JP2000505338A - 軟骨の形成および／または修復方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、骨組を適当な位置に保持することができ、生体内で骨組への付着のための軟骨始原細胞、軟骨細胞および他の間質細胞の起源を提供する骨膜／軟骨膜の組織と組み合わせて、軟骨損傷または損失箇所に生体適合性の非生物の三次元の骨組または枠組構造を患者に挿入することからなる生体内での軟骨形成および／または修復方法に関する。さらに、軟骨細胞、軟骨始原細胞または他の間質細胞を含む細胞の調製物が、骨組および／または骨膜／軟骨膜の組織の挿入の前、最中または後に適用される；その細胞は、挿入箇所に新しい軟骨を形成するために、生体内の挿入箇所に直接適用されて、軟骨形成ならびに、軟骨細胞、軟骨始原細胞および他の間質細胞を隣接する生体内環境から骨組へ移動させることを促進する因子の誘導を促進する。

Description

【発明の詳細な説明】 軟骨の形成および／または修復方法1 ．概論 本発明は、生体内での軟骨の形成および／または修復方法に関する。より 詳細には、本発明は、骨膜／軟骨膜の組織と組み合わせて軟骨損傷または損失箇 所に生物学的適合性の非生物の三次元の骨組（scaffold）または枠組（framewor k）の構造を患者に挿入すること、および軟骨始原細胞のような軟骨細胞および ／または他の間質細胞(stromal cell)の調製物を、骨組および／または骨膜／軟 骨膜の組織の挿入の前、最中または後に挿入箇所に適用することからなる軟骨の 形成および／または修復方法に関する。骨膜／軟骨膜の組織は挿入箇所の適当な 位置に骨組を保持するために用いることができ、また生体内での骨組への付着の ための間質細胞、例えば軟骨細胞および／または軟骨始原細胞の起源を提供する 。生体内の挿入箇所に直接種として植えられた間質細胞の調製物は、骨組への付 着のための軟骨細胞および／または他の間質細胞の容易に入手可能な起源を提供 するだけでなく、調製物の間質細胞により産生された因子を介して生体内周辺環 境から骨組への間質細胞の移動と同様に軟骨形成を誘導するすばやくかつ有効な 手段を提供する。さらに、種として植えられた間質細胞は、成長、挿入および／ または疾患状態の改善に有益な遺伝子産物を発現させるように遺伝子操作される （genetically engineered）ことができる。したがって本発明の方法は結果とし て、生体内での新しい軟骨の有効な産生を生じる。 本発明の方法は、外傷による軟骨欠損を持つ患者と同様に、リュ ーマチ様関節炎および／または骨関節炎のような変性性結合織病を病む患者の関 節軟骨の形成および／または修復に有効である。本発明の方法は、既存の軟骨組 織の取り替えまたは増強のため、新しいかまたは変化された組織の導入のため、 または生物学的組織または構造を共に結合させるために使用することができる。２．発明の背景 軟骨には、例えば関節またはヒアリン軟骨、弾性軟骨および繊維軟骨のよ うな様々な種類がある。関節軟骨は骨の関節表面、例えば関節中にみられ、可動 関節の滑らかな滑り動作特性を供与することができる。関節軟骨はその下にある 骨と強固に付着し、厚さはヒトの関節で５ミリメートル未満であり、また関節と 関節の場所によりかなりの変動がある。さらに、関節軟骨は無神経、無血管およ び無リンパである。成人では、この軟骨は滑膜および軟骨の密性基質（dense ma trix）を通じて二重拡散体系により、軟骨の結合組織にみられる軟骨細胞へ到達 して栄養素を得る。 実際には、関節軟骨は、主にII型コラーゲン、プロテオグリカンおよび水 からなる密性細胞外基質に囲まれた高次に分化された軟骨細胞からなっている。 関節軟骨の生化学的組成は、６５−８０％までの水（軟骨による）を含んでいる が、軟骨のコラーゲン成分は最も一般的な有機成分である。コラーゲン（主にII 型）は乾燥重量でほとんどを占める浅部を除いて、湿潤重量で約１５〜２５％、 乾燥重量で約半分を占めている。濃度は通常、関節表面からの深さが深くなるに つれ徐々に減少する。プロテオグリカン成分は湿潤重量で１０％まで、または乾 燥重量で約４分の１を占める。プロテオグリカン類は、線状硫酸化多糖類が結合 したタンパク核から主としてなり、大部分がコンドロイチン硫酸およびケラ チン硫酸の形である。II型コラーゲンに加え、関節コラーゲンは別個の構造をも つ種々の型のコラーゲンを含む（IV、Ｖ、IXおよびＸ）。これら個々の高分子の 間には、プロテオグリカンとコラーゲンとの間の非共有結合と、異なるコラーゲ ン種間の共有結合とを含む様々な相互作用がある。細胞外基質の耐水流動性によ り、軟骨は関節の高い負担を分散することができる。それは衝撃を吸収し、肋軟 骨下骨にかかる圧力を最小限にする（Ｍｏｗら，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ ．１７：３７７−３９４）。しかし、成人の軟骨および骨には修復能力に限度が ある；ゆえに、リューマチ様関節炎および／または骨関節炎のような疾患、また は外傷による軟骨の損傷は、深刻な身体的変形や衰弱を引き起こすことがある。 さらに、ヒトの関節軟骨が老化するにつれて、その伸張性は変化する。膝関節軟 骨の浅部では、伸張性において、生涯のうち３０年間までは増加がみられるが、 その後は関節表面においてII型コラーゲンへの検知可能な損傷が起こるにつれて 、年を追うごとに顕著に減少していく。軟骨の深部においても、老化が進むごと に、コラーゲン成分は減少していないが伸張性がどんどん減少していくことが示 されている。これらの観察は、老化した軟骨の機械的すなわち構造的組織におけ る変化が、たとえ十分に発達していても、軟骨の外傷的損傷の素因となることが あることを示している。骨関節炎の関節には、II型コラーゲンの過度の損傷、そ の結果としてコラーゲン繊維の縮れがみられる。リューマチ様関節炎の場合、多 形核白血球から放出されたフリーラジカルとプロテイナーゼの協力作用により、 関節表面において多くの損傷がみられる（Ｔｉｋｕら，１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎoｌ．１４５：６９０−６９６）。軟骨細胞による軟骨基質分解とプロテイナ ーゼの誘発は、おそらくインターロイキン−１（ＩＬ−１）または腫瘍壊死因子 −α（ＴＮＦ−α）（Ｔｙｌｅｒ，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２５：４ ９３−５０ ７）によって初めは誘発される。 軟骨損傷又は損失の現在の治療とは、補てつ材、たとえば美容修復のため のシリコン、または関節の再調整のための金属合金を用いての置換である。補て つ装置の挿入は通常、もとの軟骨で見込まれるすべての機能を回復していない、 その下にある組織および骨の損失と関連する。異物が不変的に存在することに関 連している長期にわたる深刻な合併症は、感染症、腐食および不安定状態を含み うる。 減菌済みの骨または骨粉、または最終的に挿入される骨細胞を種として植 えつけた外科用スチールの使用は、細胞支持体の非分解性により大抵不成功にお わった。ある処置によると、繊維芽細胞は軟骨形成反応を剌激することができる 可溶性骨タンパク質に、生体外で最低３日間曝露される。活性化された繊維芽細 胞は、その後生分解性基質と結合することにより、または関節内注射もしくは異 形挿入片や補てつ装置への付着により、生体内に移動される。この方法では、軟 骨形成は短時間培養では発達せず、また曝露された繊維芽細胞による挿入箇所で の軟骨合成に過度に依存している点で不利である。１９８６年９月２日発行、米 国特許第４，６０９，５５１号，Ｃａｐｌａｎ，Ａ．を参照のこと。 １９９１年８月２０日発行の米国特許第５，０４１，１３８号Ｊ．Ｐ．Ｖ ａｃａｎｔｉらには、生体内でその後挿入を行うために、生体外で軟骨細胞を生 分解性基質に種として植えつけることによる軟骨性構造物の成長が記載されてい る。それぞれ１９９３年３月３０日、１９９３年７月１３日発行の米国特許第５ ，１９７，９８５号および第５，２２６，９１４号、Ｃａｐｌａｎらは、骨髄由 来の間葉幹細胞を多孔性セラミックビヒクルなどの担体に塗布して成長因子の存 在下、生体外で培養し、円形細胞形態を促進すること、およびその細胞を含む担 体を損傷した関節軟骨に挿入することに関連している。最後に、１９８５年６月 ４ 日発行の米国特許第４，５２０，８２１号Ｓｃｈｍｉｄｔらは生体吸収可能な（ bioabsorbable）メッシュまたはガーゼを用いた生体組織矯正構造の成長方法に 関連している。好ましい実施態様によると、生体組織は身体の欠損部分から除去 され、生体外にて生体吸収可能なメッシュ上で成長し、組織／メッシュ構造はメ ッシュが完全に生体に吸収されるのに十分な時間、生体内の欠損部分に配置され る。上記のすべての方法において、細胞は軟骨損傷部に挿入するために生体外で 担体に塗布される。 １９８９年７月１１日発行の米国特許第４，８４６，８３５号Ｇｒａｎｄ ｅらにも、自己由来の軟骨細胞を生体外で培養させ、生体外で軟骨細胞をコラー ゲン基質に植えつけることによって関節軟骨治療を促進する挿入技術が記載され ている。Ｇｒａｎｄｅはさらに、軟骨細胞／コラーゲン基質を軟骨損傷部に挿入 し、骨膜弁を軟骨に縫合することにより挿入片を機械的に固定することを記載し ている。Ｇｒａｎｄｅは、骨膜にはほとんど骨膜形成能力がないこと、また同様 の固定目的を達成するために、使用した骨膜弁が再吸収可能な生体適合性ポリマ ーで代用できることを教示している。一方、ｖｏｎ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，１ ９９１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．２５：３２９−３３９は、動物に おける全層性骨軟骨腫欠損の修復のためのポリ乳酸基質と組み合わせた骨膜挿入 に関しており、またＭｅｓｓｎｅｒ，１９９４，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １ ５（Ｎｏ．３）：２：２３−２３０には、全層性骨軟骨腫欠陥の修復のために、 テフロンおよびダクロンフェルトを組み合わせた骨膜挿入片は、動物における通 常の軟骨修復には不十分であったという実験を示している。Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌ ｌら，１９８６，Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．６８−Ａ（Ｎ ｏ．７）：１０１７−１０３５；Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌら，１９８５，３１ｓｔ Ａｎｎｕａｌ ＯＲＳ，ｐ．２９２，Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ，Ｎｅｖａｄａ，Ｊ ａｎ．２１−２４，１９８５；Ｒｕｂａｋ，１９８２，Ａｃｔａ．Ｏｒｔｈｏｐ ．Ｓｃａｎｄ．５３：１７５−１８０；およびＭｅｓｓｅｎｅｒら，１９９３， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １４（Ｎｏ．７）：５１３−５２１は、動物の全層 性関節欠陥などの修復のために、全層性関節欠損に直接配置される遊離自己骨膜 挿入片の使用に関している。 さらに、Ｔｈｏｍａら，１９９３，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕ ｒｇ．９１（Ｎｏ．２）：３０７−３１５およびＢｒｕｎｓら，１９９２，Ｖｉ ｒｃｈｏｗｓ．Ａｒｃｈ．Ａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ａｎａｔ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏ ｌ．４２１（Ｎｏ．１）：１−８は、動物の全層性関節欠損の修復のための自己 軟骨膜挿入片の使用に関している。Ｔｈｏｍａは軟骨膜挿入片中の骨関節炎に類 似の顕著な変性変化に注目しており、そのような大きな欠損の任意の修復は、試 みられた軟骨膜挿入片よりもより正常で新しい軟骨を形成する結果となると結論 づけている。Ｂｒｕｎｓは欠陥の荷重がかかる部分でなく、荷重のかからない部 分のヒアリン様軟骨について注目している。最後に、Ｂｅａｎら，１９９４，Ｏ ＲＬ．Ｊ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ｓｐｅｃ．５６： ２２４−２２９は、ウサギの前方咽頭壁を再構成するための脱塩したウシの骨基 質と自己軟骨膜の混成挿入片の使用について述べている。３.発明の要約 本発明は、骨組を適当な位置に保持することができ、生体内で骨組への付 着のための軟骨始原細胞、軟骨細胞および他の間質細胞の起源を提供する骨膜／ 軟骨膜の組織と組み合わせて、軟骨損傷または損失箇所に生体適合性の非生物の 三次元の骨組または枠組構造を患者に挿入することからなる生体内での軟骨形成 および／または修復方法に関する。 さらに、軟骨細胞、軟骨始原細胞または他の間質細胞を含む細胞の調製物が、骨 組および／または骨膜／軟骨膜の組織の挿入の前、最中または後に適用される； 細胞は、挿入箇所に新しい軟骨を形成するために、生体内の挿入箇所に直接適用 されて軟骨形成を促進し、軟骨細胞、軟骨始原細胞および他の間質細胞を隣接す る生体内環境から骨組へ移動させることを誘発する因子の形成を促進する。 より詳細には、立体的骨組は間質性（interstitial）空間を含み、その中 で隣接する生体内環境から骨膜／軟骨膜の組織を含む軟骨始原細胞、軟骨細胞お よび他の間質細胞が骨組構造の上およびその中で付着して成長するために移動す る。骨組と骨膜／軟骨膜の組織と組み合わせて種として植えられた間質細胞の調 製物は、生物学的因子を産生する軟骨細胞と他の間質細胞との調整された起源を 提供する。その生物学的因子は、軟骨形成と、付着および／またはそこでの分化 のための間質細胞の移動、例えば骨膜／軟骨膜の組織から骨組へ、とを促進する 。間質細胞の調製物はまた、骨組へ移動してそこへ付着することのできる、例え ば軟骨細胞および／または始原細胞といった、間質細胞の直接的な起源を提供す る。骨組中の間質細胞は、骨膜／軟骨膜の組織から、外因性間質細胞の調製物か ら、または挿入箇所に隣接する生体内環境のいずれから得られようが、骨組上で 成長して細胞基質を形成し、生体内での軟骨欠損箇所における軟骨形成に必要と される支持体、成長因子および調整因子を提供する。本発明の方法はこのように 、結果として生体内で挿入箇所に新しく軟骨を産生することができる。 本発明の方法の好ましい実施態様において、骨膜／軟骨膜の組織は、軟骨 損傷または損失箇所（「欠損箇所」）の上をおおって、挿入された骨組の上に配 置され、その位置に縫合などにより固定され、ゆえに骨組は適所に保持される。 また更なる好ましい実施態様によると、骨組 は生体分解性物質からなっているため、挿入が成功した場合にはその骨組構造は 完全に生体内に吸収され、結果として異物や非生物の物質をその内部に全く含ま ない新しい軟骨が形成される。 別の実施態様によれば、軟骨細胞および／または他の間質細胞調製物は、 骨組と骨膜／軟骨膜の組織が挿入された後に生体内の挿入箇所に適用される。さ らに本発明の別の実施態様では、細胞成長因子（例えばＴＧＦ−β）、軟骨形成 を刺激する因子（例えば軟骨形成を促進する骨形態形成タンパク質（ＢＭＰｓ） ）、間質細胞の移動および／または基質沈着を剌激する因子、抗炎症薬または免 疫抑制薬のような生物活性剤が挿入箇所に含まれている。例えば、これらの因子 は骨組中へ組込まれ、挿入箇所で解離に備えることができる；骨組は、または一 つかそれ以上の生物活性剤からなっているか、またはそれに覆われている。代わ りに、この因子は間質細胞の植えつけの前、最中または後に、骨組中または隣接 部に適用されることができる、例えば独立した調製物として、または間質細胞調 製物の一部として、生物活性剤がその部位に適用される。また、欠損箇所に植え つけられた間質細胞は、遺伝子操作され、これら生物活性剤の遺伝子、例えばＴ ＧＦ−β１のような特定型ＴＧＦ−βまたはＢＭＰ−１３のような特定型ＢＭＰ 類を発現させることができる。欠損箇所をこれらの生物活性剤へ曝露することは 、成功した、および／または改良された新しい軟骨の形成を促進する、および／ または例えば挿入に関連する生体拒絶または炎症の危険を減少させることにより 、挿入の成功率を向上させる。 例えば、本発明の実施態様によると、間質細胞は遺伝子操作され、抗炎症 性遺伝子生成物を発現させ、炎症作用による軟骨損傷を引き起こすリューマチ様 関節炎のような成人病の影響を改善することができる。例えば、間質細胞は遺伝 子操作され、顆粒球マクロファージコロニー刺 激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン２（ＩＬ −２）または他の炎症性サイトカインや媒介物質などの中和抗体の遺伝子型に対 応するペプチドまたはポリペプチドを発現することができる。 別の実施態様によると、間質細胞は遺伝子操作され、隣接する生体内環境 から挿入箇所の骨組への間質細胞の移動を高める組織因子を発現することができ る。 好ましくは、細胞は、遺伝子操作されて、そのような遺伝子産物を手術後 の回復期間中に一時的に、および／または誘導可能な制御下で、または、例えば 受容体分子または受容体様分子の細胞内および／または膜内外ドメインからなり 、細胞外ドメインとして遺伝子産物と融合している、間質細胞に固定されたキメ ラ融合タンパク質として遺伝子産物を発現する。 別の代わりの実施態様においては、間質細胞は、遺伝子操作され、挿入に 対する生体拒絶または老化による関節軟骨の退行的変化、リューマチ様疾患また は炎症を促進する因子の発現を「ノックアウト（knockout）」することができる 。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ，ＴＮＦ，ＩＬ−１，ＩＬ−２およびサイトカインのよ うな進行性炎症媒介物質の発現は、外因的に適用された間質細胞中または挿入さ れた骨膜または軟骨膜の組織上でノックアウトされ、炎症の危険性を減少するこ とができる。同様に、細胞または組織上のクラスII ＭＨＣ分子の発現も、挿入 に対する生体拒絶の危険を減少するためにノックアウトされることができる。 発明の別の実施態様では、本発明の方法は、生体内に遺伝子と遺伝子産物 を導入するためのビヒクルを提供し、挿入の成果および／または遺伝子治療への 使用を支援または改良することができる。例えば、リューマチ様疾患または炎症 作用および骨吸収のような軟骨の退行性変化 の徴候を防止または改善する遺伝子は、疾患状態中および／または老化により少 なく発現されるか、過剰に発現されてもよい。このように、患者の遺伝子活性の レベルは、それぞれ遺伝子操作された間質細胞内の活性遺伝子産物のレベルを調 整することによる遺伝子組み換え治療によって増加または減少するかもしれない 。 さらに別の好ましい実施態様おいて、挿入片が配置される軟骨欠損箇所が 、好ましくは挿入の前に、処理されて、軟骨欠陥箇所に既に存在している軟骨を 分解し、細胞を遊離し挿入片の骨組に移動させ、新しい軟骨の規則的な沈着を促 進する。このような処理方法は、酵素的処理、剥離および微細穿孔を含む。さら なるに実施態様によると、本発明の間質細胞の調製物は、欠陥箇所の分解された 軟骨中へ、例えば周囲の細胞または欠陥箇所の壁に注入することができ、分解さ れた軟骨から挿入片への間質細胞の移動を誘発する生物学的因子の起源を提供す る。4 ．発明の詳細な説明 本発明は、生体内で軟骨を形成および／または治療する方法に関連し、そ の方法は、骨膜／軟骨膜の組織と組み合わせて、生体適合性を有する非生物の材 料からなる三次元の骨組または枠組構造体を生体内へ適用すること、および軟骨 細胞や軟骨始原細胞のような間質細胞の調製物を適用することを含む。この細胞 は、生体内の挿入個所に種として植えられる。 ここで用いる「軟骨始原細胞」という用語は、（１）多能性または細胞系 未決定始原細胞、通常、当該分野で「幹細胞」または「間葉幹細胞」と呼ばれ、 潜在的に無限数の有糸分裂が可能で、その系を更新または軟骨細胞に分化する後 代細胞を生成する；または（２）幹細胞の有糸分裂から生じ、最終的には軟骨細 胞に分化する細胞系の決定した始原 細胞、のいずれかを指す。細胞系決定済み始原細胞は、それが由来する幹細胞と 異なり、無限数の有糸分裂は不可能と一般に考えられており、最終的には軟骨細 胞に分化する。 ここで用いる「軟骨」又は「軟骨組織」という用語は、当該分野で一般に 認められており、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に入り込んだ細胞からなる特殊 な種類の密集した結合組織を指す（例えば、Cormack,1987,Ham's Historlogy,9t h Ed.,J.B.Lippincott Co.,pp.266-272参照）。軟骨の生化学的組成は、種類に よって異なるが、軟骨に共通する組成は、密なＥＣＭに囲まれた、コラーゲン、 プロテオグリカンおよび水からなる軟骨細胞からなる。例えば、関節内で見られ るヒアリンまたは関節軟骨、半月および肋骨領域で見られる繊維性軟骨、および 弾性軟骨を含む数種類の軟骨が当該分野で認められている。いずれの種類の軟骨 の生成も本発明の範囲に入るものとする。 さらに、本発明は、主にヒトに新しい軟骨組織を生成する方法に関してい るが、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、その他を含むいずれの哺乳類であって もその必要に応じ新しい軟骨組織を生成するのに実行してもよい。このような動 物の治療も本発明の範囲に入るものとする。 本発明は、次の項目に分けられるが、これは専ら説明のためである：（ａ ）三次元の骨組；（ｂ）骨膜／軟骨膜の組織および骨組と組み合わせたその挿入 ；（ｃ）遺伝子操作された間質細胞を含めて、間質細胞の調製；（ｄ）生体内へ の間質細胞の適用；（ｅ）本発明の方法の用途。 ４．１．三次元の骨組 三次元の骨組すなわち枠組構造体は、（ａ）細胞をそれに付着させる（も しくは細胞を変化させそれに付着させることができる）；（ｂ） １層以上に細胞を成長させる、いずれの材料および／または形状であってもよい 。この三次元の構造体は生体に挿入するものであるから、ポリグリコール酸（Ｐ ＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ヒアルロン酸、腸線縫合糸材料、ゼラチン、セル ロース、ニトロセルロース、コラーゲン、コットンもしくは他の天然に発生する 生分解性の材料等の生分解性材料を用いるのが好ましいかもしれない。さらに、 挿入に先立って、例えばエチレンオキシド処理またはガンマ線照射または電子ビ ーム照射によって、三次元の構造体を滅菌するのが好ましいかもしれない。 また、ナイロン（ポリアミド類）、ダクロン（ポリエステル類）、ポリス チレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート類、ポリビニル化合物類（例えば、 ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン （ＰＴＦＥ、テフロン）、サーマノックス（thermanox、ＴＰＸ）および様々な ポリヒドロキシアルカノエート類を含むがこれには限らない、いくつかの他の材 料を使って骨組または枠組構造体を形成してもよい。これらの材料のうち、ナイ ロン、ポリスチレン等のいくつかの材料は細胞の付着について不十分な支持体に なるかもしれないので、これらの材料を三次元の枠組として用いる場合、軟骨細 胞や他の間質細胞の骨組への付着を促進するため、挿入に先立って枠組を前処理 することが勧められる。例えば、ナイロンマトリックスは、０．１Ｍの酢酸で処 理し、ポリリシン、ＰＢＳおよび／またはコラーゲン中で加温し、ナイロンを被 覆することができる。ポリスチレンは、硫酸を用いて同じように処理することが できるだろう。 上にあげた材料のいずれも、メッシュまたはフェルトに形成し、例えば本 発明の方法に用いるための三次元の枠組すなわち骨組を作ってよい。枠組の形状 にかかわらず、枠組の開口は、軟骨細胞および他の間質細胞が開口を越えて広が るのを許す適当な大きさにするべきである。 枠組を越えて広がる間質細胞を活発に成長させ続けることが、間質細胞によって 合成される発育因子の生成を促進し、さらには生体内の新しい軟骨形成を促進す る。また、枠組の開口は、この構造体の中へおよび外への栄養素および老廃物の 適切な伝搬およひ挿入個所での血管新生を考慮しなければならない。例えば、開 口が小さすぎれば、間質細胞はすばやく集密（confluence）を作り出すが、マト リックスから簡単に抜け出せないかもしれない；捕らわれた細胞は、接触阻止を 呈し、増殖を支えるのに必要な適切な因子の生成を中止するかもしれない。開口 が大きすぎれば、間質細胞は開口を越えて広がることができないかもしれない； これもまた、増殖を支えるのに必要な適切な因子の間質細胞による生成を減少さ せるであろう。メッシュ型の枠組を使用する場合、約１５０μｍから約２２０μ ｍの範囲の開口で十分である。しかしながら、枠組の立体構造および複雑さによ っては、他の大きさも同じように十分機能するかもしれない。事実、間質細胞が 拡張し長期間複製および成長し続けることが可能であるいかなる形状または構造 も、本発明に従い機能するであろう。例えば、フェルト型の枠組については、約 ８０μｍから約１２０μｍの範囲の開口が好ましい。 ある好ましい実施態様によれば、骨組はフェルトであって、これは、例え ばＰＧＡ、ＰＬＡ、ポリグルコネート（ＰＬＧＡ）またはヒアルロン酸等の生分 解性の材料からなる、マルチフィラメント糸で構成することができる。この糸は 、クリンピング、カッティング、カーディングおよびニードリングからなる標準 の繊維加工技術を用いてフェルトにされる。さらに好ましい実施態様によれば、 フェルトの有孔性は８０−９８％の範囲であり、フェルトの密度は３０−６０ｍ ｇ／ｃｃの範囲、フェルトの厚さは１−７ｍｍの範囲である。 骨組がコラーゲンからなる実施態様では、コラーゲンは海綿、編 組、織糸等の形態であってよい。骨組がナイロンからなる実施態様では、都合の よいナイロンメッシュはナイテックス（Nitex）、平均孔サイズ２１０μｍ、平 均ナイロン繊維直径９０μｍのナイロン濾過メッシュである(#3-210/36 Tetko， Inc.,N.Y.)。 特許申請者は本発明が作用する機序を説明する義務も責務も負っているも のではないが、三次元の枠組本来のいくつかの要因が、本発明で三次元の枠組が 用いられて成功したことに係わっているかもしれない： （ａ）三次元の枠組が、タンパク質の付着、その結果、生体での間質細胞の付 着のために、より大きな表面積を提供する。 （ｂ）上述したように、マトリックスの立体性のため、枠組に付着する間質細 胞は、活発に成長し続け、かつ生体での新しい軟骨形成を促進する発育因子およ び調整因子を生成し続け、接触阻害を呈することがより起りそうもない。 （ｃ）三次元の枠組は、生体内で見られる細胞要素の空間的拡散に類似する細 胞要素の空間的拡散を考慮している。 （ｄ）三次元の構造体における細胞発育のための潜在的体積の増加は、生体内 での新しい軟骨の生成時における細胞の分化と成熟の助けとなる局所的微環境の 成立を可能にするのであろう。 （ｅ）三次元のマトリックスは、マクロファージ、単核細胞およびおそらく白 血球などの移動細胞の運動の可能性をより大きくすることによって細胞対細胞の 相互作用を最大にする。 （ｆ）分化した細胞の表現形の維持には、発育／分化因子のみならず適切な細 胞相互作用が必要であると認められている。本発明は、生体内組織微環境を効率 的に再現する。 本発明の１つの実施態様によれば、挿入に先立って、生体内での 軟骨細胞および他の間質細胞の骨組への付着および発育を高めるためのいくつか の物質で骨組を変化、例えば骨組を被覆または含浸、させてよい。これらの物質 には、細胞成長因子（例えば、ＴＧＦ−β）、軟骨形成を剌激する物質（例えば ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３のような軟骨の形成を刺激するＢＭＰ 類）、間質細胞の骨組への移動を剌激する因子、基質沈着を剌激する因子、抗炎 症剤（例えば、非ステロイド性抗炎症剤）、免疫抑制剤（例えば、サイクロスポ リン類）のような生物活性剤、ならびに、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維、糖 タンパク質類もしくはグリコサミノグリカン類（例えば、ヘパリン硫酸、コンド ロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫 酸など）のような他のタンパク質類が含まれるが、これに限定されるものではな い。例えば、ＴＧＦ−βのような成長因子は、アスコルビン酸塩と共に、軟骨細 胞分化と軟骨細胞による軟骨形成を誘発すると分かっている。また、ヒアルロン 酸は、軟骨細胞や他の間質細胞の付着に適した支持体になり、骨組の一部としで 組み込むか、または骨組にかぶせることができる。 これらの生物活性剤はまた、骨組の中または上に含ませて、薬剤を局所的 に徐々に放出させてもよい。このような徐放性製剤の例には、生物活性剤と、ポ リ（乳酸）、ポリ（乳酸−共−グリコール酸）（poly(lactic-co-glycolic acid ）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等の生体適合性を有するポリ マーとからなる複合物が含まれる。ドラッグデリバリービヒクル中の分解性ポリ マーの構造、選択および使用については、A．Dombら1992，polymers for Advanc ed Techno1ogies 3:279-292を始めとし、いくつかの刊行物中で検討されている 。医薬用製剤におけるポリマーの選択および使用時のさらなる手引きは、M．Cha sin and R．Langer(ends)，1990,“Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems，Vol 45 of Drugs and the Pharmaceutical Science s ，M．Dekker，New Yorkの本文に見つけることができる。４．２． 骨膜／軟骨膜の組織および骨組と組み合わせたその挿入 上述したように本発明の骨組は、骨膜組織または軟骨膜組織と組み合わせ て、またはこの２つの組織と組み合わせて生体内の欠損個所に挿入される。骨膜 組織は、骨の表面に位置する繊維性の膜である骨膜に由来し、患者（または被術 者）または組織適合性のあるドナーの適当ないずれの骨、例えば、腸骨、肩甲骨 、脛骨、腓骨、大腿骨等、その骨膜／骨の界面から得ることができる。骨膜組織 は、骨細胞、軟骨細胞や繊維芽細胞および骨細胞または軟骨形成細胞に分化する 能力を有する間葉幹細胞をはじめ、様々な間質細胞を含んでいる。軟骨膜組織は 、関節表面を除く軟骨を覆う繊維性結合組織である軟骨膜に由来する。軟骨膜組 織は、軟骨形成始原細胞と軟骨細胞を含む。 骨膜／軟骨膜の組織は、いかなる大きさもしくは形状の組織切片または組 織層の形態であってよいが、欠損個所内に合うまたは欠陥個所に相当する大きさ および形状であるのが好ましい。組織は、挿入個所の骨組の上または下に置くこ とができ、任意に、例えば、縫合または例えばフィブリン接着剤等の接着固定に よって、骨組および／または欠陥個所に機械的に固定することができる。骨膜／ 軟骨膜の組織は、自己由来（即ち、挿入を受ける被術者に由来する）であること が好ましいかもしれないが、組織は異質組織起源から由来してもよい。異質組織 起源からの骨膜／軟骨膜の組織を用いる時は、免疫拒絶の危険性を最小にするた めに、例えば、骨組にまたは骨組内に付着もしくは当該個所に体外的に適用して 、欠損個所に抗炎症因子または免疫抑制剤を追加するのが好ましいかもしれない 。 本発明の１つの好ましい実施態様によれば、三次元の骨組は、生体内の欠 損個所に挿入され、骨膜／軟骨膜の組織の１片が挿入された骨組の上に置かれ、 組織が骨組構造体と重なって隣接するように適所に縫合される。または、骨膜ま たは軟骨膜の切片が欠損個所に直接挿入され、その組織の間質細胞が組織から骨 組の中に移動できるように骨組が組織の上部に置かれてもよい。いずれにせよ骨 膜／軟骨膜の組織は、組織からの間質細胞が骨組の中に移動しその上およびその 中で増殖できるような仕方で、骨組に対して位置させるべきである。骨組および ／または骨膜／軟骨膜の組織は、当該分野で公知の外科的技術、例えば関節鏡検 査法、を用いて挿入することができる。 本発明の１つの好ましい実施態様によれば、骨膜組織の形成層が欠損に向 かい合うように、骨膜組織は位置もしくは向きを定められる；したがって、骨組 が直接欠損個所内に置かれ骨膜組織が骨組の上部に置かれる実施態様では、骨膜 組織は、形成層が骨組の頂部に向くように、骨組の頂部に対して向きを定められ る。軟骨膜組織が請求項記載の方法で用いられる場合、軟骨膜組織もまた、その 形成層または内部移行層が欠損または骨組に向くように、欠陥個所の中に置かれ るか骨組に対して向きを定められる。欠陥個所での新しい軟骨生成のために骨組 の中に移動できるのは、軟骨形成幹細胞および／または軟骨細胞を含むこれらの 層である。 本発明の他の実施態様では、生体再吸収可能な（bioresorbable）断片、 例えばフィルム、メッシュまたはフェルト等を骨膜/軟骨膜の組織に換えて用い 、欠損個所内で骨組に隣接して位置または向きを定めることができる。例えば、 フィルムが使用される場合、フィルムはPGAまたはポリグルコネートから構成さ れてよい；メッシュまたはフェルトが使用される場合、ヴィクリル（vicryl）ま たはPLAから構成されてよ い。間質細胞の調製物は、ここに記載するように、欠損個所の中に種として植え られる。 本発明のさらなる実施態様では、好ましくは挿入に先立って、欠損個所を 処理して、欠損の個所で軟骨を分解し、挿入物の骨組の中に移動する細胞（例え ば、間質細胞）をその領域から放ち、新しい軟骨の秩序ある形成を促進する。酵 素を用いて欠陥個所を処理する場合、そのような酵素には、トリプシン、キモト リプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、および／またはヒアルロニダーゼ、DN アーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ）、プロナーゼ、コンドロイチナーゼ等があ げられるが、これに限定されるものではない。欠損個所を処理して軟骨を分解す る他の方法には、摩砕、切除、切削もしくは微細穿孔があげられる。摩砕技術が 用いられた場合、軟骨の表面は、例えばスティールウールによって、ぎざぎざに 切り込まれる。微細穿孔においては、穿孔装置が軟骨に小さな欠陥や溝を作るた めに用いられる。すでに存在する軟骨を分解または粉砕するために欠陥個所を処 理することは、当該個所で瘢痕組織が生じる可能性を減少させ、欠陥個所での新 しい軟骨の秩序正しい形成を促進する。４．３．間質細胞の調製 この発明の方法によれば、間質細胞の調製物がさらに挿入個所に適用され る。この細胞は生物学的因子を生成するが、これらの因子は軟骨生成を促進し、 かつその上および中で付着および／または分化するために、軟骨生成幹細胞や軟 骨細胞のような細胞が、骨膜／軟骨膜の組織を含む挿入物に隣接する生体内環境 から骨組へ移動するのを促進する。間質細胞調製物はまた、骨組に移動し、そこ に付着し、欠陥個所での新しい軟骨の生成のための軟骨特異高分子や細胞外基質 を生じる、例えば 軟骨細胞および／または軟骨細胞始原細胞等の間質細胞の直接の源を提供する。 ここに記載した細胞は、下記のセクション４．４で論じるように、骨組および／ または骨膜／軟骨膜の組織の挿入の前、途中または後に適用することができる。 調製物の間質細胞は、軟骨細胞と、間葉幹細胞、繊維芽細胞、繊維芽細胞 様細胞および／またはII型コラーゲンおよび他の型のコラーゲンを生成可能な細 胞を含む軟骨細胞始原細胞と、軟骨組織に通常生成されるプロテオグリカンとを 含んでよい。間質細胞は、患者（または被術者）または組織適合性のあるドナー から得ることができる。軟骨細胞、始原細胞、繊維芽細胞様細胞およびその他の 細胞および／または間質を構成する要素は、起源において胎児性であっても成体 性であってもよいし、軟骨、骨、皮膚、靭帯、腱、筋肉、胎盤、臍帯等の都合の よい起源から由来してよい。例えば、軟骨細胞のような間質細胞は、ヒアリン軟 骨、肋骨軟骨、繊維性軟骨等を含む、だたしこれに限るものではない、いかなる 種類の軟骨に由来するものであっでもよく、これらは生検（適切であれば）また は解剖によって得られる。軟骨細胞始原細胞は、骨髄、骨膜、軟骨膜を含む様々 な起源もしくは未分化のヒトの間葉の様々な起源に由来するものであってよい。 繊維芽細胞は、包皮から、好ましくは胎児の包皮から、もしくはいずれかの適切 な死体の組織から、かなり好都合に多量に得ることができる。胎児の細胞は、繊 維芽細胞様細胞や軟骨始原細胞を含めて、臍帯または胎盤組織または臍帯血から 得てもよい。様々な起源からの間質細胞が請求項記載の方法に用いられてよいが 、生体内挿入には、挿入物に対する免疫拒絶の危険性を最小にするため、間質細 胞が挿入物を受け入れる個人または「普遍的ドナー」とみなしてよい胎児起源の 細胞に由来するのが好ましい。 間質細胞は細胞の起源として供給される適切な組織を分離する ことにより容易に単離することができる。これは、当該分野の技術者に公知な技 術を使用することにより、容易に達成することができる。例えば、組織は、機械 的におよび／または消化酵素および／またはキレート剤で処理することにより、 分離することができる。そのキレート剤は、隣接した細胞間の結合を弱め、組織 を分散させて、目に見えるほどの細胞破損なしに個々の細胞を懸濁させることを 可能とする。酵素的な分離は組織を細かく切り刻み、みじん切りにされた組織を 幾つかの消化酵素単独でまたは組み合わせで処理することにより、達成すること ができる。これらはトリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ および／またはヒアルロニダーゼ、DNアーゼ、プロナーゼ等を含むがこれに限定 されない。また機械的破壊は、粉砕機、配合機、ふるい、ホモジナイザー、細胞 圧縮機（pressure cell）または多少だが挙げられる超音波処理機を含むがこれ に限定されない幾つかの方法により達成することができる。組織分離解技術の概 観としては、Freshney，Culture of Animal Cells ，A Manual of Basic Techniq ue ，2d Ed.，A．R．Liss，Inc.，New York，1987，Ch．9，pp．107-126参照。 いったん組織を変形して個々の細胞の懸濁にすると、その懸濁は部分母集 団に分別することができ、そこから軟骨細胞、繊維芽細胞および／または他の間 質細胞および／または成分を得ることができる。これは、また特定な細胞種のク ローニングおよび選択、不必要な細胞の選択的破壊（消極的選択）、混合された 集団中の細胞の異なる凝集能力に基づく分離、凍結融解処置、混合された集団中 の細胞の異なる付着性、ろ過、従来の帯状の遠心分離、遠心水ひ（向流遠心分離 ）、単位比重分離、向流分配、電気泳動および蛍光活性化された細胞の選別を含 むが、これに限定されない細胞分離の標準的な技術を使用することにより達成す ることができる。クローンの選択および細胞分離技術の概観は、Freshney，上述のとおり ，Ch.11および12，pp．137-168を参照。 例えば、軟骨細胞、軟骨細胞始原細胞、繊維芽細胞または繊維芽細胞様細 胞の単離は以下のように行なう：新鮮なヒトの軟骨組織は、血清を除くために、 入念に洗浄し、ハンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で切り刻まれる。切り刻まれ た組織は、トリプシンのような解離酵素の新たに調整した溶液中で1-12時間イン キュベートされる。そのようなインキュベーションの後に、解離された細胞は懸 濁され、遠心分離により小さく丸められて培養皿上で培養される。全ての繊維芽 細胞は他の細胞の前に付着し、ゆえに、適切な間質細胞が選択的に分離され育て られることができる。分離された間質細胞は次いで集密に達するまで育てられ、 集密性（confluent）な培養物から持ち上げられ、軟骨欠損部位に生体内で適用 される（例えば、Naughtonら，1987，J．Med．18(3&4):219-250参照）。繊維芽 細胞はヒト臍帯（33-44週）からも分離することができる。新鮮な組織は断片に 切り刻まれ、培養液で洗浄されるかまたは更なる使用まで液体窒素中で急速凍結 されてもよい。臍帯組織は上述のように分離されてもよい。 ひとたび軟骨細胞または軟骨細胞始原細胞が分離されると、その個体数は 挿入のための調製細胞を得るために生体外で拡大することができる。最も適切な 培地、培地調製および細胞培養技術の選択方法は、当該分野でよく知られており 、Doyleら、(eds.)，1995，Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures，John Wiley & Sons，Chichester;およびHoおよひWang(eds.)，1991，Animal Cell Bi oreactors ，Butterworth-Heinemann，Bostonを含む様々な所で記載されている。 細胞はそれらが適切な密度、３から：６.５×10⁴／ｃｍ²に達したとき、 または例えば培養皿の表面上に限定した集密性のパーセントに達したとき、新鮮 な培養液に移動させるか「運搬」されるであろう。インキ ュベートのあいだ、間質細胞は、培養器の壁に貼りつき、増殖し続け集密性の単 層を形成できることもある。これは、例えば細胞の一部分を新鮮な培養液を有す る培養器へ移動することにより防ぐべきまたは最小限にすべきことである。とい うのは培養器内に集密性単層が存在すると、培地中で細胞の成長を「妨げる」傾 向にあるからである。集密性単層の除去または細胞の一部分の新しい器中の新鮮 な培養液への移動は、一般に細胞の増殖活性を回復させる。そのような除去また は移動は、約２５％の集密度を超えている単層を有する培養器のいずれでも行な われるべきである。代わりに、液体の培養物を、例えば軌道攪拌機でまたは回転 棒中で、かき回すことにより細胞が器の壁に貼りつくのを防ぐかまたは最小限に することができる。 加えて、ひとたび間質細胞が培地中に定着すると、それらは定期的な移動 を必要とする連続的な生体外の細胞の培養物、または好ましくは低温保存されて いた細胞のいずれかからなる細胞「銀行」中に保存されるか貯えられてもよい。 細胞の低温保存は、Doyleら、1995，上述と同様、に記載のような公知の方法に より行なわれる。例えば、しかし限定的な意味ではなく、細胞は、例えば、5-10 %のグリセロールを含んだり含まない、密度が例えば約4-10×１０⁶細胞／mlの、 更に２０％のFBSおよび９％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる培地 のような「凍結媒質」に懸濁されてもよい。細胞はガラスまたはプラスチック・ アンプル(Nunc)中に分配され、次いで封をされプログラム可能な冷凍庫の冷凍室 に移動する。冷凍の最適な速度は、経験的に決定されてもよい。例えば、融解熱 を通して−１℃／分の熱の変化を生じる凍結プログラムが使用される。ひとたび アンプルが−１８０℃に達すると、それらは液体窒素貯蔵領域へ移動される。低 温保存された細胞は、少なくとも５年毎に生存能力の維持を確認されるが、何年 もの間貯蔵することができる。 低温保存された細胞は細胞の銀行を構成し、細胞のある部分は解凍により 「引き出す」ことができ、必要な新しい軟骨組織を製造するのに使用されること ができる。解凍は一般に急速に、例えばアンプルを液体窒素から３７℃の水浴へ 移動さすことにより行なわれる。解凍されたアンプルの内容物は、直ちに無菌条 件下で１０％ＦＢＳと５％ＥＳで調節されたＲＰＭＩ １６４０のような適切な 培養液を含む培養器へ移動される。細胞ができるだけ速く培地を調節できるよう に、培地中の細胞が約３−６×１０⁵細胞／ｍｌの当初密度に調節され、それに より遅延型誘導期を妨げることが望ましい。一度培養物中で、例えば倒立顕微鏡 で、細胞の増殖を検出するために細胞が毎日検査され、それらが適切な密度に達 するとすぐに継代培養される。 軟骨細胞、軟骨細胞始原細胞、繊維芽細胞または繊維芽細胞様細胞に加え て、他の細胞を生体内の挿入のための細胞調製物に加えてもよい。その他の細胞 は、発明の骨組上に間質基質を産生することを助ける。例えば、疎性結合組織中 に見られる他の細胞は、軟骨細胞または繊維芽細胞とともに植え付けられてもよ い。そのような細胞は内皮細胞、血管周囲細胞、マクロファージ、単核細胞、形 質細胞、肥満細胞、脂肪細胞等を含むがそれに限定されない。これら間質細胞は 、臍帯または胎盤または臍帯血を含む適切な臓器から、前述のような当該分野で 公知の方法を使用して、たやすく得られる。 さらに、間質細胞の製造は、成長因子および／または薬物と同様に、選ば れた細胞外基質成分を含む、当該分野で知られた一以上の型のコラーゲンのよう な一以上の成分をさらに含む。細胞調製物に有効に組み込まれる成長因子は、当 該分野で公知であるかまたは将来そうみなされるであろう組織成長因子または刺 激因子を一以上含み、ＴＧＦ−β系統群、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−１２およびＢＭ Ｐ−１３のような軟骨形成を 刺激するＢＭＰ類、間質細胞の移動および／または基質沈着を刺激する因子、イ ンスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉと−II、成長ホルモン等のどれをも含み、し かしこれに限定されない。細胞調製物に有効に組み込まれる薬物は、局所麻酔剤 と同様に、非ステロイド系抗炎症剤のような抗炎症性化合物、サイクロスポリン のような免疫抑制剤を含む。他の成分はまた、調製物に含まれていてもよく、以 下のいずれをも含むがそれに限定されない：（１）適当なｐＨと等張性を提供す るための緩衝液；（２）滑剤；（３）適用部位にまたはその近辺に細胞を保持す るための粘着性物質、例えばアルギン酸塩、寒天および植物ゴムを含む；および （４）例えば、軟骨組織の形成、その物理化学的特徴もしくは細胞の生存力の支 持の増大もしくは改良、または炎症もしくは拒絶の抑制のような、適用部位で望 ましい効果を生じる他種の細胞。 また、細胞が生体内で挿入するのに使用されるため、間質細胞を患者自身 の組織からまたは胎児の起源（「万能供給者」）から得るのが好ましい。三次元 骨組上の細胞の成長は、枠組内またはその上に含むことにより、または枠組をタ ンパク質（例えば、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク類、グリコ サミノグリカン（例えば、硫酸ヘパリン、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロ イチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸等）、および／または成長因 子のような他の生物活性物質で覆うことにより、さらに高めることができる。 発明の一実施態様によると、ＴＧＦ−βおよびアスコルビン酸塩またはＢ ＭＰ−２、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３のような軟骨製造を刺激するＢＭＰ 類を含むがこれに限定されない成長調節または剌激因子は、骨組および／または 骨膜／軟骨膜の組織のいずれかの挿入の前、最中または後に、その部位で新しい 軟骨の産生が促進されるように、挿入部位に添加してもよい。さらに、そのよう な成長調整因子は、分離さ れた調製物として、または上述のとおりに記されたように間質細胞調製物の一部 として、間質細胞の適用時にその部位へ適用することができる。 加えて、間質細胞は遺伝子操作され、軟骨形成または軟骨形成細胞や他の 間質細胞をこの発明の骨組へ移動するのを刺激する因子のような他の生物学的因 子と同様に、ＴＧＦ−βのような成長因子を産生することができる。４．３．１．遺伝子操作された間質細胞 発明の骨組および骨膜／軟骨膜の組織に適用されたかまたは共同して間質 細胞は、遺伝子操作されて、欠損部位で成功した産生または軟骨の修復を促進す る、および／または遺伝子治療で使用するための、遺伝子産物を産生することも できる。例えば、間質細胞は、遺伝子操作され、例えば抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＴＮ Ｆ、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２等のような抗炎症因子を発現し、挿入の拒絶の危険 性を減らすか、またはリュウマチ様疾病または他の炎症反応のせいである軟骨中 の変性変化の危険性を減らす。例えば、間質細胞は、遺伝子操作され、顆粒細胞 −マクロファージのコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ、ＩＬ−１、Ｉ Ｌ−２または他の炎症性サイトカインのための中和抗体のイディオタイプに対応 するペプチドまたはポリペプチドを発現する。ＩＬ−１は、プロテオグリカンお よびII、およびＸＩ型コラーゲンの合成を減少させることが示されており（Tyle rら、1985，Biochem.J．227:869-878;Tylerら、1988,Coll.Re1at.Res.82:393;-4 05;Goldringら、1988,J.Clin.Invest.82:2026-2037;およびLefebvreら、1990,Bi ophys.Acta.1052:366-372）、軟骨の吸収と、軟骨細胞による炎症伝達物質の産 生の有効な刺激剤である(Cambellら、1991,J．Immunol．147:1238-1246)。ＴＮ Ｆも、ＩＬ−１より有効性が低いが、プロテオグリカン類やII型コ ラーゲンの合成を阻害する（Yaron,I．ら、1989,Arthritis Rheum.32:173-180;I kebe，T．ら、1988，J．Immunol．140:827-831;およびSaklatvala，J.，1986，N ature 322:547-549）。 ひとたび遺伝子操作された間質細胞が個体に挿入されると、抗炎症遺伝子 産物の存在が免疫拒絶またはリューマチ様疾患または関節疾患に関連した炎症反 応の改善を引き起こしうる。 他の実施態様では、間質細胞が遺伝子操作され、例えばＴＧＦ−βの産生 において軟骨形成を刺激するような治療的効果を発揮する遺伝子、または軟骨形 成を促進および／または骨生成を阻害するＢＭＰ−１３のような他の因子、また は間質細胞の移動および／または基質沈着を促進する刺激因子を発現することが できる。 加えて、間質細胞は遺伝子操作されて、患者が不足している遺伝子を発現 する。例えば、様々なリューマチ様疾患または関節疾患の症状を妨げるか改善す る遺伝子は、疾患の状態下であまり発現されないかまたは低く制御されている。 とりわけ、リューマチ様疾患または関節疾患の炎症反応を妨げることに関与して いる遺伝子の発現は、低く制御されている。または、遺伝子産物の活性が減少し 、上記病的状態およびリューマチ様疾患または関節疾患の幾つかまたは全ての症 状が現れ、その結果として症状が進展する。ゆえに、遺伝子活性のレベルは、遺 伝子産物の存在レベルを増加することまたは欠損部位での活性な遺伝子産物存在 レベルを増加させることのいずれかにより、増加する。遺伝子操作され活性な標 的遺伝子産物を発現する間質細胞を、その生成物が不足しているリューマチ様疾 患または関節疾患患者に挿入することにより、標的遺伝子産物のレベルおよび／ またはその生成物の活性が調整され、リューマチ様疾患または関節疾患の症状を 妨げるか改善することができる。ここで使用されている「標的遺伝子」は、リュ ーマチ様疾患または関節疾 患に関与している遺伝子をさしており、軟骨の再吸収および軟骨細胞による炎症 伝達物質の産生を妨げることにより、標的遺伝子発現または標的遺伝子産物活性 のレベルの調整が、リューマチ様疾患または関節疾患の症状を改善するのに働く という意味である。 加えて、患者は、この発明の方法に従って適用された間質細胞を使用する ことにより遺伝子置換治療で治療されてもよい。ゆえに、置換または修復された 軟骨は、個々の患者の必要に合うように特に計画されてもよい；例えば、間質細 胞は遺伝子操作され、一以上の遺伝子を調整してもよい；または遺伝子発現の調 整は、一過性のまたは長期のものであってもよい；または遺伝子活性は、非誘導 可能または誘導可能であってもよい。例えば、宿主による挿入の拒絶を防ぐヒト 補体調節タンパク質をエンコードする遺伝子は、ヒト繊維芽細胞に挿入されても よい［McCurryら、1995，Nature Medicine 1:423-427］。 発明の方法で使用される間質細胞は、遺伝子操作されて挿入部位での炎症 または拒絶を促進する因子の発現を「ノックアウト」することができる。標的遺 伝子発現レベルまたは標的遺伝子産物活性レベルの減少のための負の調節技術は 、以下に論じる。ここで使用される「負の調節」は、調節処置をしていない標的 遺伝子産物のレベルおよび／または活性に関して、標的遺伝子産物のレベルおよ び／または活性における減少を指している。間質細胞に否定的な遺伝子の発現は 、幾つかの技術を使用して減らすかまたはノックアウトすることができる。例え ば、発現は、標準的な相同的組換え技術を使用し、遺伝子を完全に失活させるこ と（一般に「ノックアウト」と呼ばれる）により、妨げることができる。普通、 タンパク質の重要な部位をエンコードするエキソン（またはその部位に対するエ キソン５’）は、正の選択マーカー（例えばneo）により分断され、標的遺伝子 からの正常なｍＲＮＡの産生を妨げ、遺伝子の失 活を引き起こす。遺伝子はまた、遺伝子の一部において欠失を生じさせることに より、または遺伝子全体を欠失させることにより、失活されることがある。ゲノ ム中の遠く離れたところに存在する標的遺伝子に相同的な二つの部位を有する構 造物を使用することにより、二つの部位に介在する配列は、欠失することができ る［Mombaertsら、1991,Proc.Nat.Acad．Sci.U.S.A.88:3084-3987］。 標的遺伝子の発現を妨げるアンチセンスやリボザイムも、発明に従い使用 され、標的細胞の活性レベルを減少させることができる。例えば、主要組織適合 性遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を妨げるアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫応答 に関して最も用途が多いことが示されている。さらに、適当なリボザイム分子が 、例えばHaseloffら、1988，Nature334:585-591;Zaugら、1984,Science224:574- 578;およびZaugとCech、1986，Science231:470-475に記載のように、上述のよう に計画されることができる。さらに、三重らせん分子は標的遺伝子活性のレベル を減少させることに使用することができる。これらの技術は詳しく、L．G．Davi sらeds、Basic Methods in Molecular Biology、2nd ed.,Appleton & Lange，No rwa1k，Conn．1994に記載されている。 前述の技術のいずれを使用しても、ＩＬ−１の発現は軟骨細胞中で破壊さ れ、軟骨の再吸収および軟骨細胞による炎症伝達物質の産生の危険を減らすこと ができる。同様に、クラスIIＭＨＣ分子の発現は、挿入の拒絶の危険を減らすた めに、ノックアウトされる。 発明の細胞を遺伝子操作するのに有用である方法は、当該分野でよく知ら れている。例えば、興味ある遺伝子を含む組換えＤＮＡ構造物またはベクターは 形成され使用されて、発明の間質細胞を形質転換または形質移入される。興味あ る遺伝子を担持しその遺伝子を発現することができるそのような形質転換または 形質移入された細胞は、選択され、 培養でクローン的に拡大される。興味ある遺伝子を含むＤＮＡ構造物の調製法、 細胞を形質転換または形質移入する方法、および興味ある遺伝子を担持し発現す る細胞を選択する方法は、当該分野で良く知られている。例えば、Maniatisら,1 989,Molecular Cloning ，A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．；Ausubelら、1989，Current Protocols in MolecularB iology ，Greeene Publishing Associates & Wiley Interscience， N.Y.;およびSambrookら、1989，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．に記 載の技術を参照。 細胞は、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノー関連（adeno-asso ciated）ウイルスベクターのような組み込みウイルス性ベクター；または例えば 乳頭腫ウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクターのような 非組み込み複製ベクター；または複製能欠損ウイルス性ベクターを含むが、これ に限定されない多様なベクターのいずかを使用し遺伝子操作できる。一時的な発 現を望むとき、非組み込みベクターと複製能欠損ウイルス性ベクターが好ましい 。というのは、誘導可能または構築可能のいずれかのプロモーターを、興味ある 遺伝子の発現を制御するためのこれらの系で使用することができるので。また、 組み込みベクターは、もし興味ある遺伝子が誘導可能なプロモーターにより制御 されていたならば、一時的な発現を得るために使用されることができる。ＤＮＡ を細胞に導入する他の方法としては、リポソーム、リポフェクション(lipofecti on)、電気穿孔法、パーティクルガン(particlegun)の使用または直接的ＤＮＡ注 入を含む。 宿主細胞は、制御されたＤＮＡで形質転換または形質移入されるのが好ま しい。例えば、効果的に共同して、プロモーターまたはエンハ ンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、および、特に、選択マ ーカーのような適当な発現制御因子の一つ以上により制御される。外来性のＤＮ Ａの導入に続き、遺伝子操作された細胞が強化培地中で育てられ、次いで選択培 地に移される。外来性のＤＮＡ中の選択マーカーは、選択に対し抵抗性を与え、 細胞に外来性ＤＮＡを、例えばプラスミド上に、その染色体に安定に組み込ませ 、育ててフォーカスを形成させ、次にはクローニングされて細胞株中に拡大され る。この方法は遺伝子産物を発現する細胞株を遺伝子操作するのに都合よく使用 することができる。 いずれのプロモーターも、挿入された遺伝子の発現を起こさせるのに使用 される。例えば、ウイルス性プロモーターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサ ー、ＳＶ４０、乳腫腫ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、エラスチン遺伝 子プロモーターおよびβ−グロブリンを含むがこれに限定されない。好ましくは 、興味ある遺伝子の発現を制御するのに使用される制御因子は、生成物が生体内 で必要なときのみに合成されるように遺伝子の制御された発現を考慮にいれるべ きである。一時的な発現が望ましいときは、構成可能なプロモーターを非組み込 みおよび／または複製能欠損ベクターに使用するのが好ましい。また、誘導可能 なプロモーターは、必要なとき挿入された遺伝子の発現を起こさせるために使用 することができる。誘導可能なプロモーターは、組み込みおよび／または複製ベ クター中へ造ることができる。例えば、誘導可能なプロモーターはメタロチオネ インや熱ショックタンパク質を含むが、これに限定されない。 間質細胞中へ遺伝子操作された遺伝子産物の、構成的なまたは一時的な発 現を得るために、多様な方法を使用してもよい。例えば、Seldonら、1987，Scie nce 236:714-718により記載された核質転移 （transkaryotic）挿入技術を使用することができる。ここで使用される「核質 転移」は、挿入された細胞の核が、安定なまたは一時的な形質移入によるＤＮＡ 配列の添加により変えられることを指す。間質細胞は遺伝子操作され、術後回復 期間中に、一時的におよび／または誘導可能な制御下でそのような遺伝子産物を 、またば間質細胞に足場固定されたキメラ融合タンパク質として、例えば受容体 分子または受容体様分子の細胞内および／または膜内外ドメインからなり、細胞 外トメインとして遺伝子産物に融合しているキメラ分子として発現するのが好ま しい。 ひとたび間質細胞が遺伝子操作されると、それらは変性性結合織病または 外傷の場合、患者に適用され新しい軟骨を製造する。４．４ 生体内での間質細胞の適用 間質細胞の調製物は、骨組および／または骨膜／軟骨膜の組織の挿入の前 、最中または後に適用することができる。例えば、細胞は、骨組または骨膜／軟 骨膜の組織のいずれかの挿入の前に、欠損部位へ植え付けることができる。また は、間質細胞は、骨組および組織の一方または両方が挿入された後に、その部位 へ適用することができる；例えば骨組へ骨膜／軟骨膜の組織を縫合した後に、そ の部位へ注入することにより。好ましい実施態様によれば、細胞は、欠損部位の 骨膜／軟骨膜の組織と骨組の間に植え付けられる。別の好ましい実施態様によれ ば、細胞は骨組に直接植え付けられる。軟骨を分解させるために欠損部位の軟骨 が処置される発明の実施態様によると、間質細胞は分解された軟骨中へ、例えば 周囲の細胞中へ、または軟骨壁中へ、植え付けられる。軟骨細胞は、その中で分 解された軟骨から挿入組織への間質細胞の移動を促すように働く。 間質細胞は欠損部位に細胞の適用が可能となるようないずれか の方法により、例えば注入により、植え付けられる。細胞がその部位へ注入され るとき、そのような注入は、細胞の多様性を維持するいずれかの方法により、例 えばシリンジまたはより好ましくは関節鏡により、達成される。発明の好ましい 実施形態によれば、適用された細胞の数はおよそ１×１０⁶−３０×１０⁶間質細 胞の範囲である。 骨組、骨膜／軟骨膜の組織および間質細胞を挿入した後に、欠損部位は、 外科的に封をされる。発明の好ましい実施形態によれば、植え付けられる間質細 胞は外科的に患者から、例えば耳軟骨および／または骨髄から、別の外科的処置 で得られ、生体外で培養され適当な量の細胞を得、骨組および骨膜／軟骨膜の組 織を挿入する第二の手術のときに患者に適用する。骨膜／軟骨膜の組織は、その 組織が挿入の前に生体外で培養することができるが、骨組を挿入したときに患者 から外科的に得るのが好ましい（例えば、O'Driscollら、1994，J．Bone and Jo int Surg.76-A:1042-1051参照）。 この発明の方法によれば、骨膜／軟骨膜の組織からかまたは加えられた間 質調製物からの間質細胞は、骨組構造を占め、生体内軟骨組織の微環境に類似し ている間質基質を形成し、欠損部位で新しい軟骨の産生を考慮する。その部位へ 適用された間質細胞は、軟骨形成と、生体内軟骨欠損環境である挿入された組織 からまたは間質調製物から骨組への間質細胞の移動とを促進する重要な生物学的 因子を供給し、ゆえに、生体内で間質細胞の長期間にわたる活性な増殖を維持す るのに必要な、支持体、成長因子および調節因子を提供する生物の間質細胞組織 の産生を促進する。間質細胞は、そのうえ欠損部位で生物の間質基質の沈着を促 進する因子を提供することもある。増殖している細胞は、成熟し適切に基質内へ 分離され、生体内の欠損部位で新しい軟骨組織を形成する。 損傷した軟骨の修復または置き換えの成功は、もし新しい軟骨組 織が修復部位で適所に固定されれば、高められる。順向固定技術が使用されない と、後の挿入活動は新しい軟骨組織がその部位から取り除かれる原因になる。適 所に新しい軟骨組織を固定するために、その部位の上部に置かれ縫合されること ができる生体再吸収可能なポリマーまたは生体適合性組織由来の断片；生体吸収 可能な縫合または他の留め金、例えばピン、針、鋲、ねじ、留め具、フィブリン 接着剤のような接着剤；非吸収可能な固定装置、例えば縫合糸、ピン、ねじおよ び留め具；接着剤；および緩衝適合結合構造の使用を含む、様々な方法を使用す ることかできる。４．５ 発明の方法の使用 この発明の方法は、生体内で存在する軟骨組織を取り替えるか増やすこと 、新しいかまたは変化した軟骨組織を導入すること、または生物学上の組織また は構造物に共に結合させることに有用である。本方法は、幾つかの特定な分野で の使用を見出している。例えば、ひざ、臀部、ひじ、足関節および上腕関節窩を 含む幾つかの関節中での関節軟骨の内部障害を評価することは、関節鏡技術によ り可能とされている。そのような障害は、軟骨への肉体の外傷により、様々な結 合組織病により、および／または個体の年齢の増大により、引き起こされる。関 節鏡手術は、好結果であると同様にますます評判がよくなっており、例えば直径 ３−４ｍｍの多数の小型切断道具がひざに使用することができる。三角法（tria ngulation）は、手術器具を関節鏡により提供される視野に入れ、入るための複 数の開口を必要とする；また、関節の一ヶ所の開口が必要な場合に、切断器具を 関節鏡自身中のチャンネルを通じて通すことができる（Jackson，R．W.，1983， J．Bone Joint Surg．[AM]65:416）。損傷したか悪化した軟骨を関節鏡手術によ り選択的に除去すると、軟骨が 損失し、それは本発明の方法を使用して修復することができる。本法はまた、異 なるタイプの関節のための主要な再建手術から由来する軟骨損失を修復または増 大させるのに使用することもできる。そのための手術法がResnick,D.，およびNi wayama，G.，eds.，1988，Diagnosis of Bone and Joint Disorders，2d ed.，W .B．Sanders Co.に記載されている。さらに、本法は、他の顔および頭蓋の再建 と同様に、側頭下顎関節の再建に有用である。 それ自体、本発明は、リュウマチ様関節炎または骨関節炎のような変性性 結合組織病の治療において、または軟骨が損傷されたか失われた肉体の外傷治療 において、生体内で軟骨を形成または修復するのに有用である。５． 実施例 以下のサブセクションは、発明の方法に従った骨組、骨膜組織および間質 細胞の軟骨欠損部位における生体内挿入と同様に、この発明の方法で使用される 成分について記載している。５．１． 三次元骨組の調製 ＰＧＡマルチフィラメント糸由来のフェルトからなる三次元骨組を生成し た。糸はDavis and Geck／Sherwood MedicalからDexon^TMの商品名で市販で入手 可能である。Dexon^TM糸の特定な型は56/123である。Dexon^TM糸は、標準的な織物 の加工技術によりフェルトに加工される。フェルトシートは、加工後に有孔性９ ７％、密度４５ｍｇ／ｃｃおよび２−７ｍｍの厚さを有し、生体内での挿入に適 切なサイズに切断される。医療製品のための標準的な滅菌技術（放射またはエチ レンオキシドガス）は、フェルトを滅菌するのに使用される。フェルトは乾燥し て挿入され るかまたは、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭＬ−グルタミン、可欠アミノ酸、５０ ｍｇ／ｍｌプロリン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、３５μｇ／ｍｌゲンタマイ シン硫酸および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸塩を含むＤＭＥＭ媒質を使用して 予浸されることができる。５．２． 骨膜／軟骨膜の組織の調製 この発明の方法で使用される骨膜組織は、例えば関節鏡検査法により、患 者の脛骨または大腿骨から骨膜の一部分を除去して得られる。軟骨膜組織は、患 者の肋骨から軟骨膜の一部分を除去することにより、得ることができる。骨膜／ 軟骨膜の組織は、欠損部位に相当するようなサイズおよび／または形である。患 者からの骨膜／軟骨膜の組織の摘出は、骨組の挿入時に行なわれるのが好ましい 。５．３． 間質細胞調製物の調製 ヒト軟骨細胞の調製物は、Brittbergら、1994,New Eng.J.Med.331（No.14 ）:890-895に記載されているようにして得られる。例えば、軟骨の薄切り（例え ば、300-500ｍｇの重量）は、ひざの大腿関節丘のような関節の主要でない荷重 耐性（load-bearing）領域から、関節鏡検査法により得ることができる。軟骨組 織は冷却された塩化ナトリウム滅菌溶液（容積あたり0.9重量%）中に置き、細か く刻み、ＨＥＰＥＳ緩衝液（10mmol/l）、ゲンタマイシン硫酸（50μg/ml）、ア ンホテリシンＢ（２μg/ml）およびＬ−アスコルビン酸（50μg/ml）を含むHam' s F12媒質（Gibco Labs，Grand Island，NY）中で洗浄することにより２−５時 間以内に細胞を収穫する。細胞は、セクション５．１で上述の完全なＤＭＥＭ媒 質を使用して同様に収穫することができる。軟骨は次いで、コラゲナーゼ（0.2% 重量／容積）でほぼ16時間消化され、細胞はナイロンメ ッシュを通してろ過し、媒質で洗浄して、患者の血清を補った媒質中に再懸濁さ せる。細胞はＴ−１５０フラスコあたり１×１０⁶細胞の密度で植え付けされ、 インキュベーター中で37℃、5%CO₂で培養する。細胞は5-7日毎に集密となる。 加えて、軟骨細胞始原細胞は、Wakitaniら、1994，J．Bone and Joint Su rg．76-A（No.4）：579-592に記載の方法に類似した方法を使用して得ることが できる。短く、血液は骨髄から吸引され、吸引物を洗浄し、180×gで５分間遠心 分離する。10%FCSと抗生物質で補ったHam'sF12媒質中に再懸濁させた後、赤血球 は4%酢酸で処理することにより破裂させ、残存する細胞を完全媒質（10%FCS）中 37℃、加湿された雰囲気、5%CO₂中で培養する。５日目に媒質を交換し、非粘着 細胞すべてを実質的に除去する。粘着細胞は集密になるまで単層として育てる。 細胞はその後、５分間トリプシン処理(trypsinized)し(0.25%トリプシン、１ｍ Ｍ EDTA)細胞を培養皿からはずす。 軟骨細胞始原細胞は、収穫した骨膜、例えば脛骨または大腿骨から、得る ことができる。骨膜組織はHam's F12媒質中３時間37℃で0.25%,のコラゲナーゼ とインキュベートし、周期性攪拌を行なう。組織は次いで渦により破裂させ、細 胞を100ミクロメーターナイテックスフィルターを通してろ過し、二度洗浄して 遠心分離する。細胞は次いで毎日取り替える完全媒質中で培養する。粘着細胞は 集密まで成長し、骨髄誘導性細胞で上記記載したようにトリプシンで解離させる 。 生体内での適用の前に、間質細胞調製物をトリプシンで処理することによ り懸濁させ、遠心分離して小さく丸めたものを、自家血清で補足した培養液で洗 浄する。細胞調製物は次いで、1.2mmの針を備えた1mlのツベルクリンシリンジ中 に挿入部位へ適用するために、吸引される。５．４．生体内での骨組、骨膜組織および間質細胞の挿入 軟骨欠損部位を、挿入の前に、0.75%滴定よう素のようなよう素外科用洗 浄液または0.9%塩化ナトリウム溶液のような滅菌溶液でこすり洗いまたはすすぎ 洗いにより清潔に／滅菌する。欠損部位はまた、0.1−100ユニット/mlの範囲の トリプシンで、使用する酵素の濃度によって1-30分間処理することにより酵素的 に処理し、欠損の軟骨表面領域を弱める。 上述のフェルト骨組は、欠損部位に適合するように仕立てられ、その部位 の中に置き、上述の骨膜組織を骨組に向かって面している骨膜の形成層を有する フェルト骨組の頂部および欠損中に置く。骨膜組織は任意に再吸着可能なヴィク リル縫合糸を使用してフェルトの骨組の端の上を縫うことができる。折り返し片 もまた、欠損部位で周囲の軟骨に縫いつけられる。 骨組および／または骨膜組織の挿入の前に、上述の調製物である間質細胞 を、例えば関節鏡検査法により、欠損部位へ適用することができる。5mmの厚さ の1.5cm半径の欠損に対し、DMEM(血清ありまたはなしで)のような栄養源ベース の溶液200μｌ中に合計14×10⁶間質細胞を適用する。好ましい実施態様によると 、間質細胞は骨膜組織と骨組の間に注入される。欠損部位は、縫合糸および包帯 を当てた部位を有する層中に閉じられる。術後の鎮痛薬を投与する。 本発明は、記載した特定な実施態様による範囲に限定されず、それらは発 明の個々の一面を説明するためのもので、機能的に等価な方法および成分は、本 発明の範囲にはいり、ここに示し記載したものに加えて、前述の記載から当業者 に明らかとなるであろう。そのような変更は添付した請求項の範囲内に入るもの である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．骨膜組織、軟骨膜組織またはそれらの組織の組み合わせと組み合わせた、挿 入の後に起こる軟骨の形成のための間質細胞の調製物と関連した、生体適合性な 、非生物の三次元骨組構造物の使用。 2．該間質細胞が骨組に付着し、および／または軟骨細胞形成または間質細胞の 移動を誘導することを特徴とする請求項１による使用。 3．骨膜または軟骨膜の組織が、骨組の頂部または底辺におよび隣接して位置す ることを特徴とする請求項１または２による使用。 4．骨膜または軟骨膜の組織が、組織からの間質細胞が組織から骨組に移動でき るように、骨組に対して位置を決められていることを特徴とする請求項１または ２による使用。 5．骨膜または軟骨膜の組織が、組織の形成層または内部移行層が骨組に面する ように、骨組に対して位置を決められていることを特徴とする請求項１または２ による使用。 6．間質細胞の調製物が、骨組と骨膜または軟骨膜の組織の間に物理的に置かれ ていることを特徴とする請求項１または２による使用。 7．骨組構造が生体分解性または非生体分解性物質からなることを特徴とする請 求項１から６のいずれか一つによる使用。 8．生体分解性物質が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コットン、腸線縫合糸、 セルロース、ニトロセルロース、ゼラチン、コラーゲンまたはポリヒドロキシア ルカノエートであることを特徴とする請求項７による使用。 9．非生体分解性物質が、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロ ピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオ ロエチレン、サーマノックス、コットン、セルロースまたはポリヒドロキシアル カノエートであることを特徴とする請求項７による使用。 10．枠組がフェルトまたはメッシュであることを特徴とする請求項１から９のい ずれか一つによる使用。 11．挿入の前に枠組がエチレンオキシドで、または電子ビームで処理されること を特徴とする請求項１から10のいずれか一つによる使用。 12．枠組が、枠組上の間質細胞の付着または成長を増大させることができる物質 の少なくとも一つからなるかまたは、含むように変形されることを特徴とする請 求項１から11のいずれか一つによる使用。 13．物質が、(a)細胞成長因子、間質細胞の移動を剌激する因子、軟骨形成を刺 激する因子、基質沈着を刺激する因子、抗炎症剤および免疫抑制剤からなる群か ら選ばれる生物活性剤であるかまたは、(b)コラーゲン、弾性繊維、細網繊維、 ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマ タン硫酸、ケラチン硫酸およびヒアルロ ン酸からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１２による使用。 14．生物活性剤が、(a)アスコルビン酸塩と共にまたはなしでＴＧＦ−βである 、または(b)軟骨形成を刺激する骨形態形成タンパク質である、または(c)徐放性 製剤からなることを特徴とする請求項１３による使用。 15．製剤が生物活性剤と生体適合性ポリマーの複合物からなることを特徴とする 請求項１４による使用。 16．生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−共−グリコール酸）、メチ ルセルロース、ヒアルロン酸およびコラーゲンからなる群から選択されることを 特徴とする請求項１５による使用。 17．間質細胞の調製物が、軟骨細胞、または軟骨細胞始原細胞、または繊維芽細 胞または繊維芽細胞様細胞、または軟骨細胞、軟骨細胞始原細胞、繊維芽細胞、 繊維芽細胞様細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、マクロファージ、単核細胞、白血 球、形質細胞、肥満細胞、脂肪細胞、臍帯細胞もしくは臍帯血からの骨髄細胞の 組み合わせからなることを特徴とする請求項１から１６のいずれか一つによる使 用。 18．軟骨細胞始原細胞が、間葉幹細胞からなることを特徴とする請求項17による 使用。 19．間質細胞の調製物が、さらに少なくとも一つの生物活性剤からなるかまたは 、該細胞が、遺伝子操作され少なくとも一つの生物活性剤を産生することを特徴 とする請求項１から18のいずれか一つによる使用。 20．生物活性剤が、細胞成長因子、間質細胞の移動を刺激する因子、軟骨形成を 刺激する因子、基質沈着を刺激する因子、抗炎症剤および免疫抑制剤からなる群 から選ばれてなることを特徴とする請求項19による使用。 21．生物活性剤が、アスコルビン酸塩と共にまたはなしでＴＧＦ−β、または軟 骨形成を剌激する骨形態形成タンパク質であることを特徴とする請求項20による 使用。 22.調製物の間質細胞が、遺伝子操作され、生体内で不完全に発現されている遺 伝子を発現するかまたは、間質細胞により正常に発現されている遺伝子の発現を 妨げるか減少させることを特徴とする請求項１から18のいずれか一つによる使用 。 23．(a)骨膜組織、軟骨膜組織または該組織の組み合わせと組み合わせた、生体 適合性な非生物の三次元骨組構造を欠損部位へ挿入することおよび (b)骨組への付着のためおよび／または軟骨形成もしくは間質細胞の生体内の欠 損部位に隣接する環境から骨組への移動を誘導するため、間質細胞の調製物を欠 損部位へさらに適用すること からなる生体内で軟骨欠損部位に軟骨を産生する方法。 24．骨組が欠損部位に挿入され、骨膜または軟骨膜の組織が骨組の頂部および隣 接して設置されている請求項１による方法。 25．骨膜または軟骨膜の組織が欠損部位に挿入され、骨組が組織の頂部および隣 接して設置されている請求項１の方法。 26．骨膜または軟骨膜の組織が、組織からの間質細胞が組織から骨組へ移動でき るように骨組に対して位置を決められている請求項１の方法。 27．骨膜の組織が、組織の形成層が骨組と向かいあうように骨組に対して位置を 決められている請求項１の方法。 28.軟骨膜の組織が、組織の形成層または内部移行層が骨組と向かいあうように 骨組に対して位置を決められている請求項１の方法。 29．間質細胞の調製物が、骨組構造の挿入の前、最中または後に適用される請求 項１の方法。 30．間質細胞の調製物が、骨膜または軟骨膜の組織の挿入の前、最中または後に 適用される請求項１の方法。 31．間質細胞の調製物が、骨組と骨膜または軟骨膜の組織との間に物理的に設置 される請求項１の方法。 32.骨組構造が生体分解性、または非生体分解性物質からなることを特徴とする 請求項２３から３１のいずれか一つによる方法。 33.生体分解性物質が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コットン、腸線縫合糸、 セルロース、ニトロセルロース、ゼラチン、コラーゲンまたはポ リヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項32による方法。 34．非生体分解性物質が、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロ ピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオ ロエチレン、サーマノックス、コットン、セルロースまたはポリヒドロキシアル カノエートであることを特徴とする請求項32による方法。 35．枠組がフェルトまたはメッシュであることを特徴とする請求項23から34のい ずれか一つによる方法。 36．挿入の前に枠組がエチレンオキシドで、または電子ビームで処理されること を特徴とする請求項23から35のいずれか一つによる方法。 37．枠組が、枠組上の間質細胞の付着または成長を増大させることができる物質 の少なくとも一つからなるかまたは、含むように変形されることを特徴とする請 求項23から36のいずれか一つによる方法。 38．物質が、(a)細胞成長因子、間質細胞の移動を剌激する因子、軟骨形成を刺 激する因子、基質沈着を刺激する因子、抗炎症剤および免疫抑制剤からなる群か ら選ばれる生物活性剤であるかまたは、(b)コラーゲン、弾性繊維、細網繊維、 ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマ タン硫酸、ケラチン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選ばれることを特徴 とする請求項37による方法。 39．生物活性剤が、(a)アスコルビン酸塩と共にまたはなしでＴＧＦ−βである 、または(b)軟骨形成を刺激する骨形態形成タンパク質である、または(c)徐放性 製剤からなることを特徴とする請求項38による方法。 40．製剤が生物活性剤と生体適合性ポリマーの複合物からなることを特徴とする 請求項39による方法。 41．生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−共−グリコール酸）、メチ ルセルロース、ヒアルロン酸およびコラーゲンからなる群から選択されることを 特徴とする請求項40による方法。 42．間質細胞の調製物が、軟骨細胞、または軟骨細胞始原細胞、または繊維芽細 胞または繊維芽細胞様細胞、または軟骨細胞、軟骨細胞始原細胞、繊維芽細胞、 繊維芽細胞様細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、マクロファージ、単核細胞、白血 球、形質細胞、肥満細胞、脂肪細胞、臍帯細胞もしくは臍帯血からの骨髄細胞の 組み合わせからなることを特徴とする請求項23から41のいずれか一つによる方法 。 43．軟骨細胞始原細胞が、間葉幹細胞からなることを特徴とする請求項42による 方法。 44．間質細胞の調製物が、さらに少なくとも一つの生物活性剤からなるかまたは 、該細胞が、遺伝子操作され少なくとも一つの生物活性剤を産生することを特徴 とする請求項23から43のいずれか一つによる方法。 45.生物活性剤が、細胞成長因子、間質細胞の移動を刺激する因子、軟骨 形成を刺激する因子、基質沈着を刺激する因子、抗炎症剤および免疫抑制剤から なる群から選ばれてなることを特徴とする請求項44による方法。 46．生物活性剤が、アスコルビン酸塩と共にまたはなしでＴＧＦ−β、または軟 骨形成を剌激する骨形態形成タンパク質であることを特徴とする請求項45による 方法。 47.調製物の間質細胞が、遺伝子操作され、生体内で不完全に発現されている遺 伝子を発現するかまたは、間質細胞により正常に発現されている遺伝子の発現を 妨げるか減少させることを特徴とする請求項23から43のいずれか一つによる方法 。