JP2000503542A - 造血及び非造血組織からの前駆細胞の分離及び ｉｎ ｖｉｖｏ 骨及び軟骨再生におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 造血および非造血組織からの細胞サブセットを用いて骨−および軟骨再生を行う。ＣＤ３４＋細胞上の造血細胞表面マーカーＣＤ３４およびその他のマーカーを識別する抗体およびその他の試薬を用いて、骨および軟骨前駆細胞を末梢血液、骨髄および脂肪組織から分離する。前駆細胞を、担体物質と共に、または担体物質なしで骨−または軟骨修復を必要とする体部位に、in vitro 培養を必要とせずに移植することによって、前記前駆細胞が in vivo 骨または軟骨再生のために用いられる。前駆細胞は補装具に植え付けを行ってインプラント性を向上させるためにも使用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 造血及び非造血組織からの前駆細胞の分離及び IN VIVO 骨及び軟骨再生におけ るそれらの使用 発明の背景 本発明は概ね前駆細胞の分離、および骨および軟骨再生法におけるそれらの使 用に関するものであり、より詳細に述べるならば、細胞表面抗原ＣＤ３４、およ びＣＤ３４＋細胞上のその他の前駆細胞表面抗原を利用して、種々の体組織型か ら前駆細胞を分離するための直接的方法に関する。 骨形成および軟骨形成はかなりの医学的および臨床的関連性を有する非常に複 雑な生物学的プロセスである。例えば、先進国では年間１,４００,０００件以上 の骨移植治療が行われている。これらの処置の大部分は関節置換手術後、または 外傷の外科的再構成中に行われる。骨移植処置の成功または失敗は移植部位の生 命力、移植片の処理、そして同種移植の場合は、ドナーとホストとの間の免疫学 的適合性に大きく依存する。適合性の問題は自己移植法の場合重要な要件として は大巾に除外することができる。自己移植法の場合は骨組織を患者の或る部位か ら取り、他の部位に移植する。自己骨移植は概ね成功する一方、それらは移植材 料の採取のために付加的手術を必要とし、ホストの手術痛、出血および感染症を 伴うことが稀ではない。 軟骨再生および置換処置には多分より大きい問題がある。骨形成とは異なり、 軟骨形成は、損傷軟骨組織を修復するようには起こらないのが普通である。臨床 的に意味のあるやり方で損傷軟骨を修復する試みにおいては成功率が非常に限ら れている。多くの場合、軟骨損傷の最も効果的治療は人工関節置換である。 現在使用できる骨移植および軟骨再生法で直面するこれらのおよびその他の困 難のため、細胞−および分子ベースの骨形成および軟骨形成の研究が強力に推進 される結果となった。骨髄およびその他の組織からの骨および軟骨前駆細胞の同 定および分離に関して、今日までに若干の有望な研究がある。 骨髄の複雑さを洞察した初期研究は、致命的照射を受けた動物が骨髄移植によ って救助されることを証明し、骨髄には全造血系を再生する能力を有する回復因 子が含まれることを示唆した。より最近の実験では、骨髄を in vivo で拡散チ ェンバーで移植したとき、それは骨およびその他の間葉組織を再生する能力を有 することも示された。(例えばフリーデンスタイン（Friedenstein）ら“骨髄細 胞の移植における骨形成(Osteogenesis in transplants of bone marrow cells) "J.Embryol.Exp.Morph．１６巻、３８１−３９０ページ、１９６０；オーエン（ M.Owen）“骨髄の造血能力(The osteogenic potential of marrow)”UCLA symp. on Mol.and Cell.Biol．４６巻、２４７−２５５ページ、１９８７、を参照され たい)。この種の結果から、骨髄が、間葉、造血、および基質系の種々様々の異 なる細胞型に分化する能力を有する、幹細胞として知られる多能性細胞集団を１ つ以上含むとする結論が導かれた。 骨髄にあらわれるような、細胞型の多様性の基礎にある生物学的分化のプロセ スは、未分化の始原細胞型から、分化した決定された細胞型が生まれる一般的プ ロセスである。分化とは、好都合に或る経路に沿って連なる段階-それら各段階 は特異的な遺伝的および表現型的特徴を潜在的に有する特殊細胞型によって占め られる―として考えられている。分化の典型的コースにおいて、多能性幹細胞は １つ以上の中間段階細胞分割を通って進み、最後は１つ以上の特殊化細胞型、例 えばＴリンパ球および骨細胞の外観となる。完全に分化した細胞型の前の未決定 の細胞型、或いは真の幹細胞であるかも知れないし、そうでないかも知れない未 決定の細胞型を前駆細胞と定義づける。 特殊経路を下る分化をトリガーする正確なシグナルは完全にはわかっていない とはいえ、種々の化学走化性、細胞性、およびその他の環境シグナルが役割を演 じることは明らかである。間葉系統内では、例えば in vitro で培養した間葉幹 細胞（ＭＳＣ）が in vivo および in vitro で、それら細胞が置かれた組織環 境または培養培地に応じて誘導され、骨または軟骨に分化することができた。( 参照例：ワキタニ（S.Wakitani）ら“関節軟骨の広範な全厚（full-thickness） 欠損の間葉細胞基礎−修復（Mesenchymal cell-based repair of large,full-th ickness defects of articular cartilage)”J.Bone and Joint Surg．７６−Ａ 、５７５−５９２ページ（１９９４）；ゴシマ（J.Goshima）、ゴールドバー グ（VM Goldberg）、カプラン（AI Caplan)、“燐酸カルシウム セラミックブロ ックにおいて in vivo 測定した培養-増殖ラット骨髄間葉細胞の骨形成ポテンシ ャル（The osteogenic potential of culture-expanded rat marrow mesen chym al cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks”Clin.Ortho p.２６２巻、２９８−３１１ページ（１９９１）；ナカハラ（H Nakahara）ら“ 骨膜由来細胞からの骨および肥大軟骨の in vitro 分化( In vitro differentia tion of bone and hypertrophic cartilage from periosteal-derived cells)” Exper.Cell Res.１９５巻、４９２−５０３ページ（１９９１）)。 この種の研究は結論的に、ＭＳＣが軟骨、骨、鍵、靭帯、およびその他の結合 組織型を含める種々の異なる細胞型に分化する能力を有する細胞集団であること を示した。注目すべきは、すべての明白な間葉組織型が明らかに一般的前駆幹細 胞、すなわちＭＳＣから誘導されることである。ＭＳＣそのものは、明らかに分 化しつつある細胞型の三要素―造血−、間葉−、および基質細胞系統を含む―と 密接に関係している。造血幹細胞（ＨＳＣ）は自己再生能力および全血球系生成 能力を有し、一方基質幹細胞（ＳＳＣ）は自己再生能力および造血微小環境生成 能力を有する。 骨髄にある複合細胞型サブ集団（すなわち造血、間葉および基質）がそれら自 体共通の祖先をもつ子孫であるかどうかは、興味をそそられる、しかし矛盾する 展望である。祖先連鎖（ancestral linka）e)の探索は実験科学者にとって魅力 的である。前駆体および幹細胞集団の関係を確認するには“分化抗原”と呼ばれ る共通の細胞表面マーカー−−その多くは分化過程において一過性の進化関連性 様式であらわれるー−の確認が必要−ある。例えば或るグループはＭＳＣ、ＨＳ ＣおよびＳＳＣ間の祖先の関連性を報告した;ただし後に部分的に取り消した（ フアング（S.Huang）&タースタッペン（L.Terstappen）“単一ヒト骨髄幹細胞か らの造血微小環境および造血幹細胞の形成（Formation of haematopoietic micr oenvironment and haematopoietic stem cells from single human bone marrow stem cells)”Nature、３６０巻、７４５−７４９ページ、１９９２；タースタ ッペン＆フアング“骨髄幹細胞の分析(Analysis of bone marrow stem cell)”B 1ood Cells、２０巻、４５−６３ページ、１９９４；ウォラー（EK Waller）ら “再評価された共通幹細胞仮説：ヒト胎児骨髄は造血−および基質前駆細胞の 別々の集団を含む（The Common stem cell hypothesis reevaluated:human feta l bone marrow contains separate populations of hematopoietic and stromal progeitors)”Blood、８５巻、２４２２−２４３５ページ、１９９５）。しか し他のグループによる研究は、ネズミ骨芽細胞がＬｙ−６−ファミリーの分化抗 原を有することを証明した。この研究結果は本発明に関連して重要である、なぜ ならばＬｙ−６−抗原はネズミ造血系統の細胞によっても表現されるからである 。(ホロウィッツ（M.C.Horowitz）ら“ネズミ骨芽細胞によるＬｙ−６分化抗原 の発現および調節(Expression and regulation of Ly-6 differentiation antig en by murine osteoblasts)”内分泌学（Endcrinology）１３５巻、１０３２− １０４３ページ、１９９４)。こうして共通の祖先から発している間葉−および 造血細胞型の間には密接な直系関係がある。この問題に関する最終的答えは今後 の研究に待たなければならない。 ヒト造血系の分化の過程を辿るための最も有用な分化抗原の１つは、ＣＤ３４ として公知の細胞表面抗原である。ＣＤ３４は正常成人骨髄細胞の約１％ないし ５％に、発達的、段階特異的に発現する(シヴィン（CI Civin）ら、“造血の抗 原的分析。III．ＫＧ−１ａ細胞に対して生ずるモノクローナル抗体によって決 定される造血前駆細胞表面抗原(A.hematopoietic progenitor cell surface ant igen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1a cells)”Ｊ Im munol、１３３巻、１５７−１６５ページ、１９８４)。ＣＤ３４＋細胞（ＣＤ３ ４陽性細胞）は未成熟芽細胞と、わずかなパーセントの、骨髄性、赤血球性およ びリンパ性系列の成熟した系統−単分化能細胞との混合物である。多分ＣＤ３４ ＋の１％が真のＨＳＣで、残りの数が特定な系統に決定される。ヒトにおける結 果は、末梢血液または骨髄から分離されるＣＤ３４＋細胞が一生のための全造血 系を再構成することができることを証明した。そこで、ＣＤ３４はＨＳＣおよび 造血前駆細胞のマーカーである。 ＣＤ３４は造血細胞型のマーカーとして広く認められているが、in vivo で骨 形成ポテンシャルを有する前駆細胞の確実なマーカーとしてはこれまで認められ ていない。反対に、先行技術は、骨前駆細胞は元は造血性でなく、骨前駆細胞 は造血細胞表面抗原ＣＤ３４を発現しないことを教示している（ロング(MV Long )、ウィリアムズ（JL Williams）、およびマン（KG Mann）“ヒト造血微小環境 における骨関連蛋白質の発現(Expression of bone-related proteins in the hu man hematopoietic microvironment)”J.Clin.Invest.８６巻、１３８７−１３ ９５ページ、１９９０；ロングら、“骨形成性増殖因子によるヒト骨髄由来骨前 駆細胞の調節(Regulation of human bone marrow-derived osteogenic growth f actors)”J.Clin.Invest.９５巻、８８１−８８７ページ、１９９５；ハイネス ワース（SE haynesworth）ら、“ヒト骨髄由来間葉細胞上の細胞表面抗原はモノ クローナル抗体によって検出される(Cel1 surface antigens on human marrow-d erived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies”Bone、１ ３巻、６９−８０ページ、１９９２)。 今日までのところ、骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞の最も一般的ソース は骨膜および骨髄である。多くの研究者は in vitro アッセイのために骨膜から 分離した細胞を使用している(参照：ビンダーマン（I Binderman）ら“分離骨細 胞の培養による骨組織の形成(Formation of bone tissue in culture from isol ated bone cells)”J.Cell Biol.６１巻、４２７−４３９ページ、１９７４)。 骨および軟骨形成の研究のために骨髄を培養して前駆細胞を分離するという概念 の先駆者はフリーデンスタイン（A.J.Friedenstein）である。彼は骨を形成でき る細胞（ＣＦＵ−ｆ）を骨髄から分離し増殖させる培養法を開発した(フリーデ ンスタインら“モルモット骨髄および脾細胞の単層培養における線維芽細胞コロ ニーの発達(The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea pig bone marrow and spleen cells)”Cell Tiss.Kinet.３巻、３９ ３−４０２ページ、１９７０)。他の研究者はフリーデンスタインの培養系を用 いて骨芽細胞の起源を広く研究した(参照：オーエン、“The origin of bone ce lls in the postnatal organism”Arthr.Rheum.２３巻、１０７３−１０８０ペ ージ、１９８０)。フリーデンスタインは、骨髄からのＣＦＵ−ｆ細胞が、移稙 したとき、骨、軟骨、および線維組織を形成することを示した；ただしその他の ソース、例えば胸腺、脾臓、末梢血液、および腹腔液などから培養したＣＦＵ− ｆ細胞は誘導剤を付加しない限り骨または軟骨を形成しないことも示した。フリ ーデンス タインは最近ＣＦＵ−ｆの臨床的有用性の可能性を論じ、克服しなければならな いいくつかの障害、例えば数回継代培養の必要性およびその細胞の移植法の開発 の必要性などを指摘した(フリーデンスタイン“骨髄基質線維芽細胞(Marrow str omal fibroblasts)”Calcif.Tiss.Int.５６（Ｓ）巻：Ｓ１７ページ、１９９５) 。 同様に、現在までの軟骨前駆細胞の最も一般的なソースは骨膜、軟骨膜および 骨髄である。骨髄から分離した細胞も in vivo で軟骨を生成するために用いら れている（ワキタニ（S.Wakitani）ら、“関節軟骨の広範全厚損傷の間葉細胞− 基礎−修復”J.Bone and Joint Surg．７６−Ａ、５７５−５９２ページ(１９９ ４))。骨膜−および軟骨膜グラフトも軟骨修復のための軟骨前駆細胞ソースとし て用いられている（オドリスコル（SW O'Driscoll）ら、“連続的受動的運動の 影響下における関節表面の広範全厚欠損における遊離自己骨膜グラフトによる再 生関節軟骨の耐久性(Durability of regenerated articular cartilage produce d by free autologenous peristeal grafts in mayor full-thickness defects in joint surface under the influence of continuos passive motion"J.Bone and Joint Surg、７０−Ａ、１０１７−１０３５ページ、１９８６；クッツ（R. coutts）ら、“ウサギの全厚関節欠損における肋骨軟骨膜自己グラフト(Rib per ichondral autografts in full-thickness articular defects in rabbits)” Clin Orthop.Res.２７５巻、２６３−２７３ページ、１９９２)。 一連の特許においてカプラン（Caplan）らは骨髄から間葉幹細胞（ＭＳＣ）を 分離し増殖させる方法を開示している。（米国特許第４，６０９，５５１号；第 ５，１９７，９８５号；および第５，２２６，９１４号）カプラン法は基礎的２ 段階を含む：１）骨髄を採取し、２）採取した骨髄に含まれるＭＳＣを in vitr o 培養で２ないし３週間増殖させる。この方法は、或る特定の培養培地がその他 の細胞型に対するよりもＭＳＣの付着および増殖に好都合に作用するという利点 を有する。この基礎的方法の変法においては、ＭＳＣは、in vitro 培養に先立 って、先ず最初にＭＳＣに対する特異的抗体を用いて骨髄から選択される。（カ プランおよびハイネスワース；ＷＯ９２／２２５８４）In vitro で増殖させた 、骨髄分離ＭＳＣをそれからレシピエントの移植修復部位に挿入することができ る。(カ プラン、“前駆細胞(precursor cells cells)”J.Ortho.Res．９巻、６４１ペー ジ、１９９１；ハイネスワース、ベイバー(M.A.Baber)、カプラン、“ヒト骨髄 由来間葉細胞上の細胞表面抗原はモノクローナル抗体によって検出される(Cells surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies”Bone１３巻、６９−８０ページ、１９９２)。 前駆細胞の分離のために現在用いられている方法は考慮すべき多数の欠点を有 する。まず第一に、それらの方法は骨髄またはその他の組織を採取しなければな らない。骨髄の採取は付加的外科処置を必要とし、麻酔、出血、感染および術後 痛からくる合併症の可能性を伴う。骨膜または軟骨膜の採取はさらに侵襲的であ る。第２にカプラン法は、骨髄採取ＭＳＣをその後の使用に供する前に、それら 細胞をかなり長期間（２−３週間）in vitro 培養しなければならない。この付 加的細胞培養段階のためにこの方法は時間および経費がかかり、人為的誤差の機 会がより多くなる。 したがって、in vivo 骨および軟骨再生法に用いることができる骨形成性およ び軟骨形成性ポテンシャルを有する前駆細胞を同定し、分離するためのより迅速 かつ簡単な方法が必要である。 発明の概要 種々の造血および非造血組織から骨または軟骨を生成するポテンシャルを有す る前駆細胞を分離する方法を提供することが本発明の目的である。 試薬とＣＤ３４＋細胞上の細胞表面抗原ＣＤ３４またはその他の表面抗原との 結合に基づいて、骨−または軟骨生成ポテンシャルを有する前駆細胞を、末梢血 液、骨髄または脂肪組織から分離する方法を提供することも本発明の目的である 。本発明のもう一つの目的は、組織を構成する細胞の沈降差に基づいて、骨−ま たは軟骨生成ポテンシャルを有する前駆細胞を脂肪組織から分離する方法を提供 することである。 本発明のさらにもう一つの目的は、末梢血液、骨髄、または脂肪組織から分離 したＣＤ３４＋前駆細胞の移植を含める in vivo 骨−および軟骨再生法を提供 することである。 本発明のまた別の目的は、末梢血液、骨髄、または脂肪組織からＣＤ３４＋前 駆細胞を分離し、修復を必要とする結合組織部位に前駆細胞を直ちに移植するこ とを含み、それら前駆細胞の in vitro 培養の必要のない、in vivo 骨−または 軟骨再生のための直接的一段階法を提供することである。 本発明のもう一つの目的は骨人工補装具の移植可能性を高める方法を提供する ことである。 本発明のもう一つの目的は、装具に、患者の末梢血、骨髄または軟骨組織から 分離した骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞を植え付けてある、改良骨移植人 工補装具を提供することである。 これらのおよびその他の目的は本発明によって準備される。 骨形成性および軟骨形成性ポテンシャルを有する自己前駆細胞の分離の可能性 は、骨−および軟骨修復治療に、または人工補装具と併用する前記修復治療に臨 床的に密接に関連する。本発明は末梢血液、骨髄、および脂肪組織を含める種々 の組織型から、骨−または軟骨生成ポテンシャルを有する前駆細胞を分離する簡 単な方法を提供する。前駆細胞は、ＣＤ３４＋前駆細胞の表面にあるＣＤ３４お よびその他のマーカー、例えばＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７４、およびＴＨＹ１ などを識別する試薬によって分離される。重要なことは、本発明では、分離した 前駆細胞を、その後 in vivo 使用する前に in vitro 培養する必要がないこと である。実際、本発明によって分離された前駆細胞は骨−または軟骨再生のため に直ちに in vivo 移植することができる。こうして、他の方法では前駆細胞の invitro 培養のために必要となる２ないし３週間の遅れが除去され、そのためこ の方法は臨床的環境にとって、経済的、実際的そして有用となる。 よつて本発明は、骨または軟骨を形成するポテンシャルを有する前駆細胞を造 血および非造血組織、例えば末梢血液など、から直接分離する方法に関するもの である。この方法は、組織サンプルを集め、そのサンプルを、ＣＤ３４＋前駆細 胞上の抗原ＣＤ３４またはその他の抗原を識別する抗体またはその他の試薬と接 触させ、試薬−前駆細胞コンプレックスを未結合物質から、例えば親和性クロマ トグラフィーによって分離する諸段階を含んでなる。本発明の方法は、骨−およ び軟骨再生のために in vivo において直接用いることができる。 一面において、本発明は末梢血液、骨髄または脂肪組織から、骨または軟骨形 成ポテンシャルを有する前駆細胞を分離する方法である。 他の一面において、本発明は、細胞表面マーカーＣＤ３４を担持する細胞を造 血および非造血組織から選択することに基づいて、骨−または軟骨形成ポテンシ ャルを有する前駆細胞を分離する方法である。 もう一つの面では、本発明は、末梢血液、骨髄、または脂肪組織から分離した ＣＤ３４＋前駆細胞を利用する骨−または軟骨再生法である。 好適実施態様の説明 本開示全体に用いられる用語を以下に定義する：脂肪組織（Adipose Tissue） 含脂肪細胞（adipocyte）および微小血管細胞を含む多細胞型を含む複合組織 。脂肪組織は体内の前駆細胞の最も便利なソースの一つである。ここに用いる用 語“脂肪組織”は体内の脂肪（fat）およびその他の微小血管組織のソース、例 えば胎盤または筋肉などを意味するものとする。この用語は結合組織、血液学的 組織、骨膜、および軟骨膜を特異的に除外する。軟骨形成性 軟骨増殖を促進する能力。この用語は、軟骨増殖を促進する細胞、例えば軟骨 細胞、およびそれ自体軟骨細胞に分化する細胞に使用される。この用語は或る増 殖因子、例えば軟骨増殖を促進するＴＧＦ−β、などにも適用される。結合組織 骨、軟骨、靭帯、鍵、メニスカス、および関節嚢を含める体内の多数の構造組 織のいずれかである。分化 始原的、未分化細胞が一連の細胞分割を受け、より特異的機能を有する子孫細 胞を生ずる生物学的プロセス。最終的分化に至る経路は、特異的遺伝−および表 現型特性を有する高度に特殊化された細胞で終わる。過去の一般的知識は、分化 は一方向のみに一比較的特殊化されていないものから、より特殊化されたものへ ―進むことを教えている。この教義は、実際はこの経路は二方向であることを示 唆する新しい結果の挑戦を受けている。実際、或る条件下では、より特殊化した 細胞は、より大きい特殊化の方向への流れを効果的に逆転させる子孫を生成する らしい。造血幹細胞 自己再形成能力およびすべての血液細胞型に分化する能力を有する始原細胞。間葉幹細胞 自己再生能力、および多くの別々の系統を通じて分化し、広範囲の種類の表現 型、例えば骨、軟骨、鍵、靭帯、骨髄基質、脂肪細胞、真皮、筋肉、および結合 組織などの表現型を有する子孫細胞を形成する能力を有する始原細胞。微小血管細胞 例えば内皮、平滑筋、および血管周囲細胞などの微小血管系の構造を構成する 細胞。骨形成性 骨生産を促進または発生する能力。この用語は骨増殖を促進する能力を有する 骨芽細胞、またはそれ自体骨芽細胞に分化できる細胞に使用される。この用語は 骨増殖を促進する能力をもつ増殖因子にも適用される。前駆細胞 特異的機能を行うように分化するポテンシャルを有する細胞。幹細胞 自己再形成能力および種々の分化細胞型を発生する能力を有する多能性前駆細 胞。 本発明は２つの驚くべき発見を前提とする。第一に、in vivo で結合組織を形 成するポテンシャルを有する前駆細胞を、造血−および非造血組織ソース（末梢 血液および脂肪組織を含む）から分離できる。第二に、細胞表面マーカーＣＤ３ ４ ―結合組織前駆細胞を確認するもの（これまでは未確認であつた）― を、 in vivo 骨−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞のマーカーとして利 用することができる。 発明者は、前駆細胞のための２つの便利な新しいソース（すなわち末梢血液お よび脂肪組織）と、in vitro 培養を必要としない骨髄ソースを発見した。骨形 成および軟骨形成前駆細胞のためのソースとして骨髄または骨膜を用いる先行方 法とは異なり、本発明は、より便利に採取した組織、例えば末梢血液および脂肪 組織からこれらの細胞を分離することができる。骨髄および骨膜以外の組織から 骨形成および軟骨形成前駆細胞を分離できれば、さもなければ複雑であろう方法 をかなり便利にそして簡単にすることができる。 １実施態様において本発明は、ＣＤ３４＋細胞上の抗原ＣＤ３４およびその他 の細胞表面マーカーの発現に基づいて、結合組織生成ポテンシャルを有するヒト 前駆細胞を分離することができる親和性方法である。ＣＤ３４＋細胞上のその他 のマーカーの若干例はＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７４、およびＴＨＹ１を含める ：このリストは制限するためのものではない。その他の実施態様では、示差的沈 降特性に基づいて前駆細胞を脂肪組織から分離する。重要なことは、これまでの 方法と異なり、本発明は分離した前駆細胞を、in vitro 培養を必要とせずに骨 および軟骨再生法のために直接使用できることである。その結果、本発明はこれ までに報告された方法より速く、容易に実施することができる。 Ｉ．前駆細胞の分離 １実施態様において、前駆細胞を分離する本発明の方法は、体組織サンプルを 集め、そのサンプルと、前記前駆細胞の表面の抗原を識別してそれに結合する抗 体またはその他の試薬とを接触させ、その後前駆細胞−試薬コンプレックスを未 結合物質から、例えば親和性クロマトグラフィーによって分離することを含む。 この方法は末梢血液、骨髄、またはその他の組織、例えば脂肪組織などに適用で きる。しかし分離の容易さおよび単純さでは血液が好適ソースである、なぜなら ば外科的処置が必要ないからである。 （ａ）前駆細胞のソースとしての末梢血液 例として、血液約１単位を患者の腕から適切な手段、例えば注射器、によって 採取する。臨床的環境において特に魅力的な方法はアフェレーシスである；それ は赤血球を除去するという付加的利点も有する。赤血球の除去は必須ではない、 ただし、それは方法の性能を高め、好ましい。赤血球はサンプルから、適した手 段、例えば細胞溶解、遠心分離、または密度勾配分離などによって除去される。 例えばクエン酸、ヘパリンまたはＥＤＴＡで処理することによってサンプルの凝 固を防ぐことも好ましい。 前駆細胞の収率は有核血球集団の約０．１％ないし約０.５％であると予想さ れる。収率はドナーの健康および年齢、およびサンプルの新鮮さによって変動す るかも知れない。採血前に患者に薬剤または増殖因子を投与すると収率は劇的に 上昇するらしい。この方法は凍結下で保存されていたサンプルでも行うことがで きるが、新鮮サンプルの方が好ましい。 末梢血液から前駆細胞を分離する方法における重要な段階は、血液サンプルを 、ＣＤ３４＋細胞上の細胞表面マーカーを識別し、それに結合する試薬と接触さ せる段階を含める。ＣＤ３４＋細胞を識別し、それに結合する試薬は本発明の範 囲内である。適切な試薬としては、レクチン類、例えば大豆凝集素（ＳＢＡ）、 抗体類、および接着分子、例えばＬ−セレクチンを含める。 好適実施態様においては、サンプルを抗ＣＤ３４抗体と接触させる。モノクロ ーナル（ｍＡｂ）かポリクローナル抗体のどちらかを用いる。ＣＤ３４＋細胞上 のＣＤ３４およびその他の細胞表面抗原に向かう抗体の製造法は熟練せる当業者 には公知である。ＣＤ３４＋細胞上のＣＤ３４およびその他の細胞表面マーカー に向かう適したヒト抗体の標本はセルプロ社(Cell Pro Inc.)、Bothell、ＷＡま たはベクトン-ジキンソン（Becton-Dickinson）、Mountain View、ＣＡから市場 で入手できる。 前駆細胞上の適した細胞表面抗原は、ＣＤ３４＋細胞上のＣＤ３４およびその 他の抗原、例えばＴＨＹ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ７４を含める。好 適細胞表面マーカーはＣＤ３４である。この方法は、前駆細胞のためのマーカー としてＣＤ３４＋細胞上のその他の細胞表面抗原を用いることによって成功する ことが期待される。 サンプルと抗体とを結合できるように短時間インキュベーションした後、前駆 細胞−抗体コンプレックスを適切な方法、例えば親和性クロマトグラフィー、磁 気ビーズ、およびパンニングなどによって回収する。好適実施態様において、回 収は親和性クロマトグラフィーによって行われる。(例えばベレンソン（RJ Berenson）ら、“アビジン−ビオチン免疫吸着法を用いる生育可能細胞集団の正 の選択(Positive selection of viable cell populations using avidin-biotin immunoadsorption)”J.Immunolog.Meth.９１巻、１１−１９ページ、１９８６) つまり、親和性回収法はビオチン−アビジン結合反応を利用する；この反応に おいて抗体が適切な方法によってビオチンに結合する。反応混合物をアビジン標 識基質充填カラムを通すことによって、抗体−ビオチン標識化前駆細胞コンプレ ックスを未結合物質から分離することができる。未結合物質はカラムを洗浄する ことによって除去される。有用な市販細胞分離キットはビオチン標識ヒト抗ＣＤ ３４およびアビジン標識化基質充填カラムを含む（セルプロ社、Bothell、ＷＡ 、から販売される“CEPRATE?LC″)。 間接的標識化法も本発明の範囲内である。例えば、一次抗体を前駆細胞表面マ ーカーに対して向け、ビオチンで標識化した二次抗体を一次抗体に向ける。或る いは、二次抗体を適切な固体支持体物質に結合させてもよい。 負の選択スキームも本発明の範囲内にあるものとする。負の選択を用いるとき 、抗体またはその他の試薬はＣＤ３４＋細胞にはない細胞表面マーカーに対して 向けられる。 （ｂ）前駆細胞のソースとしての骨髄 血液から前駆細胞を分離するために前に開示した方法を、実質上同じやり方で 骨髄に適用してもよい。骨髄を適切なやり方で、例えば腸骨稜吸引によって集め る。好適実施態様において、骨髄は抗凝固剤、例えばＥＤＴＡ、ヘパリンまたは クエン酸塩などで処理され、有核細胞は適切な手段、例えば血液溶解または密度 勾配遠心分離によって非有核細胞から分離される。 ＣＤ３４＋細胞の表面上のＣＤ３４、またはその他の若干の抗原を識別し、そ れらに結合する試薬を用いて、ＣＤ３４細胞表面抗原を発現する前駆細胞を骨髄 から分離する。適切な試薬は抗体、レクチン、および接着分子を含める。結合し た細胞は親和性クロマトグラフィー、磁気ビーズ、またはパンニング法によって 未結合細胞から分離する。 好適実施態様において、ＣＤ３４に向かう抗体を結合反応に用い、以下の例に より詳細に開示するように、結合した細胞を親和性クロマトグラフィーによって 未結合細胞から分離する。 （ｃ）前駆細胞のソースとしての脂肪組織 この章の始めに定義したように、“脂肪組織”とはこの開示では遺伝的意味で 用いられ、微小血管細胞を含む脂肪組織およびその他の組織型（結合組織、血液 学的組織、骨膜および軟骨膜を除く）を意味する。毛細血管を作る微小血管組織 は、血液輸送系の必須部分であり、からだ中いたるところにある。微小血管組織 は少なくとも３種類の細胞型 − 内皮、血管周囲細胞、および平滑筋 − か らなる。初期研究は、微小血管組織が骨代謝に重要な役割を演ずるらしいことを 示唆した。鍵となる観察は、微小血管細胞および組織が骨修復および新しい骨増 殖の部位に新たに現れ、増殖することであった。このような観察は、内皮細胞、 血管周囲細胞、またはその両方が骨前駆細胞であり、あるいは微小血管細胞が骨 前駆細胞にマイトジェン（有糸分裂促進）効果をあらわすという考えに導く。（ 参照例：ブライトン（C.Brighton）ら、“潜在的骨形成前駆細胞としての血管周 囲細胞（The pericyte as a possible osteoblast progenitor cells）″Clin.O rthop.２７５巻、２８７−２９９ページ、１９９２）In vitro 培養細胞を用い たより最近の研究は、微小血管細胞による前駆体様細胞増殖効果もマイトジェン 効果も示唆している。(ジョーンズ(AR Jones)ら、“微小血管内皮細胞および血 管周囲細胞はラット頭蓋冠骨細胞培養において増殖を高め、骨芽細胞表現型マー カーを抑制する（Microvessel endothelial cells and pericytes increase pro liferation and repress osteoblast phenotype marakers inrat calvarial bon ecell cultures)”J.Ortho.Res.１３巻、５５３−５６１ページ、１９９５)。し たがって、微小血管細胞集団のなかには骨形成性および軟骨形成性ポテンシャル を有する前駆細胞がある。 本発明の方法には、脂肪組織に適用するとき、２実施態様がある。最初の実施 態様では、組織と、ＣＤ３４＋細胞上のＣＤ３４またはその他の表面抗原を識別 する試薬とを接触させる。末梢血液および骨髄を用いる場合のように、脂肪組織 で使用するために適した結合試薬は、レクチン、抗体、および接着分子を含める 。脂肪組織に適用するような親和性結合法は、抗原結合試薬と共にインキュベー ションする前に単一−細胞懸濁液を生成する段階を必要とするという点で血液お よ び骨髄に適用する方法とは異なる。適したいかなる解離酵素、例えばコラゲナー ゼなど、も使用することができる。試薬に結合する細胞は適切な手段、例えば親 和性クロマトグラフィー、磁気ビーズまたはパンニング法によって未結合細胞か ら分離できる。 脂肪組織に適用する本発明の好適実施態様において、沈降法を用いて骨形成お よび軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞に富む細胞フラクションを得る。組 織を採取し、酵素で消化して単一−細胞懸濁液を形成した後、細胞をベンチトッ プの重力沈降法によって、または遠心分離によって分離する。 例により、脂肪は脂肪吸引法またはその他の適した方法によって確保すること ができた。約１０ｃｃないし３０ｃｃの脂肪組織を十分な解離酵素（例えばコラ ゲナーゼ）で消化して単一−細胞懸濁液を生成する。酵素消化のための適した反 応条件は、熟練せる当業者には公知のように使用酵素によって変わる。酵素消化 後、脂肪細胞をその他の細胞型から遠心分離によって分離する。脂肪細胞は表面 に浮き、一方、前駆細胞を含めるより緻密な細胞は底部に集まり、その後適切な 手段で分離することができる。収穫した前駆細胞の洗浄後、それらを適した担体 と混合し、直ちに修復を必要とする部位に in vivo 移植することができる。 ＩＩ．In vivo 間葉組織再生 本方法により回収した前駆細胞は種々の臨床的応用のために有用である。例え ば、それらをそれ以上処理せずに患者の結合組織部位に移植し、損傷した骨また は軟骨の修復を促進することができる。 これまでの方法とは異なり、本発明は、in vivo 適用のために使用する適切な 細胞型または十分量の前駆細胞を得るための in vitro 培養を必要としない。本 発明は、骨−および軟骨形成性前駆細胞が種々の造血性および非造血性体組織、 例えば末梢血液および脂肪組織などから分離されるという予想外の研究結果を利 用している。この研究結果は、これまで評価されなかった前駆細胞貯蔵庫を生み 出した；この貯蔵庫の前駆細胞は好都合に引き出され、in vitro 培養によって 細胞数を増加する付加的な時間のかかる段階を必要とせずに in vivo 使用のた めに十分な細胞を与えることができる。本発明のこの面は時間とお金を節約し、 患者にとっては合併症および痛みのリスクをより少なくする。 単なる例として、そして本発明を制限するものではなく、本発明によって適し た組織ソースから分離される前駆細胞を骨−または軟骨再生を必要とするいかな る結合組織にも移植することができる。適した移植法には手術または関節鏡注入 が含まれる。 生物学的分化を決める要因は完全には理解されていないが、前駆細胞は、修復 を必要とする体部位に移植されると、骨または軟骨に分化することは知られてい る。本発明の方法によって分離した前駆細胞は単独で、またはＴＧＦ−βのよう な増殖因子とあらかじめ混合して、移植することができる。熟練せる当業者には 公知のように、細胞を適した担体物質と混合し、移植細胞の転位を阻止すること が好ましい。適した担体の非制限的リストは、例えば、コラーゲンまたはゼラチ ンのような蛋白質類；澱粉、多糖、蔗糖、メチルセルロース、寒天、またはアル ギン酸塩などの炭水化物類；プロテオグリカン類；合成ポリマー類；セラミック ス；または燐酸カルシウムを含める。 表２に示すデータは、in vivo 適用のための本発明の実施性能をあらわす。こ れらの実験に用いたラット頭蓋冠モデルは、モノクローナル抗体を用いて骨髄か ら分離したＣＤ３４＋細胞は in vivo 環境において骨増殖を陽性対照（自己グ ラフト）と同様に効果的に促進することを示した。データは、抗体そのものが、 多分、補体系との相互作用によって、結果の結末に影響を与え得ることも示して いる。例えば、ｍＡｂ ５Ｅ６が結合した細胞は、ラット頭蓋冠モデルにおいて 骨増殖を刺激しなかった。試験した両抗体共ＣＤ３４を識別し、ＩｇＭアイソタ イプであるとはいえ、５Ｅ６は補体に効果的に結合し、２Ｃ６は結合しない。 III．人工補装具 臨床的に有用な種々の人工補装具が骨および軟骨移植法に使用するために開発 されている。(参照例：“骨グラフトおよび骨置換物（Bone Grafts and Bone Su bstitutions） ″ヘーベル（M.B.Habal）＆レディ（A.H.Reddi）編、サウンダー ズ社（W.B.Saunders Co.）、１９９２）例えば効果的膝および股関節置換装具は 臨床的環境に広く用いられてきたし、現在も用いられている。これら装具の多く は体内で安全に機能する低免疫活性を有する種々の無機材料を用いて作られてい る。試用され、品質が証明された合成材料の例としては、チタン合金、燐酸カ ルシウム、セラミックヒドロキシアパタイトおよび種々のステンレス鋼およびコ バルト−クロム合金がある。これらの材料は構造的支持体となり、その中へのホ スト血管化および細胞移動が起こり得る足場を形成することができる。 表面−織物の人工補装具は裸の無機構造と同様にホスト内に効果的に固定され るとはいえ、それらの付着は、骨形成前駆細胞、または骨形成細胞を引き付け、 活性化する増殖因子を植え付けることによって改善する。このような“生物学的 植え付け(seeding)”は、ホスト血管化および細胞移動が起こり得る肥沃な環境 を提供することによって付着生成効果および−速度を高めると考えられる。 本発明はこのような人工補装具に“植え付ける(seed)”ために用いる前駆細胞 ソースを提供する。好適実施態様において、前駆細胞を装具に適用する前に先ず 担体物質と混合する。熟練せる当業者に公知の適切な担体はゼラチン、コラーゲ ン、澱粉、多糖、蔗糖、プロテオグリカン、合成ポリマー類、燐酸カルシウム、 またはセラミックスを含める、ただしこれらに制限されるものではない。担体は 、細胞が移植装具の多孔性表面に有用期間確実に保持されるようにする。 本発明の実施のための下記の例証的例を参照することによって、本発明をより 完全に理解することができる。ただしこれらの例は本発明を不当に制限するもの ではない。 例１ 前駆細胞の骨再生能力のための動物モデル ラット頭蓋冠モデルを用いて、in vivo 適用の際の本発明の実施可能性を試験 した。モデルは、ラット頭蓋に外科的に施した頭蓋冠欠損部の骨増殖を促進する 、種々の試験サンプルの能力を評価することからなっていた。頭蓋冠欠損部は約 ３００ｇないし５００ｇの体重範囲を有する齢６ないし９カ月のフィッシャーラ ットに下記の方法によって生起した。動物をケタミン−ロンパン（キシラジン） −アセプロマジン（アセプロマジンマレート）混合の筋肉内注射によって麻酔し 、頭蓋の頭蓋冠部分に外科的切り込みを作った。皮膚フラップをはがした後、頭 蓋の直径８ｍｍの頭蓋冠部分をドリルと冠状鋸と生理食塩液潅注とを用いて除去 した。“ゲルフィルム(GELFILM)”の８ｍｍ直径円板を各欠損部に置いて、露出 した脳と試験物質とを分離し、ホメオステーシスを維持した。この方法で形成 した頭蓋冠欠損部にその後、分離した細胞集団からなる試験サンプルを充填した 。若干の実験では、頭蓋冠欠損部に入れる前に、試験サンプルをラット尾コラー ゲンまたは“アビテン(AVITENE)”ウシコラーゲンからなる担体物質と混合した 。陽性対照は自己移植片からなり、陰性対照は燐酸三カルシウム（ＴＣＰ）担体 のみのインプラントから成っていた。創傷部位を外科的に閉鎖した後、処置動物 を檻に戻し、通常の食物および水で飼育し、手術後２８日目に殺した。 試験サンプルの頭蓋冠欠損部におれる骨増殖生成効果を、欠損部位における新 しい骨形成を推定することによって評価した。そのためには頭蓋冠欠損部におけ る切った骨端間の閉鎖した直線距離を測定するか、または骨増殖の島を記録する かした。スコアリングクリテリアを表１に示す。結果は表２にまとめる。 例２ ラット骨髄からの富有核細胞隼団の分離 齢８ないし１０週の雄フィッシャーラットから取った６個の大腿骨の骨髄腔か らラット骨髄を分離した。殺す前、動物は食物および水の通常食で飼育されてい た。骨髄は、切り取った大腿骨から、約５ｍｌのＡＣＤ緩衝液を含む試験管に流 し込むという方法で抽出された。生の状態の緩衝液ＡＣＤは２.２ｇのクエン酸 三ナトリウム・Ｈ₂Ｏ、０．８ｇのクエン酸、および２.４ｇのデキストロースを １００ｍｌ水に溶解したものである。特に記載がない限り、緩衝液ＡＣＤはＰＢ Ｓによって１５％の濃度に希釈した。抽出した骨髄細胞をピペットで取り、しず かに緩衝溶液に懸濁させた。赤血球を白血球から分離するために、骨髄細胞懸濁 液の下に、比重１.０９のフィコール−ハイペーク（Ficoll-Hypaque）（シグマ ケミカル社、St.Louis、ＭＯ）を敷き、１２００×ｇで２０分間遠心分離した。 遠心分離後、有核細胞を含む中間（インターフェース）層をピペットで取った。 それらの細胞をＡＣＤ５ｍｌ中で洗い、２５０×ｇで６ないし７分間遠心分離し た。ペレットを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ウシ血清アルブミン、燐酸緩衝食塩液；CE PRATELCキットで提供される）で２回以上洗った。すべてのＰＢＳは、凝固を回 避するため、Ｃａ⁺²およびＭｇ⁺²フリーであった。 例３ モノクローナル抗体および親和性クロマトグラフィーを用いるラット骨髄からの ＣＤ３４＋細胞の分離およびラット頭蓋冠モデル in vivo 骨再生におけるその 使用 材料および方法 ラット造血細胞サブ集団の表面上のラットＣＤ３４に対してマウスＩｇＭモノ クローナル抗体２Ｃ６および５Ｅ６が生成した。これらの実験に用いたＣＤ３４ ｍＡｂ'ｓはフォルスター（Dr.Othmar Forster）から贈られたものであり、熟練 せる当業者に公知の方法で作られたものである。ｍＡｂ'ｓ ２Ｃ６および５Ｅ ６と結合した細胞の蛍光区分のために用いる抗マウスＩｇＭ：ＦＩＴＣは、ベー リンガーマンハイムから入手し、カタログ番号＃１００２０５であった。ｍＡｂ ２Ｃ６または５Ｅ６で標識したＣＤ３４＋細胞を親和性カラム法を用いて未結 合細胞から分離した。有用な市販の親和性細胞分離キット、“CEPRATE LC”はセ ルプロ（Cellpro,Inc．Bothell,ＷＡ ９８０２１）から入手することができる。 抗マウスＩｇＭ：ビオチンはサザンビオテック(Southern Biotech)、Birmingham ,AL,から購入した。カタログ番号＃１０２２−０８。 ＣＤ３４表面抗原を担う細胞をラット骨髄から次のように分離した。例２に記 載した方法で分離し、すすいだ有核細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（セルプロ キッ ト）約０．５ｍｌに懸濁した。その後約１μｇ／ｍｌないし４０ｐｇ／ｍｌ濃度 範囲のｍＡｂを或る量加え、混合物を時々しずかに撹拌しながら室温で約１時間 インキュベートした。インキュベーション後、その混合物を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ で１０ｍｌとし、混合物を２５０×ｇで６分間遠心分離した。ペレットを１％Ｂ ＳＡ／ＰＢＳ １０ｍｌにしずかに再懸濁し、さらに２回すすぎ、前記のように 遠心分離した。もう１度再懸濁し遠心分離した後、最終的細胞ペレットを１％Ｂ ＳＡ／ＰＢＳ ２ｍｌに再懸濁し、ビオチニル化抗−マウスＩｇＭと共にインキ ュベートする。 ヤギ抗マウスＩｇＭ：ビオチン（希釈前は０．５ｍｇ／ｍｌ）約１０μｌを前 段階で得た再懸濁ｍＡｂ−細胞ペレットに加えた。混合物をしずかに撹拌しなが ら室温で３０分間インキュベートし、その後細胞を前記のように遠心分離および ＢＳＡ／ＰＢＳへの再懸濁によって２回すすいだ。最終的細胞ペレットを、５％ ＢＳＡ１ｍｌないし４ｍｌ容量中、約１００×１０⁶細胞／ｍｌになるように再 懸濁し、アビジンカラムに担持させる。 抗体−標識化細胞と未標識細胞とを“CEPRATE LC”アビジンカラム上で、その メーカー（セルプロ社、Bothell,ＷＡ）の薦める条件を用いて分離した。つまり 、そのカラムはＰＢＳで平衡化したアビジン基質床を含んでいた。サンプル担持 前に、約５ｍｌの５％ＢＳＡをそのカラムを通した。希釈前細胞サンプルをその 後ゲル基質のテッペンに置き、サンプルが自然に基質ゲル内に入るようにした。 未標識細胞は約３ｍｌから５ｍｌのＰＢＳでカラムから洗い流した。その後ｍＡ ｂ標識細胞は、ＰＢＳでカラムを洗いながら基質をゆすり、カラムをしずかに絞 り出すようにすることによって、基質から遊離し、少量の５％ＢＳＡに集められ た。結合および未結合フラクションから小部分を取り置き、細胞計数およびフロ ーサイトメトリーに用いた。移植実験のための細胞はＰＢＳ／ＢＳＡで２回、Ｐ ＢＳで１回洗っただけであった。結果 各実験は約１０ないし２０×１０⁶の付着細胞を生じ、この数の約半分を頭蓋 冠欠損部に移植した。カラムから取った細胞フラクションの生育活性を血球計を 用いたトリパンブルー細胞数によって調べ、約８５％ないし９７％が生育可能で あることが判明した。付着細胞集団は小芽細胞群であることがわかった。ＦＡＣ Ｓを用いてカラムで分離したＣＤ３４＋細胞の純度を測定した。付着細胞集団は 約５０％純度で、最初の数の約５０％のＣＤ３４＋細胞を含んでいた。 ＣＤ３４＋細胞を適した担体物質と共に、または担体物質を使わずに、ラット 頭蓋冠欠損部に移植した。これらの実験で２種類の担体“アビテン(AVITENE)” およびラット尾コラーゲンを試みた。これらは両方共有用であることが判明した が、ラット尾コラーゲンは最小の炎症反応を示し、そのためより好ましい。コラ ーゲン約５０ｍｇを６０℃でＰＢＳ １ｍｌに溶解し、細胞と混合する前に３７ ℃で平衡化した。若干の実験では、頭蓋冠欠損に移植する前に、コラーゲン溶液 １００ｐｌと細胞ペレットとを混合し、その混合物を４℃に冷やすことによって 、コラーゲンと細胞とを含むペレットを形成した。外科的移植を例１に記載した ように行い、手術後２８日目にレシピエント動物を殺した。 骨形成のための組織学的スコアを表１に示すスキームによって評価した。検討 ｍＡｂ ５Ｅ６によって分離したＣＤ３４＋細胞が in vivo における骨再生 を促進できなかったという研究結果は、この抗体がｍＡｂ ２Ｃ６よりもより効 果的な補体系アクチベーターである（データは示されず）という補助的観察によ って説明できるかも知れない。 例４ （ａ）フィコール分離-全血を用いるラット頭蓋冠モデルにおける骨再生 例１に記載したラット頭蓋冠モデルを用い、フィコール分離−全血の骨再生能 力を測定した。ドナー血液約２．５ｍｌを各レシピエント頭蓋冠に用いた。ドナ ー動物は齢８ないし１０週の雄Ｆ３４４種ラットであった。レシピエントは齢６ ないし８カ月であった。ドナーから、凝固を阻止するためのＡＣＤ溶液約０.５ ｃｃを含む３ｃｃ注射器に採血した。 ＡＣＤ保存溶液 ＡＣＤ使用溶液 ２．２ｇ３クエン酸Ｎａ・２Ｈ₂Ｏ １５ｍｌＡＣＤ保存溶液 ０.８ｇクエン酸・１Ｈ₂Ｏ １００ｍｌＰＢＳ(Ｃａ／Ｍｇ⁺⁺フリー) ２ .４ｇデキストロース １００ｍｌ蒸留水 血液を１５ｍｌ円錐管に入れ、ＡＣＤ使用溶液で５ｍｌにした。そのサンプル の下にフィコールーハイペークを敷き、１２００×ｇで室温で２０分間遠心分離 した。遠心分離後、白血球層を各管からピペットで取った。 フィコール分離血球を直接、または担体物質と混合後、移植実験に用いた。直 接移植の場合は、細胞ペレットを１０ｍｌＰＢＳで２回洗い、大体５ないし１０ ×１０６細胞を含む最終的ペレットをそのまま頭蓋冠欠損部に供給した。担体物 質と予備混合する細胞サンプルは、移植前にラット尾コラーゲンと一緒にした。 ラット尾コラーゲン（シグマ社、St.Louis,ＭＯ；カタログ番号＃Ｃ−８８９７ ）約５０ｍｇを５００μｌＰＢＳ中で６０℃に加熱し、コラーゲン蛋白質を溶解 した。細胞ペレットと混合する前にコラーゲン溶液を３7℃で平衡化した。コラ ーゲン溶液約６０μｌを細胞ペレットと混合し、全細胞−コラーゲン混合物を頭 蓋冠欠損部に移植した。例５ モノクローナル抗体および親和性クロマトグラフィーを用いるラット血液からの ＣＤ３４＋細胞の分離 （１）溶血緩衝液−１０×保存溶液 下記を１Ｌ蒸留水に溶解し、ｐＨを７．３に調節し、滅菌濾過し、２−８℃で保 存する。 ８３ｇ ＮＨ₄Ｃｌ １０ｇ ＮａＨＣＯ₃ ４ｇ Ｎａ₂ＥＤＴＡ （２）燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ） Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含まず 下記を１Ｌ蒸留水に溶解し、ｐＨを７．２に調節し、滅菌濾過し、２−８℃で保 存する。 ８ｇ ＮａＣｌ １.１５ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ０.２ｇ ＫＨ₃ＰＯ₄ ０.２ｇ ＫＣｌ （３）ＰＢＳ＋ウシ血清アルブミン ＢＳＡ １ｇを１００ｍｌＰＢＳに溶解する。 （ａ）齢８ないし１０週の雄Ｆ３４４ラット１７匹から全血約１００ｍｌを集 め、標準法でヘパリン化した。赤血球は、全血を１×溶解緩衝液３００ｍｌと共 に３７℃で混合し、約３分間静置することによって溶解（lysed）した。その後 ＰＢＳ／ＢＳＡ洗浄溶液１００ｍュを加え、混合物を１７０×ｇで１０分間遠心 分離した。生成上澄液を、細胞ペレットを撹乱しないようにして吸引した。ペレ ットをＰＢＳ／ＢＳＡにしずかに再懸濁し、その後遠心分離するという方法でペ レットをさらに２回洗った。最終的ペレットをＰＢＳ／ＢＳＡで２ｍｌとし、ｍ Ａｂとインキュベーションするための準備をし、細胞計数およびＦＡＣＳ分析の ために少量を取った。 （ｂ）段階（ａ）で２ｍｌＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁した細胞ペレットを生のｍ Ａｂ ２Ｃ６と共にインキュベートし、ＣＤ３４＋細胞に結合させた。ｍＡｂ− 細胞混合物を４℃で４５分間インキュベートし、インキュベーション中に細胞を しずかに１回かきまぜて、再懸濁した。インキュベーション期間後、容量をＰＢ Ｓ／ＢＳＡで１０ｍｌとし、サンプルを段階（ａ）のようにして２回洗った。洗 ったペレットを２ｍｌＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁し、ヤギ抗マウスＩｇＭ：ビオチ ン１５ｍｌを加え、４℃で３０分間インキュベートし、インキュベーション中に １回しずかにかきまぜて細胞を再懸濁した。細胞を段階（ａ）に記載したように ＰＢＳ／ＢＳＡで２回すすぎ、最終的ペレットを５％ＢＳＡ１０ｍｌに再懸濁し た。例３に記載のように、２種類の“CEPRATE LC”カラムの各々に再懸濁ペレッ ト５ｍｌを用いた。抗体結合細胞を例３に記載のようにカラムから遊離させ、遊 離した細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで２回、ＰＢＳで１回洗った。最終的細胞ペレット をガラススライド上で３７℃でラット尾コラーゲン（１００ｍｇ／ｍｌ）６０ｍ ｌと混合した。コラーゲンと細胞との混合物を短時間氷上に置き、固体ペレット を形成させた。細胞含有ペレットを例１に記載したように、その後直ちにラット 頭蓋冠欠損部に移植した。 例６ ラット副睾丸脂肪パッドからの微小血管細胞の分離 ２つの副睾丸脂肪パッドを雄フィッシャーＦ３４４ラットから切り取り、無菌 条件下でハサミで細切し、１０ｍｌＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で、８ｍｇ／ｍｌコラ ゲナーゼ（ＩＩ型粗製、２７３Ｕ／ｍｇ；ワーシントン研究所(Worthington Lab oratories)）の存在下、３７℃でしずかに振動しながら４５分間インキュベート した。消化後、サンプルを２５０×ｇで４分間遠心分離し、管の最上部の低密度 脂肪を吸引によって除去した。前駆細胞を含むペレットをＰＢＳ／１％ＢＳＡで ２回、ＰＢＳで１回洗った。洗ったペレットを３７℃でラット尾コラーゲン５０ ｍｌと混合し、短時間氷上に置いてゲルとし、ラット頭蓋冠欠損部に移植した。 本発明による骨および軟骨前駆細胞を分離、使用する方法、およびその付随する 多くの利点は上述の説明から理解されると考えられ、その諸要素の形、構造、お よび配置には本発明の精神および範囲から逸脱したりその材料的利点のすべてを 犠牲にすることなく種々の変更を加えることができ、上記の形態は単にその好適 または例示的実施態様に過ぎないことは明らかである。 表１ 骨形成スコア 部位 スコア 説明 欠損部 ０ 骨の正味増加はない；形成が吸収より少ないか、または 全く形成しない。 １ 切断骨端間の直線距離の５％以下が新しい骨で架橋さ れる。 ２ 欠損部の約５％ないし３３％が新しい骨で架橋されるか、 または欠損部の中心部分に骨の島がある。 ３ 欠損部の約３３％ないし６６％が新しい骨で架橋される。 ４ 欠損部の６６％以上が新しい骨で架橋される。 ５ 欠損部が新しい骨によって完全に架橋される。 表２ ＲＢＲＡ 組織／細胞型 Ｎ （平均値＋−Ｓ．Ｄ．） 自己グラフト（陽性対照） １４２ ２．４＋−０．７ ＴＣＰ（陰性対照） １０５ １．０＋−０．９ 骨髄 ３０ ２．５＋−１．１ 骨髄フィコール １８ ２．３＋−０．８ 骨髄／アビテン ９ １．８＋−０．４ 血液フィコール １１ １．３＋−０．５ 血液／ＲＴＣフィコール １６ １．４＋−０．５ ２Ｃ６＋細胞 １２ １．８＋−０．４ ２Ｃ６−細胞 １２ ０．７＋−０．５ ５Ｅ６＋細胞 １２ １．３＋−０．６ ５Ｅ６−細胞 １２ １．５＋−０．５ ＳＢＡ＋細胞 １２ １．８＋−１．１ ＳＢＡ−細胞 １８ １．４＋−０．７ ＲＢＲＡ：相対的骨再生活性 Ｎ：実験数 Ｓ．Ｄ．：標準偏差 ２Ｃ６および５Ｅ６細胞は骨髄から分離した。 ＳＢＡ：大豆アグルチニン

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．結合組織形成に使用するための前駆細胞の分離法であって、 ａ）適切な手段によって前記細胞を含む体組織を集め、前記体組織は末梢血液ま たは骨髄であり； ｂ）前記体組織と、前記細胞上の細胞表面マーカーを識別し、それに結合する試 薬とを接触させ、細胞−試薬複合体を形成し、前記試薬はレクチンまたは接着分 子であり、前記細胞表面マーカーはＣＤ３４＋細胞表面上の抗原類及びＣＤ３４ からなる群から選択された抗原であり； ｃ）前記細胞−試薬複合体を前記組織から適切な手段によって分離する 諸段階を含んでなる方法。 ２．前記分離段階が親和性クロマトグラフィー、磁気ビーズおよびパンニングか らなる群から選択される方法を含む請求項１に記載の方法。 ３．前記試薬がレクチンである請求項１に記載の方法。 ４．前記試薬が接着分子Ｌ−セレクチンである請求項１に記載の方法。 ５．前記組織が末梢血液である請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の 方法。 ６.前記組織が骨髄である請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の方法 。 ７．末梢血液から、骨または軟骨形成に使用する骨形成−および軟骨形成ポテン シャルを有する前駆細胞を分離する方法であって： ａ）前記血液を適切な手段によって集め； ｂ）前記血液をレクチン、抗体または接着分子を含む試薬と接触させ、前記試薬 はＣＤ３４＋細胞上のＣＤ３４以外の細胞表面マーカーを識別し、それらに結合 し、細胞−試薬複合体を形成し； ｃ）前記細胞−試薬複合体を前記組織から適切な手段によって分離する 諸段階を含んでなる方法。 ８．前記試薬が抗体であり、前記収集段階がアフェレーシスを含んでなる請求項 ７に記載の方法。 ９．骨または軟骨形成に使用するための骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを 有するＣＤ３４＋前駆細胞のサブ集団を末梢血液から分離する方法であって： ａ）前記血液を適切な方法によって集め； ｂ）前記血液を前記試薬と接触させ、前記試薬はレクチン、抗体または接着分子 を含み、その際前記試薬はＣＤ３４＋細胞上のＣＤ３４以外の細胞表面マーカー を識別し、それらに結合し、細胞−試薬複合体を形成し； ｃ）前記細胞−試薬複合体を前記組織から適切な手段によって分離する 諸段階を含む方法。 １０．前記試薬が抗体である請求項９に記載の方法。 １１．前記収集段階がさらに、 ａ）前記血液を、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、およびヘパリンからなる群から選択さ れる試薬による処理によって抗凝固性にし、 ｂ）赤血球を前記血液から適切な手段によって除去することを含む請求項７に記 載の方法。 １２．骨髄から前駆細胞を分離し、骨−または軟骨形成に使用するための方法で あって： ａ）前記骨髄を適切な手段によって集め； ｂ）前記骨髄を、ＣＤ３４＋細胞上の細胞表面マーカーを識別し、それらに結合 する試薬と接触させ、細胞−試薬複合体を形成し； ｃ）前記ＣＤ３４＋細胞−試薬複合体を前記骨髄から適切な手段によって分離す る 諸段階を含む方法。 １３．前記収集手段がさらに： ａ）適切な手段によって有核細胞を非有核細胞から分離し；ｂ）抗凝固剤で処理 し、その際前記抗凝固剤はＥＤＴＡ、ヘパリンまたはクエン酸塩であることを含 む請求項１２に記載の方法。 １４．有核細胞を非有核細胞から分離する前記手段が密度勾配遠心分離または赤 血球溶解を含む請求項１３に記載の方法。 １５．前記試薬がレクチン、抗体、または接着分子である請求項１２に記載の方 法。 １６．前記試薬が抗体であり、前記細胞表面マーカーがＣＤ３４であり、前記分 離手段が親和性クロマトグラフィーを含める請求項１２に記載の方法。 １７．骨または軟骨形成に使用するための前駆細胞を脂肪組織から分離する方法 であって、 ａ）適切な手段によって前記脂肪組織を集め； ｂ）酵素的解離によって前記組織の単一細胞懸濁液を作り； ｃ）前記単一細胞懸濁液を、前記細胞上の細胞表面マーカーを識別し、それらに 結合する試薬と接触させて、細胞−試薬複合体を形成し、 ｄ）前記細胞−試薬複合体を前記組織から適切な手段によって分離する 諸段階を含む方法。 １８．前記試薬が抗体、レクチン、または接着分子であり、前記分離段階が親和 性クロマトグラフィー、磁気ビーズまたはパンニングを含んでなる請求項１７に 記載の方法。 １９．前記試薬が抗体であり、前記細胞表面マーカーがＣＤ３４＋細胞の表面上 の抗原類及びＣＤ３４からなる群から選択された抗原である請求項１８に記載の 方法。 ２０．骨または軟骨形成に使用するための前駆細胞を脂肪組織から分離する方法 であって： ａ）前記組織を適切な手段によって集め； ｂ）酵素的解離によって前記組織の単一細胞懸濁液を作り；そして ｃ）適切な手段によって前記前駆細胞を前記単一細胞懸濁液から沈殿させる諸段 階を含んでなる方法。 ２１．前記沈殿段階が遠心分離または重力沈降法を含んでなる請求項２０に記載 の方法。 ２２．前記組織が脂肪（ｆａｔ）を含み、前記収集段階が脂肪吸引または手術を 含む請求項２１に記載の方法。 ２３．骨−または軟骨形成に使用するための前駆細胞を造血または非造血体組織 から分離するための負の選択法であって、 ａ）前記組織を適切な手段によって集め； ｂ）前記組織を、細胞表面マーカーを識別し、それらに結合する試薬と接触させ て細胞−試薬複合体を形成し、その際前記細胞表面マーカーはＣＤ３４＋細胞集 団から除かれ； ｃ）適切な手段によって前記細胞−試薬複合体を前記組織から分離し、結合しな いまま残っている細胞フラクションは前記前駆細胞に富んだ集団を含む、 前記負の選択法。 ２４．前記組織が末梢血液または骨髄である請求項２３に記載の方法。 ２５．前記試薬が抗体、レクチン、または接着分子である請求項２４に記載の方 法。 ２６．骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞の集団であって、 前記細胞は末梢血液または脂肪組織から分離されたものである前記前駆細胞集団 。 ２７．骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞の集団であって、 前記細胞は脂肪組織から分離されたものである前記前駆細胞集団。 ２８．骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞の集団であって、 前記細胞は in vitro 培養段階なしに骨髄から分離される前記前駆細胞集団。 ２９．骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞の集団であって、 前記細胞は請求項１、請求項７、請求項８または請求項１１のいずれかの項に記 載のようにして末梢血液から分離されたものである前記前駆細胞集団。 ３０．骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞の集団であって、 前記細胞は請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０または請求項２２ のいずれかの項に記載したように脂肪組織から分離されたものである前記前駆細 胞集団。 ３１．骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞の集団であって、 前記細胞は請求項１２、請求項１４、請求項１５、または請求項１６のいずれか の項に記載したように in vitro 培養段階なしに骨髄から分離されたものである 前記前駆細胞集団。 ３２．ａ）請求項２６、請求項２７、または請求項２８のいずれかの項に記載の 骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞集団と；ｂ）担体物質と を含んでなる組成物。 ３３．前記担体物質が蛋白質、炭水化物、合成ポリマー、または無機物質である 請求項３２に記載の組成物。 ３４．前記担体がゼラチン、コラーゲン、多糖、蔗糖、澱粉、プロテオグリカン 、合成ポリマー、セラミック、または燐酸カルシウムである請求項３３に記載の 組成物。 ａ）請求項２９に記載の骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞 の集団と；ｂ）担体物質とを含んでなる組成物。 ３６．前記担体が蛋白質、炭水化物、合成ポリマー、または無機物質である請求 項３５に記載の組成物。 ３７．前記担体がゼラチン、コラーゲン、多糖、蔗糖、澱粉、プロテオグリカン 、合成ポリマー、セラミック、または燐酸カルシウムである請求項３６に記載の 組成物。 ３８．ａ）請求項３０に記載の骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前 駆細胞の集団と；ｂ）担体物質とを含んでなる組成物。 ３９．前記担体が蛋白質、炭水化物、合成ポリマー、または無機物質である請求 項３８に記載の組成物。 ４０．前記担体がゼラチン、コラーゲン、多糖、蔗糖、澱粉、プロテオグリカン 、合成ポリマー、セラミック、または燐酸カルシウムである請求項３９に記載の 前駆細胞集団。 ４１．ａ）請求項３１に記載の骨形成および軟骨形成ポリマーを有する前駆細胞 集団と；ｂ）担体物質とを含んでなる組成物。 ４２．前記担体が蛋白質、炭水化物、合成ポリマー、または無機物質である請求 項４１に記載の組成物。 ４３．前記担体がゼラチン、コラーゲン、多糖、蔗糖、澱粉、プロテオグリカン 、合成ポリマー、セラミック、または燐酸カルシウムである請求項４２に記載の 組成物。 ４４．臨床的使用に有用な移植装具であって： ａ）適した形を有する、結合組織修復を必要とする患者の部位と接触するための 少なくとも１つの表面を含み； ｂ）前記表面には結合組織形成ポテンシャルを有する前駆細胞が植え付けられ； そして ｃ）前記細胞は末梢血液または脂肪組織から分離されたものである 移植装具。 ４５．前記細胞が請求項１、請求項７、請求項１０または請求項１１に記載の末 梢血液から分離されたものである請求項４４に記載の移植装具。 ４６．前記細胞が請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、または請 求項２２に記載の脂肪組織から分離されたものである請求項４４に記載の移植装 具。 ４７．臨床的使用に有用な移植装具であって： ａ）適した形を有する、結合組織修復を必要とする患者の部位と接触するための 少なくとも１つの表面を含み； ｂ）前記表面には結合組織形成ポテンシャルを有する前駆細胞が稙え付けられ； そして ｃ）前記細胞は in vitro 培養段階なしに骨髄から分離されたものである 移植装具。 ４８．前記細胞が請求項１２、請求項１４、請求項１５、または請求項１６に記 載のように骨髄から分離されたものである請求項４７に記載の移植装具。 ４９．前記表面が結合組織の内方成長のための織物領域を含む請求項４４または 請求項４７に記載の移植装具。 ５０．前記細胞が担体物質と混合される請求項４４または請求項４７に記載の移 植装具。 ５１．前記担体が蛋白質、炭水化物、合成ポリマー、または無機物質である請求 項５０に記載の移植装具。 ５２．前記担体がゼラチン、コラーゲン、多糖、蔗糖、澱粉、プロテオグリカン 、合成ポリマー、セラミック、または燐酸カルシウムであり、前記表面が結合組 織内方増殖のための織物領域を含み、前記領域が燐酸三カルシウム、ヒドロキシ アパタイト、アルミナ、チタン、チタン合金、コバルト−クロム合金、またはス テンレス鋼を含む請求項５０に記載の移植装具。 ５３．骨再生を必要とする患者の部位における人工補装具の移植性を高めるため の方法であって： ａ）前記装具の表面に結合組織形成ポテンシャルを有する前駆細胞を適用し、そ の際前記表面は骨修復を必要とする患者の部位と接触するためのものであり； ｂ）その際前記前駆細胞は請求項７、請求項１２、請求項１９、請求項２０、ま たは請求項２４のいずれかの項によって分離される前記方法。 ５４．前駆細胞を含む体組織から直接採取した前記細胞を用いて哺乳動物の inv ivo 骨再生を促進する方法であって： ａ）前記組織を適切な手段によって集め； ｂ）前記組織を、前記細胞を識別し、それと結合する試薬と接触させて細胞−試 薬複合体を形成し、その際前記細胞表面マーカーはＣＤ３４＋細胞の表面のＣＤ ３４および抗原類からなる群から選択される抗原であり； ｃ）前記細胞−試薬複合体を前記組織から適切な手段によって分離し； ｄ）適切な手段によって前記細胞−試薬複合体を骨再生を必要とするレシピエン トの結合組織と接触させる諸段階を含んでなる方法。 ５５．前記組織が末梢血液または骨髄で、前記収集段階がさらに、有核細胞を適 切な手段で非有核細胞から分離し、抗凝固剤処理を施すことを含む 請求項５４に記載の、哺乳動物の in vivo 骨再生を促進する方法。 ５６．前記組織が脂肪組織であり、前記収集段階がさらに酵素的解離によって単 一細胞懸濁液を形成することを含む請求項５４に記載の哺乳動物の in vivo 骨 再生を促進する方法。 ５７．段階（ｂ）の前記試薬が抗体、レクチン、または接着分子を含む請求項５ ５または請求項５６に記載の哺乳動物の in vivo 骨再生を促進する方法。 ５８．前記接触段階（ｄ）が手術または関節鏡注入を含んでなる請求項５７に記 載の哺乳動物の in vivo 骨再生を促進する方法。 ５９．前記接触段階（ｄ）がさらに、前記前駆細胞と、蛋白質、炭水化物、合成 ポリマー、または無機物質からなる群から選択される担体物質との混合物を形成 することを含む請求項５８に記載の哺乳動物の in vivo 骨再生を促進する方法 。 ６０．前記担体物質がゼラチン、コラーゲン、多糖、蔗糖、澱粉、プロテオグリ カン、合成ポリマー、セラミック、または燐酸カルシウムである請求項５９に記 載の方法。 ６１．脂肪組織から直接採取した前駆細胞を用いて哺乳動物の in vivo 骨再生 を促進する方法であって、 ａ）請求項１９または請求項２２に記載のように前記細胞を分離し； ｂ）適切な手段によって前記細胞を、骨再生を必要とするレシピエントの結合組 織部位と接触させる諸段階を含む方法。 ６２．前駆細胞を含む体組織から直接採取した前記前駆細胞を用いて哺乳動物の in vivo 軟骨再生を促進する方法であって： ａ）前記組織を適切な手段によって集め； ｂ）前記組織を、前記細胞を識別し、それらに結合する試薬と接触させて、細胞 −試薬複合体を形成し、その際前記細胞表面マーカーはＣＤ３４＋細胞の表面上 のＣＤ３４および抗原類からなる群から選択される抗原であり； ｃ）前記細胞−試薬複合体を前記組織から適切な手段によって分離し； ｄ）適切な手段によって前記細胞−試薬複合体を、軟骨再生を必要とするレシピ エントの結合組織部位と接触させる諸段階を含む方法。 ６３．前記組織が末梢血液または骨髄であり、前記収集段階が有核細胞を適切な 手段によって非有核細胞から分離し、抗凝固剤で処理することをさらに含む請求 項６２に記載の、哺乳動物の in vivo 軟骨再生を促進する方法。 ６４．前記組織が脂肪組織であり、前記収集段階が酵素解離によって単一細胞懸 濁液を形成することをさらに含む請求項６２に記載の in vivo 哺乳動物軟骨再 生の促進法。 ６５．段階（ｂ）の前記試薬が抗体、レクチン、または接着分子である請求項６ ３または請求項６４に記載の in vivo 哺乳動物軟骨再生促進法。 ６６．前記接触段階（ｄ）が手術または関節鏡注入を含んでなる請求項６５に記 載の in vivo 哺乳動物軟骨再生促進法。 ６７．前記接触段階（ｄ）がさらに、前記前駆細胞と、蛋白質、炭水化物、合成 ポリマー、または無機物質からなる群から選択される担体物質との混合物を形成 することを含む請求項６６に記載の in vivo 哺乳動物軟骨再生促進法。 ６８．前記担体がゼラチン、コラーゲン、多糖、蔗糖、澱粉、プロテオグリカン 、合成ポリマー、セラミック、または燐酸カルシウムである請求項６７に記載の 方法。 ６９．脂肪組織から直接採った前駆細胞を用いて in vivo 哺乳動物軟骨再生を 促進する方法であって、 ａ）前記細胞を請求項１９または２２に記載のように分離し；そして ｂ）適切な手段によって前記細胞と、軟骨再生を必要とするレシピエントの結合 組織部位とを接触させる諸段階を含む方法。 ７０．骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞のサブ集団であっ て、前記細胞が、in vitro 培養段階なしに、末梢血液、脂肪組織または骨髄か ら分離されたものである前記前駆細胞サブ集団。 ７１．骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞のサブ集団であっ て、前記細胞が吸引脂肪から分離されたものである前記前駆細胞サブ集団。 ７２．末梢血液に見いだされる有核細胞サブセットを用いて哺乳動物結合組織再 生を促進する方法であって、 ａ）前記細胞を適切な手段によって分離し； ｂ）適切な手段によって前記細胞と結合組織修復を必要とする患者部位とを接触 させる諸段階を含む方法。 ７３．脂肪組織に見いだされる細胞サブセットを用いて哺乳動物結合組織再生を 促進する方法であって： ａ）適切な手段によって前記細胞を分離し； ｂ）適切な手段によって前記細胞と、結合組織修復を必要とする患者部位とを接 触させる諸段階を含む方法。 ７４．前記脂肪組織（adipose tissue）がファット組織（fat tissue）である請 求項７３に記載の方法。 ７５．骨髄に見いだされる有核細胞サブセットを用いて哺乳動物結合組織再生を 促進する方法であって、ａ)適切な手段によって前記細胞を分離し、前記手段は invitro 培養を含まず；そしてｂ）適切な手段によって前記細胞と、結合組織修 復を必要とする患者部位とを接触させる諸段階を含む方法。 ７６．修復を必要とする患者の結合組織部位において骨−または軟骨修復を促進 する方法であって、前記部位に人工補装具を外科的に移植する段階を含み、前記 補装具には骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞が植え付けら れ、前記細胞は末梢血液から分離されたものである前記方法。 ７７．前記細胞が請求項１、請求項７、請求項１０、または請求項１１に記載の ように分離されたものである請求項７６に記載の方法。 ７８．修復を必要とする患者の結合組織部位において骨−または軟骨修復を促進 する方法であって、前記部位に人工補装具を外科的に植え込む段階を含み、前記 補装具には骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞が植え付けら れており、前記細胞は脂肪組織から分離されたものである前記方法。 ７９．請求項７８に記載の骨−または軟骨修復を促進する方法であって、前記細 胞が請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、または請求項２２に記 載のように分離されたものである前記方法。 ８０．修復を必要とする患者の結合組織部位において骨−または軟骨修復を促進 する方法であって、前記部位に人工補装具を外科的に植え込む段階を含み、前記 補装具には骨形成−および軟骨形成ポテンシャルを有する前駆細胞が植え付けら れており、前記細胞は in vitro 培養段階なしに骨髄から分離されたものである 前記方法。 ８１．請求項８０に記載の骨−または軟骨修復を促進する方法であって、前記細 胞が請求項１２、請求項１４、請求項１５、または請求項１６に記載のように分 離されたものである前記方法。