JP2000506501A - 抗イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体およびそれらの医薬としての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 静止した内皮細胞には影響を与えずに、脈管形成を阻害するかあるいは脈管形成を促進するという観点で、脈管形成過程にある内皮細胞を含む疾患の処置のための薬剤の調製のための、あるいは脈管形成過程にある内皮細胞を含む疾患の診断のための製品の調製のための、血管内皮細胞成長因子の抗イディオタイプ抗体の使用。

Description

【発明の詳細な説明】 抗イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体およびそれらの医薬としての使用 本発明は、抗イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体およびそれらの医薬と しての使用に関する。 ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）は、現在では、腫瘍の進行(Folkmanに概説 )、糖尿病性網膜症(Malecaze，1994)またはリウマチ性多発性関節炎(Fava，1994 )において観察される制御されない新生血管形成の主な物質として認識されてい る。 Connolly)。１２１、１６５、および１８９アミノ酸の少なくとも３つのホモダ イマー型が、プレメッヤンジャーＲＮＡのオルタナティブスプライシングにより 生成される。１６５アミノ酸のＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ１６５と呼ばれる。その脈 管形成の役割に加えて、ＶＥＧＦは、毛細血管の透過性を刺激する(Connolly,19 89)。腫瘍形成におけるＶＥＧＦの役割は、腫瘍壊死に伴う低酸素症がそのｍＲ ＮＡの発現を増加させるという観察から疑われてきた。一方、ＶＥＧＦは、腫瘍 の病状の多くの症例において過剰に発現されている。さらに、抗−ＶＥＧＦ抗体 の注射は、腫瘍の増殖を阻害する(Kim,1993)。 成長因子は、したがって、多くの異なる効果、例えば、増殖および生存を、そ れがその一つまたは他のレセプターに結合するかどうかにより、誘導することが できる。免疫中和(immunoneutralization)は、したがって、増殖を阻害すること により、有益な効果をもたらすが、生存を低下させることにより不利益な効果を ももたらし得る。ヘパリンに結合する成長因子、例えば、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ (線維芽細胞成長因子)のレセプターによってin vivoで仲介される機能の分析は 、２つの主要な障害にぶつかる。１つは、成長因子がいくつかのレセプターに結 合することができ、さらに、いくつかの成長因子が同じレセプターに結合するこ とができるため、リガンドとレセプターとの間の相互作用の組み合わせが非常に 複雑なことである。ＦＧＦをコードする９遺伝子の産物は、したがって、ＦＧＦ のレセプターをコードする５遺伝子の利用可能な産物を有する。一方、グリコサ ミノグリカンに対するそれらの高度な親和性は、ＶＥＧＦまたはＦＧＦのような 成長因子が細胞外マトリックスに腐骨を形成し(sequestrated)、それらの合成部 位 の直ぐ近く（０．５mm以内）にのみ見出されることを意味し、それはそれらのin vivoでの役割を理解することを難しくしている。 ２つの異なる遺伝子が、ＶＥＧＦレセプターとして同定された膜貫通チロシン キナーゼをコードしている：ヒトではＫＤＲ(Terman，1992)あるいはマウスでは flk-1(Millauer，1993)およびflt-l(DeVries，1992)。 flk-1レセプターのメッセンジャーＲＮＡが胚形成の間に内皮細胞に存在し、 成人では消失することが実証された(Millauer，1993)。flk-1が見出される唯一 の非内皮細胞は、臍帯の基質細胞(stromal cell)である(Quinn，1993)。他の著 者は、成人の肝臓の洞様毛細血管内皮細胞(Yamane，1994)、成人の糸球 (glomerules)(Millauer，1994)およびランゲルハンス島β(Oberg，1994)におけ るflk-1のｍＲＮＡの存在を実証した。 さらに、腫瘍細胞とドミナントネガティブflk-1レセプターにより感染した細 胞の同時接種は、腫瘍の増殖を阻害する(Millauer，1994)。 本発明の目的の１つは、ヘパリンに親和性を有し、新しいタイプの循環するア ゴニストをそれらの１つのまたは他のレセプター上で特異的に標的化し得る成長 因子の抗イディオタイプ抗体の用途を提案することである。 本発明の他の面の一つは、適切な特異性と長い半減期を有する成長因子レセプ ターのアゴニストを提供することである。 本発明の目的の１つは、それらの免役グロブリン構造ゆえに、循環しているＶ ＥＧＦのＫＤＲとの結合領域の内部イメージを提供することである。 本発明は、静止した内皮細胞には影響を与えずに、脈管形成を阻害するかある いは脈管形成を促進するかのいずれかの、脈管形成過程に関与する内皮細胞を含 む病状の処置のための医薬の調製のための、あるいは、脈管形成に関与する内皮 細胞を含む病状の診断のための製品の調製のための、抗−イディオタイプ血管内 皮細胞成長因子抗体に関する。 「脈管形成過程に関与する内皮細胞」という表現は、基底膜を通じて移動し、 増殖する内皮細胞を意味する。 細胞が脈管形成過程に関与するかどうかを決定するためには、インテグリンβ ３に対する抗体の助けを借りるイムノマーキングを用いることができる (Brooks et al.，Cell，1994，79:1157-1164)。 「静止した内皮細胞」という表現は、正常な成人の非脈管形成血管の内皮細胞 を意味する。 本発明は、抗−イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の、脈管形成内皮細 胞を含む病状のＫＤＲレセプターの選択的刺激による処置のための医薬の調製の ための使用に関する。 「脈管形成内皮細胞」という表現は、脈管形成過程に関与する細胞をいう。 本発明の抗イディオタイプ抗体は、ヒトＫＤＲレセプター（あるいはマウスfl k−1レセプター）を認識するが、flt−1レセプターは認識しない。 本発明の抗−イディオタイプ抗体の助けを借りると、ＫＤＲ（またはflk-1） が異常な脈管形成の標的であるという事実を実証することが可能であった。 有利な実施態様によると、本発明は、静止した内皮細胞には影響を与えずに、 脈管形成を阻害するため脈管形成過程に関与する内皮細胞を含む病状の処置のた めの医薬の調製のための抗−イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使用に 関し、この抗−イディオタイプ抗体は、トキシン（その機能はタンパク質の翻訳 をブロックする）と結合しする。 トキシンとしては、サポリン、リシン、または放射活性元素、例えば、ヨウ素 −-125または-131を挙げることができる。 別の有利な実施態様によると、本発明は、静止した内皮細胞には影響を与えず に、脈管形成を阻害するため脈管形成過程に関与する内皮細胞を含む病状の処置 のための医薬の調製のための抗−イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使 用に関し、この抗−イディオタイプ抗体は、そのＦａｂフラグメントの形態であ る。 処置のためには脈管形成の阻害が必要とされる病状としては、ガン、糖尿病性 網膜症、および角膜移植の拒絶を挙げることができる。 本発明は、静止した内皮細胞には影響を与えずに、脈管形成を促進するため脈 管形成過程に関与する内皮細胞を含む病状の処置のための医薬の調製のための抗 −ィディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使用に関する。 処置のためには脈管形成の刺激が必要とされる病状としては、動脈または静脈 血栓症の間に虚血性にされた領域の瘢痕形成と再潅流を挙げることができる。 本発明は、抗−イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の、瘢痕形成または 卵巣の黄体の成熟過程において血管形成のスピードを増加させるため生理学的脈 管形成を刺激するための、あるいは血管血栓症の間に虚血にされた領域を再潅流 するために血管の閉塞性の異常の過程で脈管形成を刺激するための医薬の調製の ための使用に関する。 本発明の抗−イディオタイプ抗体はまた、脈管形成過程に関与する内皮細胞を 含む病状の診断のための製品の調製のためにも用いられ得る。 健康な組織のＫＤＲ刺激に対する一般的な経路による反応の欠如の実証は、Ｋ ＤＲまたはflk-1を発現する領域のマッピングのための道を開いた。ヨウ素化し た抗−イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の注射は健康な器官に結合する ことなく腫瘍の視覚化を可能にした。 本発明は、抗−イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体に関し、それはヒト ＫＤＲレセプターの、またはネズミflk-1レセプターのリガンドであって、fltの リガンドではないことを特徴とする。 本発明は、抗−イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体に関し、それらは以 下の性質： −それらはＫＤＲに対して特異的である、 −それらは循環している、 −それらは、約２３日の、特に約２１日の、そしてさらに特定すると ２２．５日の半減期を有している、 −それらは、２００kDaのタンパク質のチロシンにリン酸化を誘導する 、 −それらは血管内皮細胞の増殖を誘導する、 −それらは内皮細胞の移動を誘導しない、 −それらは脈管形成を刺激する、 −それらは低血圧を引き起こさない、 −それらは血管透過性に影響を与えない、 を有することを特徴とする。 ＫＤＲに対する特異性は、放射性ヨウ素化したＶＥＧＦを用いる競合試験によ り、ＫＤＲ配列を有する真核生物発現ベクターでトランスフェクションしたＣＯ Ｓ細胞へのその結合に関して、決定され得る(Terman et al.，Biochem. Biophys．Res．Commun.，1992，187:1579-1596)。 本発明の抗−イディオタイプ抗体とは対照的に、ＶＥＧＦは、fltレセプター に結合し得るため、ＫＤＲに対して特異的ではない。 本発明の抗−イディオタイプ抗体の特異性の有利な点は、静止した細胞には影 響を与えない薬物による脈管形成内皮細胞の標的化にある。 「循環する」という表現は、循環する血液に自由に輸送され、血管壁にとらわ れないことを意味する。 本発明の抗−イディオタイプ抗体とは対照的に、ＶＥＧＦは、循環しない。本 発明の循環している抗−イディオタイプ抗体の有利な点は、静止した細胞には影 響を与えない薬物による脈管形成内皮細胞の標的化にある。 抗−イディオタイプ抗体の半減期に関しては、これは種毎に異なり、例えば、 ラットではそれは７日である。 本発明の抗体の半減期は、以下の試験により測定することができる：放射性ヨ ウ素化したリガンド１μCiの静脈内注射、次いで、種々の間隔の時間での血液の 採取および放射活性の測定。半減期は、最初の放射活性の５０％が循環する血液 から消失するのに必要な時間に相当する。 ＶＥＧＦの半減期は６分未満である(Beuters et al.，Circulation，1995);Ｉ ｇＧの半減期は２３日のオーダーである。 その上に抗−イディオタイプ抗体がチロシンのリン酸化を誘導する２００kDa のタンパク質はＫＤＲである。 この面は、抗−イディオタイプ抗体によるＫＤＲの活性化がＫＤＲのリン酸化 に必要な機能の引き金を引くことを意味する。 この面は、実施例に記載するリン酸化試験により測定することができる。 血管内皮細胞の増殖の誘導とは、それらが増殖することを意味する。 これは、実施例に記載する試験により測定することができる。 本発明の抗体は、ＶＥＧＦよりも、すなわち約２倍の率で、有効に血管内皮細 胞の増殖を誘導する。 本発明の抗−イディオタイプ抗体による内皮細胞の増殖の誘導のこの増加の利 点は、ＫＤＲレセプターに対する抗−イディオタイプ抗体の結合とそれに続くＫ ＤＲのチロシンでのリン酸化は、細胞増殖の引き金を引くのに十分であるという 事実にある。 内皮細胞の移動がないということは、ＶＥＧＦによって引き金を引かれる効果 の中で、抗−イディオタイプ抗体はＫＤＲによって仲介されるものを擬態し、fl t-1によって仲介されるものは擬態しないということを意味する。 この面は、実施例に記載する試験により測定される。 本発明の抗体とは対照的に、ＶＥＧＦは、内皮細胞の移動を誘導する。 本発明の抗体により提供される利点は、flt-1レセプターに対するそれらの効 果の欠如を、flt-1の機能を探る移動および透過性試験により実証することにあ る。 脈管形成の刺激とは、ＫＤＲレセプターに対する抗−イディオタイプ抗体の結 合とそれに続くＫＤＲのチロシンでのリン酸化および細胞増殖が、脈管形成の引 き金を引くのに十分であることを意味する。 これは、実施例に記載した試験により定量できる。 本発明の抗体が、脈管の透過性に影響を与えないという事実は、ＶＥＧＦによ って引き金が引かれる効果の中で、抗−イディオタイプ抗体はＫＤＲによって仲 介されるものを擬態し、flt-1によって仲介されるもの、例えば、血管透過性は 擬態しないということを意味する。 このことは以下の試験により決定され得る：ろ紙（１２mmの直径）を、２mg/m lのゼラチン(Millicell-Millipore)を補足したＰＢＳで前もって４℃で１６時間 インキュベーションし、それに角膜の内皮細胞を播種する(40,000細胞/cm²)。ウ ェルを２４ウェルの箱に整える(直径１６mm)。５日後、細胞内区画と細胞外区画 との間の電気抵抗を測定する（１８０Ωのオーダーで）。モジュレーターを付加 して抵抗を１０分毎に測定する。ＶＥＧＦの影響下で（５−５０ng/ml）、抵抗 は約９０分間の行程で１５０Ωまで低下した。抵抗の低下は、したがって、透過 性の増加を示す。この機能は、flt-1レセプターによって仲介されるものであり 、ＫＤＲレセプターによってではない。 本発明の抗体とは対照的に、ＶＥＧＦは、脈管の透過性に影響を与える。本発 明の有利な点は、したがって、抗−イディオタイプ抗体がin vivoでflt-1レセプ ターによって仲介される効果を刺激しないことを示すことにある。 本発明はまた、本発明による抗−イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントに も関する。 本発明はまた、本発明による抗−イディオタイプ抗体とトキシン、特に、サポ リンおよびリシンから選ばれるものとの間の、あるいは本発明の抗−イディオタ イプ抗体と放射性元素、例えば、ヨウ素−１２５または−１３１との間の複合体 にも関する。 本発明はまた、以下の方法： −精製したＶＥＧＦを動物、特にウサギに注射する、 −血液を抜き取って特定の抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを含む精製Ｉｇを、 例えば、プロテインＡに対するアフィニティークロマトグラフィーで回収し、次 いで、可能な段階で、その特定の抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを精製Ｉｇから、例えば 、ＶＥＧＦに対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製する、 −上記の精製Ｉｇまたは上記の精製抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを、ＶＥＧ Ｆの注射に用いたのと同じ種の動物に、特にＶＥＧＦの注射に用いたのと同じ起 源のウサギの膝窩神経節に注射する、 −血液を抜き取り、全Ｉｇを、例えば、プロテインＡにより回収し、 次いで、その全Ｉｇを２つの免疫吸着に付す： ・抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを産生し、抗一アロタイプもしくは アイソタイプ抗体を排除するために用いたウサギの予備免疫 Ｉｇを用いて調製したアフィニティーカラムでの免疫吸着、 ・抗イディオタイプを精製するために抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧ を用いて調製したアフィニティーカラムでの免疫吸着 によって得ることができる本発明の抗−イディオタイプ抗体にも関する。 本発明の抗イディオタイプのin vivoでの作用を証明するためには、プロテイ ンＡ−セファロースでの精製のみが必要である。 本発明はまた、本発明の抗イディオタイプ抗体の調製方法にも関し： −精製ＶＥＧＦを動物、特にウサギに注射する、 −血液を抜き取って特定の抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを含む精製Ｉｇを、 例えば、プロテインＡに対するアフィニティークロマトグラフィーで回収し、次 いで、可能な段階で、その特定の抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを精製Ｉｇから、例えば 、ＶＥＧＦに対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製する、 −上記の精製Ｉｇまたは上記の精製抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを、ＶＥＧ Ｆの注射に用いたのと同じ種の動物に、特にＶＥＧＦの注射に用いたのと同じ起 源のウサギの膝窩神経節に注射する、 −血液を抜き取り、全Ｉｇを、例えば、プロテインＡにより回収し、 次いで、その全Ｉｇを２つの免疫吸着に付す： ・抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを産生し、抗−アロタイプもしくは アイソタイプ抗体を排除するために用いたウサギの予備免疫 Ｉｇを用いて調製したアフィニティーカラムでの免疫吸着、 ・抗イディオタイプを精製するために抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧ を用いて調製したアフィニティーカラムでの免疫吸着 を特徴とする。 本発明の抗体のＦａｂフラグメントを調製するには、手順は次の通りであって よい：Ｆａｂフラグメントを、３．５mgのパパインおよび０．１MのＥＤＴＡ（ エチレンジアミン四酢酸）および０．１Mシステインを含む４２mlに溶解した２ ００mgのＩｇ２ Ｉｄから調製した。この混合物を、４時間３７℃でインキュベ ーションし、反応を、次いで、４．６mlの０．３Mヨードアセトアミドの添加に より停止する。この混合物を、次いで、２リットルのＰＢＳに対して４℃で１６ 時間透析し、次いで、１０mlのプロテインＡ−セファロースのカラムでクロマト グラフィーする。Ｆａｂフラグメントは限界容量(dead volume)で回収される。 本発明はまた、医薬組成物にも関し、それらは、活性物質として、少なくとも １つの本発明の抗イディオタイプ抗体、もしくは少なくとも１つの本発明のＦａ ｂフラグメント、もしくは少なくとも１つの本発明の複合体を含むことを特徴と する。 本発明はまた、抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントの超可変領域の配 列から誘導した医薬組成物にも関する。 本発明はまた、結晶学およびＸ線回折、円二色法および核磁気共鳴により決定 された抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントの三次元構造から誘導した医 薬組成物にも関する。 図面の説明 Figure１は、ヨウ素化ＶＥＧＦのそのレセプターへの結合の抗−イディオタイ プ抗体Ｊによる阻害を示す。抗体Ｊは、ＶＥＧＦのflt-1レセプターに対する結 合を置換しないと結論づけられる。 示されるＶＥＧＦまたは抗−Ｉｄ Ｊの濃度は、４８時間前に、flt-1配列 （FigureのパートＡ）もしくはflk-1配列(FigureのパートＢ）を含む１μg/mlの ベクターpSV7dでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞と、１ng/ml(Figureのパ ートＡ)または１０ng/ml（FigureのパートＢ）のヨウ素化ＶＥＧＦ存在下で４℃ でインキュベーションされる。３時間後、細胞をすすぎ、溶解し、放射活性をガ ンマカウンターで計測する。 Figure２Ａは、ＶＥＧＦのその高親和性のレセプターへの結合の、アンチセン スＫＤＲオリゴヌクレオチドによるＦＢＡＥ細胞のトランスフェクションによる 阻害を示す。 １２ウェルのプレートに播種した集蜜下のＦＢＡＥ細胞を、２μMのセンス （□）もしくはアンチセンス（◆）ＫＤＲオリゴヌクレオチドを用いてトランス フェクションする。２４時間後、細胞を、３時間４℃で、濃度の増加するヨウ素 化ＶＥＧＦの存在下で、最終容量５００μlで、インキュベーションする。Ｊはf lk-1を発現しない細胞には結合しないと結論づけられる。 Figure２Ｂは、ＶＥＧＦのＦＢＡＥ上のその高親和性のレセプターへの結合の 、抗イディオタイプＪ（抗−Ｉｄ Ｊ）とのプレインキュベーションによる阻害 を示す。 集蜜下のＦＢＡＥ細胞を１０cm²のウェルに播種し、インターナリゼーション のため、５μg/mlの抗−Ｉｄ Ｊまたは予備免疫ＩｇＧと、３７℃で９０分間イ ンキュベーションする。このプレートを、次いで、４℃に移し、種々の濃度のヨ ウ素化ＶＥＧＦとインキュベーションする。非特異的結合を、１μg/mlのヨウ素 化していない(cold)ＶＥＧＦ(挿入図)の存在下で測定する。データを、次いで、 スキャッチャードプロットで表す。Ｊは、flk-1に結合し、flk-1のみに結合する と結論づけられる。 Figure３は、抗イディオタイプＪによるＦＢＡＥ細胞におけるＫＤＲ/flk-1の チロシン残基へのリン酸化の誘導を示す。 ＦＢＡＥ細胞を１０分間３７℃で、予備免疫ＩｇＧ、ＶＥＧＦまたは抗−Ｉｄ Ｊにより刺激し、次に、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、溶解物を抗−ホスホチロシ ンモノクローナル抗体（ＰＹ２２）を用いて免役沈降させる。免役複合体をプロ テインＡ−セファロースビーズで回収し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付 し、ニトロセルロースフィルターに移し、そして抗−ホスホチロシンモノクロー ナル抗体ＰＹ２２または抗-flk-1ポリクローナル抗体のいずれかにより明らかに する。 Figure４は、ＦＢＡＥ細胞の増殖の抗イディオタイプＪによる刺激を示す。Ｊ は、flk-1レセプターを、ＶＥＧＦがするようにリン酸化すると結論づけられる 。 ＦＢＡＥ細胞を１２ウェルのプレートの１ウェル当たり５，０００細胞で、 ０．０１ng/ml〜１，０００ng/mlの範囲の種々の濃度のＶＥＧＦ、抗−Ｉｄ Ｊ または予備免役ＩｇＧの存在下で播種する。５日後、細胞をトリプシン処理し、 計数する。示したデータは３点の平均で、実験は４回行なって、同じ結果を得た 。ＪはＦＢＡＥ細胞の増殖を刺激すると結論づけられる。 Figure５は、Ｉｇ２ Ｉｄの注射の腫瘍容積に対する効果を示す。 グリーソン(Gleason)スコアＩＸ（３×３×３mm）に相当するホルモン−非依 存性前立腺癌の断片をnu/nu雌マウスに移植した。１ヶ月後、それらが臨床的に 触診できるようになったとき、その動物（各群ｎ＝８−１０）に、ＶＥＧＦ （Ｖ−ＩｇＧ）、またはＩｇ１ ＰＩ（ＰＩ−ＩｇＧ）、またはＩｇ２ Ｉｄ （Ｊ−ＩｇＧ）の活性を中和する２００μｇのＩｇ１ Ｔを１週間に２度与えた 。腫瘍の容積をノギスを用いて１週間に２度測定し、マウスの体重を量った。動 物を３ヶ月後に屠殺し、腫瘍を写真に取った。 Figure６は、Ｖ−ＩｇＧ、ＰＩ−ＩｇＧまたはＪ−ＩｇＧで処理した腺癌異種 移植片の組織学的分析（ａ−ｃ）、血管新生（ｄ−ｉ）および増殖（ｊ−ｌ）の マーキングを示す。 Figure５の凡例で示されたように処理された動物を、異種移植片のの移植の３ ヶ月後に屠殺し、ついで、これらの腫瘍から切片を作製し、ヘマトキシリン−エ オシン（ａ−ｃ）で染色した。隣接する切片をulexマーカー（ｄ−ｆ）（ペルオ キシダーゼに結合させたUlex Euopeaus,Sigma，ref.L8146）、抗-flt-1抗体 （SantaCruz）（g−i）またはmib-1（ｊ−ｌ）を用いて明らかにした。Ｊは血管 の数と癌細胞の増殖を刺激すると結論づけられる。 表１は、ＶＥＧＦおよび抗−Ｉｄ ＪがセンスもしくはアンチセンスＫＤＲオ リゴヌクレオチドでトランスフェクションされたＦＢＡＥ細胞に及ぼす生物学的 効果を示す。 集蜜下のＦＢＡＥ細胞を、上の説明に記載したように、センスもしくはアンチ センスＫＤＲオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションする。２４時間後 、細胞を無血清培地に移し、続いてそれらを５０pMのＶＥＧＦ、抗−Ｉｄ Ｊの 存在下で、またはどちらも無しでインキュベーションし、次いで、２０時間の刺 激後、トリチル化したチミジンで４時間標識した。平行して、移動実験も集密な 細胞に対して行なう。マルタ十字の形態の切傷を細胞の単層に作成した。ウェル を無血清培地で洗浄し、細胞を１０倍高いモジュレーター濃度でインキュベーシ ョ を８つのフィールドにわたって計数し、各ポイントを３重に測定した。これらの 実験は３回行なって同じような結果を得た。ＪはＶＥＧＦのいくつかの効果を擬 態する：それは増殖を刺激するが移動は刺激しないと結論づけられる。 実施例に用いる略語 ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）：リン酸緩衝液の生理食塩水溶液 Ｉｇ１ ＰＩ：ＶＥＧＦによる免役化の前に抜き取った血液からプロテインＡ −セファロースにより精製したウサギ免役グロブリン。 Ｉｇ１ Ｔ：ＶＥＧＦによる免役化の後に抜き取った血液からプロテインＡ− セファロースにより精製したウサギ免役グロブリン。 抗−ＶＥＧＦ Ｉｇ１：ＶＥＧＦ−セファロースにより精製したＩｇ１ Ｔ。 Ｉｇ２ Ｉｄ：Ｉｇ１ Ｔによる免役化の後に抜き取った血液からプロテインＡ −セファロースにより精製したウサギ免役グロブリン２。 Ｉｇ２ Ｊ（Ｊとも呼ぶ）：Ｉｇ１ ＰＩ−セファロース次いで抗−ＶＥＧＦ Ｉｇ１−セファロースにより精製したＩｇ２ Ｉｄ。 研究方法 １．抗イディオタイプＶＥＧＦ１６５抗体の産生 予備免役ＩｇＧ（Ｉｇ１ ＰＩ）の調製 各免役化の前に、血液を抜き取り、血清を回収直後に分画して、１５mlの血清 をプロテインＡのカラム（０．９×１８cm）でクロマトグラフィーにかける。こ のカラムをＰＢＳで洗浄し、免役グロブリンを０．２Mのグリシン（pH２．５で 緩衝）で溶出させ、１／５の容量の1MＫ₂ＨＰＯ₄の添加により直ちに中和し、そ れをＰＢＳに対して透析する。免役グロブリン（Ｉｇ１ ＰＩ）を−８０℃で使 用するまで保存する。 １．１．ネズミ抗イディオタイプ抗体の調製 集蜜まで培養し、５μg/mlのインスリンおよび１０μg/mlのトランスフェリン を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコの改変イーグル培地(Gibco，ref．13016 027) ） INSERM，Toulouse）で産生された５ng/mlの組換えＦＧＦ２により４８時間刺激 のネズミＶＥＧＦをポリアクリルアミドゲル電気泳動で非変性条件下で分離し、 ニトロセルロースリーフに移す。 ＶＥＧＦを含む画分を切り出し、１mlのジメチルスルホキシドで溶解した。１ ０μgのＶＥＧＦを０．２５mlのフロイント完全アジュバントで乳化し、「Fauve de Bourgogne」ウサギ(Iffa-Credo)に１５日間の間隔を空けて４回注射した。 最初の注射から３ヶ月〜７ヶ月の間に抜き取った血液を分画し、Ｉｇをプロテ インＡに対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製する；これらの精 製ＩｇをＩｇ１ Ｔと呼ぶ。 麻酔した「Fauve de Bourgogne」ウサギに、エバンスブルー(Evans blue)を含 有する０．５mlＰＢＳの注射を、足の肉鉦に、リンパ腺系を染色するために与え る。次いで、皮膚の切傷を作成し、皮膚のレベルを除き(freed)、そして青くな った神経節をこうして可視化する。 １００μlのＰＢＳ／フロイント完全アジュバントの１：１混合物で乳化した １０μgのＩｇ１ Ｔ（５μl）を各ウサギの膝窩神経節に３０分後に注射した。 アジュバントの注射は、炎症性の肉芽腫を生じ、それは神経節が感じられるの を可能にし、それにより経皮的注射を必要な皮膚レベルの切傷もなく続いて行な うことが可能である。３，６および９週間後、ウサギに１０μgのＩｇ１ Ｔの神 経節内注射を与える。 最初の注射から４〜７ヶ月後に抜き取った血液を上記のように精製する。抗− イディオタイプＩｇ（Ｉｇ２ Ｊ）を、次いで、以下の段落２および３に示すよ うに一連の２つのアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。 １．２．ヒト抗イディオタイプ抗体の調製 ＶＥＧＦ１６５を、ＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡ（Judith Abraham，Scios Nova ,Mountain View，CAにより提供）を含む発現プラスミド（prCEN-1、F.Bayard，U nit 397 INSERM）によって安定な方法でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞内 で産生させた。 細胞を、抗生物質と１０％ウシ新生児血清を含むＤＭＥＭ培地で集蜜まで培養 し、次いで、無血清ＤＭＥＭ培地で３回すすぎ、５μg/mlのインスリンと１０μ g/mlのトランスフェリンを含むＤＭＥＭ培地内で４８時間インキュベーションす る。 ２日後、この培地を回収し、遠心分離し（20,OOOg、３０分間）、次いで、予 め０．０５M ＮａＣｌを含む０．０１M Tris緩衝液、pH７．２で平衡化しておい たヘパリン−セファロースのクロマトグラフィーにかけた（０．９×６cm）。カ ラムを同じ緩衝液で洗浄した後、ＶＥＧＦをTris緩衝液中のＮａＣｌの濃度勾配 により溶出した。ＶＥＧＦの生物学的活性は、その分裂促進活性により測定する セプターアッセイにより、およびそのレセプターへの結合についてヨウ素化ＶＥ ＧＦとの競合を測定することにより定量する。 １０μｇのＶＥＧＦをニュージーランドウサギ（INRA，Toulouse）の膝窩神経 節に上記のように注射した。３〜７ヶ月後、Ｉｇ１ Ｔを、ＶＥＧＦがＡＣＥ細 胞（ウシの副腎皮質の毛細血管の内皮細胞）に及ぼす分裂促進効果を中和するそ れらの能力について試験する。 同系の(co-isogenic)ウサギに１０μｇのＩｇ１ Ｔを上記のプロトコールにし たがって与える。 ２．免役吸着物質の構築 ＶＥＧＦ−セファロース １gのセファロース−ＣＮＢr(Pharmacia)を、０．１Ｍ炭酸緩衝液、pH８．５ に対して予め透析した２mgのＶＥＧＦと接触させて一晩維持する。この後、マト リックスを１０mlの炭酸緩衝液で３回遠心分離（2,000g、５分間）することによ り洗浄する。依然として遊離しているアミン官能基を、次に５mlの０．２Mエタ ノールアミンとインキュベーションすることによりブロックする。このマトリッ クスを再度ＰＢＳで３回、０．２Mグリシン、pH２．５で１回、５分間、そして 次に１０mlのＫ₂ＨＰＯ₄で１回洗浄する。次いで、このマトリックスを、０．０ ２％アジ化ナトリウムを補充したＰＢＳ中で使用するまで保存する。 予備免役Ｉｇ１ 親和性マトリックスを上記のように調製し、１gのＣＮＢｒ−セファロースお よび５mgのＩｇ１ ＰＩを接触させる。 抗−ＶＥＧＦ Ｉｇ１ ５０mgのＩｇ１ Ｔをセファロース−ＶＥＧＦカラムでクロマトグラフィーに かけ、０．２Mグリシン、pH２．５で溶出させ、透析して−８０℃で使用するま で保存する。ＶＥＧＦ特異的ＩｇはＩｇ１ Ｔの８％を示す。 ３．抗イディオタイプＩｇの精製 プロテインＡ−セファロースで精製した抗イディオタイプＩｇ（Ｉｇ２ Ｉｄ ）を連続する２つのアフィニティークロマトグラフィー：Ｉｇ１ ＰＩ−セファ ロースのクロマトグラフィーおよび抗−ＶＥＧＦ Ｉｇ１−セファロースのクロ マトグラフィーにより精製する。 Ｉｇ１ ＰＩ−セファロース ５０mgのＩｇ２ Ｉｄを、Economo-packカラム（０．２×１cm）に調整された Ｉｇ１ ＰＩ−セファロースカラムに接種する。一旦Ｉｇ２を、Ｉｇ１ ＰＩのア イソタイプおよびアロタイプに対するいかなるＩｇ２ Ｉｄからも分離してしま ったので、Ｉｇ２はＩｇ１ ＰＩ−セファロースに結合し、保持されない画分は 、したがって、非免役の通常のＩｇ、およびＶＥＧＦを認識するＩｇ１領域に対 するＩｇ２ Ｊからなり、抗−ＶＥＧＦ Ｉｇ１−セファロースカラムに沈着する 。 この手順が測定可能な量の抗アイソタイプおよび抗アロタイプＩｇを分離する ことを可能にするということはこれまでわかっていなかった。 抗−ＶＥＧＦ Ｉｇ１−セファロース Ｉｇ１ ＰＩカラムに保持されず、したがって抗アイソタイプおよび抗アロタ イプ抗体を涸渇させた抗−ｉｄ １ｇを、Economo-packカラム（０．２×１cm） に調整されたＶＥＧＦ−Ｉｇ１−セファロースカラムに接種する。 このカラムを、続いて１０mlのＰＢＳで洗浄し、保持されたＩｇを次いで０． ２Mグリシン、pH２．５で溶出し、直ちに１／５容量の１M Ｋ₂ＨＰＯ₄で中和し 、次いでＰＢＳに対して透析する。 この手順により、全Ｉｇ２ Ｉｄの２−３％を示す抗イディオタイプ免役グロ ブリン（Ｉｇ２ Ｊ）を精製することが可能になる。 ４．抗体の特異性についての研究 抗イディオタイプ抗体のスクリーニングを、実験室で進行する以下の順序に従 って行なう。 １ウェル２cm²あたり30,000細胞で播種したＣＯＳ細胞を、１０％ウシ胎児血 清、１００IU/mlペニシリンおよび５０μg/mlストレプトマイシンを含むＤＭＥ Ｍ培地で培養する。２日後、この細胞を血清も抗生物質も含まない培地に移し、 flt-1またはflk-1のｃＤＮＡを含む２μg/mlのプラスミドｐ SV7d （L.Williams,UCSFより提供）および１０μg/mlリポフェクチンと共に３０分間 インキュベーションする。 ６時間後、この培地を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで４８時間置換える 。 放射性ヨウ素化ＶＥＧＦ（１−２×１０⁵cpm/ng）のトランスフェクションし たＣＯＳ細胞への結合を４℃で測定する。細胞を結合緩衝液（２０mM Hepesおよ び１mg/mlゼラチンを含むＤＭＥＭ、pHを７．４に調整）で２回洗浄する。所望 の濃度の放射性ヨウ素化ＶＥＧＦ（ＣＯＳ／flt-1細胞については１ng/ml ＣＯＳ／flk-1細胞については１０ng/ml）を種々の濃度の非標識ＶＥＧＦまたは Ｉｇ２ ＩｄまたはＩｇ２ Ｊと共に加えて最終容量０．５mlとする。非特異的結 合を過剰な（５００ng）精製ＶＥＧＦの存在下で測定する。全結合および非特異 的結合を二重に測定する。 ２時間後、細胞を冷緩衝液で３回洗浄し、０．５mlの０．２M ＮａＯＨで溶解 する。可溶化した物質に含まれているヨウ素−１２５をガンマカウンターで計測 する。 平行して、１０cm²のウェルあたり100,000細胞で播種したＦＢＡＥ細胞（ウシ 胎児大動脈内皮細胞）を、１０％ウシ胎児血清および１００IU/mlペニシリンお よび５０mg/mlストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養する。２日後、細 胞を、血清も抗生物質も含まない培地に移し、予め１０mg/mlのリポフェクチン と３０分間インキュベーションされている１０mg/mlのセンスもしくはアンチセ ンスＫＤＲオリゴヌクレオチドとインキュベーションする。 ６時間後、この培地を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで２４時間置換える 。トランスフェクションされていない集蜜下のＦＢＡＥ細胞を９０分間抗イディ オタイプＩｇＧまたはＩｇ１ ＰＩと共にインキュベーションする。この細胞を 続いて４℃に移し、次いで、３時間種々の濃度のヨウ素化ＶＥＧＦと１μg/ml ＶＥＧＦの存在下（非特異的結合）または非存在下（全結合）でインキュベーシ ョ ンする。次いで、データをMunsonプログラム（Munson,1980）を用いてスキャッ チャードプロットにより分析する。 ５．抗体の生物学的活性 レセプターのリン酸化 ＦＢＡＥ細胞を１０分間３７℃で１nMのＶＥＧＦまたはＩｇ２ Ｊで刺激し、 次いで、ＲＩＰＡ緩衝液（５０mM Tris，pH7.5、１％ Nonidet P40，Sigma，ref .N6507、１mM ＥＤＴＡ、それぞれ５μg/mlの以下のプロテアーゼインヒビター ：ベンズアミジン、ペプスタチン、ロイペプチンおよびアプロチニン）で溶解し 、溶解物を抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体（ＰＹ２２、Amersham）で免 役沈降させる。免役複合体をプロテインＡ−セファロースビーズで回収し、次に ポリアクリルアミド電気泳動により分離する。タンパク質をニトロセルロースフ ィルターに移し、抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体ＰＹ２２（Figure３） または市販の抗-flk-1ポリクローナル抗体(Santa-Cruz)(Figure３）のいずれか により明らかにする。 増殖 ４cm²のウェルあたり20,000細胞で播種したＦＢＡＥ細胞を、１０％ウシ胎児 血清および１００IU/mlペニシリンおよび５０μg/mlストレプトマイシンを含む ＤＭＥＭ培地で培養する。２日後、細胞を、血清も抗生物質も含まない培地に移 し、予め１０μg/mlのリポフェクチンと３０分間インキュベーションされている １０μg/mlのセンスもしくはアンチセンスＫＤＲオリゴヌクレオチドとインキュ ベーションする。 ６時間後、この培地を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで置換える。２４時 間後、細胞を無血清培地内でトランスフェクションし、５０pMのＶＥＧＦ、 Ｉｇ２ ＪまたはＰＢＳ単独の存在下でインキュベーションする。６８〜７２時 間の間に１マイクロキュリー（μＣｉ）のトリチル化チミジンを加える。細胞を 、４℃で、ＰＢＳで３回、１０％に希釈したトリクロロ酢酸で１回すすぎ、次い で、０．２M ＮａＯＨで溶解する。溶解物を次いで、シンチレーションカウンタ ーを用いて計測する。 同様の実験において、ＦＢＡＥ細胞を１２ウェルのプレートで１ウェルあたり ５，０００細胞で、０．０１ng/ml〜１，０００ng/mlの範囲の種々の濃度のＶＥ ＧＦ、Ｉｇ２ ＪまたはＩｇ１ ＰＩの存在下で播種する。５日後、細胞をトリプ シン処理して計数する。示したデータは、３点の平均値であり、実験は４回行な って同様の結果を得た。 移動 ＡＣＥ細胞を４cm²のウェルあたり１００，０００細胞で播種する。この細胞 を、マルタ十字を示している領域にわたる単層で、度盛りされている円錐体の助 けを借りて、増殖させる。この細胞をすすぎ、増殖実験に用いたのよりも１０倍 高いモジュレーター濃度（ＶＥＧＦ、Ｉｇ２ Ｊ、ＰＢＳ）でインキュベーショ ン 細胞を８つのフィールドにわたって計数し、各ポイントを３重に測定した。これ らの実験は３回行なって同じような結果を得た。 透過性に及ぼす生物学的効果 角膜の内皮細胞（１０⁵/cm²）を、予めＰＢＳに溶解した１mg/mlのコラーゲン タイプ１とインキュベーションしておいたフィルター(直径０．４５m、Transwel l^*,Costar)に沈着させる。次いで、このフィルターを、０．５mlのＤＭＥＭ培地 および１５％ウシ胎児血清が上のチャンバーと下のチャンバーに入ったマルチウ ェル培養皿(Nunc)のウェルに置く。３日後に細胞は集蜜となり、この細胞をすす いで無血清培地内でインキュベーションする。単層の細胞の抵抗を測定する （Millicel^*装置、Millipore）。３つの一連の同じウェル(１条件あたり３ウェ ル)で、２０ng/ml ＶＥＧＦまたは胎盤成長因子（flt-1レセプターのみに結合す る）または２００ng免役精製Ｉｇ２ Ｊ抗体を上のチャンバー内でインキュベー ションし、抵抗を１０分毎に測定する。抵抗は１５分から減少し、３０分で最小 になり、そしてＶＥＧＦまたは胎盤成長因子で処理したウェルのみで９０分後に はその基底レベルまで上昇するが、Ｉｇ２ Ｊで処理したものは上昇しない。 これらの結果は、抵抗が低下するにつれ、flt-1レセプターの活性化の派生的 な機作により透過性は上昇することを示す。Ｉｇ２ Ｊはflt-1には結合しないの で、それは透過性には効果的に影響を及ぼさない。 低血圧 静脈内に注射されたＶＥＧＦは、低血圧の引き金を引くが、抗イディオタイプ ＶＥＧＦ抗体はそうではない（血管新生表現型を獲得した内皮細胞に対してのみ 働く）。 網膜血管新生 ２μlのビヒクル（５０mgのウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）、またはビヒ クルと２００ngのＶＥＧＦもしくは６００ngのＩｇ２ Ｊに浸漬したレンズ核を 、ニュージーランドウサギの角膜縁(limbus)から２mmのところで角膜間質に挿入 する。１２日後、移植物について新生血管形成のあった表面を０−４のスケール で定量する(Favard,1992)。 腫瘍血管新生 前立腺癌（グリーソン分類ＩＸ）を免役抑制したマウス(Iffa-Cred)内で連続 的に増殖させた。１ヶ月後、このマウスに２００μｇのＩｇ１ ＴまたはＩｇ１ ＰＩまたはＩｇ２ Ｉｄ（全てのＩｇはプロテインＡ−セファロースに対する親 和性により精製した）の腹腔内注射を一週間に２回行なった。腫瘍を１週間に２ 回測定した。マウスを２ヶ月後に屠殺した。腫瘍切片をＭｉｂ−１抗体(Immunot ech)（有糸分裂期にある細胞のみを標識する）、ペルオキシダーゼ(Sigma)と結 合させたulexレクチン(European)（内皮細胞のみを標識する）および抗-flt-1抗 体と共にインキュベーションした。 結果 予備免役した血清（ｎ＝１８）はどれも、flt-1またはflk-1レセプターの発現 ベクターによってトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上のヨウ素化ＶＥＧＦの 結合を妨害するＩｇＧを含んでいなかった。対照的に、２０％の抗イディオタイ プ血清がflk-1に結合するＩｇＧを含んでいる。免役化後４〜７ヶ月の間に回収 した血清から精製したＩｇ２ Ｉｄの調製物を選択したが（Ｉｇ２ Ｊ）、それは 、ヨウ素化ＶＥＧＦの、flk-1でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞への結合 を完全に阻害するが（５０％阻害の引き金を引く濃度は約４００ngである）、fl t-1によってトランスフェクションした細胞へのその結合は妨げない(Figurel)。 ＫＤＲの翻訳開始コドンの中心にある１５メンバーのアンチセンスオリゴヌク レオチドによるＦＢＡＥ細胞のトランスフェクションは、ヨウ素化ＶＥＧＦの結 合部位の２０−２５％を阻害する。スキャッチャードプロットによる結果の分析 は、結合のこの低下は、最も高い親和性５pMを有する結合部位に専ら影響を及ぼ すことを示した(Figure２Ａ)。この部位への結合はまた、ＦＢＡＥ細胞をＩｇ２ Ｊとプレインキュベーションすることによっても阻害される(Figure２Ｂ)。 Ｉｇ２ ＪおよびＶＥＧＦは、２００kDaのタンパク質のチロシンにリン酸化を 誘導する。この分子種のflk-1に対する抗体による曝露は、flk-1レセプターがＩ ｇ２ Ｊにより容易にリン酸化されることを確証する(Figure３)。 Ｉｇ２ ＪおよびＶＥＧＦは、ＡＣＥ細胞の増殖を（最大増殖の半分は、１． ２ngのＩｇ２ Ｊおよび０．５ngのＶＥＧＦで得られる）、ＶＥＧＦの存在下で 得られるのよりも著しく高いレベルで誘導し、それは刺激を受けていないウェル で計数される細胞の数の１．８倍（ＶＥＧＦ）および３．１倍（Ｉｇ２ Ｊ）に 相当する（Figure４）。 対照的に、Ｉｇ２ Ｊは、内皮細胞の移動を誘導しない（表１）。 これらのＩｇが血管新生を調整するかどうかを調べるため、２００ngの ＶＥＧＦまたは６００ngのＩｇ２ ＪまたはＰＢＳ単独を含有する移植物をウサ ギの角膜間質に移植した。１２日後、ＰＢＳのみを含む移植物では新生血管形成 は観察されなかった。対照的に、同等の強度の新生血管形成が５pmolのＶＥＧＦ またはＩｇ２ Ｊを含む移植物では観察された（それぞれ２．７８および２．４ ５）。網膜の組織学的分析は、増殖的反応を示さなかったが、ＶＥＧＦは、少な くともin vitroで内皮細胞、周皮細胞および色素上皮細胞によって合成される。 実施例 １： 前立腺腫瘍 ＶＥＧＦは最近になって腫瘍血管新生の主な原因と認められたので、前立腺癌 の断片を１ヶ月前に移植しておいたマウスにＩｇ２ Ｉｄを注射した。Ｉｇ２ Ｊ での処理の１ケ月後、腫瘍の容積はＩｇ１ ＰＩで処理した腫瘍のそれより著し く大きかった（Figure５）。 腫瘍切片の免役組織化学的分析は、これらの抗体がin vivoで免役組織化学に よりｍｉｂ−１抗体を用いて測定される細胞増殖を誘導することを示した。対照 的に、健康な器官（肝臓、腎臓、肺、網膜、脳）には陽性細胞はないが、網膜移 植試験により測定される血管新生を刺激する。これらの性質は、それを、血管新 生表現型を獲得した内皮細胞の特異的マーカーにする。 ＶＥＧＦは血管新生と透過性を誘導する。Ｊは血管新生は誘導するが透過性は 誘導しない。 このことは、虚血の処置において主な利点を示す。したがって、ヒトにおいて 、ＶＥＧＦは、血管新生、および虚血にされた領域の再潅流により虚血に対して 有利な効果を誘導するが（Isner J.M.,Pieczek A.,Schainfeld R.,Blair R.,Hal ey L.,Asahra T.,Rosenfield K.,RazviS.,WalsjK.,Symes J.F.Clinical evidenc e of angiogenesis after arterial gene transfer of VEGF 165 in patients wit h ischaemic limb．Lancet，1996，348:370-374）、合併症もまた処置される四 肢の重篤な浮腫の形態で生じ（ＶＥＧＦの透過性に及ぼす影響のため）、それは 、Ｉｇ２ Ｊによる処置の間にはならないはずである。 実施例 ２： 乳癌： マウスの卵巣を摘出し、３週間だけ活性なエストロゲン移植物をそれらに移植 する。ヒトの乳癌の癌性細胞（ＭＣＦ７）は癌の引き金を引くが、それはエスト ロゲンがもはや活性でなくなる３週間後には増殖を停止する。抗イディオタイプ ＶＥＧＦ抗体（flk-1レセプターアゴニスト）を注射すると、腫瘍は増殖し続け るが、抗イディオタイプＶＥＧＦ抗体は新生血管形成を刺激する。 コメント： 化学療法における血管新生成長因子の抗イディオタイプの使用： 従来の抗癌化学療法は、細胞増殖を抑えることを目的とし、したがって、高い 増殖能を有するかなりの数の細胞、特に癌性細胞を減少させるが、消化壁のそれ らのような正常な細胞もまた減少させる。さらに、腫瘍はそれが血管新生する場 合にのみ進行し得る。別の処置は、腫瘍の新生血管形成をトキシンまたは抗有糸 分裂物質をこれらの新生血管に向かわせることにより低下させることからなるが 、それは正常な血管には存在せず、本発明の目的である標的が選択される場合に 限る。 いかなる腫瘍も、それが予め存在している血管に、内皮細胞の新生血管への移 動、増殖および分化を誘導する血管新生成長因子を合成し浸出する場合にのみ進 行し得る。血管新生因子のうち、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）は、現在、 腫瘍の進行、糖尿病性網膜症またはリウマチ性多発性関節炎において観察される 制御されない新生血管形成の主な原因と認められている。しかし、成長因子は、 それがその１つまたはその他のレセプターに結合するかどうかにより、多くの異 なる効果、例えば、増殖または生存を誘導することができる。免役中和は、した がって、新生血管形成の阻害に有益な効果を及ぼし得るが、健康な内皮細胞の生 存の低下にも好ましくない効果を及ぼし得る。さらに、ＶＥＧＦの半減期は３分 である。それは循環しないので、全身の注射の後でも標的に到達し得ない。 ＶＥＧＦレセプターのアゴニストの構築は、したがって、特異性と生物学的利 用可能性という２つの要件を満足しなければならない。このため、イディオタイ プ反応を利用して、循環しているＫＤＲ上のＶＥＧＦの結合領域の内部イメージ を、それらの免役グロブリン構造ゆえに、得た。 得られた結果： 本発明は、全身に用いることのできる成長因子のレセプターの特異的アゴニス トの産生のためのプロトコールを提案する。ＶＥＧＦのＫＤＲレセプターの特異 的アゴニストは、この方法で得られた。 ＫＤＲレセプターアゴニストは： −前立腺癌および乳癌の新生血管形成を誘導し、 −健康な内皮細胞の望ましくない増殖を誘導せず、 −ＶＥＧＦとは対照的に、毛細血管透過性を誘導せず、 −ＶＥＧＦとは対照的に、低血圧を誘導しない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ (72)発明者 オルテガ，ナタリー フランス国、エフ―31400 トゥルーズ、 リュ・エル・ヴィール、10 アパルトマン ３ (72)発明者 リュシュ，マリ―マグダレーヌ フランス国、エフ―37100 トゥール、リ ュ・クロワ―パスキエ、50

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．静止した内皮細胞には影響を与えずに、脈管形成を阻害するかあるいは脈管 形成を促進する、脈管形成過程に関与する内皮細胞を含む病状の処置のための医 薬の調製のための、あるいは、脈管形成に関与する内皮細胞を含む病状の診断の ための製品の調製のための、抗イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使用 。 ２．ＫＤＲレセプターの選択的刺激により脈管形成内皮細胞を含む病状の処置の ための医薬の調製のための抗イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使用。 ３．静止した内皮細胞には影響を与えずに、脈管形成を阻害する、脈管形成過程 に関与する内皮細胞を含む病状の処置のための医薬の調製のための、請求項１ま たは２記載の抗イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使用であって、その 抗イディオタイプ抗体が、その機能がタンパク質の翻訳をブロックすることであ るトキシンに結合するか、あるいはその抗イディオタイプ抗体がＦａｂフラグメ ントの形態である、使用。 ４．静止した内皮細胞には影響を与えずに、脈管形成を促進する、脈管形成過程 に関与する内皮細胞を含む病状の処置のための医薬の調製のための、請求項１ま たは２記載の抗イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使用。 ５．抗体が、サポリンおよびリシンまたは放射活性元素、例えば、ヨウ素−１２ ５または−１３１から選択されるトキシンに結合している、請求項３記載の抗イ ディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使用。 ６．瘢痕形成または卵巣の黄体の成熟過程において血管形成のスピードを増加さ せる、生理学的脈管形成を刺激するための、あるいは血管血栓症の間に虚血にさ れた領域を再潅流するために血管の閉塞性の異常の過程で脈管形成を刺激するた めの医薬の調製のための抗−イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使用。 ７．トキシンと結合した抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体のＦ ａｂフラグメントの、脈管形成の阻害を必要とする病状、例えば、癌、糖尿病性 網膜症および角膜移植の拒絶、の処置のための医薬の調製のための使用。 ８．脈管形成過程に関与する内皮細胞を含む病状の診断のための製品の調製のた めの、請求項１記載の抗イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体の使用。 ９．ヒトＫＤＲレセプターの、あるいはネズミflk-1レセプターのリガンドであ り、かつfltのリガンドではないことを特徴とする、抗イディオタイプ血管内皮 細胞成長因子抗体。 １０．以下の性質： −ＫＤＲに対して特異的である、 −循環している、 −約２３日の、特に約２１日の、そしてさらに特定すると２２．５日 の半減期を有する、 −２００kDaのタンパク質のチロシンにリン酸化を誘導する、 −血管内皮細胞の増殖を誘導する、 −内皮細胞の移動を誘導しない、 −脈管形成を刺激する、 −低血圧を引き起こさない、 −血管透過性に影響を与えない、 を有することを特徴とする、抗イディオタイプ血管内皮細胞成長因子抗体。 １１．請求項９記載の抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメント。 １２．請求項９記載の抗イディオタイプ抗体と、特にサポリンおよびリシンから 選ばれるトキシンとの間の複合体、または請求項９記載の抗イディオタイプ抗体 とヨウ素−１２５または−１３１のような放射活性元素との間の複合体。 １３．以下の方法： −精製したＶＥＧＦを動物、特にウサギに注射する、 −血液を抜き取って特定の抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを含む精製Ｉｇを、 例えば、プロテインＡに対するアフィニティークロマトグラフィーで回収し、次 いで、可能な段階で、その特定の抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを精製Ｉｇから、例えば 、ＶＥＧＦに対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製する、 −上記の精製Ｉｇまたは上記の精製抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを、ＶＥＧ Ｆの注射に用いたのと同じ種の動物に、特にＶＥＧＦの注射に用いたのと同じ起 源のウサギの膝窩神経節に注射する、 −血液を抜き取り、全Ｉｇを、例えば、プロテインＡにより回収し、 次いで、その全Ｉｇを２つの免疫吸着に付す： ・抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを産生し、抗−アロタイプもしくは アイソタイプ抗体を排除するために用いたウサギの予備免疫 Ｉｇを用いて調製したアフィニティーカラムでの免疫吸着、 ・抗イディオタイプを精製するために抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧ を用いて調製したアフィニティーカラムでの免疫吸着 によって得られ得る請求項９記載の抗−イディオタイプ抗体。 １４． −精製ＶＥＧＦを動物、特にウサギに注射する、 −血液を抜き取って特定の抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを含む精製Ｉｇを、 例えば、プロテインＡに対するアフィニティークロマトグラフィーで回収し、次 いで、可能な段階で、その特定の抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを精製Ｉｇから、例えば 、ＶＥＧＦに対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製する、 −上記の精製Ｉｇまたは上記の精製抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを、ＶＥＧ Ｆの注射に用いたのと同じ種の動物に、特にＶＥＧＦの注射に用いたのと同じ起 源のウサギの膝窩神経節に注射する、 −血液を抜き取り、全Ｉｇを、例えば、プロテインＡにより回収し、 次いで、その全Ｉｇを２つの免疫吸着に付す： ・抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧを産生し、抗−アロタイプもしくは アイソタイプ抗体を排除するために用いたウサギの予備免疫 Ｉｇを用いて調製したアフィニティーカラムでの免疫吸着、 ・抗イディオタイプを精製するために抗−ＶＥＧＦ ＩｇＧ を用いて調製したアフィニティーカラムでの免疫吸着 を特徴とする、請求項９記載の抗イディオタイプ抗体の調製方法。 １５．活性物質として、請求項９または１０記載の抗イディオタイプ抗体、また は請求項１１記載のＦａｂフラグメント、または請求項１２記載の複合体を含む ことを特徴とする、医薬組成物。