワップ」キメラタンパク質を指す。最後に「fltF4.2」は、f lt-1タンパク質のIg様ドメイン2がFLT4レセプターのIg様ドメイン2に置き換えられている「スワップ」キメラタンパク質を指す。図7は、種々のflt-1/IgG「スワップ」キメラタンパク質での非標識VEGF競合剤または非標識PLGF競合剤によるVEGF結合の阻害率(%)を示している。「flt」と「 KDR」はそれぞれ天然のflt-1レセプターと天然KDRレセプターを表わす。「flt.K 1」は、flt-1レセプターのIg様ドメイン1がKDRレセプターのIg様ドメイン1に置き換えられている「スワップ」キメラを指す。「flt.K2」は、flt-1レセプターのIg様ドメイン2がKDRレセプターのIg様ドメイン2に置き換えられている「スワップ」キメラを指す。「flt.K3」は、flt-1レセプターのIg様ドメイン3がKDRレセプターのIg様ドメイン3に置き換えられている「スワップ」キメラを指す。「f lt.K5」は、flt-1レセプターのIg様ドメイン5がKDRレセプターのIg様ドメイン5 に置き換えられている「スワップ」キメラを指す。最後に「flt.K7」は、flt-1 レセプターのIg様ドメイン7がKDRレセプターのIg様ドメイン7に置き換えられている「スワップ」キメラを指す。図8は無傷のFLT4レセプターの全アミノ酸配列を示している。アミノ酸残基は標準的な一文字指定で表わされている。図9はflt-1(1,2,3)/FLT4発現構築物によってコードされるレセプターの全アミノ酸配列を示している。下線部のアミノ酸残基は、flt-1レセプターのIgドメイン1〜3に由来し、FLT4レセプターのIg様ドメイン1〜3と差し替えられた残基である。太字のアミノ酸残基は、通常その位置にある野生型のFLT4アミノ酸残基とは異なっている。アミノ酸残基は標準的な一文字指定で表わされている。図10はflt-1(2)/FLT4発現構築物によってコードされるレセプターの全アミノ酸配列を示している。下線部のアミノ酸残基は、flt-1レセプターのIg様ドメイン2に由来し、FLT4レセプターのIg様ドメイン2と差し替えられた残基である。太字のアミノ酸残基は、通常その位置にある野生型のFLT4アミノ酸残基とは異なっている。アミノ酸残基は標準的な一文字指定で表わされている。発明の詳細な説明 A．定義本明細書において「キメラVEGFレセプタータンパク質」とは、少なくともその一方がflt-1またはKDRレセプターである少なくとも2種類のタンパク質に由来するアミノ酸配列を持つレセプター分子であって、VEGFに結合しかつその活性を阻害できる分子を意味する。本発明のVEGFレセプタータンパク質は好ましくは2種類のVEGFレセプター分子のみに由来するアミノ酸配列からなるが、flt-1および/ またはKDRレセプターの細胞外リガンド結合領域のIg様ドメインを構成するアミノ酸配列が他の無関係なタンパク質に由来するアミノ酸配列（例えば免疫グロブリン配列）に連結されていてもよい。Ig様ドメインを結合させるその他のアミノ酸配列は、当業者には明白だろう。本明細書にいう「KDRレセプター」は、KDRレセプターだけでなく、FLK-1と呼ばれるヒトKDRレセプターのネズミ相同体をも包含するものとする。「免疫グロブリン様ドメイン」または「Ig様ドメイン」は、flt-1、KDRおよび FLT4レセプターの細胞外リガンド結合領域に認められる7つの独立した別個のドメインのそれぞれを指す。一般にIg様ドメインは、図1に示すように特定のドメインを指す数字で呼ばれる。本明細書で使用する場合、「Ig様ドメイン」という用語は、完全な野生型ドメインだけでなく、無傷のドメインの機能的特徴を実質的に保持しているその挿入、欠失および置換変種をも包含するものとする。野生型ドメインと同じ機能的特徴を実質的に保持したflt-1およびKDRレセプターのIg 様ドメインの変種が数多く得られることは、当業者には明白だろう。本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質に関して「可溶型（可溶性）」という場合、これは、膜貫通ドメインを介して細胞の表面に固定されないキメラVEGF レセプタータンパク質を意味するものとする。したがって可溶型の本発明キメラ VEGF結合タンパク質は、VEGFを結合しかつそれを不活化することはできるものの、膜貫通ドメインを持たず、したがって一般にその分子が発現した細胞の細胞膜と結合した状態にはならない。これらの可溶型レセプターは、VEGFに結合して、それが標的細胞の表面に存在するその天然レセプターに結合するのを妨げることにより、VEGFタンパク質の生理活性に対する阻害作用を発揮する。本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質に関して「膜結合型」という場合、これは、膜貫通ドメインによりそれらが発現した細胞の表面に固定されるキメラ VEGFレセプタータンパク質を意味するものとする。「機能的均等物」という用語をflt-1、KDRまたはFLT4レセプターの細胞外リガンド結合領域のIg様ドメインに関して使用する場合、それは、その1または複数のIg様ドメインが欠失、付加および/または置換などの特定の変異を少なくとも1 つは保有し、それでもなおそれらが1または複数の野生型Igドメインと同じ機能的特徴を実質的に保持することを意味する。より具体的にflt-1および/またはKD RレセプターのIg様ドメイン1、2および3について述べると、「機能的均等物」の範囲には、それらドメインのうち少なくとも実質的なVEGFへの結合をもたらす部分、すなわち結合作用を生むそれら各ドメインの部分配列が含まれる。本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質の活性に関して「阻害作用」という用語を使用する場合、これは、そのキメラVEGFレセプタータンパク質がVEGFに結合しかつその活性を実質的に阻害することを意味する。一般にこの阻害作用の結果は、VEGFタンパク質の結果として起る脈管形成および/または血管新生の減少である。「望ましくない脈管形成」とは、望ましくない疾患または障害と関係し、その減少または排除により、その疾患または障害の望ましくない特徴が減少または排除される内皮増殖および/または血管新生を指す。例えば腫瘍の形成と転移や種々の網膜症と関係する脈管形成および/または血管新生は望ましくない。「トランスフェクション」とは宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指し、何らかのコード配列が実際に発現されるかどうかを問わない。当業者には、例えばCaPO₄法やエレクトロポレーションなどといった数多くのトランスフェクション法が知られている。一般にトランスフェクションの成功は、そのベクターの作用を示す何かがその宿主細胞内で起る時に認識される。「形質転換」とは、DNAを、ある生物にそのDNAが染色体外要素としてまたは染色体成分として複製できるように導入することをいう。形質転換は、使用する宿主細胞に応じて、その細胞に適した一般的技術を用いて行われる。Cohen，S.N.P roc．Natl．Acad．Sci． (USA)，69，2110 (1972)やMandelら，Ｊ．Mol．Biol． 53,154 (1970)に記述されているように、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、原核生物または堅固な細胞壁境界を持つ他の細胞に広く使用されている。そのような細胞壁を持たない哺乳類細胞には、Graham，Fおよびvan der Eb，A.,Virolo gy，52，456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳類細胞宿主系の形質転換に関する一般的側面については、Axelが米国特許第4,399,216号（1 983年8月16日発行）に記述している。酵母の形質転換は、通例、VanSolingen，P .ら，Ｊ．Bact.，130，946 (1977)とHsiao，C.L.ら，Proc．Natl.Acad．Sci．(U SA)，76，3829 (1979)の方法に従って行われる。ただし、DNAを細胞に導入するその他の方法、例えば核注入、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合などによる方法も使用できる。「部位特異的突然変異導入法」は当技術分野で広く使用されている技術であり、突然変異させようとする一本鎖ファージDNAに相補的（限定されたミス対合部分を除く）な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。簡単に述べると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ファージに相補的な鎖の合成を行い、得られた二本鎖DNAをファージ維持宿主細菌に形質転換する。形質転換した細菌の培養を上層寒天に撒き、ファージを保有する単一の細胞からプラークを形成させる。理論的には、新しいプラークの50％が突然変異型を一本鎖として持つファージを含有し、50％が元の配列を持つだろう。それらのプラークを、キナーゼ処理した合成プライマーと、正確な対合のハイブリッド形成が可能であって、かつ、元の鎖とのミス対合がハイブリッド形成を妨げるに足るような温度でハイブリッド形成させる。次に、そのプローブとハイブリッド形成するプラークを選択し、培養して、そのDNAを回収する。「作動可能に連結された」とは、その成分の通常の機能が遂行されうるような並置を指す。したがって制御配列に作動可能に連結されたコード配列とは、そのコード配列がそれら配列の制御下に発現できるような、また連結されたそれらの DNA配列が隣接するような（分泌リーダーの場合は隣接しかつ解読相が一致するような）配置を指す。例えばプレ配列または分泌リーダーのDNAは、それがあるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、そのポリペプチドのDNAに作動可能に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響を与えるのであれば、そのコード配列に作動可能に連結されている。また、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するような位置にあるのであれば、コード配列に作動可能に連結されている。連結は都合のよい制限部位での連結（ライゲーション）によって達成される。そのような部位が存在しない場合は、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。「制御配列」とは、特定の宿主生物中で作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列をいう。原核生物に適した制御配列には、例えばプロモーター、任意にオペレーター配列、リボソーム結合部位、あるいは他のまだよくわかっていないその他の配列が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することがわかっている。「発現系」とは、所望のコード配列と制御配列を含むDNA配列であって、それらの配列で形質転換された宿主がコードされているそのタンパク質を産生できるように、そのコード配列と制御配列が作動可能な連鎖関係にあるものを指す。形質転換を達成するには、発現系がベクターに含まれていてもよいが、関連するDN Aが続いて宿主染色体に組込まれてもよい。本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」という用語は相互に交換可能であって、これらはいずれも予孫を包含する。したがって「形質転換体」または「形質転換細胞」という用語は、初代対象細胞とそこから派生する培養を、その継代数にかかわらず包含する。また、すべての子孫は、意図的な突然変異または偶然の突然変異により、そのDNAの内容が正確には同一でない場合もあると解される。元の形質転換細胞中で選択の対象とした機能と同じ機能を持つ突然変異体子孫が含まれる。明確な指定を意図する場合は、その文脈から明らかになるだろう。「プラスミド」は、小文字pとその前後に添えた大文字および／または数字によって指定される。本発明での出発プラスミドは市販されているか、公に無制限に入手できるか、もしくはそれら入手可能なプラスミドから公表された手法に従って構築することができる。また当技術分野では、他の均等なプラスミドも知られており、それらは当業者には明らかだろう。 DNAの「消化」とは、そのDNAの特定の位置でのみ作用する酵素によるDNAの触媒的切断を指す。そのような酵素は制限酵素と呼ばれており、それぞれの制限酵素が特異性を示す部位は制限部位と呼ばれる。本発明で使用される種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子その他の必要条件は、その酵素の供給者によって確立されたものを使用する。制限酵素は通常、その制限酵素が最初に得られた時の微生物を表わす大文字とそれに続く他の文字、さらにその酵素を指定する数字からなる略号によって指定される。一般的には、約1mgのプラスミドまたはDNA断片を約1〜2単位の酵素と共に約20mlの緩衝液中で使用する。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質量は、その製造者によって指定される。通常は、37℃で約1時間のインキュベーションを使用するが、これは供給者の指示に従って変わりうる。インキュベーション後、フェノールとクロロホルムでの抽出によってタンパク質を除去し、消化された核酸をエタノール沈澱によって水相から回収する。まれに、制限酵素による消化の後、その末端5'リン酸基を細菌アルカリホスファターゼで加水分解することにより、DNA断片の2つの制限切断末端が「環化」または閉環を形成してその制限部位へのもう1つのDNA断片の挿入を妨害するのを防止することもある。特に明記しない限り、プラスミドの消化後に5' 末端脱リン酸化を行なわない。脱リン酸化の方法と試薬は従来通りである（T．M aniatisら，1982,Molecular Cloning：A Laboratory Manual（ニューヨーク：コールドプスリングハーバー研究所，1982）133-134ページ）。与えられたDNA断片の制限消化物からの「回収」または「単離」とは、その消化物のポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルでの電気泳動による分離、既知の分子量を持つマーカーDNA断片と移動度を比較することによる目的断片の同定、所望の断片を含有するゲル切片の切り出し、およびDNAからのゲルの分離を意味する。この操作は広く知られている。例えば、R．Lawnら，Nucleic Acids Res．9,6103-6114 (1981)やD．Goeddelら，Nucleic Acids Res．8，4057 (1980 )を参照されたい。「連結（ライゲーション）」とは、2つの二本鎖核酸断片間にリン酸ジエステル結合を形成する過程を指す（T．Maniatisら，1982，上記，146頁）。特に断わらない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結しようとするDNA断片0.5mgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて、既知の緩衝液と条件で達成することができる。形質転換体からのDNAの「調製」とは、微生物培養からプラスミドDNAを単離することを意味する。特に断わらない限り、Maniatisら（1982,上記，90頁）のアルカリ/SDS法を使用できる。「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（例えばEP特許公開番号266,032（198 8年5月4日公開）に記載されているような固相法を用いるホスホトリエステル法、ホスファイト法またはホスホルアミダイト法、もしくはFroehlerら，Nucl．Ac idsRes．14，5399-5407 [1986]に記述されているようなデオキシヌクレオシドH- ホスホネート中間体による方法など）によって化学的に合成される短い一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。これらは合成に続いてポリアクリルアミドゲルで精製される。Ｂ．一般的方法論１．アミノ酸配列変種本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質の1または複数のIg様ドメインに、そのキメラタンパク質がVEGFに結合しかつその活性を阻害できるという点に関して本発明の思想から逸脱することなく、種々のアミノ酸置換を施しうることは理解されるだろう。したがって本発明のVEGFレセプタータンパク質の1または複数のIg様ドメインには、VEGFに結合しかつその活性を阻害するというそのキメラタンパク質の能力に実質的な影響を及ぼさない興味深い特性が付与されるように、点突然変異およびその他のより広範な変異を導入することができる。これらの変種は当技術分野で広く知られている手段によって作成することができる。ａ．共有結合修飾キメラVEGFレセプタータンパク質中に存在する1または複数のIg様ドメインの種々のアミノ酸残基に共有結合修飾を施すことにより、VEGFに結合しかつそれを不活化する能力を除去することなく、その1または複数のIg様ドメインに新しい特性を付与することができる。例えばシステイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸やクロロアセトアミドなどのα-ハロ酢酸類（および対応するアミン類）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアヤトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)ピロピオン酸、リン酸クロロアセチル、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリベンゾエート、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキソ-1,3-ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。ジエチルピロカーボネートはヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるので、ヒスチジル残基はpH5.5〜7.0におけるこの試薬との反応によって誘導体化される。p-ブロモフェナシルブロミドも有用であり、その反応はpH6.0の0.1Mカコジル酸ナトリウム中で行なうことが好ましい。リジニル残基とアミノ末端残基は無水コハク酸その他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬による誘導体化は、リジニル残基の電荷を反転させるという効果を持つ。α-アミノ含有残基の誘導体化に適したその他の試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル類；ピリドキサルリン酸；ピリドキサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチルイソ尿素；2,4-ペンタンジオン；およびグリオキシレートを用いるトランスアミナーゼ触媒反応がある。アルギニル残基は、1または数種類の従来試薬（例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、ニンヒドリンなどがある）との反応によって修飾される。グアニジン官能基のpK_aは高いので、アルギニン残基を誘導体化するには、その反応をアルカリ条件下で行なう必要がある。また、これらの試薬はアルギニンε-アミノ基の他にリジンの官能基とも反応しうる。チロシル残基の特異的修飾法そのものは、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入するという目的で詳細に研究されている。最も一般的には、N-アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを使って、それぞれO-アセチルチロシル種と3-ニトロ誘導体を得る。放射免疫測定法で使用される標識タンパク質を調製するには、チロシル残基を¹²⁵Iまたは¹³¹Iを用いてヨウ素化する。この場合、上述のクロラミン T法が好適である。カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、1-シクロヘキシル -3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミドや1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4- ジメチルペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド類（R'-N-C-N-R'）との反応によって選択的に修飾される。また、アスパルチル残基とグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。二価試薬による誘導体化は、VEGFタンパク質を複雑な混合物から精製する方法で使用するために、水不溶性支持マトリックスまたは水不溶性支持面にキメラVE GFレセプタータンパク質を架橋する際に役立つ。一般的に使用される架橋剤には、例えば1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N -ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二価イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンなどの二価マレイミドがある。メチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートなどの誘導体化試薬は、光の存在下に架橋を形成することができる光活性化中間体を与える。別法として、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性の水不溶性マトリックスと、米国特許第3,969,287号、同第3,691,016号、同第4,195, 128号、同第4,247,642号、同第4,229,537号および同第4,330,440号に記載の反応性基質を使用して、タンパク質を固定化する。グルタミニル残基とアスパラギニル残基はしばしば対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に脱アミド化される。また、これらの残基は温和な酸性条件下に脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。その他の修飾には、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のa-アミノ基のメチル化（T.E．Creighton，Proteins: Structure andWolecul ar Properties，W.H．Freeman & Co.,サンフランシスコ，79-86頁[1983]）、N末端アミンのアセチル化、また場合によっては、C末端カルボキシル基のアミド化がある。ｂ． DNA突然変異本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質中に存在する1または複数のIg様ドメインのアミノ酸配列変種は、そのキメラタンパク質をコードするDNAに突然変異を導入することによって調製することもできる。そのような変異には、例えば 1または複数のIg様ドメインのアミノ酸配列からのアミノ酸残基の欠失、または該アミノ酸配列内でのアミノ酸残基の挿入または置換がある。また最終構築物が所望の活性を持つ限り、欠失、挿入および置換を任意に組み合せて最終構築物を得ることができる。変種をコードするDNAに施される突然変異がその配列を読み枠外に置いてはならないことは明らかであり、また二次mRNA構造をもたらしうる相補領域を生み出さないことが好ましい（EP 75,444Aを参照されたい）。遺伝子レベルでは、本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質中に存在する1 または複数のIg様ドメインの変種は通常、それら1または複数のIg様ドメインをコードするDNA中のヌクレオチドへの部位特異的突然変異導入によってその変種をコードするDNAを作成し、次にそのDNAを組換え細胞培養中で発現させることによって調製される。これらの変種は通例、元のキメラタンパク質と定性的に同様のVEGFリガンド結合能を示す。キメラVEGFレセプタータンパク質の1または複数のIg様ドメイン中のアミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、突然変異そのものを決定しておく必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異の効果を最適化するために、標的コドンまたは標的領域で無作為突然変異導入を行い、発現したキメラタンパク質変種を所望の特性（例えばVEGFリガンドに特異的に結合する能力や生体内半減期など）の最適な組み合わせについてスクリーニングすることができる。既知の配列を持つDNA中の予定の部位に置換突然変異を導入する部位特異的突然変異導入法などの技術は、よく知られている。これらの技術に従ってキメラVEGFレセプタータンパク質の1または複数のIg様ドメインに変異を導入する場合、先に調製したキメラタンパク質をコードするDN Aへの部位特異的突然変異導入によってこれを行なうことが好ましい。部位特異的突然変異導入法では、所望の突然変異のDNA配列と、横断される欠失接合部分の両側に安定な二本鎖を形成しうるサイズおよび配列を持つプライマー配列を与えるに足る数の隣接ヌクレオチドとをコードする、特定のオリゴヌクレオチド配列を使用することによって、Ig様ドメイン変種を生産することができる。通例、約20〜25ヌクレオチド長で、変異させる配列の接合部分の両側に約5〜10残基を持つプライマーが好ましい。Adelmanら，DNA 2，183（1983）（その詳細は参考文献として本明細書の一部を構成する）などの刊行物によって例示されるように、一般に、部位特異的突然変異導入技術は当技術分野でよく知られている。通例、部位特異的突然変異導入法には、一本鎖型と二本鎖型の両方で存在するファージベクターが使用されることは理解されるだろう。部位特異的突然変異導入法に役立つ典型的ベクターには、例えばMessingら，Third ClevelandSymosium on Macromolecules and Recombinant DNA，A．Walton編,Elsevier社，アムステルダム（1981）（その詳細は参考文献として本明細書の一部を構成する）に開示されているようなM13ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージは市場から容易に入手でき、それらの使用法は一般に当業者にはよく知られている。また、一本鎖ファージ複製起点を含有するプラスミドベクター（Veiraら，Met h．Enzymol.，153，3 [1987]）を使用して、一本鎖DNAを得ることもできる。一般に、この方法による部位特異的突然変異導入は、まず関連するキメラVEGF レセプタータンパク質をコードするDNA配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得ることによって行われる。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般には合成的に、例えばCreaら，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA) ，75，5765（1978）の方法によって調製される。次に、そのプライマーを一本鎖キメラタンパク質配列含有ベクターとアニーリングし、大腸菌ポリメラーゼIクレノウ断片などのDNA重合酵素にさらして、突然変異保有鎖の合成を完了する。このようにして一方の鎖が元の非突然変異配列をコードし、他方の鎖が所望の突然変異を保有するヘテロ二本鎖が形成される。次に、そのヘテロ二本鎖ベクターを用いて、JM101細胞などの適当な細胞を形質転換し、突然変異した配列を保有する組換えベクターを含むクローンを選択する。そのようなクローンを選択した後、その変種キメラVEGFレセプタータンパク質をコードする突然変異型DNAを取り出し、それをタンパク質生産に適したベクター（一般的には、適当な宿主の形質転換に使用しうるタイプの発現ベクター）に入れる。ｃ．突然変異のタイプアミノ酸配列欠失は一般的には約1〜15残基、より好ましくは1〜7残基の範囲にわたり、通常は連続している。アミノ酸配列挿入には、1残基から基本的に無制限の長さのポリペプチドまでのアミノ末端融合および/またはカルボキシル末端融合、ならびに1または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。配列内挿入（すなわちIg様ドメイン配列内での挿入）は一般的には約1〜10残基、より好ましくは1〜5残基の範囲にわたりうる。末端挿入の例には、そのキメラタンパク質の組換え宿主からの分泌を促進するために行なわれる、シグナル配列（その宿主細胞と同種であるか異種であるかを問わない）のキメラVEGFレセプタータンパク質のN末端への融合がある。キメラVEGFレセプタータンパク質中に存在する1または複数のIg様ドメインに導入することができる第3のグループの突然変異は、その1または複数のIg様ドメイン中のアミノ酸残基の少なくとも1つ（好ましくは1つだけ）が除去され、その位置に異なる残基が挿入されたものである。1または複数のIg様ドメインの特徴を細かく調節したい場合は、このような置換を次の表1に従って行なうことが好ましい。表1 元の残基典型的置換 A1a（A） gly; ser Arg（R） lys Asn（N） gln; his Asp（D） glu Cys（C） ser Gln （Q） asn Glu（E） asp Gly（G） ala; pro His（H） asn; gln Ile（I） leu; val Leu（L） ile; val Lys（K） arg; gln; glu Met（M） leu; tyr;ile Phe（F） met; leu; tyr Ser（S） thr Thr（T） ser Trp（W） tyr Tyr（Y） trp; phe Val（V） ile; leu 機能的または免疫学的同一性の本質的な変化は、表1のよりも保存性の低い置換を選択することによって、すなわち（a）置換される領域のポリペプチド骨格の構造（例えばシートまたはらせんコンフォメーション）、（b）標的部位における分子の電荷または疎水性、もしくは（c）側鎖の嵩高さ、を維持する効果がより有意に異なる残基を選択することによって生じる。Ig様ドメインの特性に最も大きな変化をもたらすと一般的に予想される置換は、（a）グリシンおよび/またはプロリン（P）を別のアミノ酸で置換するもの、もしくはこれらの残基を欠失または挿入するもの、（b）親水性残基（例えばセリルまたはスレオニル）で（を）疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルを（で）置換するもの、（c）システイン残基で（を）他の任意の残基を（で）置換するもの、（d）正に帯電した側鎖を持つ残基（例えばリジル、アルギニルまたはヒスチジル）で（を）負電荷を持つ残基（例えばグルタミルまたはアスパルチル）を（で）置換するもの、（e）負に帯電した側鎖を持つ残基で（を）正電荷を持つ残基を（で）置換するもの、または（f）嵩高い側鎖を持つ残基（例えばフェニルアラニン）で（を）そのような側鎖を持たない残基（例えばグリシン）を（で）置換するものだろう。ほとんどの欠失と挿入、そして特に置換は、キメラVEGFレセプタータンパク質の1または複数のIg様ドメインの特徴に根本的な変化をもたらさないと予想される。しかし、置換、欠失または挿入の正確な効果を前もって予測することが困難な場合、その効果が日常的な選抜検定法によって評価されることは、当業者には理解されるだろう。例えば、Ig様ドメイン変種は通例、無傷のVEGFレセプタータンパク質をコードする核酸の部位特異的突然変異導入、その変種核酸の組換え細胞培養における発現、変種キメラVEGFレセプタータンパク質の細胞培養からの精製、およびVEGFリガンドに特異的に結合するというその変種キメラVEGFレセプタータンパク質の能力の検出によって作成される。1または複数のIg様ドメイン中の特定の1または複数の変異が、VEGFに結合しかつその活性を阻害するというキメラVEGFレセプターの能力に影響を与えるかどうかを決定するために日常的に使用することができる結合測定法は、下記実施例にもParkら，Ｊ．Biol．Chem．26 9:25646-25654（1994）（この報文は特に参考文献として本明細書の一部を構成する）にも記述されている。このように変種キメラVEGFレセプタータンパク質の活性は、所望の特徴について適当な選抜検定法でスクリーニングできる。例えばVEGFリガンドに特異的に結合する能力の変化は、競合型VEGF結合測定法で測定することができる。酸化還元安定性、熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、担体との会合傾向、多量体への会合傾向などといったタンパク質特性の変化は、当業者によく知られている方法で測定される。３．組換え発現本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質は、よく知られる組換え法を含む任意の技術で製造することができる。また本明細書において、単離されたDNAとは、3'-および/または5'-隣接領域を伴うもしくは伴わない化学合成DNA、cDNA、染色体DNAまたは染色体外DNAを意味するものと理解される。本発明において望ましいキメラVEGFレセプタータンパク質は、好ましくは組換え細胞培養での合成によって調製される。そのような合成には、まず、本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質をコードする核酸を確保することが必要である。flt-1またはKDRレセプターをコードするDNAは、（a）それらの細胞からcDNAライブラリーを調製し、（b）flt-1または KDRレセプターもしくはその断片（100塩基対まで、またはそれ以上の長さのもの）をコードする標識DNAを使ってハイブリッド形成分析を行うことによって、相同な配列を含有するライブラリー中のクローンを検出し、（c）そのクローンを制限酵素分析と核酸配列決定によって分析して完全長クローンを同定することにより、血管内皮細胞から得ることができる。完全長クローンがcDNAライブラリー中に存在しない場合は、flt-1レセプターとKDRレセプターに関して知られている核酸およびアミノ酸配列情報を用いて種々のクローンから適当な断片を回収し、それらのクローンに共通する制限部位でそれらの断片を連結して、そのflt-1またはKDRドメインをコードする完全長クローンを組み立てることができる。別法として、ゲノムライブラリーから所望のDNAを得ることもできる。このDNAをライブラリーから同定、単離したら、そのDNAを適当な制御配列に作動可能に結合された適当な発現ベクターに連結することができる。さらに、適当なベクターにクローニングしたら、そのDNAを上述のような数多くの方法で変異させて、機能的に均等なその変種を作出することができる。また、細胞内ドメイン、膜貫ドメインおよび/または種々のIg様ドメインなどの様々なドメインをコードするDNAを欠失させたり、かつ/または、他のレセプターの対応するドメインをコードするDNAで置換することもできる。免疫グロブリン分子のF_c部分などといった無関係なアミノ酸配列をコードするDNAをVEGFレセプターの一部または全部をコードするDNAに融合することによって、キメラVEGFレセプター分子を作出することもできる。組換え発現系の一例として、Ig様ドメイン含有キメラVEGFレセプタータンパク質を、そのキメラVEGFレセプタータンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターでの形質転換により、哺乳類細胞中で発現させる。培養培地中または宿主細胞のペリプラズム中に（すなわち分泌分子として）キメラタンパク質が得られるようにプロセシングを行ないうる宿主細胞を形質転換することが好ましい。ａ．有用な宿主細胞とベクター本明細書に開示するベクターと方法は、広範囲にわたる原核生物および真核性物を宿主細胞とする使用に適している。一般にDNA配列の最初のクローニングと本発明で有用なベクターの構築には、当然ながら、原核生物が好ましい。例えば大腸菌K12 MM294株（ATCC番号31,446 ）は特に有用である。使用しうるその他の微生物株には、大腸菌Bや大腸菌X1776 （ATCC番号31,537）などの大腸菌株がある。これらの例はもちろん限定ではなく例示を意図するものである。原核生物は発現にも使用できる。上述の株に加えて、大腸菌のW3110株（F-、ラムダ-、原栄様株、ATCC番号27,325）、K5772株（ATCC番号53,635）およびSR10 1株、枯草菌などのバチルス属、ネズミチフス菌や霊菌（セラチア=マルセサンス）などといったその他の腸内細菌、および種々のシュードモナス種も使用できる。一般にこれらの宿主には、その宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンと制御配列を含有するプラスミドベクターが使用される。これらのベクターは通常、複製部位と、形質転換された細胞の表現型による選択を可能にする標識配列とを保有する。例えば、大腸菌は通例、大腸菌種に由来するプラスミドpBR322を用いて形質転換される（例えばBolivaraら，Gene 2，95 [1977]を参照されたい）。pBR322はアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定する簡単な手段を与える。pBR322プラスミドやその他の微生物プラスミドまたはファージは、その微生物がそれ自身のタンパク質の発現に使用しうるプロモーターをも含有するか、もしくはそれを含有するように修飾されなければならない。組換えDNA構築に最も一般的に使用されるプロモーターには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Changら，Nature，375,6 15[1978]；Itakuraら，Science，198，1056 [1977]; Goeddelら，Nature，281,5 44 [1979]）と、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら，NucleicAc ids Res.，8，4057 [1980]; EPO出願公開番号0036,776）がある。最も一般的に使用されるプロモーターはこれらであるが、その他の微生物プロモーターも発見され、使用されている。また、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公表されているので、当業者はそれらをプラスミドベクターと機能的に連結することができる（例えばSiebenlistら，Cell，20，269 [1980]を参照されたい）。原核宿主細胞に加えて、酵母培養などの真核微生物も使用できる。一般的なパン酵母サッカロミセス・セレビシェは、なかでも最も広く使用されている真核微生物である（ただし、その他にもいくつかの株が広く使用されている）。サッカロミセスでの発現には、例えばプラスミドYRp7などがよく使用される（Stinchco mbら，Nature 282，39 [1979]; Kingsmanら，Gene 7，141 [1979]; Tschemperら，Gene 10，157 [1980]）。このプラスミドは既にtrp1遺伝子を含有しており、それがトリプトファン中で生育する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばATCC番号44,076やPEP4-1（Jones，Genetics 85，12 [1977]）に選択マーカーを与える。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてtrp1損傷が存在することは、トリプトファン不在下での生育によって形質転換を検出するのに有効な環境となる。酵母ベクター中の好適な促進配列には、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitz emanら，Ｊ．Biol．Chem．255，2073 [1980]）その他の解糖系酵素（Hessら，Ｊ．AdV．Enzime Reg．7，149 [1968]; Hollandら，Biochemistry 17，4900[1978] ）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6- リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどのプロモーターがある。また、好適な発現プラスミドを構築するには、これらの遺伝子に付随する終結配列を、その発現ベクター中の発現させようとする配列の3’側に連結することにより、mRNAのポリアデニル化と終結に備える。生育条件によって転写を制御できるという利点をも持つその他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、上述のグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトースの資化に寄与する酵素群のプロモーター領域である。酵母に適合するプロモーター、複製起点および終結配列を含有するプラスミドベクターはいずれも好適である。微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養も宿主として使用できる。原則的には、脊椎動物培養であるか無脊椎動物培養であるかにかかわらず、それらの細胞はいずれも使用できる。しかし、最大の関心は脊椎動物細胞にあり、培養された脊椎動物細胞（組織培養）の増殖は近年、日常的な手法になっている［ Tissue Culture，Academic Press社，KruseおよびPatterson編 (1973)］。それら有用な宿主細胞系の例はVERO細胞、ヒーラ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系、W138、BHK、COS-7、293およびMDCK細胞系である。これらの細胞用の発現ベクターは通常、（必要であれば）複製起点と、発現させる遺伝子の前に位置するプロモーターを、必要なリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列と共に含む。哺乳類細胞で使用する場合、発現ベクター上の制御機能はウイルス物質から得られることが多い。例えば広く使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、そして最も多くの場合シミアンウイルス40（SV40）に由来する。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、それらが共にSV4Oウイルス複製起点をも含む断片としてウイルスから容易に得られるので、とりわけ有用である[Fiersら，Nature，273，113(1978)］。より小さいSV40断片やより大きいSV40 断片も、HindIII部位からウイルス複製起点に位置するBglI部位に向かって伸びる約250bpの配列が含まれている限り使用できる。さらに、所望の遺伝子配列に通常付随するプロモーターまたは制御配列がその宿主細胞系に適合するのであれば、それらを使用することもでき、またそうすることがしばしば望ましい。複製起点は、SV40その他のウイルス（例えばポリオーマ、アデノ、VSV、BPV）供給源から得られるような外来の起点を含むようにベクターを構築することによって、あるいは宿主細胞染色体複製機構によって提供されうる。満足できる量のタンパク質が細胞培養によって生産されるが、二次コード配列を用いる改良は、生産レベルをさらに向上させるのに役立つ。二次コード配列の一つはジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）を含む。これはメトトレキヤート（ MTX）などの外部から制御されるパラメーターによる影響を受けるので、メトトレキセート濃度の制御によって発現を制御することが可能になる。キメラタンパク質とDHFRタンパク質の両方をコードするDNA配列を含む本発明のベクターによるトランスフェクションに好ましい宿主細胞を選択する際には、使用するDHFRタンパク質のタイプに応じて宿主を選択することが妥当である。野生型DHFRタンパク質を使用する場合は、DHFR欠損性の宿主細胞を選択して、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く選択培地中で成功したトランスフェクションのマーカーとしてそのDHFRコード配列を使用できるようにすることが好ましい。この場合に適当な宿主細胞は、Ur1aubおよびChasin，Proc．Natl．Acad .Sci．(UNA)，77，4216 (1980)に記述されているように調製、増殖されるDHFR活性欠乏性チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系である。これに対し、MTXに対する結合親和性が低いDHFRタンパク質を制御配列として使用する場合は、DHFR欠損細胞を使用する必要はない。この突然変異型DHFRはメトトレキセートに対して耐性を示すので、宿主細胞自体がメトトレキセート感受性であれば、MTX含有培地を選択手段として使用することができる。MTXを吸収できるほとんどの真核細胞はメトトレキセート感受性であると思われる。そのような有用な細胞系の一つはCHO細胞系CHO-K1（ATCC番号CCL61）である。ｂ．使用できる代表的方法論所望のコード配列と制御配列を含有する好適なベクターの構築には、一般的な連結技術が使用される。単離されたプラスミドまたはDNA断片を切断し、加工処理し、望ましい形態に再連結することにより、必要なプラスミドを調製する。平滑末端が必要な場合は、10単位のポリメラーゼI（クレノウ）を用いて15℃ で15分間処理し、フェノール-クロロホルム抽出し、エタノール沈澱すればよい。切断した断片のサイズ分離は、Goeddelら，Nucleic Acids Res．8，4057(1980 )に記載の6%ポリアクリルアミドゲルを用いて行なうことができる。構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、通例、連結混合物を用いて大腸菌K12 294株（ATCC 31,446）その他の適当な大腸菌株を形質転換し、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。それらの形質転換体からプラスミドを調製し、制限マッピングおよび/またはMessingら，Nucleic Acids Res．9，309 (1981)の方法もしくはMaxa mら，Methods of Enzymology 65，499 (1980)の方法によるDNA配列決定によって分析する。そのDNAを哺乳類細胞宿主に導入し、適当なトランスフェクタントを培地中で選択した後、約20,000-500,000nM濃度のメトトレキセート（DHFR活性の競合阻害剤）の存在下に宿主細胞培養を生育することにより、DHFRタンパク質コード配列の増幅を達成する。当然、有効濃度範囲はDHFR遺伝子の性質と宿主の特徴に強く依存する。普遍的な上限と下限を明確にできないことは明らかである。DHFRを阻害する他の葉酸類縁体やその他の化合物も適当な濃度で使用できるだろう。しかし、MTX自体は便利で、容易に入手でき、効果的である。使用しうるその他の技術については実施例に記述する。ｃ．VEGFレセプター-免疫グロブリンキメラ（イムノアドヘシン）免疫グロブリンとその一定の変種は知られており、組換え細胞培養中で製造されているものもある。例えば米国特許第4,745,055号、EP 256,654、Faulknerら，Nature 298:286 (1982)、EP 120,694、EP 125,023、Morrison，Ｊ．Immunol.1 23:793 (1979)、Kohlerら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197 (1980)、Rasoら， Cancer Res．41:2073 (1981)、Morrison，Ann．Rev．Immunol．2:239 (1984)、M orrison，Science 229:1202 (1985)、Morrisonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:6851 (1984)、EP 255,694、EP 266，663およびWO 88/03559を参照されたい。新たな組み合せの（reassorted）免疫グロブリン鎖も知られている。例えば米国特許第4,444,878号、WO 88/03565およびEP 68,763とそれらに引用されている文献を参照されたい。適当な免疫グロブリン定常ドメイン配列に連結されたタンパク質レセプター配列から構築されたキメラ（イムノアドヘシン（免疫付着因子））は当該技術分野で知られている。文献に報告されたイムノアドヘシンには、T細胞レセプター（G ascoigneら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:2936-2940 [1987］)、CD4（Capon ら,Nature 337:525-531［1989］)、L-セレクチン（ホーミング因子）（Watsonら，Ｊ.Cell．Biol．110:2221-2229［1990］）、CD44（Aruffoら，Cell 61:1303-1313[1990]）、CD28およびB7 (Linsleyら，Ｊ．Exp.Med．173:721-730 ［1991］）、CTLA-4（Linsleyら，Ｊ．Exp．Med．174:561-569［1991］)、CD22 （Stamenkovicら，Cell 66:1133-1144［1991］）、TNFレセプター（Ashkenaziら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:10535-10539［1991］）およびIgEレセプター・アルファ（Ridgwayら，Ｊ．Cell Biol．115:abstr．1448［1991］）の各融合物がある。最も単純で最も簡単なイムノアドヘシン設計では、「アドヘシン（付着因子）」タンパク質の結合領域が免疫グロブリン重鎖のFc領域に結合された。免疫グロブリン配列を持つ本発明のキメラVEGFレセプターを製造する場合、通常は、VEGF レセプターのIg様ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端融合するが、N末端融合も考えられる。通例、このような融合では、コードされるキメラポリペプチドが、少なくとも免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に活性なヒンジ、CH2およびCH3ドメインを保有するだろう。融合は、定常ドメインのFc部分のC末端、または重鎖のCH1または軽鎖の対応する領域のすぐN末端側に対しても行われる。融合を行なう正確な位置は決定的な問題ではない。特定の部位がよく知られており、VEGFレセプター/免疫グロブリンキメラの生理活性、分泌性または結合性を最適化するために、それらを選択することができる。いくつかの態様では、基本的にWO 91/08298に記述されている方法で、本発明のVEGFレセプター/Igキメラを単量体、ヘテロ多量体またはホモ多量体（特に二量体および三量体）として集合させてもよい。好ましい態様として、興味あるVEGFレセプタ−Ig様ドメインを免疫グロブリン G₁（IgG-1）のFcドメインのN末端に融合する。全重鎖定常領域を興味あるVEGFレセプタ−Ig様ドメインに融合することもできる。しかし、より好ましくは、Fcを化学的に規定するパパイン切断部位または他の免疫グロブリンの類似の部位のすぐ上流にあるヒンジ領域中に始まる配列を融合物に用いる。特に好ましい態様として、興味あるVEGFレセプターのIg様ドメインを、IgG-1、IgG-2またはIgG-3重鎖の（a）ヒンジ領域とCH2およびCH3、または（b）CH1、ヒンジ、CH2およびCH3 ドメインに融合する。融合を行なう正確な部位は決定的な問題ではなく、日常的な実験で最適な部位を決定することができる。いくつかの態様では、本発明のIg様ドメインVEGFレセプター/免疫グロブリンキメラを多量体（特にホモ二量体またはホモ四量体）として会合させる。一般にこれらの会合免疫グロブリンは既知の単位構造を持つだろう。基本的な四鎖構造単位は、IgG、IgDおよびIgEがとる形態である。より高分子量の免疫グロブリンでは四鎖単位が繰り返される。IgMは一般にジスルフィド結合で互いに結合した四基本単位の五量体として存在する。IgAグロブリンと、時にはIgGグロブリンも、血清中で多量体型で存在しうる。また、VEGFレセプターに由来するIg様ドメイン配列を、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列の間に挿入することもできる。この態様では、VEGFレセプタ−Ig様配列を免疫グロブリンの各アーム中の免疫グロブリン重鎖の3’末端、ヒンジとCH2ドメインの間、またはCH 2ドメインとCH3ドメインの間に融合する。類似の構築物はHoogenboomら,Mol.Imm unol．28:1027-1037（1991）に報告されている。免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンには必要でないが、免疫グロブリン軽鎖がVEGFレセプターIg様ドメイン−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合していたり、あるいはVEGFレセプターIg様ドメインに直接融合していても構わない。前者の場合は、通例、免疫グロブリン軽鎖をコードする DNAを、VEGFレセプターIg様ドメイン−免疫グロブリン重鎖キメラタンパク質と同時に発現させる。分泌時に、そのハイブリッド重鎖と軽鎖は共有結合して、ジスルフィド結合した2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様の構造を与えるだろう。このような構造の調製に適した方法は、例えば米国特許第4,816,567号（1989年3月28日発行）に開示されている。好ましい態様では、本発明イムノアドヘシンの構築に使用される免疫グロブリン配列がIgG免疫グロブリン重鎖ドメインに由来する。ヒトイムノアドヘシンについては、ヒトIgG1およびIgG3免疫グロブリン配列の使用が好ましい。IgG1を使用することの主な利点は、IgG1イムノアドヘシンを固定化プロテインAで効率よく精製できるということである。しかし特定のイムノアドヘシンを構築するためにIg 融合パートナーを選択する際には、免疫グロブリンのその他の構造的特徴と機能的特徴も考慮すべきである。例えばIgG3ヒンジはIgG1より長く柔軟なので、IgG1 に融合すると正しく折りたたまれないか、あるいは正しく機能しないかもしれない大きな「アドヘシン」ドメインに順応することができる。考慮すべきもう1つの点は結合価だろう。IgGイムノアドヘシンは二価のホモ二量体であるが、IgAや IgMのようなIgサブタイプは、基本Igホモ二量体単位のそれぞれ二量体または五量体構造を生じうる。生体内で応用するために設計されるVEGFレセプターIg様ドメイン/免疫グロブリンキメラについては、Fc領域によって特定されるエフェクター機能と薬物動態特性も同様に重要である。IgG1、IgG2およびIgG4はいずれも 21日間の生体内半減期を持つが、補体系を活性化する際のそれらの相対効力は異なる。さらに、種々の免疫グロブリンは様々な数のアロタイプ性イソタイプを持つ。イムノアドヘシンの構築と発現に適した一般的方法は、種々のVEGFレセプターの（天然または変種）Ig様ドメインに関して上述した方法と同じである。本発明のキメライムノアドヘシンを構築する最も便利な方法は、興味ある1または複数のVEGFレセプタ−Ig様ドメインをコードするcDNA配列を、Ig cDNA配列に枠を合わせて融合することである。しかしゲノムIg断片への融合も使用できる（例えば上記のGascoigneらを参照されたい）。後者のタイプの融合物は、発現にIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、牌臓または末梢血リンパ球由来のcDNAライブラリーから、公表された配列に基づいて、ハイブリッド形成法またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法で単離することができる。1 または複数のVEGFレセプターIg様ドメインに由来する「アドヘシン」とそのキメラのIg部分をコードするcDNAは、選択した宿主細胞内で効率のよい発現を指示するプラスミドベクターに、直列に挿入される。正確な接合部は、設計した接合部コドン間の余分な配列を、オリゴヌクレオチド特異的欠失突然変異導入法（Zoll erおよびSmith，Nucleic Acids Res．10:6487［1982］）で除去することによって作成できる。各半分が所望の接合部の両側の配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを使用することができる。またPCR技術を用いて、その分子の2つの部分を枠を合わせて適当なベクターに結合することもできる。本発明のキメライムノアドヘシンは、プロテインAまたはGでのアフィニティークロマトグラフィー、親硫黄性（thiophilic）ゲルクロマトグラフィー（Hutche nsら，Anal．Biochem．159:217-226［1986］）および固定化金属キレートクロマトグラフィー（Al-Mashikhiら，Ｊ．Dairy Sci．71:1756-1763［1988］）を含む様々なよく知られる方法によって精製できる。ｄ．治療的使用法と製剤治療的応用では、本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質は医薬的に許容できる剤形（ボーラスとして静脈内に、または一定の期間にわたる持続注入によって、あるいは筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑液包内、髄腔内、経口、局所または吸入経路によって人間に投与できるものを含む）で哺乳動物（好ましくは人間）に投与される。本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質は腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内または病巣周辺経路でも好適に投与されて全身性作用と共に局所作用を発揮する。腹腔内経路は例えば卵巣腫瘍の治療にはとりわけ有用であると予想される。そのような剤形は本質的に無毒性かつ非治療性の製薬上許容できる担体を含む。そのような担体の例には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシンなどの緩衝剤、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類、あるいは硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの電解質、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ヤルロース系物質およびポリエチレングリコールなどがある。キメラタンパク質の局所剤またはゲル剤用の担体には、カルボキシメチルセルロースやメチルセルロースなどの多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレンーポリオキシプロピレンブロックボリマー、ボリエチレングリコールおよびウッドワックスアルコールがある。いずれの投与についても、従来のデポー剤を好適に使用できる。そのような剤形には、例えばマイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入剤、鼻腔スプレー、舌下錠、徐放性製剤などがある。徐放性組成物の例については、米国特許第3,773,919号、EP 58,481A、米国特許第3,887,699号、EP 158,277A、カナダ特許第1176565号、U．Sidmanら，Biopolymers 22:547 (1983)およびR.Lan gerら，Chem．Tech．12:98 (1982)を参照されたい。通常、本キメラタンパク質は上述の賦形剤に約0.1mg/ml〜100mg/mlの濃度で製剤されるだろう。任意に、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約10残基未満の）ポリペプチド（例えばポリアルギニンまたはトリペプチド）、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのアミノ酸、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類その他の炭水化物、EDTAなどのキレート剤、マンニトールやソルビトールなどの糖アルコールなどといった他の成分を、本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質の医薬製剤に加えてもよい。治療的投与に使用されるキメラVEGFレセプタータンパク質製剤は滅菌状態でなければならない。滅菌状態は滅菌濾過膜（例えば0.2ミクロン膜）による濾過で容易に達成される。キメラVEGFレセプタータンパク質は通常、凍結乾燥体として保存されるか、熱変性と酸化的変性に対して高度に安定な場合は水溶液として保存されるだろう。キメラVEGFレセプタータンパク質製剤のpHは通例、約6〜8であろう。ただし場合によっては、より高いpH値またはより低いpH値が適当である場合もありうる。疾患の予防または治療に関して、キメラVEGFレセプタータンパク質の適当な用量は、治療しようとする疾患のタイプ、その疾患の重篤度と経過、そのキメラVE GFレセプタータンパク質が予防のために投与されるのか、治療目的で投与されるのか、過去の治療法、その患者の病歴とそのキメラVEGFレセプタータンパク質に対する反応、そして主治医の判断に依存するだろう。キメラVEGFレセプタータンパク質は一度にまたは一連の治療の一貫として適宜、患者に投与される。本明細書においてキメラVEGFレセプタータンパク質の「治療有効量」とは、処置される状態の予防、その悪化の軽減、その状態の緩和または治療に有効な量であり、具体的には生体内での血管内皮の増殖を減少させるまたは阻止するに足る量である。本発明のキメラVEGFレセプタータンパク質は、種々の新形成性および非新形成性の疾患と障害の処置に有用である。処置に服しやすい新生物とそれに関連する状態には、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵胞膜細胞腫、男性胚腫、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭頚部癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽細胞腫、シュワノーマ、乏突起細胞腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に関係する異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関係するものなど）およびメーグス症候群がある。処置に服しやすい非新形成性状態には、慢性関節リウマチ、乾癖、アテローム硬化、糖尿病性網膜症とその他の網膜症、後水晶体繊維増殖、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜その他の組織移植、慢性炎症、肺炎、ネフローゼ症候群、プレクラムパシア（preclampasia）、腹水、心内膜液滲出（心膜炎に関係するものなど）および胸水がある。下記の実施例は単に現在知られている最良の発明実施態様を例示するものに過ぎず、本発明がこれら実施例の詳細に限定されると考えてはならない。実施例1：flt-1細胞外ドメイン/IgGF_cキメラ（flt-1/IgG）とその欠失構築物の構築と分析 7つのIg様ドメインを持つ天然flt-1細胞外リガンド結合領域がヒトIgG₁のF_c部分に融合されてなる発現構築物を、基本的にParkら，Ｊ．Biol．Chem．269:2564 6-25654（1994）（これは特に参考文献として本明細書の一部を構成する）の記述と同様にして構築した。具体的に述べると、flt-1レセプターの細胞外リガンド結合領域を、Pfuポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応によってクローニングした。ヒト胎盤cDNAをテンプレートした。プライマーは、flt-1細胞外リガンド結合領域をコードするcDNAの全細胞外リガンド結合領域を、シグナルペプチドを含めて包含した。Shibuyaら，Oncogene 5:519-524 (1990)およびdeVriesら，Science 255:989-991 (1992)。配列決定を容易にするために、flt-1細胞外リガンド結合領域のcDNAを2つの断片としてクローニングした。2組のプライマー（下記）を使用し、得られたバンド（サイズは約1キロ塩基）を適当な酵素で消化してpB1uesc ript IIまたはpSL301にサブクローニングした。生成したcDNAはflt-1レセプターの最初の758アミノ酸をコードしていた。完全長flt-1細胞外リガンド結合領域cD NAは、2つのflt-1ポリメラーゼ連鎖反応クローンを唯一の天然Mun I制限部位で連結することによって作成した。flt-1 プライマーセット＃１ 5' TCTAGAGAATTCCATGGTCAGCTACTGGGACACC 3' 5' CCAGGTCATTTGAACTCTCGTGTTC 3'flt-1 プライマーセット＃２ 5' TACTTAGAGGCCATACTCTTGTCCT 3' 5' GGATCCTTCGAAATTAGACTTGTCCGAGGTTC 3' これらのプライマーはflt-1細胞外リガンド結合領域のアミノ酸757をフェニルアラニンに変え、その3'末端にBst BI部位を導入した。リンカー配列をすべて除去するBst BI突然変異を、IgGγ1重鎖cDNAクローンCH₂CH₃の5'末端に導入した。 Canonら，Nature337:525-531 (1989)。次にflt-1細胞外リガンド結合領域をコードする領域の3'末端にある唯一のBst BI部位を介して、flt-1細胞外リガンド結合領域配列をこのIgGγ1重鎖クローンのアミノ酸216〜443のコード配列に融合した。次にこの構築物を、Parkら，Mol．Biol．Cell．4:1317-1326 (1993)に記述されているように、CEN4細胞での発現用のプラスミドpHEBO23にサブクローニングした。そのクローンの信頼性をDNA配列決定によって確認した。これにより、f lt-1レセプターの天然細胞外リガンド結合領域がヒトIgGのF_c部分に融合したキメラ「flt-1/IgG」の構築に成功した。次に、flt-1、KDRおよびFLT4レセプターの細胞外リガンド結合領域のアミノ酸配列を配列分析プログラム「アライン (align)」を使って整列し、flt-1 KDRおよびFLT4レセプターの細胞外リガンド結合領域中に存在する7つのIg様ドメインのそれぞれの境界を構造と配列を検討して決定した。図1はflt-1、KDRおよびFLT4 レセプターの細胞外リガンド結合領域の整列を表わす。 flt-1、KDRおよびFLT4レセプターの細胞外リガンド結合領域中の7つのIg様ドメインの境界を図1に示すように定めた後、上で調製したflt-1/IgG構築物をテンプレートとして使用し、Urferら，ENBO Ｊ．14:2795-2805 (1995)に既に記述されている「ループアウト」突然変異導入法によって、flt-1細胞外リガンド結合領域の7つの各Ig様ドメインのそれぞれを系統的に欠失させた。Kunkle，Proc．N atl.Acad Sci．USA 82:488-492 (1985)をも参照されたい。具体的には、オリゴヌクレオチド特異的突然変異導入法を使用して、単一のIg様ドメインがflt-1/Ig G構築物から「ループアウト（輪を形成して削除）」されるように、また同時に、他のキメラVEGFレセプター分子を作る目的で他のVEGFレセプター細胞外リガンド結合領域から得られる他のIg様ドメインを挿入する際に使用するため、7つのI g様ドメインのそれぞれの境界に唯一の制限部位が生成するように、オリゴヌクレオチドを設計した（下記参照）。図2はflt-1/IgG構築物からIg様ドメイン欠失体を作成する際に使用したオリゴヌクレオチドと、それによって生成する制限部位を表わす。これらの実験により、それぞれ7つの異なるIg様ドメインのうちの1 つが削除されているさらに7つのflt-1/IgG構築物を得た。 flt-1 Ig様ドメイン1欠失体の作成には、オリゴヌクレオチド5'-AAAATTAAAAGA TCCAGATCTGACTATCTATATATTTATTAGTGATACCGGTAGACCTTTT-3'を使用することにより、アミノ酸36-123を「ループアウト」すると共に、ドメイン1欠失部の5'末端と3 '末端にそれぞれBgl II部位とAge I部位を導入した（図２参照）。Bgl II部位の生成はアミノ酸E33をDに変化させた。 flt-1 Ig様ドメイン2欠失体の作成に使用したオリゴヌクレオチドは5'-GAAGGA AACAGAAGGCGCCATCTATATATTTATTCGAGGTACCAATACAATCATAG-3'であり、これはアミノ酸S129からH223までを効率よく除去する。Kas I制限部位とKpn I制限部位の生成は、それぞれS122からGおよびQ225からGへのアミノ酸変化を引き起こした。オリゴヌクレオチド5'-CAAACTATCTCACACATAGATCTACCGTGCATATATATGATACCGGTTT CATCACTGTGAAAC-3'による第３Ig様ドメインの欠失はアミノ酸N227からS325までを除去した。Bgl II制限部位とAge I制限部位の挿入に合わせるため、アミノ酸Q22 5、K331およびA332をそれぞれS、TおよびGに変更した。アミノ酸K331からI423までのループアウト（flt-1 Ig様ドメイン4欠失）には、オリゴヌクレオチド5'-GTTAACACCTCAGTGCACGTGTATGATGTCAATGTGAAACCCCAGATCT ACGAAAAGGCCGTGTC-3'を使用した。Bbr PI制限部位の生成によって生じたアミノ酸変化はI328からVへの変化である。Ig様ドメイン4の3'末端へのBgl II制限部位の設置はどのアミノ酸も変化させなかった。 Ig様ドメイン5（アミノ酸K427からS549まで）の欠失は、オリゴヌクレオチド5 '-AAACCTCACTGCCACGCTAGCTGTCAATGTGTTTTATATCACAGATCTGCCAAATGGGTTTCAT-3'を用いて達成した。5'末端にNhe I制限部位を工作することによりI423がAに変異した。また3’末端にBgl II部位を挿入する際にアミノ酸V555がLに置換された。 Ig様ドメイン6欠失突然変異体を作成するために、オリゴヌクレオチド5'-GTGG GAAGAAACATAAGCTTTGTATACATTACAATCAGATCTCAGGAAGCACCATAC-3'を使ってアミノ酸 T553からE652までを切出した。5'末端にBst 1107I制限酵素部位を作ることにより、アミノ酸Y551とI552がそれぞれVとYに変化した。また3'末端にBgl II制限部位を形成させる際にアミノ酸D657がSで置換された。欠失させようとする最後のflt-1 Ig様ドメイン（ドメイン7）については、アミノ酸Q658からY745までを除去すると共に、制限部位Bsi WIとKpn Iをそれぞれ5 'および3'に付加した。オリゴヌクレオチド5'-CCAGAAGAAAGAAATTACCGTACGAGATCT CACTGTTCAAGGTACCTCGGACAAGTCTAAT-3'により、I655からVへのアミノ酸置換が起った。 flt-1/IgG構築物とflt-1IgGに基くIg様ドメイン欠失構築物を構築した後、当技術分野でよく知られる技術を使って、それらの構築物を大腸菌XL-1 Blue株に個別に形質転換した。大腸菌XL-1 Blue株への構築物の形質転換の後、図2に示す新たに生成した制限部位の存在についてコロニーを制限消化によって調べ、次に各構築物の全コード領域をシークエナーゼ（Sequenase）バージョン2.0キット（ USBiochemical社）を使って配列決定した。選択した各クローンの二本鎖DNAをQI AGEN DNA精製キット（Qiagen社）を使って調製し、それらをCEN4細胞へのトランスフェクションに使用した。天然flt-1/IgGタンパク質またはflt-1/IgGドメイン欠失体をコードするプラスミドDNAをリン酸カルシウム沈殿法（Current protocols in Molecu1ar Biology ）によってCEN4細胞に導入した。CEN4細胞は、flt-1/IgG構築物の基礎になっているpHEBO23ベクターのエピソーム複製に必要なエプシュタイン-バーウイルス核抗原-1を発現させるヒト胎児腎臓293細胞系の誘導体である。Suら，Proc．Natl ．Acad.Sci．USA 88:10870-10874 (1991)。80%コンフルエント10mm細胞培養皿一つのトランスフェクションに10pgのプラスミドDNAを使用した。トランスフェクションの48時間後、可溶性キメラVEGFレセプターを含有するその培地を集め、生産されたタンパク質の濃度を、キメラタンパク質のF_c部分を検出するように設計されたELISAによって測定した。実施例 2：VEGF リガンドへの結合を検出するための結合測定上記実施例1で作成した可溶性キメラVEGFレセプターを用いる結合測定は、基本的にParkら，Ｊ．Biol．Chem．269:25646-25654 (1994)に記述されているように行なった。具体的には、50mM Na₂CO₃（pH9.6）中の2μg/mlアフィニティー精製ヤギ抗ヒトF_cIgG（Organon-Teknika社）を使って4℃で終夜コーティングした9 6ウェル簡易免疫吸着測定プレートで結合測定を行なった。プレートを10％ウシ胎児血清／PBS（緩衝液Ｂ）で1時間遮断した。その遮断緩衝液を除去した後、10 0μlの結合カクテルを各ウェルに加えた。結合カクテルはすべて最終体積を100 μlにする量の緩衝液B中に所定量のflt-1/IgGキメラタンパク質および¹²⁵I-VEGF₁₆₅ （＜9000cpm/ウェル）（50ngの未標識VEGF競合剤の添加・無添加は表示に従う）からなり、これらのカクテルを調製して、4℃で終夜平衡させた。VEGF₁₆₅は Keytら，Ｊ．Biol．Chem．271:5638-5646 (1996)に既に記述されているようにクロラミンT法でヨウ素化した。ヨウ化VEGFの比活性は5.69×10⁷cpm/μgだった。被覆ウェルでのインキュベーションを室温で4時間行った後、緩衝液Bで4回洗浄した。結合量はガンマ計数器で個々のウェルをカウントすることによって測定した。4変数非線形カーブフィッティングプログラム（Kalidagraph，Abelbeck Sof tware）を使ってデータを分析した。無傷のflt-1/IgGキメラタンパク質と7つのflt-1/IgG Ig様欠失キメラタンパク質を使った結合測定の結果を図3に示す。図3に示すように、試験した全キメラタンパク質のうちIg様ドメイン2を欠くキメラタンパク質だけがVEGFリガンドを特異的に結合できなかった。試験した他の6つのflt-1/IgG欠失キメラはすべて無傷のflt-1/IgGキメラと同様に、VEGFリガンドを特異的に結合する能力を保っていた。これらの結果は、flt-1細胞外リガンド結合領域のIg様ドメイン2がVEGFリガンドへの特異的結合に必要であることを示している。これらの結果から、他の様々なflt-1/IgG欠失キメラ構築物をクローニングし、発現させて試験することにした。IgG1重鎖cDNAプラスミドの5'末端にクローニングするためのインフレーム部位を提供する制限部位（5'と3'にそれぞれC1a I およびBst BI）を含むPCRプライマーを使って、所望する特定のIg様ドメインを増幅することにより、特定のIg様ドメイン/IgG構築物を作成した（Caponら，Nat ure337:525-531 (1989)を参照されたい）。これによって、IgGのF_cに融合したfl t-1細胞外リガンド結合領域のIg様ドメイン1および2だけを持つflt-1/IgG欠失構築物［flt(1,2)］を得た。flt(1,2)を構築するため、アミノ酸M1からQ224までを次のオリゴヌクレオチドを使って増幅した： 5'-CAGGTCAATCATCGATGGTCAGCTACTGGGACACC-3'（Flt.sp.Cla I）及び 5'-GGTCAACTATTTCGAATTGTCGATGTGTGAGATAG-3'（Flt.2C.Bst BI）。その他のflt-1/IgG欠失キメラも同様に調製した。それらはIg様ドメイン2のみ [flt(2)］、Ig様ドメイン2および3のみ［flt(2,3)］、およびIg様ドメイン1、2 および3のみ［flt(1,2,3)］という組み合せを含むものである。flt(1,2)を作成するのに使用した2つのオリゴヌクレオチドと同じものを使用して、Ig様ドメイン1を欠く構築物からflt(2)を作成した。flt(2,3)はIg様ドメイン1を欠く構築物を、オリゴヌクレオチドFlt.sp.Cla1と、I328までのコード配列を含むもう1つのオリゴヌクレオチド：5'-GGTCAACTATTTCGAATATATGCACTGAGGTGTTAAC-3'（Flt.3C. BstBI）で増幅することによって作成した。flt-1 Ig様ドメイン1〜3の増幅は、3 つのIg様ドメインすべてを持つ構築物にプライマ−flt.sp.Cla IとFlt.3C.Bst B Iを使用することによって達成した。次に全ドメイン-IgGコード配列をpHEBO23の Cla I部位とNot I部位にサブクローニングした。上記実施例1と2に記述したように、これらのflt-1/IgGキメラ構築物をすべてクローニングし、発現させ、VEGFに特異的に結合する能力について調べた。他の flt-1/IgG構築物の場合と同様に、これらのflt-1/IgG欠失構築物を配列決定し、 CEN4細胞にトランスフェクションし、発現したタンパク質をF_c ELISAで定量した。これらのflt-1/1gGドメイン欠失キメラを用いたVEGF結合測定の結果を図4に示す。図4に記載の結果は、flt-1 Ig様ドメイン2だけではVEGFリガンドの結合には不十分であることを示している。ドメイン2をIg様ドメイン1と組み合せても、VEGF リガンドの結合には十分でなかった。Ig様ドメイン2と3が組み合わさって存在する場合は少量のVEGF結合が検出できたが、その結合の程度と親和力はさらに分析する必要があった。しかし、これとは対照的に、Ig様ドメイン1、2および3が3つともすべて組み合わさって存在する場合は、VEGFリガンドを結合する能力が完全に回復した。したがってこれらの結果は、VEGF結合にはflt-1 Ig様ドメイン1、２および3の組み合せで十分であることを示している。次に、使用する非標識VEGFリガンドの量を増やしつつ、1ngの免疫活性flt-1/I gGまたはflt(1,2,3)への¹²⁵I-VEGF₁₆₅結合を滴定した。結合測定は基本的に上述のように行なった。これらの実験で得た結果を図5に示す。4Pロジスティック曲線フィット：［(ml-m4)／(1+(mO/m3) m2)］＋m4を使用し、m3の値は50%阻害をもたらす濃度（IC₅₀）に等しい。これは曲線の変曲点で起る。図5に示すように、無傷のflt-1/IgGキメラタンパク質とflt(1,2,3)欠失キメラに関するIC₅₀はそれぞれ1.89ng/mlおよび1.34ng/mlで同等だった。したがってflt(1,2,3)欠失キメラはVEGFリガンドへの結合に関して無傷のflt-1/IgGキメラタンパク質と同じように振る舞う。実施例3 ：「スワップ」キメラによるVEGFリガンドへの結合を検出するための結合測定図1に示すように、flt-1、KDRおよびFLT4レセプターの細胞外リガンド結合領域内に存在する7つのIg様ドメインのそれぞれの境界を決定した。この情報に基いて、flt-1/IgG構築物のIg様ドメインの1またはそれ以上がKDRまたはFLT4レセプターの同じIg様ドメインで置換されている種々の「スワップ」キメラを調製した。それら「スワップ」キメラを構築するために、KDRまたはFLT4レセプターの所望のドメイン断片を、上述の無傷のflt-1/IgG構築物の構築に際して作成したものと同じ隣接制限部位をインフレームに含有するPCRプライマーを使って増幅した。無傷のflt-1/IgF構築物とKDRまたはFLT4レセプターDNAの増幅によって得たPCR断片とを制限酵素で切断し、それによって得た断片を連結することにより、所望の「スワップ」キメラをコードする構築物を得た。作成したすべてのキメラ構築物を配列決定して、それらの信頼性を確認した。ある実験では、KDRまたはFLT4レセプターのIg様ドメイン2をflt-1/IgG構築物のIg様ドメイン2と「スワップ」して、flt-1 Ig様ドメイン1および3〜7とKDR（f lt.K2）またはFLT4（fltF4.2）に由来するIg様ドメイン2とを合わせ持つ「スワップ」キメラを作成した。先と同様に、両「スワップ」構築物を配列決定した後、CEN4細胞へトランスフェクションしてそこで発現させ、CEN4細胞によって生産された「スワップ」キメラをF_cELISAにかけた。次にそれらのキメラタンパク質を、¹²⁵I-VEGF₁₆₅に特異的に結合する能力について上述のように試験した。その結果を図6に示す。図6に記載の結果は、KDRレセプターのIg様ドメイン2によるflt-1 Ig様ドメイン2の置換はVEGFリガンドに特異的に結合する能力を再樹立する機能を持つが、F LT4Ig様ドメイン2の存在はVEGFリガンドに特異的に結合する能力を再樹立しないことを示している。天然FLT4レセプターはVEGFリガンドに結合しないことが知られており、またKDRレセプターはこのリガンドと相互作用するので、これらの結果はIg様ドメイン2がVEGF結合を担う主要ドメインであることを示している。予想通り、天然flt-1/IgGキメラはVEGFリガンドに特異的に結合したが、Ig様ドメイン2を欠くflt-1/IgGキメラはVEGFリガンドを特異的に結合しなかった。次に、VEGFリガンドへの結合の特異性がflt-1およびKDRレセプターのIg様ドメイン2に存在するかどうかを決定するための実験を行なった。具体的に述べると、胎盤増殖因子（PLGF）はflt-1レセプターの細胞外リガンド結合領域には結合できるが、KDRまたはFLT4レセプターの細胞外リガンド結合領域には結合しないことがよく知られている。したがってPLGFの結合はflt-1レセプターへのVEGFリガンドの結合と競合できる。この情報に基き、種々のIg様ドメインがKDRレセプター由来の同じIg様ドメインで置換されているflt-1/IgGキメラタンパク質からなる一連の「スワップ」突然変異体を用いて、VEGF結合に対する競合を行なった。具体的には、flt-1/IgG キメラのIg様ドメイン1、2、3、5または7のいずれかがKDRレセプター由来の対応するIg様ドメインで置換されている「スワップ」キメラを、上述のように構築した。競合結合測定は、50ngの非標識VEGFまたは50ngの非標識PLGFを競合剤として、上述のように行なった。それら競合結合測定の結果を図7に示す。図7に記載の結果は、flt-1レセプターのIg様ドメイン2をKDRレセプターのIg様ドメイン2で置換した場合にのみ、そのVEGF相互作用が野生型flt-1よりも野生型 KDRにより近くなることを示している。構築したその他の「スワップ」キメラはそれぞれ野生型flt-1レセプターに類似する挙動を示した。さらに、flt-1/IgGキメラタンパク質のIg様ドメイン2をFLT4レセプターのIg様ドメイン2で置換すると、その結果生じるキメラタンパク質は無傷のFLT4レセプターの結合特異性を示した（データの表示なし）。したがってこれらの結果は、flt-1およびKDRレセプターのIg様ドメイン2がリガンド特異性の主要決定因子であることを示している。次に、細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞内チロシンキナーゼドメインを含む全ヒトFLT4レセプターをコードする発現構築物（Leeら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 93:1988-1992 (1996)）を使用して、その他の種々のキメラレセプターを作成した。全FLT4レセプターをコードする構築物を上述のようにオリゴ特異的突然変異導入にかけて、FLT4細胞外リガンド結合領域のIg様ドメイン1の先頭（Afl II）、ドメイン1の末尾/ドメイン2の先頭（Nhe I）、ドメイン2の末尾/ドメイン3の先頭（Bsi WI）、およびドメイン3の末尾（Mlu I）に位置するインフレーム制限部位を作った。次に同じインフレーム制限部位を持つPCRプライマーを使って、次に示すflt-1 Ig様ドメインの組み合せを基本的に上述のようにして増幅した：ドメイン2のみ、およびドメイン1〜3のみ。突然変異させたFLT4をコードする構築物にそのflt-1 PCR産物をクローニングすることにより、flt-1/FLT 4キメラレセプター構築物を得た。具体的には、FLT4 Ig様ドメイン1〜3がflt-1 レセプターのIg様ドメイン1〜3で置換されている点（構築物flt-1(1,2,3)/FLT4）またはF LT4 Ig様ドメイン2がflt-1レセプターのIg様ドメイン2で置換されている点（構築物flt-1(2)/FLT4）以外は全FLT4レセプター配列を持つ構築物を調製した。flt -2(1,2,3)/FLT4については、アミノ酸N33からE324までをコードするFLT4配列をS 35からS325までをコードするflt-1配列で置換した。クローニング部位の作成に伴ってFLT4の1325がRに変化した。flt-1(2)/FLT4については、S128からI224までをコードするFLT4配列を、I124からR224までをコードするflt-1配列で置換した。これによって、FLT4アミノ酸N33と1326がそれぞれSとRに変化し、T36が加わる。配列決定によってこれらキメラの信頼性が確認された。図8、9および10はそれぞれ無傷のFLT4レセプターの全アミノ酸配列、flt-1(1,2,3)/FLT4構築物によってコードされるキメラレセプターの全アミノ酸配列、およびflt-1(2)/FLT4構築物によってコードされるキメラレセプターの全アミノ酸配列を示している。これらの発現構築物を調製した後、DEAE-デキストラン法を使って293細胞をそれら構築物でトランスフェクトし、一過性発現細胞をVEGFリガンドに結合する能力について分析した。VEGFリガンドの結合を検出するために、無傷のFLT4レセプター、flt-1ドメイン2/FLT4キメラレセプター、flt-1ドメイン1〜3/FLT4キメラレセプターまたは無傷のflt-1レセプターを発現させる一過性発現293細胞で飽和結合測定を行なった。具体的には、最終体積0.2mlの緩衝液C（0.1% BSAと25mMHe pesを含む50/50培地，pH7.3）中で2.5×10⁵個の細胞を様々な量の¹²⁵I-VEGF（比活性56.9×10⁶cpm/μg）と共にわずかに撹拌しながら4℃で4時間インキュベートした。次にその細胞混合物を0.75mlの30%ショ糖上に重層し、最大速度で10分間遠心分離し、ペレットを回収し、ガンマ計数器でカウントした。293細胞はflt-1 様のVEGF結合性をいくらか持っているので、非遺伝子導入細胞をも使用して、バックグランドカウントを遺伝子導入細胞から回収されたカウントから差引いた。次に、添加したカウント量と回収された結合カウント量をスキャッチャード分析にかけた。これらの実験の結果は、予想通り、無傷のFLT4レセプターを発現させる細胞が VEGFリガンドを特異的に結合しないことを示した。しかし、flt-1ドメイン2/FLT 4 キメラレセプターまたはflt-1ドメイン1〜3/FLT4キメラレセプターを発現させる細胞はVEGFリガンドを特異的かつ強固に結合した。Kdはflt-1ドメイン2/FLT4キメラレセプターとflt-1ドメイン1〜3/FLT4キメラレセプターについてそれぞれ10 .2nM±1.1pMと10.4pM±3.4pMだった。これらの値は無傷の全長flt-1レセプターについて報告されている範囲に近い。トランスフェクションの60〜72時間後に、これらのキメラレセプターを一時的に発現させる293細胞でのチロシンリン酸化の量を測定する実験も行なった。チロシンリン酸化測定は、基本的にParkら，Ｊ．Biol．Chem．269:25646-25654 (1 994)に記述されているように行なった。所定の因子で刺激する16〜18時間前に、一過性発現293細胞から血清を除去した。細胞を濃度400ng/mlのFLT4リガンド（V H1.4.5;VEGF-C/VRP）、50ng/ml VEGFまたは0.5nM PLGFで37℃で15分間刺激した。刺激培地を除去した後、細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、次に1mlの溶解緩衝液で溶解した。その溶解液から細胞残渣を除去し、FLT4レセプターの細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体JTL.1を使ってレセプターを免疫沈降した（Leeら， Proc．Natl．Acad．Sci.，93:1988-1992 (1996)を参照されたい）。次にその免疫沈降物を、4G10抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（UBI,ニューヨーク州レークプラシッド）を使ったウェスタンゲル/ブロット分析にかけた。ABCキットを使用し、その製造者（Vector Laboratories社）の指示に従って、免疫活性バンドを可視化した。安定な細胞系を樹立するために、各キメラ構築物をネオマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドと共にリン酸カルシウム沈殿法でNIH3T3細胞に同時トランスフェクションした。G418の存在下に増殖するクローンを、VEGFに結合するその能力についてスクリーニングした。flt-1(1,2,3)/FLT4またはflt-1(2)/FLT4キメラを発現させるクローンを細胞結合測定法で分析することにより、非放射性VEGF₁₆ ₅ の量を増やしながら微量の¹²⁵I-VEGF₁₆₅（最終約5000cpm/ml）を滴定することで、VEGFに関するKdを決定した。まず付着細胞を冷結合緩衝液C（0.2％BSAと25m MHEPESを含むDMEM/F12培地，pH7.4）で洗浄した後、それぞれ緩衝液C 0.5ml中の¹²⁵ I-VEGF₁₆₅と非放射性競合剤とを同時に加えた。次にその細胞を4℃に4時間置いた。結合緩衝液を吸引除去した後、細胞を冷PBSで洗浄し、次に2M NaClを含む冷 PBSで2回洗浄した。最後に、細胞を0.25M NaOHで溶解し、全溶解液をガンマ計数器でカウントした。その結果をスキャッチャード分析プログラムNew Ligand（Ge nentech社）で分析し、Kdを計算した。 flt-1(1,2,3)/FLT4またはflt-1(2)/FLT4キメラレセプターを安定に発現させる NIH 3T3細胞を、10%FBS、100単位/mlペニシリン-ストレプトマイシン（GibcoBRL 社）、2mMグルタミン、2.5μg/mlファンギゾン（Gibco BRL社）および200μg/m lG418を含む低グルコースDMEM培地中50,000細胞/ウェルの密度で、12ウェル形式にてプレート培養した。0.5%FBSを含む培地での18〜24時間の血清飢餓後、増殖因子または10%FBSを加えた。添加したVEGF₁₆₅の濃度は5pg/mlから300ng/mlまでの範囲、PIGF₁₅₂濃度は5.12ng/mlと3.2μg/mlの間、VEGF-Cの濃度は40ng/mlと4 μg/mlだった。37℃で12〜16時間の刺激後、[³H]チミジン（1mCi/ml；5Ci/mmol ）を1μCi/mlの最終濃度で加え、37℃で4時間インキュベートした。培地の除去と数回のPBS洗浄の後、TCA沈殿を行なった。TCAを除去した後、細胞を0.2N NaOH /1%SDSで溶解し、シンチレーションバイアルに移し、2M Na₂OAc（pH4.0）で中和した。それらの試料をトリチウムチャンネルでカウントした。これらの実験の結果は、VEGFが無傷のFLT4レセプターを一時的に発現させる細胞でのチロシンリン酸化を刺激しないのに対して、flt-1(2)/FLT4キメラレセプターまたはflt-1(1,2,3)/FLT4キメラレセプターを一時的に発現させる細胞では有意なチロシンリン酸化が観察されることを示した。したがってこれらの実験は、flt-1(2)/FLT4キメラレセプターとflt-1(1,2,3)/FLT4キメラレセプターがVEGF に結合しかつVEGFに対して特異的に反応できることを示している。さらにこれらのクローンはチミジン取り込み測定でもVEGFに対する有意な反応を示した。結び上記の説明は本発明の実施に使用できる具体的方法を詳述したものである。これらの具体的方法を詳述しおえたので、当業者には、本発明の成果を利用して同じ知見を得るのに確実な代替法を案出する方法が十分にわかるだろう。しかし上述の詳細は、その全範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲の適法な解釈によってのみ決定されるべきである。ここに引用した文書はすべて特に参考文献として本明細書の一部を構成するものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者プレスタ，レナードアメリカ合衆国94109カリフォルニア州サン・フランシスコ、ゴー1900番、アパートメント206 (72)発明者フェラーラ，ナポレオンアメリカ合衆国94123カリフォルニア州サン・フランシスコ、スコット・ストリート 3835番、アパートメント306

Claims

【特許請求の範囲】 1. VEGFに結合することができ、かつそれによりVEGFに対する阻害作用を発揮できるキメラVEGFレセプタータンパク質であって、flt-1レセプターおよび/またはKDRレセプターの免疫グロブリン様ドメイン1、2および3またはその機能的均等物を含むキメラVEGFレセプタータンパク質。 2. 免疫グロブリン様ドメイン1、2および3がすべてflt-1レセプターに由来する請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 3. 免疫グロブリン様ドメイン1、2および3がすべてKDRレセプターに由来する請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 4. 免疫グロブリン様ドメイン1および3がflt-1レセプターに由来し、免疫グロブリン様ドメイン2がKDRレセプターに由来する請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 5. 免疫グロブリン様ドメイン1および3がKDRレセプターに由来し、免疫グロブリン様ドメイン2がflt-1レセプターに由来する請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 6. 免疫グロブリン様ドメイン1および2がflt-1レセプターに由来し、免疫グロブリン様ドメイン3がKDRレセプターに由来する請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 7. 免疫グロブリン様ドメイン1および2がKDRレセプターに由来し、免疫グロブリン様ドメイン3がflt-1レセプターに由来する請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 8. 免疫グロブリン様ドメイン1がflt-1レセプターに由来し、免疫グロブリン様ドメイン2および3がKDRレセプターに由来する請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 9. 免疫グロブリン様ドメイン1がKDRレセプターに由来し、免疫グロブリン様ドメイン2および3がflt-1レセプターに由来する請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 10. 該免疫グロブリン様ドメイン1、2および3がヒトIgG免疫グロブリンのF_c 部分に融合している請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 11. 可溶性である請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質。 12. VEGFに結合することができ、かつそれによりVEGFに対して阻害作用を発揮できるキメラVEGFレセプタータンパク質であって、FLT4レセプターの細胞外ドメインを含み、該FLT4レセプターの免疫グロブリン様ドメイン2がflt-1レセプターまたはKDRレセプターの免疫グロブリン様ドメイン2もしくはその機能的均等物で置換され、該FLT4レセプターのその他の1またはそれ以上の免疫グロブリン様ドメインがflt-1レセプターまたはKDRレセプターの対応する免疫グロブリン様ドメインで置換されているか、もしくは置換されていないキメラVEGFレセプタータンパク質。 13. flt-1レセプターの免疫グロブリン様ドメイン2とFLT4レセプターの免疫グロブリン様ドメイン1および3〜7を持つ請求項12のキメラVEGFレセプタータンパク質。 14. flt-1レセプターの免疫グロブリン様ドメイン1〜3とFLT4レセプターの免疫グロブリン様ドメイン4〜7を持つ請求項12のキメラVEGFレセプタータンパク質。 15. 図9に示すアミノ酸配列を持つ請求項12のキメラVEGFレセプタータンパク質。 16. 図10に示すアミノ酸配列を持つ請求項12のキメラVEGFレセプタータンパク質。 17. 可溶性である請求項12のキメラVEGFレセプタータンパク質。 18. 膜結合型である請求項12のキメラVEGFレセプタータンパク質。 19. 請求項1または12のキメラVEGFレセプタータンパク質をコードする核酸。 20. 形質転換体宿主細胞中で請求項1または12のキメラVEGFレセプタータンパク質を発現させることができる複製可能な発現ベクター。 21. 請求項20の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 22. CEN4細胞である請求項21の宿主細胞。 23. 製薬上許容できる担体と混合された請求項1のキメラVEGFレセプタータンパク質を含む組成物。 24. 請求項20の発現ベクターを適当な発現系に導入する段階と、該キメラVEG Fレセプタータンパク質の発現を達成する段階とを含むキメラVEGFI/セプタータンパク質の生産法。 25. 望ましくない脈管形成と関係する状態に関して哺乳動物を治療する方法であって、請求項23の組成物の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法。 26. 該望ましくない脈管形成と関係する状態が腫瘍の形成を含む請求項25の方法。 27. 該腫瘍が悪性である請求項26の方法。 28. 哺乳動物内のVEGF活性を実質的に阻害する方法であって、請求項1または 12のキメラVEGFレセプタータンパク質の阻害有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法。