ES2309119T3 - Utilizacion de antagonistas del factor de crecimiento celular vegf. - Google Patents
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Abstract
Uso de un antagonista hVEGF en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno no neoplásico caracterizado por exceso de neovascularización no deseable, en el que el antagonista de hVEGF es: (a) un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo; (b) un anticuerpo receptor anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo; o (c) un receptor hVEGF aislado.
Description
Utilización de antagonistas del factor de
crecimiento celular VEGF.
Uso de antagonistas del factor de crecimiento
endotelial vascular.
La presente invención se refiere a antagonistas
del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), a
composiciones terapéuticas que comprenden los antagonistas y a
procedimientos de uso de los antagonistas para propósitos
diagnósticos y terapéuticos.
Los dos principales componentes celulares del
sistema vascular son las células endoteliales y de la musculatura
lisa. Las células endoteliales forman el revestimiento de la
superficie interna de todos los vasos sanguíneos y constituyen una
interfaz no trombogénica entre la sangre y el tejido. Además, las
células endoteliales son un componente importante del desarrollo de
nuevos capilares y vasos sanguíneos. De este modo, las células
endoteliales proliferan durante la angiogénesis, o
neovascularización, asociada con formación de tumores y metástasis,
y con una variedad de enfermedades o trastornos no neoplásicos.
Varios polipéptidos de aparición natural inducen
según se informa la proliferación de células endoteliales. Entre
aquellos polipéptidos se incluyen los factores de crecimiento de
fibroblastos (FGF) ácidos y básicos, Burgess and Maciag, Annual
Rev. Biochem., 58: 575 (1989), el factor de crecimiento endotelial
derivado de plaquetas (PD-ECGF), Ishikawa y otros,
Nature, 338: 557 (1989) y el factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF), Leung y otros, Science 246: 1.306 (1989); Ferrara
y Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851 (1989); Tischer y
otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1.198 (1989); Ferrara y
otros, publicación de patente PCT n.º WO 90/13649 (publicada el 15
de noviembre, 1990); Ferrara y otros, solicitud de patente US
07/360.229.
El VEGF se identificó por primera vez en medios
condicionados con células foliculares o foliculoestrelladas de
hipófisis bovina. Los análisis bioquímicos indican que el VEGF
bovino es una proteína dimérica con una masa molecular aparente de
aproximadamente 45.000 dalton y con aparente especificidad mitógena
por las células endoteliales. El ADN que codifica el VEGF bovino se
aisló mediante cribado de una genoteca de ADNc preparada a partir
de tales células, utilizando nucleótidos basados en la secuencia de
aminoácidos aminoterminales de la proteína como sondas de
hibridación.
El VEGF humano se obtuvo mediante un primer
cribado de una genoteca de ADNc preparada a partir de células
humanas, utilizando ADNc de VEGF bovino como sonda de hibridación.
Un ADNc identificado de este modo codifica una proteína de 165
aminoácidos que tiene una homología superior al 95% con el VEGF
bovino, a la cual proteína se hace referencia como VEGF humano
(hVEGF). La actividad mitógena del VEGF humano se confirmó
expresando el ADNc del VEGF humano en células huésped de mamíferos.
Los medios condicionados por células transfectadas con el ADNc del
VEGF humano favorecieron la proliferación de células endoteliales
capilares, mientras que las células de control no. Leung y otros,
Science 246: 1.306 (1989).
Se identificaron varios ADNc adicionales en
genotecas de ADNc humano que codifican isoformas de 121, 189 y 206
aminoácidos del hVEGF (a las que en conjunto también se hace
referencia como proteínas afines a hVEGF). La proteína de 121
aminoácidos difiere del hVEGF en virtud de la deleción de los 44
aminoácidos entre los restos 116 y 159 en hVEGF. La proteína de 189
aminoácidos difiere de hVEGF en virtud de la inserción de 24
aminoácidos en el residuo 116 en hVEGF, y al parecer es idéntica al
factor de permeabilidad vascular humano (hVPF). La proteína de 206
aminoácidos difiere del hVEGF en virtud de una inserción de 41
aminoácidos en el resto 116 en hVEGF. Houck y otros, Mol. Endocrin.
5: 1.806 (1991); Ferrara y otros, J. Cell. Biochem. 47: 211 (1991);
Ferrara y otros, Endocrine Reviews 13: 18 (1992); Keck y otros,
Science 246: 1.309 (1989); Connolly y otros, J. Biol. Chem. 264:
20.017 (1989); Keck y otros, EPO Pat. Pub. n.º 0 370 989 (publicada
el 30 de mayo, 1990).
El VEGF no sólo estimula la proliferación de
células endoteliales, sino que también induce la permeabilidad
vascular y la angiogénesis. La angiogénesis, que implica la
formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de endotelio
preexistente, es un componente importante de una variedad de
enfermedades y trastornos entre los cuales la formación de tumores
y la metástasis, la artritis reumatoide, la soriasis, la
aterosclerosis, la retinopatía diabética, la fibroplasia
retrolental, el glaucoma neovascular, los hemangiomas, el rechazo
inmunitario del trasplante de un tejido de córnea y de otros tejidos
y la inflamación crónica.
En el caso de formación de un tumor, la
angiogénesis es al parecer fundamental para la transición de la
hiperplasia a la neoplasia, y para proporcionar alimento al tumor
sólido en crecimiento. Folkman y otros, Nature 339: 58 (1989). La
angiogénesis también permite a los tumores estar en contacto con el
lecho vascular del huésped, que puede proporcionar una vía para la
metástasis de las células tumorales. Los indicios sobre la función
de la angiogénesis en la metástasis tumoral proceden, por ejemplo,
de estudios que muestran una correlación entre el número y la
densidad de microvasos en secciones histológicas de carcinoma de
mama humano invasivo y la presencia actual de metástasis distantes.
Weidner y otros, New Engl. J. Med. 324: 1 (1991).
Dada la función del crecimiento endotelial
vascular y la angiogénesis, y la función de aquellos procesos en
muchas enfermedades y trastornos, es deseable contar con un medio
para reducir o inhibir uno o más efectos biológicos del VEGF.
También es deseable contar con un medio para analizar la presencia
del VEGF en condiciones normales y patológicas, y en especial en el
cáncer.
La presente invención tal como se define en la
reivindicaciones proporciona el uso de antagonistas del VEGF, entre
los cuales: (a) anticuerpos y variantes de los mismos que pueden
unirse específicamente al hVEGF o al receptor hVEGF y (b) receptor
hVEGF y variantes del mismo en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento de enfermedades o trastornos no neoplásicos
caracterizados por un exceso de neovascularización no deseable,
entre los cuales a modo de ejemplo artritis reumatoide, soriasis,
aterosclerosis, retinopatía diabética y otras, fibroplasia
retrolental, glaucoma neovascular, hemangiomas, hiperplasias
tiroideas (incluida la enfermedad de Grave), trasplante de córnea y
de otros tejidos, e inflamación crónica.
El antagonista del VEGF pueden ser anticuerpos
monoclonales poliespecíficos que pueden unirse a: (a) un epítopo no
hVEGF, por ejemplo, un epítopo de una proteína implicada en la
trombogénesis o la trombólisis, o un antígeno de superficie de una
célula tumoral y a (b) hVEGF o a un receptor hVEGF.
Los antagonistas del VEGF pueden conjugarse con
una parte citotóxica.
El antagonista del VEGF puede administrarse,
simultánea o secuencialmente, junto con uno o más antagonistas del
VEGF o con sustancias antiangiogénicas.
La figura 1 muestra el efecto de anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2) o de un
anticuerpo irrelevante del factor de crecimiento antihepatocítico
(anti-HGF) en la unión de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF a hVEGF.
La figura 2 muestra el efecto de anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2) o de un
anticuerpo irrelevante anti-HGF en la actividad
biológica de hVEGF en cultivos de células endoteliales de capilares
de corteza suprarrenal (ACE) bovina.
La figura 3 muestra el efecto de anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2 o A2.6.1) en
la unión de hVEGF a células ACE bovinas.
La figura 4 muestra el efecto de un tratamiento
con anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 en el
índice de formación de tumores NEG55 en ratones.
La figura 5 muestra el efecto de un tratamiento
con anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 en el
tamaño de tumores NEG55 en ratones tras cinco semanas de
tratamiento.
La figura 6 muestra el efecto de un tratamiento
con anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF
Ab) en la formación de tumores
SK-LMS-1 en ratones.
La figura 7 muestra el efecto de varias dosis de
un tratamiento con anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab) en la formación de
tumores A673 en ratones.
La figura 8 muestra el efecto de un tratamiento
con anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 en la
formación y supervivencia de células de glioblastoma NEG55 (G55) en
cultivo.
La figura 9 muestra el efecto de un anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la formación y
supervivencia de células de rabdomiosarcoma A673 en cultivo.
La figura 10 muestra el efecto de un anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la quimiotaxis
sinovial inducida por líquido sinovial de células endoteliales
humanas.
El término "hVEGF" se utiliza en la
presente invención para referirse al factor de crecimiento celular
endotelial humano de 165 aminoácidos, y a los factores de
crecimiento celular endotelial vascular de 121, 189 y 206
aminoácidos, tal como describieron Leung y otros, Science 246: 1.306
(1989) y Houck y otros, Mol. Endocrin. 5: 1.806 (1991) junto con
las formas alélicas de aparición natural y procesadas de aquellos
factores de crecimiento.
La presente invención proporciona antagonistas
del hVEGF que pueden inhibir una o más de las actividades
biológicas del hVEGF, por ejemplo, su actividad mitógena o
angiogénica. Los antagonistas del VEGF actúan interfiriendo en la
unión del hVEGF a un receptor celular. Dentro del alcance de la
invención se incluyen anticuerpos, y preferiblemente anticuerpos
monoclonales, o fragmentos de los mismos que se unen al hVEGF o al
receptor hVEGF. También incluidos dentro del alcance de la
invención destacan el receptor hVEGF y fragmentos y variantes de
secuencias de aminoácidos de los mismos que pueden unirse al
hVEGF.
La expresión "receptor hVEGF" o
"hVEGFr" tal como se utiliza en la presente invención se
refiere a celular para hVEGF, normalmente un receptor de superficie
celular observado en células endoteliales vasculares, así como a
variantes del mismo que conservan la capacidad de unirse a hVEGF.
Habitualmente, los receptores hVEGF y las variantes de los mismos
que son antagonistas del hVEGF aparecerán de forma aislada, más que
integradas en una membrana celular o fijadas en una superficie
celular tal como puede ser el caso en la naturaleza. Un ejemplo de
receptor hVEGF es la tirosinquinasa de tipo fms (flt),
un receptor transmembrana en la familia de las tirosinquinasas.
DeVries y otros, Science 255: 989 (1992); Shibuya y otros, Oncogene
5: 519 (1990). El receptor flt comprende un dominio extracelular,
un dominio transmembrana y un dominio intracelular con actividad
tirosinquinasa. El dominio extracelular está implicado en la unión
de hVEGF mientras que el dominio intracelular está implicado en la
transducción de
señal.
señal.
Otro ejemplo de receptor hVEGF es el receptor
flk-1 (al que también se hace referencia como
KDR). Matthews y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 9.026 (1991);
Terman y otros, Oncogene 6: 1.677 (1991); Terman y otros, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 187: 1579 (1992).
La unión de hVEGF al receptor flt produce
la formación de por lo menos dos complejos de peso molecular
elevado, que tienen un peso molecular de al parecer 205.000 y
300.000 dalton. Se cree que el complejo de 300.000 dalton es un
dímero que comprende dos moléculas receptoras unidas a una sola
molécula del hVEGF.
Dentro del alcance de la presente invención
también se incluyen variantes del hVEGFr. Entre los ejemplos
representativos se incluyen formas truncadas de un receptor en el
cual los dominios transmembrana y citoplasmático son eliminados del
receptor, y proteínas de fusión en las que los polímeros o
polipéptidos no hVEFGr están conjugados con el hVEGFr o,
preferiblemente, con formas truncadas del mismo. Un ejemplo de tal
polipéptido no hVEGF es una inmunoglobulina. En tal caso, por
ejemplo, el dominio extracelular del hVEGFr es sustituido por el
dominio Fv de una cadena ligera o (preferiblemente) una cadena
pesada de inmunoglobulina, con el extremo terminal C del dominio
extracelular del receptor unido covalentemente al extremo
aminoterminal del CH1, la bisagra, el CH2 u otro fragmento de la
cadena pesada. Dichas variantes se elaboran del mismo modo que las
conocidas inmunoadhesonas Véase, por ejemplo, Gascoigne y
otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 2.936 (1987); Capon y otros,
Nature 337: 525 (1989); Aruffo y otros, Cell 61: 1.303 (1990);
Ashkenazi y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 10.535 (1991); Bennett
y otros, J. Biol. Chem. 266: 23.060 (1991). En otras realizaciones,
el hVEGFr se conjuga con un polímero no proteínico tal como
polietilenglicol (PEG) (véase por ejemplo, Davis y otros,
patente de EE.UU. US 4.179.337; Goodson y otros, BioTechnology 8:
343-346 (1990); Abuchowski y otros, J. Biol. Chem.
252: 3.578 (1977); Abuchowski y otros, J. Biol. Chem. 252: 3.582
(1977)) o carbohidratos (véase por ejemplo, Marshall y otros, Arch
Biochem. Biophys., 167: 77 (1975)). Esto sirve para ampliar la
semivida biológica del hVEGFr y reduce la posibilidad de que el
receptor sea inmunógeno en el mamífero al cual se administre. El
hVEGFr se utiliza sustancialmente del mismo modo que los anticuerpos
del hVEGF, teniendo en cuenta la afinidad del antagonista y su
valencia en hVEGF.
El dominio extracelular del receptor hVEGF, bien
por sí mismo como fusionado a un polipéptido de inmunoglobulina o a
otro polipéptido portador, es especialmente útil como antagonista de
hVEGF, en virtud de su capacidad para secuestrar el hVEGF presente
en un huésped que no está unido a hVEGFr en una superficie
celular.
El hVEGFr y las variantes del mismo también son
útiles en análisis de cribado para identificar agonistas y
antagonistas de hVEGF. Por ejemplo, las células huésped
transfectadas con ADN que codifica hVEGFr (por ejemplo, flt o flk1)
sobreexpresan el polipéptido receptor en la superficie de la célula,
haciendo que tales células huésped recombinantes sean en teoría
adecuadas para analizar la capacidad de un compuesto de prueba (por
ejemplo, una molécula pequeña, un péptido lineal o cíclico, o un
polipéptido) para unirse a hVEFGr. El hVEGFr y las proteínas de
fusión hVEGFr, tales como una proteína de fusión
hVEGFr-IgG, pueden utilizarse de manera similar Por
ejemplo, la proteína de fusión se une a un soporte inmovilizado y se
determina la capacidad de un compuesto de prueba para desplazar el
hVEFG radiomarcado del dominio hVEGFr de la proteína de fusión.
El término "recombinante", utilizado para
referirse al hVEGF, al receptor hVEGF, a anticuerpos monoclonales o
a otras proteínas, se refiere a proteínas que son producidas por la
expresión de ADN recombinante en una célula huésped. La célula
huésped puede ser procariota (por ejemplo, una célula bacteriana tal
como E. coli) o eucariota (por ejemplo, una levadura o una
célula de mamífero).
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal
como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido
de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es
decir, cada uno de los anticuerpos comprendido en la población es
idéntico en especificidad y afinidad excepto por posibles mutaciones
de aparición natural que pueda haber en cantidades menores. Debería
apreciarse que, como resultado de tales mutaciones de aparición
natural y similares, una composición de anticuerpos monoclonales de
la invención, que mayormente contendrá anticuerpos que pueden
unirse específicamente al hVEFG o al hVEGFr también pueden contener
cantidades de otros anticuerpos.
De este modo, el modificador "monoclonal"
indica el carácter del anticuerpo como habiendo sido obtenido de
tal población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe
interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo
mediante cualquier procedimiento en particular. Por ejemplo, los
anticuerpos monoclonales de la invención pueden crearse utilizando
el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y
Milstein, Nature 256: 495 (1975), o pueden crearse mediante
procedimientos de ADN recombinante. Cabilly y otros, Patente de
EE.UU. US 4.816.567.
En el procedimiento de hibridoma, se inmuniza a
un ratón o a otro animal huésped adecuado con antígeno por vía
subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular para descubrir
linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que
se unen específicamente a la proteína o proteínas utilizadas en la
inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser
inmunizados in vitro. A continuación se fusionan los
linfocitos con células de mieloma utilizando un agente de fusión
adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de
hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
págs. 59-103 (Academic Press, 1986).
El antígeno puede ser hVEGF o hVEGFr. El
antígeno es opcionalmente un fragmento o parte de cualquiera del
hVEFG o el hVEGFr que tiene uno o más restos de aminoácidos que
participan en la unión del hVEGF a uno de sus receptores. Por
ejemplo, la inmunización con el dominio extracelular de un hVEGFr
(es decir, un polipéptido hVEGFr truncado que carece de los
dominios transmembrana e intracelular) será especialmente útil en la
producción de anticuerpos que son antagonistas del hVEGF, ya que es
el dominio extracelular el que está implicado en la unión
hVEGF.
Las células de hibridoma preparadas de este modo
son cultivadas y dejadas crecer en un medio de cultivo adecuado que
preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o la supervivencia de las células parentales de mieloma
no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales de mieloma
carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas
habitualmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio
HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes
en HGPRT.
Las células preferidas de mieloma son aquellas
que se fusionan de manera eficaz, que sostienen un nivel elevado
estable de expresión de anticuerpo mediante las células productoras
de anticuerpo seleccionadas y que son sensibles a un medio tal como
el medio HAT. Entre éstas, las estirpes celulares de mieloma
preferidas son estirpes murinas, tales como las derivadas de los
tumores murinos MOPC-21 y MPC-11,
disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San
Diego, California, EE.UU., células SP-2, disponibles
en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EE.UU.
y células P3X63Ag8U.1 descritas por Yelton y otros, Curr. Top.
Microbiol. Immunol. 81:1 (1978). También se han descrito estirpes
celulares de mieloma humano y de heteromieloma
humano-murino para la producción de anticuerpos
monoclonales humanos. Kozbor, J. Immunol. 133: 3.001 (1984).
Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.,
Nueva York, 1987).
El medio de cultivo en el que crecen las células
de hibridoma se analiza para la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la
especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos
por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o
mediante un análisis de unión in vitro, tal como
radioinmunoanálisis (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción
(ELISA). Los anticuerpos monoclonales de la invención son aquellos
que preferiblemente inmunoprecipitan hVEGF o hVEGFr o aquellos que
preferiblemente se unen a por lo menos uno de aquellos antígenos en
el análisis de unión, y que son capaces de inhibir una actividad
biológica del hVEGF.
Una vez identificadas las células de hibridoma
que producen anticuerpos antagonistas de la especificidad, afinidad
y actividad deseadas, pueden subclonarse los clones mediante
procedimientos de dilución limitantes y cultivarse mediante
procedimientos estándar. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice, págs. 59-104 (Academic Press, 1986).
Entre los medios de cultivo adecuados para este propósito se
incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco o
medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma
pueden cultivarse in vivo como los tumores ascíticos en un
animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de
cultivo, del líquido ascítico o del suero mediante procedimientos
convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por
ejemplo, columna de sefarosa-proteína A,
cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis,
o cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando
procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de
oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes
que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos
murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como
fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede
colocarse en vectores de expresión que a continuación son
transfectados a células huésped tales como células COS de simio,
células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que
al contrario no producen proteína inmunoglobulínica, para obtener
la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped
recombinantes.
El ADN puede modificarse opcionalmente para
cambiar el carácter de la inmunoglobulina producida por su
expresión. Por ejemplo, las formas humanizadas de anticuerpos
murinos son producidas mediante la sustitución de una región
determinante de complementariedad (CDR) del dominio variable del
anticuerpo murino por la región correspondiente de un anticuerpo
humano. En algunas realizaciones, los restos de aminoácidos de la
región de entramado (FR) seleccionada del anticuerpo murino son
sustituidos por los restos de aminoácidos correspondientes en el
anticuerpo humano. Carter y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 89: 4.285
(1992); Carter y otros, BioTechnology 10: 163 (1992). Las formas
quiméricas de anticuerpos murinos también son producidas por
sustitución de la secuencia codificante por dominios constantes de
las cadenas ligera y pesada humanas seleccionadas en lugar de las
secuencias murinas homólogas. Cabilly y otros, Patente de EE.UU. US
4.816.567; Morrison y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851
(1984).
Los anticuerpos incluidos dentro del alcance de
la invención incluyen variantes de anticuerpos, tales como
anticuerpos quiméricos (incluidos "humanizados") y anticuerpos
híbridos que comprenden cadenas de inmunoglobulina que pueden
unirse al hVEGF o al hVEGFr, y un epítopo no hVEGF.
Los anticuerpos de la presente invención
incluyen todas las especies de origen, y clases de inmunoglobulina
(por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) y subclases, así como
fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2} y
Fv), en tanto que puedan unirse al hVEGF o hVEGFr y sean capaces de
antagonizar una actividad biológica de hVEGF.
En una realización preferida de la invención, el
anticuerpo monoclonal tendrá afinidad por el antígeno inmunizante
de por lo menos aproximadamente 10^{9} litros/mol, tal como se ha
determinado, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson
y Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980). Asimismo, el anticuerpo
monoclonal inhibirá habitualmente la actividad mitógena o
angiogénica del hVEGF en aproximadamente un 50%, preferiblemente en
más de un 80% y más preferiblemente en más de un 90%, tal como se ha
determinado, por ejemplo, mediante un análisis de supervivencia o
proliferación celular in vitro, tal como se describe en el
Ejemplo 2.
Para algunas aplicaciones terapéuticas y
diagnósticas, es deseable que el anticuerpo monoclonal reaccione
con unas pocas de todas las formas moleculares distintas del hVEGF.
Por ejemplo, puede ser deseable disponer de un anticuerpo
monoclonal que pueda unirse específicamente a polipéptidos hVEGF de
secuencia de 165 aminoácidos pero no a polipéptidos hVEGF de
secuencia de 121 o 189 aminoácidos. Dichos anticuerpos se
identifican fácilmente mediante análisis comparativos ELISA o
mediante inmunoprecipitación comparativa de los distintos
polipéptidos hVEGF.
En algunas realizaciones es deseable
proporcionar una parte citotóxica conjugada con un anticuerpo
monoclonal específico de hVEGF o con un hVEGFr. En estas
realizaciones la citotoxina sirve para incapacitar o eliminar
células que expresan hVEGF o se unen al mismo, o a su receptor. El
conjugado es dirigido a la célula por el dominio que es capaz de
unirse al hVEGF o al hVEGFr, De este modo, los anticuerpos
monoclonales que son capaces de unirse al hVEGF o al hVEGFr están
conjugados a citotoxinas. De un modo parecido, el hVEGFr está
conjugado a una citotoxina. Mientras los anticuerpos monoclonales
sean capaces de neutralizar de manera óptima sólo la actividad del
hVEFG (sin la citotoxina), ya no es necesario en esta realización
que el anticuerpo monoclonal o receptor sea capaz de unirse al
hVEGF o al hVEGFr.
Habitualmente, la citotoxina es una citotoxina
proteínica, por ejemplo, toxina de la difteria, toxina del ricino o
toxina de Pseudomonas, aunque en el caso de algunas clases de
inmunoglobulinas el propio dominio Fc del anticuerpo monoclonal
puede servir para proporcionar la citotoxina (por ejemplo, en el
caso de anticuerpos IgG2, que son capaces de fijar complemento y de
participar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
(ADCC)). No obstante, no es necesario que la citotoxina sea
proteínica y puede incluir agentes quimioterapéuticos utilizados
hasta ese momento, por ejemplo, en el tratamiento de tumores.
La citotoxina se relaciona habitualmente con un
anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo mediante un enlace
amida en la cadena principal dentro del dominio Fc del anticuerpo (o
situado en parte del mismo o en todo) Cuando la función direccional
es proporcionada por el hVEGFr, la parte citotóxica es sustituida
en cualquier dominio del receptor que no participe en la unión
hVEGF; preferiblemente, la parte es sustituida en lugar de o en los
dominios transmembrana y/o citoplasmático del receptor. El sitio
óptimo de sustitución se determinará mediante experimentación
sistemática y forma parte de las habilidades normales del experto
en la materia.
Los conjugados que son fusiones de proteínas se
crean fácilmente en cultivo celular recombinante mediante la
expresión de un gen que codifica el conjugado. Alternativamente, los
conjugados se crean entrecruzando covalentemente la parte
citotóxica con una cadena secundaria de restos de aminoácidos o con
un carboxilo del extremo terminal C del anticuerpo o del receptor,
utilizando procedimientos conocidos per se tales como
intercambio disulfuro o unión a través de un enlace tioéster
utilizando por ejemplo iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimadato.
Los anticuerpos monoclonales y el hVEGFr que son
antagonistas del hVEGF están también conjugados a sustancias que
quizás no se clasifican fácilmente como citotoxinas por sí mismas,
pero que aumentan la actividad de las composiciones de la presente.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales o hVEGFr capaces de unirse
al hVEGF o al hVEGFr están fusionados con polipéptidos heterólogos,
tales como secuencias víricas, con receptores celulares, con
citocinas tales como TFN, interferones o interleucinas, con
polipéptidos que tienen actividad anticoagulante y con otros
polipéptidos biológicamente o inmunológicamente activos. Dichas
fusiones se crean fácilmente mediante procedimientos recombinantes.
Habitualmente, tales polipéptidos no inmunoglobulínicos son
sustituidos por el dominio o los dominios constantes de un
anticuerpo anti-hVEGF o por el dominio transmembrana
y/o intracelular de un hVEGFr. Alternativamente, son sustituidos
por un dominio variable de un sitio de unión a antígenos de un
anticuerpo anti-hVEGF descrito en la presente
invención.
En realizaciones preferidas, tales polipéptidos
no inmunoglobulínicos están unidos a los dominios constantes de un
anticuerpo descrito en la presente invención, o son sustituidos por
los mismos. Bennett y otros, J. Biol. Chem. 266:
23.060-23.067 (1991). Alternativamente, son
sustituidos por el Fv de un anticuerpo de la presente invención
para crear un anticuerpo polivalente quimérico que comprenda por lo
menos un sitio presente de unión a antígenos que tenga
especificidad por el hVEGF o el hVEGFr, y un sitio remplazado de
unión a antígenos que tenga una función o especificidad distintas
de las del anticuerpo de inicio.
Los anticuerpos monoclonales capaces de unirse
al hVEGF o al hVEGFr sólo es necesario que contengan un único sitio
de unión para los epítopos enumerados, habitualmente un solo
complejo cadena ligera/pesada o un fragmento del mismo. No
obstante, tales anticuerpos también pueden llevar opcionalmente
dominios de unión que son capaces de unirse a un epítopo que no se
encuentra en el hVEGF ni en el hVEGFr. Por ejemplo, la sustitución
de la correspondiente secuencia de aminoácidos o restos de
aminoácidos de un anticuerpo nativo anti-hVEGF o
anti-hVEGFr por la determinante de
complementariedad, y si es necesario por restos de entramado, de un
anticuerpo con especificidad por un antígeno distinto del hVEGF o
el hVEGFr creará un anticuerpo poliespecífico que comprende un
sitio de unión a antígenos que tiene especificidad por el hVEGF o el
hVEGFr y otro sitio de unión a antígenos que tiene especificidad
por el antígeno no hVEGF o hVEGFr. Estos anticuerpos son por lo
menos bivalentes, pero pueden ser polivalentes, dependiendo del
número de sitio de unión a antígenos que posea la clase de
anticuerpos elegida. Por ejemplo, los anticuerpos de la clase IgM
serán polivalentes.
En realizaciones preferidas de la invención
tales anticuerpos son capaces de unirse a un epítopo hVEGF o hVEGFr
y a: (a) un polipéptido activo en coagulación sanguínea, tal como
una proteína C o un factor tisular, (b) una proteína citotóxica tal
como un factor de necrosis tumoral (TNF), o (c) un receptor de
superficie celular no hVEGFr, tal como CD4, o un receptor
HER-2 (Maddon y otros, Cell 42: 93 (1985); Coussens
y otros, Science 230: 1.137 (1985)). Los anticuerpos multivalentes
heteroespecíficos se crean de un modo conveniente cotransformando
una célula huésped con ADN que codifica las cadenas pesada y ligera
de ambos anticuerpos y recuperando a partir de entonces, mediante
cromatografía de inmunoafinidad o similar, la proporción de
anticuerpos expresados que tienen la propiedades de unión a
antígenos deseadas. Alternativamente, tales anticuerpos se crean
mediante recombinación in vitro de anticuerpos
monoespecíficos.
Los anticuerpos monovalentes que pueden unirse
al hVEGFr son especialmente útiles como antagonistas del hVEGF. Sin
limitar la invención a cualquier mecanismo particular de actividad
biológica, se cree que la activación de receptores hVEGFr celulares
procede mediante un mecanismo en el que la unión del hVEGF a
receptores celulares hVEGF induce la agregación de los receptores y
activa a su vez la actividad quinasa de los receptores
intracelulares. Puesto que los anticuerpos monovalentes de
receptores anti-hVEGF no pueden inducir tal
agregación y por lo tanto no pueden activar el receptor hVEGF
mediante aquel mecanismo, son antagonistas ideales del hVEGF.
No obstante, debería indicarse que estos
anticuerpos deberían dirigirse contra el sitio de unión a hVEGF del
receptor o que por el contrario deberían ser capaces de interferir
con la unión hVEGF al receptor hVEGF, tal como dificultando
estéricamente el acceso del hVEGF al receptor. No obstante, tal como
se ha descrito en alguna otra parte de la presente invención, los
anticuerpos anti-hVEGFr que no son capaces de
interferir en la unión a hVEGF son útiles cuando se conjugan con
partes no inmunoglobulínicas, por ejemplo, citotoxinas.
Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son bien conocidos en el estado de la técnica. Por
ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la
cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina.
La cadena pesada se halla truncada generalmente en cualquier punto
en la región Fc de modo que se impide el entrecruzamiento de las
cadenas pesadas. Alternativamente, los restos relevantes de
cisteína son sustituidos por otro resto de aminoácido o son
eliminados para evitar el entrecruzamiento. Los procedimientos
in vitro son también adecuados para preparar anticuerpos
monovalentes. Por ejemplo, los fragmentos Fab se preparan mediante
escisión enzimática de un anticuerpo intacto.
Para las aplicaciones diagnósticas, los
anticuerpos o hVEGFr de la invención habitualmente pueden marcarse
con una parte detectable. La parte detectable puede ser cualquiera
que sea capaz de producir, directa o indirectamente, una señal
detectable. Por ejemplo, la parte detectable puede ser un
radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{36}S, o
^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como
fluoresceína isotiocianato, rodamina o luciferina; marcadores
isotópicos radiactivos, tales como por ejemplo, ^{126}I, ^{32}P,
^{14}C o ^{3}H o una enzima, tal como fosfatasa alcalina,
betagalactosidasa o peroxidasa de rábano picante.
Puede utilizarse cualquier procedimiento
conocido en el estado de la técnica para conjugar el anticuerpo o
hVEGFr con la parte detectable, incluidos los procedimientos
descritos por Hunter y otros, Nature, 144: 945 (1962); David y
otros, Biochemistry, 13: 1.014 (1974); Pain y otros, J. Immunol.
Meth. 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407
(1982).
Los anticuerpos y receptores de la presente
invención pueden utilizarse en cualquier procedimiento de análisis
conocido, tal como análisis de unión competitiva, análisis de
intercalado, directos e indirectos, y análisis de
inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of
Techniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc.,
1987).
Los análisis de unión competitiva se basan en la
capacidad de un estándar marcado (que puede ser hVEGF o una parte
inmunológicamente reactiva del mismo) para competir con el analito
de la muestra de prueba (hVEGF) a la hora de unirse con una
cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de hVEGF en la muestra
de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar
que se une a los anticuerpos o receptores. Para facilitar la
determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos
o receptores generalmente se insolubilizan antes o después de la
competición, de modo que el estándar y el analito que están unidos a
los anticuerpos o receptores pueden separarse de un modo
conveniente del standard y el analito que permanecen sin unir.
Los análisis de intercalado implican el uso de
dos anticuerpos o receptores, cada uno de ellos capaz de unirse a
distinta parte inmunógena, o epítopo, de la proteína que tiene que
detectarse. En un análisis de intercalado, el analito de la muestra
de prueba se une con un primer anticuerpo o receptor que es
inmovilizado en un soporte sólido y a partir de entonces un segundo
anticuerpo se une al analito, formando de este modo un complejo
insoluble de tres partes. David y Greene, patente de EE.UU. US
4.376.110. El segundo anticuerpo o receptor puede marcarse con una
parte detectable (análisis de intercalado directo) o puede medirse
utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que
está marcado con una parte detectable (análisis de intercalado
indirecto). Por ejemplo, un tipo de análisis de intercalado es un
análisis ELISA, en cuyo caso la parte detectable es una enzima.
Los anticuerpos o receptor de la presente
invención también son útiles para una técnica de diagnóstico por la
imagen in vivo, en la que se administra un anticuerpo o
hVEGFr marcado con una parte detectable a un paciente,
preferiblemente en el torrente circulatorio, y se analiza la
presencia y localización del anticuerpo o receptor marcado en el
paciente. Esta técnica de diagnóstico por la imagen es útil, por
ejemplo, en la estadificación y tratamiento de neoplasmas. El
anticuerpo o hVEGFr se marca con una parte que es detectable en un
mamífero, bien mediante resonancia magnética nuclear, radiología u
otro medio de detección conocido en el estado de la técnica.
Además de los anticuerpos descritos en la
presente invención, entre otros antagonistas útiles del hVEGF se
incluyen fragmentos y variantes de secuencias de aminoácidos del
hVEGF nativo que se unen al receptor hVEGF pero que no muestran la
actividad biológica del hVEGF nativo. Por ejemplo, entre tales
antagonistas se incluyen fragmentos y variantes de secuencias de
aminoácidos que comprenden un dominio de unión a receptor, pero que
carecen de un dominio que confiera actividad biológica o que de lo
contrario no puedan activar receptores hVEGF celulares, tales como
en el caso de un fragmento o una variante de secuencia de
aminoácidos que no tiene capacidad para inducir agregación o
activación de receptores celulares hVEGF. La expresión "dominio de
unión a receptores" se refiere a secuencias de aminoácidos en
hVEGF que están implicadas en la unión a receptores hVEGF. La
expresión "dominio de actividad biológica" o "dominio que
confiere actividad biológica" se refiere a una secuencia de
aminoácidos en hVEGF que confiere una actividad biológica particular
del factor, tal como actividad mitógena o angiogénica.
La observación según la cual hVEGF es al parecer
capaz de formar un complejo con dos o más moléculas hVEGFr en la
superficie de una célula sugiere que hVEGF tiene por lo menos dos
sitios concretos de unión al hVEGFr y que se une a tales receptores
celulares de manera secuencial, primero en un sitio y a continuación
en el otro antes de que tenga lugar la activación, a la manera de
la hormona de crecimiento, la prolactina y similares (véase por
ejemplo, Cunningham y otros, Science 254: 821 (1991); de Vos y
otros, Science 255: 306 (1992); Fuh y otros, Science 256: 1.677
(1992)). Por consiguiente, las variantes de antagonistas del hVEGF
se seleccionan de modo que un sitio de unión a receptores del hVEGF
(habitualmente el sitio implicado en la unión inicial del hVEGF a
hVEGFr) permanece sin modificar (o si está modificado varía para
estimular la unión), mientras que un segundo sitio de unión a
receptores del hVEGF habitualmente se halla modificado por
sustitución de restos de aminoácidos no conservativos o deleción
para volver inoperativo este sitio de unión.
Los dominios de unión a receptores en hVEGF y
hVEGF se determinan mediante procedimientos conocidos en el estado
de la técnica, entre los cuales estudios de rayos X, análisis
mutacionales y estudios de unión a anticuerpos. Entre las
estrategias mutacionales se incluyen las técnicas de mutagénesis por
saturación aleatoria acopladas con la selección de mutantes de
escape y mutagénesis insercional. Otra estrategia adecuada para
identificar dominios de unión a receptores en ligandos se conoce
como mutagénesis por rastreo de alanina (Ala) (alanine
(Ala)-scanning mutagenesis). Cunningham y otros,
Science 244, 1.081-1.985 (1989). Este procedimiento
implica la identificación de regiones que contienen cadenas
secundarias de aminoácidos cargadas. Los restos cargados en cada
región identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys y Glu) son
sustituidos (una región por molécula mutante) con Ala y se
comprueba la unión a receptores de los ligandos obtenidos para
evaluar la importancia de la región particular en la unión a
receptores. Otro procedimiento convincente para la localización de
los dominios de unión a receptores es mediante el uso de
anticuerpos anti-hVEGF neutralizantes. Kim y otros,
Growth Factors 7: 53 (1992). Normalmente se utiliza una combinación
de estos procedimientos y similares para localizar los dominios
implicados en la unión a receptores.
La expresión "variante de secuencia de
aminoácidos" utilizada en referencia al hVEGF se refiere a
polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que hasta cierto
punto difieren de las secuencias de aminoácidos de las formas
nativas del hVEGF. Normalmente, las variantes de secuencias de
aminoácidos antagonistas tendrán por lo menos aproximadamente un
70% de homología con por lo menos un dominio de unión a receptores
del hVEGF nativo y preferiblemente por lo menos aproximadamente un
80%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de
homología con un dominio de unión a receptores del hVEGF nativo. Las
variantes de secuencias de aminoácidos tienen sustituciones,
deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la
secuencia de aminoácidos del hVEGF nativo, de tal modo que las
variantes conservan la capacidad de unirse al receptor hVEGF (y de
este modo compiten con el hVEGF nativo por la unión al receptor
hVEGF) pero no pueden inducir uno o más efectos biológicos del
hVEGF, tales como proliferación de células endoteliales,
angiogénesis o permeabilidad vascular.
"Homología" se define como el porcentaje de
restos en la secuencia de aminoácidos que son idénticos a los
restos en la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión a
receptores de un hVEGF nativo después de alinear las secuencias e
introducir espacios, si es necesario, para adquirir el porcentaje
máximo de homología. Los procedimientos y los programas
informáticos para la alineación son bien conocidos en el estado de
la técnica. Un programa informático de este tipo es "Align 2",
de Genentech, Inc., que se llenó con documentación de usuario en la
oficina de derechos de autor de Estados Unidos, Washington, DC
20559, el 10 de diciembre de 1991. Las variantes de sustitución son
aquellas que tienen por lo menos un resto de aminoácidos en una
secuencia nativa eliminada y un aminoácido distinto insertado en su
lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas,
cuando sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden
ser múltiples, cuando se han sustituido dos o más aminoácidos en la
misma molécula.
Las variantes de inserción son aquellas con uno
o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un
aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa.
Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado bien
al grupo funcional carboxilo \alpha o bien al amino \alpha del
aminoácido.
Las variantes de deleción son aquellas con uno o
más restos de aminoácidos eliminados en una secuencia nativa.
Normalmente, las variantes de deleción tendrán uno o dos restos de
aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.
Los fragmentos y variantes de secuencias de
aminoácidos del hVEGF se preparan fácilmente mediante procedimientos
conocidos en el estado de la técnica, tales como mediante
mutagénesis dirigida del ADN que codifica el factor nativo. El ADN
mutado se inserta en un vector de expresión apropiado y a
continuación se transfectan las células huésped con el vector
recombinante. Las células huésped recombinantes se cultivan en un
medio de cultivo adecuado y a continuación se recupera del cultivo
de células recombinantes el fragmento deseado o la variante de la
secuencia de aminoácidos expresada en las células huésped mediante
procedimientos de purificación cromatográficos o dis-
tintos.
tintos.
Alternativamente, se preparan fragmentos y
variantes de aminoácidos del hVEGF in vitro, por ejemplo
mediante proteólisis del hVEGF nativo, o mediante síntesis
utilizando procedimientos estándar de síntesis de péptidos de fase
sólida tal como se describe en Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:
2.149 (1963]), aunque pueden utilizarse otras síntesis químicas
equivalentes conocidas en el estado de la técnica. La síntesis de
fase sólida se inicia a partir del extremo terminal C de aquel
péptido mediante acoplamiento de un aminoácido \alpha protegido a
una resina adecuada. Los aminoácidos se acoplan a la cadena
peptídica utilizando técnicas bien conocidas en el estado de la
técnica para la formación de enlaces peptídicos.
Para aplicaciones terapéuticas, se administran
los antagonistas de la invención a un mamífero, preferiblemente a
un humano, en una forma farmacéutica farmacéuticamente aceptable,
que incluye aquellas que pueden administrarse a un humano por vía
intravenosa como bolo o mediante infusión continua a lo largo de un
período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal,
intracerebrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial,
intratecal, oral, tópica o por inhalación. Los antagonistas también
se administran adecuadamente por vías intralesiva o perilesiva para
ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos.
Dichas formas farmacéuticas incluyen portadores
farmacéuticamente aceptables que son inherentemente no tóxicos y no
terapéuticos. Entre los ejemplos de tales portadores se incluyen
intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina,
proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias
tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de
potasio, mezclas glicéridas parciales de ácidos grasos vegetales
saturados, agua, sales o electrólitos tales como sulfato de
protamina, fosfato de hidrógeno disódico, fosfato de hidrógeno de
potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal,
trisilicato de magnesio, pirrolidona de polivinilo, sustancias a
base de celulosa y polietilenglicol. Entre los portadores para
formas tópicas de antagonistas a base de gel se incluyen
polisacáridos tales como carboximetilcelulosa sódica o
metilcelulosa, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros bloque
de polioxietileno-polioxipropileno y alcoholes de
cera de madera. En todas las administraciones, son adecuadas formas
convencionales de administración prolongada. Entre tales formas se
incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas,
parches, formas de inhalación, atomizadores nasales, comprimidos
sublinguales y preparados de liberación prolongada. El antagonista
se formulará habitualmente en tales vehículos a una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.
Entre los ejemplos adecuados de preparados de
liberación prolongada se incluyen matrices semipermeables de
polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista las cuales
se hallan en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas
o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación
prolongada se incluyen hidrogeles de poliésteres (por ejemplo,
poli(2-hidroxietilmetacrilato) tal como se
describe en Langer y otros, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167 (1981) y
Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), o
poli(vinilalcohol), poliláctidos (Patente de EE.UU. US
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (Sidman y otros,
Biopolymers, 22: 547 (1983), etileno-vinil acetato
no degradable (Langer y otros, supra), copolímeros
degradables de ácido láctico y ácido glicólico tales como el Lupron
Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero
ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y
poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico.
Aunque polímeros tales como el etileno-vinil acetato
y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de
moléculas durante más de 100 días, algunos hidrogeles liberan
proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los
antagonistas de polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo
durante un período largo de tiempo pueden desnaturalizarse o
agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, lo
que es causa de una pérdida de la actividad biológica y de posibles
cambios en la inmunogenicidad. Pueden concebirse estrategias
razonables para la estabilización dependiendo del mecanismo
implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de
agregación es la formación de enlaces SS intermoleculares a través
de intercambio tio-disulfuro, puede conseguirse la
estabilización modificando restos sulfhidrilo, liofilizando a partir
de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad,
utilizando aditivos apropiados y elaborando composiciones de
matrices de polímeros específicos.
La liberación prolongada de composiciones
antagonistas de hVEGF también incluye anticuerpos antagonistas y
hVEGFr secuestrados por liposomas. Los liposomas que contienen los
antagonistas se preparan mediante procedimientos conocidos en el
estado de la técnica, tales como los que se describen en Epstein y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3.688 (1985); Hwang y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4.030 (1980); patente de EE.UU. US
4.485.045; patente de EE.UU. US 4.544.545. Normalmente los liposomas
son de tipo unilamelar pequeño (aproximadamente
200-800 angstroms) en los cuales el contenido lípido
es mayor que aproximadamente el 30% del colesterol molecular,
ajustándose la proporción seleccionada al tratamiento HRG óptimo Los
liposomas con aumento del tiempo de circulación se describen en la
patente de EE.UU. US 5.013.556.
Otro uso de la presente invención comprende
incorporar un antagonista del hVEGF en artículos formados. Dichos
artículos pueden utilizarse para modular el crecimiento de las
células endoteliales y la angiogénesis. Además, la invasión de
tumores y la metástasis pueden modularse con estos artículos.
Para la prevención o tratamiento de la
enfermedad, la posología adecuada de antagonista dependerá del tipo
de enfermedad que deba tratarse, tal como se ha definido
anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si los
anticuerpos se administran con propósitos preventivos o
terapéuticos, del tratamiento anterior, de los antecedentes
clínicos del paciente y de la respuesta al antagonista, y del
criterio del médico que lleva el caso. El antagonista se administra
de manera adecuada al paciente de una sola vez o a lo largo de
series de tratamientos.
Los antagonistas del hVEGF son útiles en el
tratamiento de varias enfermedades y trastornos no neoplásicos.
Las enfermedades no neoplásicas que pueden
tratarse son artritis reumatoide, soriasis, aterosclerosis,
retinopatía diabética y otras, fibroplasia retrolental, glaucoma
neovascular, hiperplasias tiroideas (entre las cuales enfermedad de
Grave), trasplante de córnea y de otros tejidos, inflamación
crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, preeclampsia,
ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada con pericarditis)
y efusión pleural.
Dependiendo del tipo y la gravedad de la
enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg de antagonista
es una posible posología inicial para administrar al paciente,
bien, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o
mediante infusión continua. Una posología diaria habitual oscilaría
entre aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de
los factores mencionados anteriormente. En el caso de
administraciones repetidas a lo largo de varios días o más,
dependiendo de la enfermedad, se repite el tratamiento hasta que
tiene lugar la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad.
No obstante, pueden ser útiles otras pautas. El progreso de este
tratamiento se controla fácilmente mediante técnicas y análisis
convencionales.
Según otra realización de la invención, la
eficacia del antagonista para prevenir o tratar la enfermedad puede
mejorarse administrando el antagonista serialmente o en combinación
con otro agente que sea eficaz para estos propósitos, tales como el
factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o
neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento de
fibroblastos (FGF) ácidos o básicos o el factor de crecimiento de
hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las
actividades coagulantes del factor tisular, la proteína C, o la
proteína S (véase Esmon y otros, publicación de patente PCT n.º WO
91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), o uno o más agentes
terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes
alquilantes, antagonistas del ácido fólico,
anti-metabolitos del metabolismo del ácido nucleico,
antibióticos, análogos de la pirimidina,
5-fluorouracilo, nucleósidos de purina, aminas,
aminoácidos, nucleósidos de triazol, o corticosteroides. Estos
agentes pueden estar presentes en la composición administrada o
pueden administrarse por separado. Asimismo, el antagonista se
administra de manera adecuada serialmente o en combinación con
tratamientos radiológicos, bien implicando la irradiación o la
administración de sustancias radioactivas.
El tratamiento con antagonistas del hVEGF puede
suspenderse de manera óptima durante períodos de curación de
heridas o de neovascularización deseable.
Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente
con propósitos ilustrativos, y de ningún modo pretenden limitar el
alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para obtener hVEGF conjugado con hemocianina de
lapa (KLH) para inmunización, se mezcló hVEGF recombinante (165
aminoácidos), Leung y otros, Science 246: 1.306 (1989), con KLH a
una proporción 4:1 en presencia de glutaraldehído al 0,05% y se
incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas removiendo
suavemente. A continuación se dializó la mezcla frente a solución
salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC durante toda la noche.
Se inmunizó a ratones Balb/c cuatro veces cada
dos semanas mediante inyecciones intraperitoneales con 5 \mug de
hVEGF conjugado con 20 \mug de KLH, y se volvieron a inmunizar con
la misma dosis de hVEGF conjugado con KLH cuatro días antes de la
fusión celular.
Las células del bazo de los ratones inmunizados
se fusionaron con células de mieloma P3X63Ag8U.1 Yelton y otros,
Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81: 1 (1978), utilizando
polietilenglicol (PEG) al 35% tal como se describe en Yarmush y
otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 77: 2.899 (1980). Los hibridomas se
seleccionaron en medio HAT.
Se cribaron los sobrenadantes de los cultivos
celulares de hibridoma para la producción de anticuerpos
anti-hVEGF mediante análisis ELISA utilizando placas
de microtitulación recubiertas con hVEGF. Se determinó el
anticuerpo que se había unido al hVEGF en cada uno de los pocillos
utilizando inmunoglobulina IgG de cabra anti-murina
conjugada con fosfatasa alcalina y el sustrato
p-nitrofenil fosfato. Harlow & Lane, Antibodies:
A Laboratory Manual, pág. 597 (Cold Spring Harbor Laboratory,
1988). Las células de hibridoma determinadas de este modo para
producir anticuerpos anti-hVEGF se subclonaron
mediante dilución limitante, y se eligieron dos de estos clones,
designados A4.6.1 y B2.6.2, para posteriores estudios.
Ejemplo
2
Las especificidades de unión de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Los
anticuerpos monoclonales se añadieron a los pocillos de las placas
de microtitulación que anteriormente habían sido recubiertas con
hVEGF, FGF, HGF o con factor de crecimiento epidérmico. El
anticuerpo unido se detectó con peroxidasa conjugada con
inmunoglobulinas IgG de cabra anti-murinas. Los
resultados de estos análisis confirmaron que los anticuerpos
monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen
al hVEGF, pero no de forma detectable a aquellos otros factores de
crecimiento de proteínas.
Se utilizó un análisis ELISA de unión
competitiva para determinar si los anticuerpos monoclonales
producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen a los mismos
epítopos (sitios) o a epítopos distintos en el hVEGF. Kim y otros,
Infect. Immun. 57: 944 (1989). Se añadió cada uno de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF sin marcar (A4.6.1 o
B2.6.2) o el anticuerpo irrelevante anti-HGF
(isotipo IgG1) a los pocillos de placas de microtitulación que
anteriormente habían sido recubiertos con hVEGF. A continuación se
añadieron anticuerpos monoclonales anti-hVEGF
biotinilados (BIO-A4.6.1 o
BIO-B2.6.2). La proporción de anticuerpo biotinilado
frente a anticuerpo sin marcar era 1:1.000. La unión de los
anticuerpos biotinilados se visualizó mediante la adición de
peroxidasa conjugada con avidina, seguido de
o-fenilenodiamina dihidrocloruro y peróxido de
hidrógeno El cambio de color en la reacción, que indica la cantidad
de anticuerpo biotinilado unido, se determinó midiendo la densidad
óptica (DO) a 495 nm de longitud de onda.
Tal como se muestra en la figura 1, en cada
caso, la unión de anticuerpo anti-hVEGF biotinilado
fue inhibida por el anticuerpo sin marcar correspondiente, pero no
por el otro anticuerpo anti-hVEGF sin marcar o el
anticuerpo anti-HGF. Estos resultados indican que
los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se unen a distintos epítopos en el hVEGF.
Los isotipos de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Se añadieron muestras del
medio de cultivo (sobrenadante) en las cuales crecía cada uno de
los hibridomas a las placas de pocillos de microtitulación que
anteriormente se habían recubierto con hVEGF. Los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF capturados se incubaron con
distintas inmunoglobulinas de cabra anti-murinas
conjugadas con fosfatasa alcalina específica del isotipo y se
determinó la unión de los anticuerpos conjugados a los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF mediante la adición de
p-nitrofenilo fosfato. Se midió el cambio de color
en la reacción a 405 nm con un lector de placas ELISA.
Mediante este procedimiento, se determinó que el
isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 era una IgG1.
Las afinidades de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 por hVEGF se determinaron mediante análisis de unión
competitiva. Se añadió una concentración subóptima predeterminada
de anticuerpo monoclonal a las muestras que contenían
20.000-40.000 cpm de hVEGF marcado con ^{126}I
(1-2 ng) y varias cantidades conocidas de hVEGF sin
marcar (1-1.000 ng). Tras 1 hora a temperatura
ambiente, se añadieron 100 \mul de antisuero Ig de cabra
anti-murino (Pel-Freez, Rogers, AR
USA) y se incubaron las mezclas durante otra hora a temperatura
ambiente. Se precipitaron los complejos de anticuerpo y proteína
unida (complejos inmunes) mediante la adición de 500 \mul de
polietilenglicol al 6% (PEG, % en peso molecular} 8.000) a 4ºC.,
seguido de centrifugación a 2.000 x G. Durante 20 minutos a 4ºC. Se
determinó la cantidad de ^{125}I-hVEGF unido al
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF en cada muestra
contando el material sedimentado en un contador gamma.
Las constantes de afinidad se calcularon a
partir de los datos obtenidos mediante análisis Scatchard. Se
calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 era de
1,2 x 10^{9} litros/mol. Se calculó que la afinidad del
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el
hibridoma B2.6.2 era de 2,5 x 10^{9} litros/mol.
Se sembraron células endoteliales de capilares
(ACE) de corteza suprarrenal bovina, Ferrara y otros, Proc. Nat.
Acad. Sci. 84: 5.773 (1987), a una densidad de 10^{4} células/ml
en 12 placas de múltiples pocillos, y se añadieron 2,5 ng/ml del
hVEGF a cada pocillo en presencia o ausencia de varias
concentraciones de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 o
B2.6.2, o un anticuerpo monoclonal irrelevante
anti-HGF. Tras cultivo de 5 días, se contaron las
células de cada pocillo en un contador Coulter. Como control, se
cultivaron células ACE en ausencia de hVEGF añadido.
Tal como se muestra en la figura 2, ambos
anticuerpos monoclonales anti-HVEGF inhibieron la
capacidad del hVEGF añadido para soportar el crecimiento o la
supervivencia de las células ACE bovinas. El anticuerpo monoclonal
producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió por completo la actividad
mitógena del hVEGF (en más de aproximadamente un 90% de
inhibición), mientras que el anticuerpo monoclonal producido por el
hibridoma B2.6.2 sólo inhibió parcialmente la actividad mitógena
del hVEGF.
Las células ACE bovinas se sembraron a una
densidad de 2,5 x 10^{4} células/0,5 ml/pocillo en 24 placas de
pocillos de microtitulación en medio Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM) que contenía suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM y 1
ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos. Tras cultivar
durante toda la noche, se lavaron las células una vez en tampón de
unión (volúmenes iguales de DMEM y medio F12 más HEPES 25 mM y
albúmina sérica bovina al 1%) a 4ºC.
Se preincubaron 12.000 cpm de
^{126}I-hVEGF (aproximadamente 5 x 10^{4}
cpm/ng/ml) durante 30 minutos con 5 \mug del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF producido por los hibridomas
A4.6.1, B2.6.2 o A2.6.1 (250 \mul del volumen total), y a
continuación se añadieron las mezclas a las células ACE bovinas en
las placas de microtitulación. Tras incubar las células durante 3
horas a 4ºC, se lavaron las células tres veces con tampón de unión
a 4ºC, se solubilizaron mediante la adición de 0,5 ml de NaOH 0,2 N
y se contaron en un contador gamma.
Tal como se muestra en la figura 3 (arriba), los
anticuerpos monoclonales anti-HVEGF producidos por
los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 inhibieron la unión del hVEGF a las
células ACE bovinas. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales
anti-HVEGF producidos por el hibridoma A2.6.1 no
tuvieron al parecer ningún efecto en la unión del hVEGF a las
células ACE bovinas. Coincidente con los resultados obtenidos en el
análisis de proliferación celular descrito anteriormente, el
anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió la
unión del hVEGF a una mayor cantidad de anticuerpo monoclonal
producido por el hibridoma B2.6.2.
Tal como se muestra en la figura 3 (abajo), el
anticuerpo monoclonal anti-HVEGF producido por el
hibridoma A4.6.1 inhibió por completo la unión del hVEGF a las
células ACE bovinas en una proporción molar 1:250 del hVEGF frente
al anticuerpo.
\newpage
Para determinar si el anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1
reacciona con las formas del hVEGF de 121 y 189 aminoácidos, se
analizó el anticuerpo para conocer su capacidad para
inmunoprecipitar aquellos polipéptidos.
Las células humanas 293 se transfectaron con
vectores que comprenden la secuencia codificante de nucleótidos de
los polipéptidos hVEGF de 121 y 189 aminoácidos, tal como se ha
descrito. Leung y otros, Science 246: 1.306 (1989). Dos días
después de la transfección, se transfirieron las células a un medio
que carecía de cisteína y de metionina. Se incubaron las células 30
minutos en aquel medio, a continuación se añadieron 100 \muCi/ml
de ^{36}S-metionina y
^{36}S-cisteína al medio y se incubaron las
células durante otras dos horas. El marcado se averiguó
transfiriendo las células a un medio sin suero e incubando durante
tres horas. Se recogieron los medios de cultivo y se lisaron las
células incubando durante 30 minutos en tampón de lisis (NaCl 150
mM, NP40 al 1%, desoxicolato al 0,5%, dodecil sulfato sódico (SDS)
al 0,1%, Tris 50 mM, pH 8,0). Los residuos celulares se eliminaron
de los lisados mediante centrifugación a 200 x G durante 30
minutos.
Se incubaron muestras de 500 \mul de cultivo
celular y se incubaron los lisados celulares con 2 \mul de
anticuerpo de hibridoma A4.6.1 (2,4 mg/ml) durante 1 hora a 4ºC, y a
continuación se incubaron con 5 \mul de inmunoglobulina IgG de
conejo anti-murina IgG durante 1 hora a 4ºC. Se
precipitaron los complejos inmunes de hVEGF marcado con ^{35}S y
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF con proteína
A-sefarosa (Pharmacia), a continuación se
sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%-SDS en
condiciones de reducción. El gel se expuso a película radiográfica
para analizar proteínas radiomarcadas inmunoprecipitadas mediante
autorradiografía.
Los resultados de aquel análisis indicaron que
el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el
hibridoma A4.6.1 presentaba reactividad cruzada con ambas formas
del hVEGF de 121 y 189 aminoácidos.
Ejemplo
3
Las secuencias codificantes de nucleótidos y de
aminoácidos del receptor hVEGF flt se describen en Shibuya y otros,
Oncogene 5: 519-524 (1990) La secuencia codificante
del dominio extracelular del receptor hVEGF flt se fusionó con la
secuencia codificante de una cadena pesada de IgG1 humana en un
proceso de dos fases.
Se utilizó mutagénesis dirigida para introducir
una restricción BstBI en el ADN que codifica flt en el sitio 5' del
codón para el aminoácido 759 de flt, y para convertir el único sitio
de restricción BstEII del plásmido pBSSK.FC, Bennett y otros, Biol.
Chem. 266: 23.060-23.067 (1991), en un sitio BstBI.
El plásmido modificado se digirió con EcoRI y BstBI y el gran
fragmento resultante del ADN plásmido se unió junto con un
fragmento EcoRI-BstBI del ADN flt que codifica el
dominio extracelular (1-758 aminoácidos) del
receptor hVEGF flt.
La construcción resultante se digirió con Clal y
Notl para generar un fragmento de aproximadamente 3,3 kb, que a
continuación se insertó en el sitio de clonación múltiple del vector
de expresión de mamíferos pHEBO2 (Leung y otros, Neuron 8: 1.045
(1992) mediante ligación. Los extremos del fragmento de 3,3 kb se
modifican, por ejemplo, mediante la adición de enlazadores, para
obtener inserción del fragmento en el vector en la orientación
correcta para la expresión.
Las células huésped de mamíferos (por ejemplo,
células CEN4; Leung y otros, supra) son transfectadas con el
plásmido pHEBO2 que contiene el inserto flt mediante
electroporación. Las células transfectadas son cultivadas en un
medio que contiene aproximadamente suero bovino fetal al 10%,
glutamina 2 mM y antibióticos, y cuando se alcanza aproximadamente
una confluencia del 75% son transferidas al medio sin suero. El
medio es condicionado durante 3-4 días antes de la
recogida y la proteína de fusión flt-IgG es
purificada del medio condicionado mediante cromatografía en una
matriz de afinidad de proteína A esencialmente tal como se describe
en Bennett y otros, J. Biol. Chem. 266:
23.060-23.067 (1991).
Ejemplo
4
(Ejemplo de
referencia)
Varias estirpes celulares de tumor humano que
crecían en cultivo fueron analizadas para comprobar la producción
de hVEGF mediante ELISA. Se observó que las estirpes celulares de
tumor de ovario, pulmón, colon, gástrico, mama y cerebro producían
hVEGF. Para posteriores estudios se utilizaron tres estirpes
celulares que producían hVEGF, NEG 55 (al que también se hace
referencia como G55) (estirpe celular de glioma humano obtenida del
Dr. M. Westphal, Departamento de Neurocirugía, Hospital
Universitario Eppendorf, Hamburgo, Alemania, a la que también se
hace referencia como G55), A-673 (estirpe celular de
rabdomiosarcoma humano obtenida de la American Type Culture
Collection (ATCC)), Rockville, Maryland EE.UU. 20852 con el número
de estirpe celular CRL 1598) y
SK-LMS-1 (estirpe celular de
leiomiosarcoma obtenida de la ATCC con el número de estirpe celular
HTB 88).
Se inyectó a ratones hembra Beige/nude de seis a
diez semanas de vida (Charles River Laboratory, Wilmington,
Massachusetts EE.UU.) con una inyección por vía subcutánea de
1-5 x 10^{8} células tumorales en
100-200 \mul de PBS En distintos momentos después
de que se hubiera establecido la formación de tumor, se inyectó a
los ratones por vía intraperitoneal una o dos veces por semana con
diversas dosis de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF
A4.6.1, de un anticuerpo monoclonal anti-gp 120
irrelevante o de PBS. Se determinó el tamaño del tumor cada semana
y al final del estudio se extirparon los tumores y se pesaron.
El efecto de varias cantidades de anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la formación de
tumores NEG 55 en ratones se muestra en las figuras 4 y 5. La
figura 4 muestra que en los ratones tratados con 25 \mug o 100
\mug de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1
empezando una semana después de la inoculación de células NEG 55
era sustancialmente inferior el índice de formación de tumores en
comparación con los ratones tratados con el anticuerpo irrelevante
o el PBS. La figura 5 muestra que cinco semanas después de la
inoculación de las células NEG 55, el tamaño de los tumores en los
ratones tratados con anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1
era de aproximadamente un 50% (en el caso de ratones tratados con
dosis de 25 \mug del anticuerpo) a un 85% (en el caso de ratones
tratados con dosis de 100 \mug del anticuerpo) inferior al tamaño
de los tumores tratados con anticuerpo irrelevante o PBS.
El efecto del tratamiento con anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la formación de
tumores SK-LMS-1 en ratones se
muestra en la figura 6. Cinco semanas después de la inoculación de
las células SK-LMS-1, el tamaño
medio de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 era aproximadamente un 75%
inferior al tamaño de los tumores en ratones tratados con anticuerpo
irrelevante o PBS.
El efecto del tratamiento con anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 en la formación de
tumores A673 en ratones se muestra en la figura 7. Cuatro semanas
después de la inoculación de las células A673, el tamaño medio de
los tumores en ratones tratados con el anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 era aproximadamente de un 60% (en
el caso de ratones tratados con dosis de 10 \mug del anticuerpo) a
más de un 90% (en el caso de ratones tratados con dosis de
50-400 \mug del anticuerpo) inferior al tamaño de
los tumores en ratones tratados con anticuerpo irrelevante o
PBS.
Ejemplo
5
Se sembraron células de glioblastoma humano
NEG55 o células de rabdomiosarcoma A673 a una densidad de 7 x
10^{3} células/pocillo en placas de multipocillos (12
pocillos/placa) en medio F12/DMEM que contenía suero fetal de
ternero al 10%, glutamina al 2 mM y antibióticos. A continuación se
añadió anticuerpo anti-hVGEF A4.6.1 a los cultivos
celulares hasta una concentración final de 0-20,0
\mug anticuerpo/ml. Al cabo de 5 días, las células cultivadas en
los pocillos se disociaron mediante exposición a tripsina y se
contaron en un contador Coulter.
Las figuras 8 y 9 muestran los resultados de
aquellos estudios. Al parecer, el anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 no tiene ningún efecto
significativo en el crecimiento de las células NEG55 o A673 en
cultivo. Estos resultados indican que el anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 no es citotóxico y sugieren
claramente que los efectos antitumorales del anticuerpo observados
son debidos a la inhibición de la neovascularización mediada por
VEGF.
Ejemplo
6
La quimiotaxis de células endoteliales y otras
células, entre las cuales monocitos y linfocitos, desempeñan una
función importante en la patogenia de artritis reumatoide. La
migración y proliferación de células endoteliales acompaña la
angiogénesis que tiene lugar en la membrana sinovial reumatoide. El
tejido vascularizado (tejido de granulación sinovial o paño
sinovial) invade y destruye el cartílago articular.
Para determinar si los antagonistas hVEGF
interfieren en este proceso, analizamos el efecto del anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 en la quimiotaxis de células
endoteliales estimulada por líquido sinovial de pacientes que
sufren artritis reumatoide. Como control, también analizamos el
efecto del anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 en la
quimiotaxis de células endoteliales estimulada por líquido sinovial
de pacientes que sufren artrosis (la angiogénesis que tiene lugar
en la artritis reumatoide no tiene lugar en la artrosis).
La quimiotaxis de células endoteliales se
analizó utilizando cámaras de Boyden modificadas según
procedimientos establecidos. Thompson y otros, Cancer Res. 51:
2.670 (1991); Phillips y otros, Proc. Exp. Biol. Med. 197: 458
(1991). Se dejó que aproximadamente 10^{4} células endoteliales de
vena umbilical se adhirieran a filtros recubiertos con gelatina
(tamaño del poro de 0,8 \mum) en microcámaras multipocillo de 48
pocillos en medio de cultivo que contenía suero fetal bovino al
0,1%. Al cabo de dos horas, se invirtieron las cámaras y se
añadieron las muestras de prueba (líquido sinovial de artritis
reumatoide, líquido sinovial de artrosis, FGF básico (bFGF) (hasta
una concentración final de 1 \mug/ml), o PBS) y anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (hasta una
concentración final de 10 \mug/ml) a los pocillos. Al cabo de
cuatro horas, se tiñieron y contaron las células que habían
migrado.
La figura 10 muestra los resultados promedio de
aquellos estudios. Los valores que se muestran en la columna
"Líquido sinovial" y al final de la página para los controles
representan el número medio de células endoteliales que migraron en
presencia de líquido sinovial, bFGF o PBS solo. Los valores de la
columna "Líquido sinovial + mAB VEGF" representan el número
medio de células endoteliales que migraron en presencia de líquido
sinovial más el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1
añadido. Los valores de la columna "% de supresión" indican el
porcentaje de reducción en la migración de células endoteliales
inducida por líquido sinovial resultante de la adición de
anticuerpo anti-hVEGF. Tal como se ha indicado, el
anticuerpo anti-hVEGF inhibió considerablemente la
capacidad del líquido sinovial de artritis reumatoide (inhibición
media en porcentaje 53,40) pero no el líquido sinovial de artrosis
(inhibición media en porcentaje 13,64) para inducir la migración de
celulas endoteliales.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias bibliográficas
mencionada por el solicitante se muestra únicamente para
conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente
europea. Aunque se ha tenido una gran precaución al recopilar las
referencias bibliográficas, no se pueden excluir errores u omisiones
y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad
al respecto.
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Claims (26)
1. Uso de un antagonista hVEGF en la preparación
de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno
no neoplásico caracterizado por exceso de neovascularización
no deseable, en el que el antagonista de hVEGF es:
- (a)
- un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo;
- (b)
- un anticuerpo receptor anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo; o
- (c)
- un receptor hVEGF aislado.
2. Uso según la reivindicación 1 en el que la
enfermedad o trastorno es artritis reumatoide, soriasis,
aterosclerosis, retinopatía diabética u otra, fibroplasia
retrolental, glaucoma neovascular, hiperplasia tiroidea (incluida
enfermedad de Grave), trasplante de córnea o de otro tejido o
inflamación crónica.
3. Uso según la reivindicación 2 en el que la
enfermedad o trastorno es artritis reumatoide.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores en el que el anticuerpo anti-VEGF es un
anticuerpo anti-hVEGF.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores en el que el anticuerpo es humanizado.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3 en el que el receptor hVEGF aislado consiste en el dominio
extracelular de un receptor hVEGF.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3 y 7 en el que el receptor hVEGF es el receptor flt.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3 y 7 en el que el receptor hVEGF es el receptor KDR.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3 y 7 a 9 en el que el receptor hVEGF se fusiona con un
polipéptido portador.
11. Uso según la reivindicación 10 en el que el
polipéptido portador es un polipéptido de inmunoglobulina.
12. Uso según la reivindicación 11 en el que la
inmunoglobulina es IgG.
13. Uso según la reivindicación 12 en el que el
antagonista hVEGF es una proteína de fusión
flt-IgG.
14. Antagonista hVEGF de uso en el tratamiento
de una enfermedad o trastorno no neoplásico caracterizado por
exceso de neovascularización no deseable, en el que el antagonista
de hVEGF es:
- (a)
- un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo;
- (b)
- un anticuerpo receptor anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo; o
- (c)
- un receptor hVEGF aislado.
15. Antagonista de hVEGF según la reivindicación
14 en el que la enfermedad o trastorno es artritis reumatoide,
soriasis, aterosclerosis, retinopatía diabética u otra, fibroplasia
retrolental, glaucoma neovascular, hiperplasia tiroidea (incluida
enfermedad de Grave), trasplante de córnea o de otro tejido o
inflamación crónica.
16. Antagonista de hVEGF según la reivindicación
15 en el que la enfermedad o trastorno es artritis reumatoide.
17. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 en el que el anticuerpo
anti-VEGF es un anticuerpo
anti-hVEGF.
18. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17 en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
19. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18 en el que el anticuerpo es humanizado.
20. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 en el que el receptor hVEGF aislado
consiste en el dominio extracelular de un receptor hVEGF.
21. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 y 20 en el que el receptor hVEGF es el
receptor flt.
22. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 y 20 en el que el receptor hVEGF es el
receptor KDR.
23. Antagonista de hVEGF según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 y 20 a 22 en el que el receptor hVEGF se
fusiona con un polipéptido portador.
24. Antagonista de hVEGF según la reivindicación
23 en el que el polipéptido portador es un polipéptido de
inmunoglobulina.
25. Antagonista de hVEGF según la reivindicación
24 en el que la inmunoglobulina es IgG.
26. Antagonista de hVEGF según la reivindicación
25 en el que el antagonista hVEGF es una proteína de fusión
flt-IgG.
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