JP2000507082A

JP2000507082A - 萎凋を誘発する真菌に対する抵抗性

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Publication number: JP2000507082A
Application number: JP9508127A
Authority: JP
Inventors: ザボー、マルク; フォス、ピーター; シモンズ、グース; グローネンディエク、ジョン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-08-07
Filing date: 1996-08-06
Publication date: 2000-06-13
Also published as: CA2227524A1; AU722863B2; AU6871096A; WO1997006259A3; IL122973A0; EP0843727A2; WO1997006259A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、I-2抵抗性遺伝子を含んでなる核酸であって、植物中に存在し発現されると、萎凋を誘発する真菌に対する抵抗性を該植物に付与しうる核酸に関する。このＤＮＡ配列は、図面に与えられたＤＮＡ配列またはこれに対して相同的ないずれかＤＮＡの少なくとも一部である。本発明はまた、I-2遺伝子によってコードされる遺伝子産物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】萎凋を誘発する真菌に対する抵抗性〔発明の分野〕本発明は、抵抗性遺伝子、ならびに該抵抗性遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物、微生物、植物細胞および植物に関する。さらに本発明は、萎凋を誘発する真菌に抵抗性である遺伝的に形質転換された植物に関する。また本発明は、該抵抗性遺伝子を同定するためのプローブおよびプライマー、ならびに該プローブおよび／またはプライマーを含んでなる診断キットに関する。最後に本発明は、該抵抗性遺伝子にコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドの用途に関する。〔発明の背景〕真菌などの植物病原体は、植物に感染するため、その植物および植物産物にかなりの損失を与える。植物病原体の感染による植物疾病は、植物および／植物産物に損害を与え、生産量および収穫量を減少させ、ある地域で成長しうる植物の種類を制限し、その結果、栽培者に著しい（経済的）損失を与える。植物病原体の防除には種々の手段があり、例えば、土壌の機械的耕うん、殺かび剤、殺虫剤などの農薬による化学的処理、輪作などが挙げられる。しかしながら、ある植物病原体（特に土壌真菌）の場合、これらの防除手段は、感染およびそれから生じる疾病から植物を防御するのに不十分である。唯一の効果的な防除手段は、植物宿主の抵抗性に関連したものである(Russell,1978,Plant Breeding for pest and disease resistance,Butterworths編,485pp)。農薬に対する莫大な需要を減少させ、最終的にはそれをなくすためには、一般的な植物病原体に抵抗性である品種を開発することが、今日の植物育種家の重要な目的の１つである。毎年世界中で作物、樹木などに噴霧される多量の農薬が環境に与える影響は、かなり深刻なものとなっている。さらに、西洋諸国では、政府の規制により、ある種の農薬の使用を制限したり、禁止さえしている。したがって、１以上の植物病原体に抵抗性であるか、あるいは植物攻撃体に対する感受性が減少した植物の必要性が、ますます差し迫ったものとなっている。植物は、病原体による攻撃および感染に対して複雑な防御機構を発達させている。一般に、その防御系は二重になっており、１つは、種々の病原体種に有効な一般的な抵抗性よりなり、もう１つは、特定の病原体種に対する強力な抵抗性よりなる。この後者の抵抗性は、一般に、過敏感反応（HR）に基づくものである。植物の正確な防御機構は依然として解明されていないが、病原体が宿主細胞に接触すると、その病原体のさらなる増殖およびそれに続く疾病の発症を妨げる急速な反応を引き起こす初期事象が生じると考えられている。しばしば、病原体集団内には、このHR抵抗性を克服しうる遺伝子型（いわゆるレース）が存在する。ある宿主が特定の病原体レースには抵抗性であるが、別のレースには感受性である場合、それはレース特異的抵抗性と呼ばれる。さらに、植物−病原体相互作用におけるそのような防御系は、遺伝子対遺伝子関係に基づくと考えられている(Flo r,1956,Adv.Gen.8,29-54)。遺伝子対遺伝子モデルでは、宿主に抵抗性を付与する各遺伝子に対して、非病原性を付与する対応遺伝子が病原体中にある（その逆もある）と仮定されている。つい最近、遺伝子対遺伝子概念に関する分子レベルの証拠が、いくつかの植物抵抗性遺伝子のクローニングにより見出された。植物の抵抗性遺伝子は、非病原性遺伝子にコードされる病原体産物（エリシター）を認識しうる産物（受容体分子）をコードする。その受容体がエリシター分子と相互作用すると、過敏感反応が誘発され、感染した植物細胞およびその周辺の細胞が破壊され、植物内で病原体が増殖し広がるのが妨げられる。最近、病原体のいくつかの非病原性遺伝子を、宿主植物の対応する抵抗性遺伝子を用いて単離することにより、仮定されているこの機構が確認された。そのような抵抗性遺伝子としては、例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis）からのRPS2(avrRpt2を発現するシュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)に対して抵抗性)、タバコからのＮ(タバコモザイクウイルスに対して抵抗性)、トマトからのCf-9（avr9を保持する葉真菌病原体クラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum)に対して抵抗性）およびアマからのＬ⁶（対応する葉さび病真菌レースに対して抵抗性）が挙げられる(Dangl,1995,Cell 80,363-366)。前記のとおり、抵抗性植物の開発は、現在の植物育種計画の重要な目的の１つである。育種系統に抵抗性表現型を導入するためには、特定の病原体に感受性である植物遺伝子型を、抵抗性植物遺伝子型と交配させる。しかしながら、抵抗性遺伝子の育種は、以下のいくつかの要因により制限される：即ち、（i）入手可能な生殖質内の（公知の）抵抗性遺伝子の存在が限定されていること、（ii）異なる種間の交配の不適合性、および（iii）ある種の病原体に関する、再現性および信頼性を有する疾病アッセイ（このアッセイは、選択育種で前もって必要である）の利用可能性が限定されていることである。植物に大きな損害を与える病原体のなかには、フザリウム(Fusarium)、ベルティシリウム（Verticillium）などの、皮層腐敗および維管束萎凋を誘発する土壌真菌の一群がある(Toussoun，1981,Fusarium Diseases,Biology and Taxonomy N elson,ToussounおよびCook編，Penn.State Univ.Press,457pp.)。前記の萎凋を誘発する真菌は、直接的な浸透または傷害を介して根から植物に感染し、その後、該植物の木部維管束組織に定着する。前記真菌の感染症状は、葉の萎凋、褐色化および乾燥であり、ついで植物は死に至る。感染後数週間以内に、植物全体または植物の一部（病原体の維管束侵入点の上部）が死亡することがある。それらの真菌は、通常、菌糸体または分生子として木部道管を通って内部に広がり、やがて植物全体を死に至らしめる。それらの真菌は、土壌中で腐生的に生存しうるため、一旦圃場に入ると永久に定着するようになる。それらは、ほぼ全世界に分布しており、野菜および花、農作物、果樹などのほとんどの種に莫大な損害を与える。それらの真菌は、非常に広範囲に広がっており、土壌中に非常に長期にわたり存在するため、前記の萎凋を誘発する真菌を防除する唯一の有効な方法は、抵抗性植物遺伝子型を利用することである。ほとんどのフザリウム（Fusarium）種は、不完全菌のファミリーに属する。このクラスの真菌は、真菌の栄養成長期だけが知られていることにより特徴付けられる。それらの真菌の生殖段階は、未だ見出されていない。真菌の全体的な分類学または分類法は、生殖相の形態学的特徴に基づいているため、不完全菌のクラスに属する真菌は、それらの生殖相が見出されたら、別のクラスに分類される可能性があり、ついで分類および名称が変化する可能性があることに留意すべきである(Gerlach,1981,Fusarium,Diseases,Biology and Taxonomy,Nelson,Tousso unおよびCook編,Penn.State Univ.Press,p.413-426)。さらに、いくつかのフザリウム（Fusarium）種は、感染植物および／または環境に応じて、別の種に「突然変異」しうることが認められている(BoltonおよびDavidson,1972,Can.J.Plant Sci,52,189-196)。現在のところ、萎凋を誘発するフザリウム（Fusarium）のほとんどは、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）種に属する。植物種が異なれば、それを攻撃するフザリウム（Fusarium）のレースまたは分離菌も異なるが(ArmstrongおよびArmstrong,1981,Fusarium,Diseases,Biology and T axonomy,Nelson,ToussounおよびCook編，Penn．State Univ．Press,p.391-399) 、いくつかのフザリウム（Fusarium）分離菌は、種々の植物種に感染しうる。公知のフザリウム（Fusarium）分離菌としては、例えば、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）( トマト)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・メロニス(F.oxysporum f.sp.m elonis)(メロン)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・バタタス（F.oxyspor um f.sp.batatas）(サツマイモ、タバコ)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・セパエ（F.oxysporum f.sp.cepae）(タマネギ)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・コングルチナンス（F.oxysporum f.sp.conglutinans）(キャベツ、ダイコン)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・キューベンセ（F.oxysporum f.sp.cubense）(バナナ)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・バシンフェクツム（F.oxysporum f.sp.vasinfectum）(綿、アルファルファ、ダイズ、タバコ)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・ディアンチイ（F．oxysporum f.sp .dianthii）(カーネーション)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・クリサンセミ（F.oxysporum f.sp.chrysanthemi）(キク)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・ツベロシ（F.oxysporum f.sp.tuberosi）(ジャガイモ)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・シクラミニス（F.oxysporum f.sp.cyclaminis）( シクラメン)、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・ニコチアナエ（F. oxysporum f.sp.nicotianae）（タバコ）が挙げられる。本発明を考慮すると、萎凋を誘発する真菌の名称が将来変化する可能性があるが、このことは本発明の範囲に影響を及ぼさないと認識すべきである。植物種は非常に大きなゲノムサイズを有するため[例えば、トマトは1000Mbのゲノムサイズ（10⁹塩基対の核ＤＮＡ）を有し、トウモロコシは3000Mbのゲノムサイズを有し、小麦では16×10⁹塩基対をはるかに超える]、遺伝子産物を知ることなく植物遺伝子を単離することは、干し草の山の中から針を探すようなものである。これらの何十億もの塩基対のなかから特定の遺伝子を探すことは、（i）関心のある遺伝子と密接に連関した十分な分子マーカーが存在する場合、および（ii）良好な遺伝物質が入手可能な場合にのみ可能である(Tanksleyら，1995,Tr ends in Genetics,11,p.63-68)。〔発明の概要〕本発明は、I-2抵抗性遺伝子を含んでなる核酸であって、植物中に存在し発現されると、萎凋を誘発する真菌に対する抵抗性を該植物に付与しうる核酸に関する。さらに本発明は、本明細書に開示するＤＮＡ配列を有するI-2抵抗性遺伝子に関する。本発明はまた、I-2抵抗性遺伝子にロードされる遺伝子産物であって、植物病原体の対応する非病原性遺伝子にコードされる遺伝子産物と接触すると植物内で過敏感反応を誘発しうる遺伝子産物に関する。さらに本発明は、それぞれI-2抵抗性遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物、コスミド、ベクター、細菌株、酵母細胞および植物細胞に関する。もう１つの態様では、本発明は、萎凋を誘発し未形質転換植物に感染しうる真菌に抵抗性である遺伝的に形質転換された植物に関する。さらに本発明は、I-2抵抗性遺伝子と相同な抵抗性遺伝子であって、植物中に存在すると、病原体による感染に対する抵抗性を該植物に付与しうる抵抗性遺伝子に関する。最後に、本発明は、I-2抵抗性遺伝子またはその一部の配列に対応するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを含んでなる検出キットに関する。〔図面の説明〕図１は、750kbのサイズおよびBssHII、RsrI、SfiIおよびSgrA1制限部位（小さな線で示されている）の位置を有するYAC 1/546の略図を示す。線影を付した棒線は、I-2抵抗性遺伝子を含む255kbのSgrA1断片を表す。最下部の直線は、サイズ目盛り（kb単位）を表す。円／矢先の組み合わせは、pYAC4の左アーム（動原体の方向）を表す。図２は、YAC 1/546のコスミドライブラリーを構築するために使用するバイナリーコスミドベクターpJJ04541の略図を示す。プラスミドpRK290（20kbの大きさ）（Dittaら,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,7347-7351）を出発ベクターとして使用した。「Tet」は、テトラサイクリンに対する抵抗性を付与する遺伝子を意味する。「LB」は、T-DNAの左境界反復配列を示し、「RB」、は右境界反復を示す。カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター配列を、「p35S」で示す。「ocs3」は、オクトピンシンターゼの３'末端を示す。「NPT」は、ネイマイシンホスホトランスフェラーゼを示し、「cos」は、インビトロパッケージングを可能にするバクテリオファージλcos部位を示す。「pDBS」は、pBluescript（St ratagene,La Jolla,CA,USA）のポリリンカーを示す。図３は、EcoRI/MseIの酵素の組み合わせによる制限断片増幅を用いる24個のコスミドのＤＮＡフィンガープリントにより4,5％の変性ポリアクリルアミドゲルの一部を示す。使用した鋳型を、この図の右部分に示す。図４は、MluIおよびSalI制限部位（小さな線で示されている）の位置および18 個のAFLPマーカー（EM01〜EM18）（矢印で示されている）の位置を有する255kb SgrA1断片の略図を示す。マーカー18および12に隣接したＤＮＡセグメントのコスミドコンティグを、水平の線で示す。アステリスクを付したコスミドを相補性分析で使用する。上側の直線は、サイズ目盛り（kb単位）を表し、MluIおよびSa lI制限断片のサイズが示されている。図５は、重複コスミドA52およびB22ならびにA55およびCC16の一部の略図を示す(白抜きの矢先は、そのコスミドが連続することを示す)。種々の制限部位の位置を、小さな線で示す。AFLPマーカーEM05、EM14およびEM06 の位置を矢印で示す。ヌクレオチド配列が決定されたＤＮＡセグメントを、二方向の矢印で示す。図６は、コスミドA52、B22およびA55の間でほとんど完全に重複しているＤＮＡ'セグメントのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列（I-2抵抗性遺伝子のもの）を示す。開始コドン（1798〜1800位のATG）に下線を付しており、終止コドン（5596〜5598位のTAA）に二重線の下線を付している。 AFLPマーカーEM06の位置は、ヌクレオチド3470位（5'-AATTCAGA-3')からヌクレオチド3565位（5'-AGATTA-3'）までである。３つのイントロン配列の位置が、イタリック体で示されている。86ヌクレオチドの１つのイントロンは、ATG開始コドンの上流の1703〜1788位に位置し、399および82ヌクレオチドの２つのイントロンは、それぞれ、TAA終止コドンの下流のヌクレオチド5628〜6026位および6093〜6174位に位置する。転写開始部位は、AT G開始コドンの少なくとも201ヌクレオチド上流に位置すると予想される。転写終結部位は、TAA終止コドンの少なくとも893ヌクレオチド下流に位置すると予想される。推定ポリアデニル化シグナル（AAUAAA）は、ヌクレオチド6406〜6411位に位置し、太字で示されている。図７は、プラスミドpKG6016の略図を示す。「smisp adtr」はストレプトマイシン／スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を意味し、pBR322の複製起点は「OriV」で示されており、「bla」はアンピシリン抵抗性遺伝子を意味する。「LB」はT-D NA左境界反復配列を示し、「RB」は右境界反復を示す。ノパリンシンターゼプロモーター配列は、「nos pr」で示されており、「nos 3'」はノパリンシンターゼの３'末端を示す。「nptII」は、カナマイシン抵抗性遺伝子を示す。「I2-upstr eam(I2-上流)」は、I-2抵抗性遺伝子のコード配列の上流の1.3kbＤＮＡセグメントを意味する。「FusI2」は、ヌクレオチド1798位からヌクレオチド5598位までのI-2抵抗性遺伝子のコード配列を意味し、「3'untrans」は、I-2抵抗性遺伝子のコード配列の下流の1.1kbのＤＮＡセグメントを意味する。関連する制限部位が示されている。〔発明の詳細な説明〕本明細書中では、以下の説明および実施例において、多数の用語を使用する。そのような用語の意味する範囲を含む明細書および請求の範囲の理解が明確で一貫したものとなるよう、以下に定義の説明をする。 − 核酸：二本鎖ＤＮＡ分子； − オリゴヌクレオチド：短い一本鎖ＤＮＡ分子； − プライマー：一般には、プライマーなる語は、ＤＮＡの合成を引き起こしうる一本鎖ＤＮＡ分子を意味する； − 核酸ハイブリダイゼーション：ナイロンメンブレン、ニトロセルロース濾紙などの支持体上での一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより、関連したＤＮＡ配列を検出する方法。相補的塩基配列を有する核酸分子は、適当な条件下で溶液中で混合されると、二本鎖構造を再形成する。一方が支持体上に固定化されている場合であっても、その二本鎖構造は２つの相補的一本鎖核酸の間で形成される。サザンハイブリダイゼーション法では、後者の状況が生じる； − ハイブリダイゼーションプローブ：サザンハイブリダイゼーション法において、特定のＤＮＡ配列を検出するために、標識されたＤＮＡ分子またはハイブリダイゼーションプローブを、ナイロンメンブレン、ニトロセルロース濾紙などの支持体に結合した分画されたＤＮＡと反応させる。該標識ＤＮＡプローブと相補的なＤＮＡ配列を保持するフィルター上の領域は、リアニーリング反応の結果、それ自体が標識される。ついで、そのような標識を示すフィルターの領域は、使用した標識の型に応じて検出することができる。該ハイブリダイゼーションプローブは、一般には、特異的なＤＮＡ配列の分子クローニングにより、あるいは合成オリゴヌクレオチドを合成することにより得る； − 相同配列：厳密な条件下で特定の配列とハイブリダイズしうる配列、および／または、その特定のＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドと同じ特性を有するボリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および／または、その特定のＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列（および／または該ポリペプチドの主要な特性に実質的な影響を及ぼすことなくその特定のポリペプチドのアミノ酸配列に対していくつかのアミノ酸残基が変化しているアミノ酸配列）を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および／または、その特定の配列に対して少なくとも50％、好ましくは60％、より好ましくは70％、最も好ましくは80％またはさらには90％の配列同一性を有する配列（その場合、核酸について比較すべき配列の長さは、一般に、少なくとも120ヌクレオチド、好ましくは200ヌクレオチド、より好ましくは300ヌクレオチドであり、ポリペプチドについて比較すべき配列の長さは、一般には、少なくとも40アミノ酸残基、好ましくは65アミノ酸残基、より好ましくは100アミノ酸残基である）； − プロモーター：隣接するコード配列の転写に必要な調節配列を含有する、コード配列の上流の転写調節領域であり、ｍＲＮＡの5'非翻訳領域またはいわゆるリーダー配列を含む； − ターミネーター：コード配列の下流にある転写の終結を指令する領域であり、３'非翻訳領域とも称され、ポリアデニル化シグナルを含む； − 抵抗性遺伝子：図６に示すコード配列またはその一部または対応するかまたは相同ないずれかのコード配列を有する核酸、； − 厳密な条件は、核酸配列が特定の配列とハイブリダイズするのを許容するハイブリダイゼーション条件を意味する。一般に、高い厳密性の条件は、少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは約200以上のヌクレオチドの核酸配列が特定の配列と、約１Ｍの塩、好ましくは６×SSCを含む溶液またはそれに匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中約65℃でハイブリダイズするのを許容し、さらに、約0.1M以下の塩、好ましくは0.2M×SSCを含む溶液またはそれに匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中65℃ で洗浄するのを許容するハイブリダイゼーション条件を意味する。これらの条件は、約90％以上の配列同一性を有する配列の検出を許容する。一般に、より低い厳密性の条件は、少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは約200以上のヌクレオチドの核酸配列が、特定の配列と、約１Ｍの塩、好ましくは６×SSCを含む溶液またはそれに匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中約45℃でハイブリダイズするのを許容し、さらに、約１Ｍの塩、好ましくは６×SSCを含む溶液またはそれに匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中室温で洗浄するのを許容するハイブリダイゼーション条件を意味する。これらの条件は、50％以下の配列同一性を有する配列の検出を許容する。当業者であれば、50％〜90％の範囲の同一性を有する配列を同定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を修飾することができるであろう。あるいは、厳密な条件は、核酸配列が、I-2抵抗性遺伝子とそのゲノム環境中で、該ゲノム環境の他のＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを除外して、選択的にハイブリダイズするのを許容するハイブリダイゼーション条件を意味する。 − フザリウム（Fusarium）２：フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）レース２、または本発明の抵抗性遺伝子を有する宿主に感染できない他の任意の遺伝子型。他の遺伝子型としては、例えば、萎凋を誘発する真菌、土壌真菌または他の任意の植物病原体が挙げられるが、これらに限定されるものではない； − 抵抗性遺伝子産物：図６に示すアミノ酸配列またはその一部または相同な任意のアミノ酸配列を有するポリペプチド、； − Ｒ₀植物：形質転換植物またはトランスジェニック植物とも称される、形質転換実験からの一次再生体（primary regenerant）； − R₁系統：自殖したR₀植物の後代； − R₂系統：自殖したR₁植物の後代； − R₁BC系統：R₁植物と該形質転換実験に最初に使用した遺伝子型の植物との戻し交雑の後代。本発明において、本発明者らは、免疫−２（I-2）抵抗性遺伝子を同定し単離することができた。この遺伝子は、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）レース２に抵抗性であるトマト遺伝子型からクローニングされた。その単離された本発明のI-2抵抗性遺伝子は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介する形質転換または他の任意の公知の形質転換法により感受性の宿主植物中に導入することができ、フザリウム（Fusarium）２に対する抵抗性をその宿主植物に付与する能力を有する。その宿主植物は、フザリウム（Fusarium）２が感染するトマトまたは他の任意の遺伝子型であってもよい。本発明はまた、図６に示すI-2抵抗性遺伝子の核酸配列を提供する。本発明のI-2抵抗性遺伝子は、感受性植物遺伝子型を形質転換し、それにより、萎凋を誘発する真菌の感染に対する感受性が減少した（好ましくは、該感染に抵抗性である）遺伝的に形質転換された植物を生産するのに使用できるため、本発明のI-2抵抗性遺伝子により、萎凋を誘発する真菌を防除するための有効な手段が得られる。好ましい実施態様では、I-2抵抗性遺伝子が含むコード配列の前方にはプロモーター領域があり、後方にはターミネーター領域がある。該プロモーター領域は、植物細胞中で機能的であるべきであり、好ましくは、I-2抵抗性遺伝子の天然プロモーター領域に対応する。しかしながら、植物細胞中で機能的である限り、任意の異種プロモーター領域が該コード配列と共に使用できると認識されるべきである。好ましくは、CaMV 35Sプロモーター、T-DNAプロモーターなど(これらはすべて当業者に公知である)の構成的プロモーターを使用する。さらに、適当なターミネーター領域は、植物細胞中で機能的であるべきであり、すべて当業者に公知である。さらに、本発明は、本発明のI-2抵抗性遺伝子にコードされ、図６に示すアミノ酸配列を有するか又は図６に示す推定アミノ酸配列またはその一部と相同であるI-2抵抗性遺伝子産物に関する。I-2抵抗性遺伝子産物は、該病原体の非病原性遺伝子にコードされる対応遺伝子産物の同定および／または単離に使用することができる。受容体分子のように作用すると推定されるI-2抵抗性遺伝子産物と、エリシター分子のように作用すると推定される該病原体の遺伝子産物との関係は、該植物中の防御機構反応の存在により特徴づけられる。さらに、I-2抵抗性遺伝子産物は、それに対する抗体を産生させるのに使用することができ、そして、その抗体は、I-2抵抗性遺伝子産物の存在の検出に使用することができる本発明のもう１つの態様においては、I-2抵抗性遺伝子は、図６に示すＤＮＡ配列またはその一部の一方の鎖に相補的なオリゴヌクレオチドを設計するのに使用することができ、該オリゴヌクレオチドは、検出可能となるよう適宜標識し、相同遺伝子に関するゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。該プローブとハイブリダイズしうる相同配列、および通常は植物に感染する真菌に対する抵抗性を該植物に付与しうる遺伝子産物をコードする相同配列が共に、本発明の範囲内に含まれる。本発明のもう１つの態様では、サザン分析でハイブリダイゼーションプローブとして使用できるオリゴヌクレオチドを、I-2抵抗性遺伝子配列に基づき設計する。これらのプローブは、該抵抗性遺伝子を有する植物遺伝子型および該抵抗性遺伝子を欠く植物遺伝子型を識別するための分子マーカーとして使用することができる。そのようなプローブは、選択育種の追加的な手段として使用することができる。本発明の好ましい実施態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの増幅反応でプライマーとして使用できるオリゴヌクレオチドを、I-2抵抗性遺伝子配列に基づき設計する。その増幅産物の生成は、ある植物遺伝子型におけるI- 2抵抗性遺伝子の存在を示すものである。本発明の特定の実施態様では、前記プライマーは、I-2抵抗性遺伝子と密接に連関している多型断片（いわゆる分子マーカー）の増幅を誘導する。本発明はまた、研究中の遺伝子型内のI-2抵抗性遺伝子の存在または不存在を検出するための、本発明のオリゴヌクレオチドを含んでなる診断キットに関する。そのような診断キットを使用すれば、該抵抗性遺伝子を有するまたは有さない遺伝子型に関してスクリーニングするための手間のかかる疾病アッセイを行なう必要がなくなる。さらに、本発明は、I-2抵抗性遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列と、植物細胞中で機能的な調節配列とを含んでなるＤＮＡ構築物（Ａ）に関する。該調節配列は、I-2抵抗性遺伝子のコード配列に対して相同または非相同である。本発明はまた、調節配列（より好ましくは、I-2抵抗性遺伝子のプロモーター領域）と、該調節配列と非相同な構造遺伝子配列とを含んでなるＤＮＡ構築物（Ｂ）に関する。本発明はまた、ＤＮＡ構築物（Ａ）および／またはＤＮＡ構築物（Ｂ）を含んでなるＤＮＡベクターに関する。適当なベクターは、当業者によく知られているクローニングベクター、形質転換ベクター、発現ベクターなどであってもよい。さらに、図６に記載の配列に対応するＤＮＡ配列またはその一部、ＤＮＡ構築物（Ａ）またはＤＮＡ構築物（Ｂ）を含んでなるベクターを保持する細胞が、本発明の範囲内に含まれる。本発明の１つの好ましい実施態様においては、フザリウム（Fusarium）２に抵抗性である遺伝的に形質転換された植物は、フザリウム（Fusarium）２に感受性の遺伝子型を有する該植物のゲノム中にI-2抵抗性遺伝子を、標準的な形質転換技術を用いて導入することにより得られる。さらに、I-2抵抗性遺伝子は、前記の遺伝的に形質転換された植物の後の世代に遺伝し、フザリウム（Fusarium）２に対する該植物抵抗性を次世代に付与しうる。本発明のさらに別の実施態様では、I-2抵抗性遺伝子を含んでなるＤＮＡ配列の一部を、フザリウム（Fusarium）２に感受性である植物を形質転換するのに使用する。そのような部分は、本発明のI-2抵抗性遺伝子内またはI-2抵抗性遺伝子に隣接する配列内の認識部位の存在に基づき選択した１以上の適当な制限酵素で、I-2抵抗性遺伝子を含むＤＮＡ配列を１以上の工程で消化することにより得ることができる。得られたＤＮＡセグメントは、感受性の宿主植物に導入することができ、抵抗性表現型を有する遺伝的に形質転換された植物は、フザリウム（Fu sarium）２の接種により同定することができる。本発明者らは、本発明のI-2抵抗性遺伝子が、同種系および／または異種系（例えば、トマト、メロン、タバコ、シロイヌナズナ、ナス、ジャガイモ種などであるが、これらに限定されるものではない）内で機能的であり、該感受性の減少に関与しており、および／または前記のフザリウム（Fusarium）２（特に、萎凋を誘発する１以上の真菌）に対する抵抗性をこれらの植物種に付与する能力を有することを見出した。同種系は、抵抗性遺伝子が単離された植物種と同じ植物種を意味し、異種系は、抵抗性遺伝子が単離された植物種と異なる植物種を意味する。本発明で提供するI-2抵抗性遺伝子を含むＤＮＡ配列は、多数の用途を有し、そのいくつかを本明細書に記載するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。以下、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）レース２に抵抗性であるトマト系統内に存在するI-2抵抗性遺伝子の単離に関して、本発明をさらに詳しく説明する。I-2抵抗性遺伝子の単離には、本発明者らは、以下の工程を含む地図作製に基づくクローニング（ボジショナルクローニング）戦略を用いた：（１）I-2抵抗性遺伝子と連関した分子マーカーの同定、（２）形態学的マーカーを用いるI-2座の遺伝地図作製、（３）高分子量ゲノムYACライブラリーの構築、（４）YACクローン上での分子マーカーの物理的地図作製およびYAC コンティグ構築、（５）連関している分子マーカーを保持するYACクローンのコスミドライブラリーの構築、（６）詳細な物理的地図作製およびコスミドコンティグ構築、（７）そのコンティグを形成するコスミドによる感受性植物の形質転換、（８）相補性分析。分子マーカーの同定には、本発明者らは、選択的制限断片増幅法(以下、AFLP^T ^M 法と称する)を用いた。この方法は、多数のＤＮＡ断片の複雑な混合物からＤＮＡ断片のサブセットをランダムに増幅するものであり、この増幅された断片は、分析可能なフィンガープリントを与える。一般に、同じ植物種の種々の遺伝子型の全ＤＮＡをAFLP法に付し、種々の遺伝子型から得られた種々のAFLPフィンガープリントを比較する。１つの遺伝子型内には存在し、別の遺伝子型内には存在しない断片は、多型断片であり、AFLP マーカーと称される。 AFLP反応における選択性は、ランダムに選択される選択ヌクレオチドを、制限酵素部位のヌクレオチドに直接隣接するPCRプライマーの３'末端で用いることにより得られる。AFLPスクリーニングでは、調べるＤＮＡを、異なるプライマーの組み合わせに付す。使用することができる異なるプライマーの全量は、３'末端に付加する選択ヌクレオチドの数で決まる(１選択ヌクレオチドでは４プライマー、２選択ヌクレオチドでは16プライマー、３選択ヌクレオチドでは64プライマー)。２つの異なる制限酵素を使用する場合は、プライマー量は２倍になる。それらのプライマーは、種々の組み合わせで使用することができる。AFLPスクリーニングにおいて、可能なすべての組み合わせを使用すれば、そのプライマーの組み合わせの１つにより、存在するすべての断片が増幅されたはずである(Zabeau およびVos,EP 0534858)。 I-2抵抗性遺伝子と連関しているAFLPマーカーを同定するために、種々のトマト系統をAFLPスクリーニングに付した。これらのトマト系統を、異なるプール［一方のトマト系統のプールは、フザリウム（Fusarium）２に対して抵抗性であり、他方のトマト系統のプールは、フザリウム（Fusarlum）２に対して感受性である］にプールした。。 EcoRI/MseI酵素の組み合わせを用いて、それらのプールをAFLPスクリーニングに付した。 AFLPスクリーニングには、以下のプライマーを使用する：Ｎは、可変的な選択ヌクレオチドを示す。AFLPスクリーニングでは、EcoRIおよびMseIの各プライマーに、全部で64個の可能なプライマーを使用した。したがって、プライマーの組み合わせの合計は、64×64＝4096となる。このスクリーニングの目的は、I-2抵抗性遺伝子に連関したAFLPマーカー（すなわち、該抵抗性プールのフィンガープリント内には存在し、該感受性プール内のフィンガープリント内には存在しないもの）を同定することであった。すべてのAFLPフィンガープリントの分析で、該抵抗性プールのフィンガープリント内には存在し、該感受性プール内のフィンガープリント内には存在しない合計18個のAFLPマーカーが同定された。これらのマーカーを、候補I-2連関AFLPマーカーと称する。これらの候補I-2連関AFLPマーカー存在は、個々のトマト系統において確認された。すべてのマーカーは、抵抗性系統には存在したが、感受性系統には存在しなかった。しかしながら、I-2抵抗性遺伝子に対するAFLPマーカーの位置およびI-2抵抗性遺伝子とそれぞれのマーカーとの間の距離が、まだ決定されなければならない。その目的のために、フザリウム（Fusarium）２抵抗性トマト系統と感受性トマト系統（形態学的マーカーを有するもの）との間で遺伝的に交配させ、ついで、分離するF2集団内の組換え体に関してスクリーニングし、さらに該AFLPマーカーを有するF2組換え体をスクリーニングすることにより、I-2座の遺伝地図を作製した。その結果から、I-2座には、I-2抵抗性遺伝子を含むＤＮＡセグメントの一方の末端でマーカーEM18が隣接しており、そして、もう一方の末端でマーカーEM03 、EM12およびEM16が隣接していることが示された。残りのすべてのAFLPマーカーは、I-2抵抗性遺伝子と共に分離した。つぎに、該AFLPマーカーを、高分子量ゲノムライブラリー上でスクリーニングした。非常に長いＤＮＡセグメントを酵母内で大きな人工染色体としてクローニングすることは、ポジショナルクローニングにより遺伝子を単離する際の必須の工程となっている。YACベクターのクローニング容量によれば、100万塩基対長までものＤＮＡ断片の単離が可能である。I-2座とホモ接合であるトマト系統リコペルシコン・エスクレンツム（Lycopersicon esculentum）E22をＤＮＡ源として使用して、YACライブラリーを構築した。本発明者らは、該トマトゲノムの約2.2 ゲノム当量（genome equivalents）に相当する、520Kbの平均挿入サイズを有する3840クローンを含有するYACライブラリーを得た。I-2連関AFLPマーカーによるAFLPスクリーニングの後で、１つの陽性クローンを得た。 YAC 1/546と称されるこの個々のYACクローン上に、すべてのマーカーが存在していた。このYACクローンのサイズは、750kbと決定される。さらなる分析により、AFLPマーカーはすべて、SgrAI断片上に位置し、第１のS grAI部位に達するYACの左アームの255kbの距離にあることが確認された。18個の AFLPマーカーの位置を含むI-2座を含有するYAC 1/546の左アームの物理的地図の略図を、図４に示す。AFLPマーカーの正確な位置は、物理的地図上のマッピングコスミドに基づき決定することができる。 YAC 1/546中の挿入断片のサイズは、依然として非常に大きいため、I-2遺伝子を直接局在化することはできない。そのような大きな挿入断片を、植物細胞中に直接に形質転換することはできない。したがって、アグロバクテリウム（Agroba cterium）を介する形質転換に適したコスミドベクターを用いて、YAC1/546を含有する酵母株のコスミドライブラリーを構築した。このバイナリーコスミドベクターのサイズは29kbになり、それを図２に図示する。ファージλパッケージングエクストラクトを用いるこのバイナリーコスミドベクターのクローニング容量は、９〜24kbの範囲内である。サイズ分画された酵母ＤＮＡから、約250,000個のコスミドクローンのバンクを得た。標識されたSgrAI断片をプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションにより、該コスミドバンクをスクリーニングした。約10,000個のコロニーのうち、約150個の陽性コスミドクローンを同定した。次の工程では、255kbのSgrAI断片上のAFLPマーカーの位置を、コスミドコンティグに基づいて決定した。該陽性コスミドクローンを、18個のAFLPマーカーでスクリーニングし、それらの位置を決定した。そのコスミドコンティグおよびその 18個のAFLPマーカーの詳細な物理的地図作製の概要を、図４に示す。ポジショナルクローニングによるI-2抵抗性遺伝子の同定の最終工程は、対応する感受性表現型の相補性である。該コスミドクローンを、三親交配における接合導入によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）中に導入した。エイ・ツメファシエンス（A.tumefaciens）株中の該コスミドの存在は、該エイ・ツメファシエンスからの種々の制限酵素パターンおよびＤＮＡフィンガープリントを、該コスミドを含有する大腸菌（Escherichi a coli）株と比較することにより確認した。対応する大腸菌培養と同じＤＮＡパターンを有するコスミドを保持するエイ・ツメファシエンス培養を使用して、感受性トマト系統を形質転換した。標準的な形質転換方法により、感受性トマト系統を、コスミドコンティグを形成するいくつかのコスミドで形質転換した。該形質転換実験の一次再生体（R₀植物）を温室内で成長させて結実させ、R₁系統を得た。該抵抗性遺伝子を有するコスミドを同定するために、これらの病状を試験した。疾病アッセイは、実生上で行なった。それらの根を、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（Fusarium oxysporum f.sp.lycope rsici）レース２の分生子懸濁液に浸し、接種の３〜４週間後に病状を評価した。萎凋の症状および／または茎組織の褐色化がなく健常な場合には、植物は抵抗性だと評価する。死亡するかまたは黄色く萎凋た葉を有し、茎組織が著しく褐色化した植物は、感受性だと評価する。該疾病アッセイの観察から、３つのコスミドが感受性表現型を相補する能力を有することが明らかになり、それにより、機能的なI-2抵抗性遺伝子がこれらの３つの各コスミド上に位置しているという決定的な証拠が得られた。。重複コスミドA52、B22およびA55で形質転換したトランスジェニックR₀植物の抵抗性表現型が、それらの種々のコスミド内に存在するゲノム挿入により決定されることを証明するために、対応するAFLPマーカーの存在を調べた(図５を参照されたし)。コスミドA52またはB22で形質転換されたR₀植物の場合にはマーカーE M14およびEM06を同定するプライマーの組み合わせにより、また、コスミドA55で形質転換されたR₀植物の場合にはマーカーEM06およびEM04を同定するプライマーの組み合わせにより、選択的な制限断片増幅を行なった。どちらの場合においても、また、どちらのマーカーについても、得られたＤＮＡフィンガープリントから、該抵抗性植物内には該マーカーが存在し、該感受性植物内には該マーカーが存在しないことが示され、このことは、３つの重複コスミドA52、B22およびA55がI-2抵抗性遺伝子を含むことを示すものである。トランスジェニックR₀植物のゲノム内へのI-2抵抗性遺伝子の安定な組込みを確認するために、R₁系統の抵抗性植物を自殖させ、温室内で成長さぜて結実させ、R₂系統を得た。R₂系統の実生を、前記のとおり、疾病アッセイに付し、病状を評価した。萎凋ている植物は感受性だとみなし、一方、萎凋を示さない植物は抵抗性だとみなした。得られた結果は、I-2抵抗性遺伝子の安定なメンデル遺伝を示した。さらに、R₁系統の抵抗性植物を、該形質転換実験に使用した感受性トマト遺伝子型と戻し交雑して、R₁BC系統を得た。R₁BC系統の実生上で行なった疾病アッセイの結果から、I-2抵抗性遺伝子の遺伝および優性の両方が確認された。最後に、コスミドA52、B22およびA55中の挿入断片をさらに特徴づけ、コスミドA55の左末端からコスミドB22の右末端までの範囲のI-2抵抗性遺伝子を含む最小ＤＮＡ-セグメントを配列決定した。配列決定分析から、3798ヌクレオチドの大きなオープンリーディングフレームが示された。そのＤＮＡ配列を図６に示す。転写開始部位および転写終結部位を同定し、イントロン配列の存在を確認するために、I-2抵抗性遺伝子を含むＤＮＡ配列をさらに転写地図作製研究に付した。これらの転写地図作製研究は、ｃＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列とを比較する一般的に公知の方法により行なった。ｃＤＮＡ配列とゲノム配列との比較から、コード配列の外側のI-2抵抗性遺伝子内に３つのイントロン配列が存在することが明らかとなった。図６に示すとおり、86ヌクレオチドの１つのイントロンは、 ATG開始コドンの上流に位置し、それぞれ399ヌクレオチドおよび82ヌクレオチドの２つのイントロンは、TAA停止コドンの下流に位置する。転写開始部位は、ヌクレオチド1597またははその上流に位置する。転写終結部位は、ヌクレオチド64 91またはその直ぐ下流に位置する。推定ポリアデニル化シグナルの位置は、ヌクレオチド6406〜6411（AAUAAA）と推定される。図６に示すＤＮＡ配列の一部に対応するＤＮＡセグメント（ヌクレオヂド464 位からヌクレオチド6658位まで）を使用して、感受性トマト遺伝子型を形質転換した。そのＤＮＡセグメントは、コスミドB22を制限酵素BamHIおよびSalI（3.8k bの断片を与える）およびScaIおよびBamHI（2.4kb断片を与える）で消化し、上流に1.3kbのＤＮＡ配列が、そして下流に1.１kbのＤＮＡ配列が隣接するI-2抵抗性遺伝子のコード配列を含む6.2kbの断片を生成させることにより得た。そのＤＮＡセグメントを適当なコインテグレート型のベクター中にクローニングし、ついでアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を介する形質転換により、フザリウム（Fusarium）２に感受性のトマト植物中に導入した。該R₀植物を温室内で成長させ結実させて、R₁系統を得、これらのR₁系統を、前記のとおり、疾病アッセイに付した。その観察から、該ＤＮＡセグメントが、減少したフザリウム（Fusarium）２感受性を該形質転換植物に付与するのに関与していることが示された。当業者であれば、図６に示すＤＮＡ配列の一部を得るため、あるいはコスミド B22またはA55中に存在するゲノム挿入の一部を得るために、本明細書の教示に基づき、あるいはよく知られている他の任意の方法により、該ＤＮＡ配列の他の部分を選択し、植物細胞内での発現を許容する適当なＤＮＡ構築物中に前記部分を導入し、フザリウム（Fusarium）２に感受性の宿主植物中に前記構築物を導入し、フザリウム（Fusarium）２を接種した後で病状に関して該形質転換植物を試験することができると理解される。コスミドB22を使用して、一般的に公知の形質転換方法によりメロン、タバコおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis）の感受性遺伝子型を形質転換した。そのR₀ 植物を温室内で成長させ結実させて、R₁系統を得た。I-2抵抗性遺伝子の機能を同定するために、病状に関してこれらを試験した。本明細書に記載のとおりに、実生上で疾病アッセイを行なった。また、コスミドB22を使用して、ジャガイモの感受性遺伝子型を形質転換した。栄養繁殖した形質転換植物を得、それを挿木上の疾病アッセイに付した。その形質転換植物に関する疾病アッセイの観察から、該感受性表現型の相補性が明らかとなった。本発明の範囲内に含まれる相同配列の同定および単離には、I-2抵抗性遺伝子のコード配列をプローブとして、厳密なハイブリダイゼーション条件下、ゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンを単離し、それを相補性分析に使用した。コスミドB22は、1995年７月14日にプラスミドpKGI2-B22として、Centraalbure au voor Schimmelcultures（Baarn,The Netherlands）に受託第CBS 546.95号として寄託されている。コスミドA55は、1996年８月５日にプラスミドpKGI2-A55として、Centraalbure au voor Schimmelcultures（Baarn,The Netherlands）に受託第CBS 820.96号として寄託されている。以下、実施列により本発明をさらに例示するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。〔実施例〕実施例１：疾病アッセイフザリウム・オキシスポラム・フォルマ・スペシアリス・リコペルシチ（Fusa rium oxysporum forma specialis lycopersici）レース２をツァペック・ドックス寒天（Difco Laboratories,Detroit,MI,USA）上で維持した。該真菌をツァペック・ドックス・ブロス（Difco Laboratories,Detroit,MI,USA）中、往復振とう器上、摂氏25℃で４〜７日間培養することにより、分生子懸濁液を得た。孔径 50μｍのステンレス鋼フィルターで濾過することにより、該分生子を菌糸体断片から分離した。該懸濁液を、水で希釈することにより、２×10⁶分生子/mlの濃度に調整した。トマトの実生トマトの実生を、摂氏25℃の温室内の土壌中で発芽させた。10〜14日齢の実生を使用して、該真菌を接種した。該実生を土壌から注意深く引き抜き、その根を水に浸して、付着している土壌のほとんどを取り除いた。ついで、その根を該分生子懸濁液に２分間浸し、該植物を土壌中に鉢替えした。その小植物を、温室内で、日中（16時間）は25℃で、夜間（８時問）は22℃で成長させた。３〜４週間後、該植物を病状に関して評価した。該植物は、以下のとおり評価した。抵抗性植物は、未接種の対照植物と類似しており、大きく、萎凋はなく、および／または茎組織の褐色化を伴わない。感受性植物は死亡しているか、または典型的な症状（黄色く萎凋た葉を有し、茎組織が著しく褐色化した小さい植物）を示す。トマトの挿木温室で成長させたR₀植物から、挿木を調製した。該植物から小さな側部シュート（sideshoot）を切り、摂氏20℃、湿度100％で、土壌中に入れた。１〜２週間後、その挿木は根づき始めた。２〜３週齢の挿木を使用して、該真菌を接種した。該小植物を土壌から注意深く引き抜いた。その根を水に浸して、付着している土壌のほとんどを取り除いた。ついで、その根を該分生子懸濁液に５分間浸し、該植物を土壌中に鉢替えした。その小植物を、温室内で、日中（16時間）は25℃ で、夜間（８時間）は22℃で成長させた。３〜４週間後、該植物を病状に関して評価した。該植物の評価は、トマトの実生に関して記載したとおりであった。実施例２： I-2抵抗性遺伝子を含むＤＮＡセグメントと連関したAFLPマーカーの同定トマト系統（リコペルシコン・エスクレンツム(Lycopersicon esculentum)）エフ・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（F.oxysporum f.sp.lyc opersici）レース２に抵抗性の合計10個のトマト系統、およびエフ・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（F.oxysporum f.sp.lycopersici）レース２に感受性の10個のトマト系統を使用した(それらを以下に示す)。ＤＮＡの単離および修飾前記の20系統からの全トマトＤＮＡを、BernatzkiおよびTanksley（1986,Theo r.Appl.Genet.72,314-321）に記載されているとおりに若葉から単離した。典型的な収量は、新鮮な葉材料１グラム当たり、ＤＮＡ50〜100μgであった。EcoRI-MseI の酵素の組み合わせを用いるAFLP分析用の鋳型ＤＮＡを、ZabeauおよびVos （欧州特許出願,EP0534858）に記載されているとおりに、および以下に大まかに説明するとおりに調製した。 0.5μgのトマトＤＮＡを、40μlの10mM Tris.HAc(pH7.5)、10mM MgAc、50mM KAc、５mM DTT、50ng/μl BSA中、トリス５単位のEcoRIおよび５単位のMseIと共に37℃で１時間インキュベートした。ついで、10mM Tris.HAc (pH7.5)、10mM MgAc、50mM KAc、5mM DTT、50ng/μl BSA中、5pMolEcoRI-アダプター、５pMol MseI-アダプター、１単位のT4 DNA-リガーゼ、１mM ATPを含有する10μlの溶液を加え、該インキュベーションを37℃で３時間継続した。該アダプターを以下に示す。 EcoRI-アダプターの構造は、であった。 MseI-アダプターの構造は、であった。アダプターは、等モル量の両鎖を加えることにより調製した。アダプターは、リン酸化しなかった。連結後、該反応混合物を10mM Tris.HCl、0.1mM EDTA（pH8 .0）で希釈して500μlとし、−20℃で保存した。その希釈した反応混合物はなおも、鋳型ＤＮＡと称される。 AFLP反応 AFLPスクリーニングに使用したプライマーを以下に示す：それらのプライマー中のＮは、それらのプライマーのこの部分が可変的であることを示す。AFLPスクリーニングでは、EcoRIおよびMseIの各プライマーに、全部で64個の可能なプライマーを使用した。これにより、EcoRIおよびMseIのプライマーの組み合わせの合計は、64×64で4096となる。全部で4096個のプライマーの組み合わせを、I-2連関AFLPマーカーに関するAFLPスクリーニングで使用した。AFLP反応は、以下の方法で行なった。 AFLP反応では、放射能標識したEcoRIプライマーおよび未標識のMseIプライマーを使用した。EcoRIプライマーは、(γ-³³P)ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端標識した。該標識反応は、50μlの25mM Tris.HCl(pH7.5)、10m M MgCl₂、5mM DTT、0.5mMスペルミジン・3HCl中、500ngのオリゴヌクレオチドプライマー、100μCi(γ-³³P)ATPおよび10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて行なった。AFLP分析のために、5ngの標識EcoRI-プライマー(該標識反応混合物からの0.5μl)、30ngのMseI-プライマー、5μlの鋳型-ＤＮＡ、0.4単位のTaq- ポリメラーゼ、10mM Tris.HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl₂、50mM KCl、0.2mMの４個すべてのdNTPを含有する20μlの反応混合物を調製した。AFLP反応は、以下のサイクルプロフィールを用いて行なった：94℃で30秒間のＤＮＡ変性工程、30秒問のアニーリング工程（以下を参照されたし）および72℃で１分間の伸長工程。アニーリング温度は、第１サイクルでは65℃であり、ついで次の12サイクルでは、サイクル毎に0.7℃ずつ減少させ、残りの23サイクルでは56℃で継続した。すべての増幅反応は、PE-9600サーモサイクラー（Perkin Elmer Corp.,Norwalk,CT,USA ）中で行なった。 AFLP反応産物のゲル分析増幅後、反応産物を等量（20μl）のホルムアミド色素（98％ホルムアミド、1 0mM EDTA(pH8.0)および追跡用色素としてのブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール）と混合した。得られた混合物を90℃で３分間加熱し、ついで氷上で急冷した。各サンプル２μlを５％変性（配列決定）用ポリアクリルアミドゲル上にローディングした(MaxamおよびGilbert，1980,Methods in Enzymology 65,499-560)。該ゲルマトッリクスは、50mM Tris/50mMホウ酸/1mM EDTA中、５％アクリルアミド、0.25％メチレンビスアクリル、7.5M尿素を用いて調製した。10 0mlのゲル溶液へ、500μlの10％APSおよび100μlのTEMEDを加え、SequiGen38×5 0cmゲル装置（Biorad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA）を用いてゲルを成型した。サメ歯櫛（sharktooth combs）を用いて、SequiGenゲル単位上に97レーンを作った。100mM Tris/100mMホウ酸/2mM EDTAを移動用緩衝液として使用した。電気泳動は、一定の電力（110ワット）で約２時間行なった。電気泳動後、ゲルを10％酢酸中で30分間固定し、ガラスプレート上で乾燥し、Fujiホスホイメージスクリーンに16時間さらした。Fu ji BAS-2000ホスホイメージ分析システム（富士写真フィルム、日本）を用いて、フィンガープリントパターンを可視化した。連関マーカーに関するAFLPスクリーニング 20個のトマト系統の鋳型ＤＮＡを以下のようにプールした：抵抗性プール１：トマト系統１〜５抵抗性プール２：トマト系統６〜10 感受性プール３：トマト系統11〜15 感受性プール４：トマト系統16〜20 可能なすべてのEcoRI-MseIプライマーの組み合わせ（4096個）をその４つのプール上で使用して、AFLPスクリーニングを行なった。その目的は、両方の抵抗性プールに存在するが、両方の感受性プールに存在するとは限らないAFLPマーカーを同定することであった。AFLPゲルは、その４つのプールの24個のプライマー組み合わせのAFLPフィンガープリントを含有しており、合計171個のゲルが得られた。成功しなかったAFLP反応を再分析し、候補マーカーを確認するために、追加的なゲルを移動させた。両方の抵抗性プールに存在するが、両方の感受性プールに存在するとは限らない合計18個のAFLPマーカーが同定された。これらのマーカーを、候補I-2連関マーカーと称することとした。次のAFLP反応は、20個の個々のトマト系統上に全部で18個の候補マーカーが存在することを確認するために行なった。すべてのマーカーは、その10個の抵抗性系統内に存在し、その10個の感受性系統内には存在しないようであった。これらの18個のマーカーを、EM01〜EM18と命名し、I-2フザリウム（Fusarium）抵抗性遺伝子を地図作製するためのさらなる研究に使用した。マーカーEM01〜EM18を同定するのに必要なプライマーの組み合わせを、表１に示す。プライマーの組み合わせの欄において、「EcoRI-」は、配列5'-GACTGCGTACCAATTC-3'を意味し、「Ms eI.」は、配列5'- GATGAGTCCTGAGTAA-3'を意味する。例えば、マーカーEM06は、配列5'-GACTGCGTAC CAATTCAGA-3'を有するEcoRI-プライマーおよび配列5'-GATGAGTCCTGAGTAATCT-3' を有するMseI.プライマーを用いて同定することができる。実施例３：トマトI-2座の遺伝地図作製遺伝物質の作製エフ・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（F.oxysporum f.sp.lyc opersici）レース２に抵抗性の２つのトマト（リコペルシコン・エスクレンツム（Lycopersicon esculentum）系統は共に、感受性のトマト系統GCR210およびGCR 508と交配されている。両方の抵抗性系統（DR9およびRZ5）は、２つの種会社（それぞれDe Ruiter ZonenおよびRijk Zwaan）からの育種系統である。感受性トマト系統GCR210は、劣性形態学的マーカー遺伝子ａ（アントシアニン無し）に関してホモ接合である。感受性GCR508は、劣性形態学的マーカー遺伝子sub（サチリス(subtilis)）に関してホモ接合である(Stevensおよび Rick,1986:The Tomato Crop,AthertonおよびRudich編,Chapman and Hall,p.35-1 09)。どちらの感受性系統も、Institute of Horticultural Research（Littleha mpton,United Kingdom）から入手した。優性I-2遺伝子(エフ・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ(F.oxysp orum f.sp.lycopersici)２に対する抵抗性を付与する)、および劣性遺伝子ａおよびsubはすべて、トマトの第11染色体の長腕に位置づけられており(StevensおよびRick，1986:The Tomato Crop,AthertonおよびRudich編，Chapman and Hall, p-35.109)、I-2はこの染色体の85位上、ａは68位（I-2から17ヤンチモルガン(cM )）上、subは89位（I-2から４cM）上にそれぞれ存在する。行なわれた交配を以下に示す：交配１： DR9（+ +,I-2 I-2）× GCR210（a a,i-2 i-2）交配２： RZ5（+ +,I-2 I-2）× GCR210（a a,i-2 i-2）交配３： DR9（I-2 1-2,+ +）× GCR508（i-2 i-2,sub sub）交配４： RZ5（I-2 I-2,+ +）× GCR508（i-2 i-2,sub sub）すべての交配からのF₁植物を自殖させて、F₂の種子を得た。得られるF₂集団は、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ(F.oxysporum f.sp.lyco persici)２に対する抵抗性および該形態学的マーカーに関して分離するであろう。 I-2を含有する領域中の組換え体の選択 GCR210（ａを含有する）との交配１および２からのF₂の種子3000個を発芽させた。10〜14日後、それらの実生を２群［その一方は紫色の胚軸を有し(野生型実生)、他方は緑色の胚軸を有する(ａホモ接合の実生)］に分けた。330個の野生型実生および565個のアントシアニン無しの実生に、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ(F.oxysporum f.sp.lycopersici)レース２を接種した。３〜４週間後、抵抗性／感受性に関して該植物を評価した。その結果を以下に示す。該組換え体は、感受性の野生型植物および抵抗性のアントシアニン無しの植物である。 GCR508（subを含有する）との交配３および４からのF₂の種子1500個を発芽させた。10〜14日後、それらの実生に、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ(F.oxysporum f.sp.lycopersici)レース２を接種した。そのアッセイ中に、それらの小植物を、発育習性、正常か「サチリス(subtilis)」かに関して、および抵抗性／感受性に関して、表現型により評価した。その結果を以下に示す。それらの組換え体は、感受性の野生型植物および抵抗性の「サチリス(subtili s)」植物である。 F²植物を温室内で成長させ結実させた(誘発的または自発的な自殖による)。F₃ 種子は、抵抗性組換え体F₂植物のほとんどから、および少数の感受性組換え体から得た。F₂植物の表現型を確認するために、これらのF₃系統を抵抗性／感受性に関して試験した。各F₃系統の20〜30個の実生に、エフ・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ(F.oxysporum f.sp.lycopersici)２を接種し、評価した( 実施例１に記載のとおりに行なった)。該抵抗性組換え体のF₃後代は、抵抗性に関して３：１に分離したが、該感受性組換え体のものはすべて感受性と評価された。 F₂組換え体中のAFLPマーカーのスクリーニング同定されている18個のI-2マーカーEM-01〜EM18のAFLP分析は、実施例２に記載されているとおり、187個の抵抗性組換え体植物、10個の感受性組換え体植物および39個の対照植物（12個が抵抗性で27個が感受性）上で行なった。以下の結果が得られた。 − マーカーEM01、EM02、EM04、EM05、EM06、EM07、EM08、EM09、EM10、EM11 ，EM13、EM14、EＭ15およびEM17は、199個すべての抵抗性F₂植物に存在していたが、37個すべての感受性植物に存在しているわけではなかった。これらのマーカーは、I-2遺伝子と密接に連関していた。 − マーカーEM03、EM12およびEM16は、199個すべての抵抗性植物に存在していたが、１個のアントシアニン無し植物を除き、該感受性植物には存在していなかった。 − マーカーEM18は、７個のアントシアニン無し植物を除き、すべての抵抗性植物に存在しているが、すべての感受性植物に存在しているわけではない。これらのデータから、I-2座は、I-2抵抗性遺伝子を含むＤＮＡセグメントの一方の末端でマーカーEM18に隣接しており、もう一方の末端でマーカー EM03、EM12およびEM16に隣接していると結論づけることができた。前記の交配の組換え体の分析に基づけば、残りのマーカーはすべて、完全にI-2 抵抗性遺伝子と共に分離する。実施例４：トマトYACライブラリーの構築およびスクリーニング材料 I-2座に関してホモ接合であるトマト系統リコペルシコン・エスクレンツム（L ycopersicon esculentum）E22（Enza Zaden）を起源ＤＮＡとして使用して、YAC ライブラリーを構築した。Van Daelenら（1989,Plant Mol.Biol.12,341-352）に記載されているとおり、２〜３週齢のインビトロシュートの葉からプロトプラストを単離した。生存可能なプロトプラスト（プロトプラスト５０００万個/mlの濃度）を集め、等容量のアガロース（１％,Seaplaque,FMC BioProducts,Rockland,Maine, USA）と混合して、プラグを形成させた。それらのプラグ中に包埋したプロトプラストを、溶解混合物（0.5M EDTA、１％N-ラウリルサルコシナートおよび1mg/m lプロテイナーゼK,pH8.0）で溶解した。溶解後、使用するまで該プラグを保存緩衝液（新鮮な溶解混合物）中４℃で保存した。約4.5μgの染色体ＤＮＡを得るために、プラグ１個当たりプロトプラスト約300万個を、さらなる研究に使用した。唯一のEcoRIクローニング部位を含有するプラスミドpYAC4を、クローニングベクターとして使用し、酵母AB1380株を宿主として使用した(Burkeら,1987,Scienc e 236,806-812)。 YACライブラリーの構築高分子量のＤＮＡの単離、EcoRIメチラーゼの存在下でのEcoRIによる部分分解、ゲノムＤＮＡへのベクターアームの連結、パルスフィールドゲル電気泳動によるサイズ選択、および該酵母宿主の形質転換を、Burkeら(1987,Science236,806- 812)およびLarinら（1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,4123-4127）に記載されているとおりに行なった。すべての標準的な操作は、SambrookらのMolecular cloning:a laboratory man ual（1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているとおりに行なった。 2.2ゲノム当量（genome equivalents）に相当する520kbの平均挿入サイズを有する3840個のクローンを最終的に得、それらの個々のクローンを、75μlYPD溶液（１％酵母エキス、２％ペプトンおよび２％デキストロース）を含有する40個の 96ウェルマイクロタイタープレート中で保存した。 YACライブラリーのスクリーニング取り扱うサンプルの数を減少させるために、１個の96ウェルマイクロタイタープレートの細胞をプールし(プレートプール)、Rossら（1991,Nucleic Acids Res .,19,6053）に記載されているとおりにＤＮＡの単離に使用した。その2.2ゲノム当量（genome equivalents）のトマトYACライブラリーは、40個の96ウェルマイクロタイタープレートよりなり、その結果、実施例２に記載のAFLPプロトコールを用いて、AFLPマーカーEM01、EM02およびEM18（実施例２を参照されたし）で、その40個のプレートプールのＤＮＡをスクリーニングした。その40個のうちの１個の陽性プレートプールを、３つすべてのAFLPマーカーで同定した。ついで、YACの正確な所在地を見つけるために、その96個の個々のYAC クローンの二次スクリーニングを行なった。1/546と称される１個のYACクローンを同定し、ついで残りのAFLPマーカーで分析した。そのスクリ−ニングにおいては、該フランキングマーカーおよび１個の共分離（co-segregating）マーカーを使用していたため、予想どおり、同定されたマーカーEM01〜EM18のすべては、このYACクローン上に存在していた。YACクローンのサイズは、カウンタークランプト均一電界(countour-clamped homogeneous electric field)（CHEF;Chuら，198 6,Science,235,1582-1585）を用いるパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)分析により測定したところ、750kbであるようであった。実施例５：YAC 1/546の物理的地図の構築およびAFLPマーカーの位置制限酵素SgrAI、RsrII、SfiIおよびBssHIIの濃度を増加させながら、YAC 1/54 6を部分消化に付した。該サンプルをPFGEにより分画し、Gene Screen Plusメンブレン（DuPont,NEN,Boston,MA,USA）に転移させ、Burkeら（1987,Science 236, 806-812）に記載されている直接末端標識マッピングのためのプロトコールに従う末端隣接（end-adjacent）配列プローブを用いるハイブリダイゼーションによりアッセイした。図１に、YAC 1/546の物理的地図の略図を示す。その物理的地図上の種々のAFL Pマーカーの位置を決定するために、該AFLPマーカーをYAC 1/546の部分消化物上でハイブリダイゼーションプローブとして使用した。したがって、該AFLPマーカー断片を、乾燥したゲルから切り出し、0.5M酢酸アンモニウム、10mM酢酸マグネシウム、1mM EDTA(pH=8.0)、0.1％SDSを含有する緩衝液中の拡散により溶出し、 AFLP反応で使用したPCRプライマーで再増幅し、FeinbergおよびVogelstein（198 3,Anal.Biochem.132,6-10）のランダムプライマー法により³²Pで標識した。該AFLPマーカーのすべてが、SgrA1断片上に位置し、最初のSgrA1部位まで達するYACの左アームの255kbの距離に位置しているらしかった。実施例６：YAC 1/546のコスミドライブラリーの構築材料バイナリーベクターpJJ04541は、pJJ1881の誘導体であり(Jonesら,1992,Trans genic Research 1,285-297)、大腸菌（Escherichia coli）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）中での選択のためのテトラサイクリン抵抗性遺伝子を含有するプラスミドpRK290に基づく。pRK290の唯一のEcoRI部位中へ、 − バクテリオファージλのcos部位 − カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター配列（Odellら,1984, Mol.Gen.Genet.223,369-378）により発現が駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Beckら，1982,Gene 19,327-336）および − pBluescript（Stratagene,La Jolla,CA,USA）ポリリンカー配列に隣接する配列（LBは左境界反復、RBは右境界反復を示す）を保持するT-DNA を挿入した。pJJ04541のサイズは29kbになり、それを図２に図示する。ファージ λパッケージングエクストラクトを用いるこのバイナリーコスミドベクターのクローニング容量は、９〜24kbの範囲内である。ライブラリーの構築 YAC 1/546を含有するサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae ）AB1380株の全ＤＮＡを、ザイモリアーゼを用いて単離して、プロトプラストを作製した[GreenおよびOlsen(1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,1213-1217)に従い行なった]。 PFGE上でアリコートを分析したところ、100kb以上のサイズを有するようであった。このＤＮＡの約15μgをSau3Aで部分消化して、15〜25kbの平均サイズの分子を得た。ついで、このサンプルを10〜35％のショ糖勾配により、Be ckman SW41ローター中、22,000rpm、20℃で22時間遠心分離した。その遠心管の底に針で穴をあけて、0.5mlの画分を集めた。これらの画分のアリコートを0.7％アガロースゲル上で分析した。約20kbのサイズを有するＤＮＡ分子を含有する画分をプールし、エタノール沈殿により濃縮した。ついで、Korch(1987,Nucleic A cids Res.15,3199-3220)およびLoftusら（1992,Biotechniques 12,172-176）に記載されているII型制限エンドヌクレアーゼにより産生されたＤＮＡの５'−伸長のパーシャルフィリング法により、付着末端をdATPおよびdGTPでパーシャルフィルインした。バイナリーコスミドベクーpJJ04541をXhoIで完全消化し、Korch（1987,Nuclei c Acids Res.15,3199．3220）に記載されているとおりに、該線状断片をdTTPおよびdCTPでパーシャルフィルインした。その20kb断片を該コスミドベクターに連結し、ファージλ Gigapack II XLパッケージングエクストラクト（Stratagene,La Jolla,CA,USA）を製造業者の推奨どおりに使用して、大腸菌（E.coli）XLl−Blue MR株（Stratagene,LaJolla,CA, USA）に形質導入した。選択は、10mg/lのテトラサイクリンを含有するLB（１％バクト−トリプトン、0.5％バクト−酵母エキスおよび１％NaCl,pH7.5）寒天プレート上で行なった。サイズ分画された酵母ＤＮＡ２〜３μgから、約250,000個のコスミドクローンのバンクを作製した。ついで、これらの形質転換体をマイクロタイタープレート（96ウェル、10mg/l のテトラサイクリンを含有する100μlのLB培地）のウェル中に保存した。マイクロタイタープレート中のコスミドクローンの96ウェル格子のレプリカを、Gene S creen Plusメンブランフィルター（DuPont NEN,Boston,MA,USA）上に押付け、コロニーになるまで培地上で増殖させる。³²Pで標識されたSgrA1断片を用いるコロニーハイブリダイゼーションは、陽性コスミドを示した。約10,000個のコロニーのうち、約150個の陽性コスミドクローンを同定した。実施例７： 255SgrA1断片の詳細な物理的地図およびALFPマーカーの位置255k bのSgrA1断片のコスミドコンティグの構築大腸菌（E.coli）中でのコスミドの増殖および操作のための標準的な技術に従った(Sambrookら,Molecular cloning:a laboratory manual,1989,Cold Spring H arbor Laboratory Press)。Ish-Horowiczら（1981,Nucl.Acids Res.9,2989-2997 ）の方法を用いるアルカリ溶解により、コスミドＤＮＡを単離した。鋳型調製には、約500ngを使用し、制限断片の増幅におけるプライマーは、実施例２と同じく、選択ヌクレオチドを有さないEcoRI-プライマー5'-GACTGCGTACCAATTC-3'、および選択ヌクレオチドを有さないMseI-プライマー5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'であった。該EcoRI-プライマーを５'末端で標識し、記載されているプライマーセットを用いて150個の各ＤＮＡを増幅した。該ＤＮＡフィンガープリントは、約８〜20個の増幅断片を含有していた。同一サイズの増幅断片を含有するＤＮＡサンプルのセットを選択し、そのSgrA1断片全体のすべての増幅断片の連続的な並びが得られるまで、実施例２に記載のとおりにポリアクリルアミドゲル上で再移動させた。該コスミドコンティグの最終的なフィンガープリントを図３に示す。制限断片増幅は、コスミドのコンティグ構築のための優れた手段であるが、２つの隣接するコスミド間の重複の程度を、前記の酵素の組み合わせを用いて決定することができない。したがって、該コスミドコンティグＤＮＡサンプルを、Ec oRIおよびHindIIIで消化し、ついでSouthern,J.Mol.Biol.98,503-515に従うサザンブロット分析に付した。³²Pで標識されたSgrA1断片をプローブとして使用し、サイズマーカーを用いて２つの隣接コスミドＤＮＡ間の重複断片のサイズを決定した。少なくとも５kbの重複を有する隣接コスミドを相補性分析に使用した。 255kbのSgrA1断片上での18AFLPマーカーの詳細な地図作製左末端プローブ（実施例５の記載を参照されたし）を用いるBurkeら（1987,Sc ience 236,806-812）に記載されている、制限酵素MluIおよびSalIに関する間接的な末端標識地図作製技術により、I-2抵抗性遺伝子を含有する255kbのSgrA1断片のより詳細な物理的地図を作成した。100kbまでの範囲内の分離を最大にする条件下で、パルスフィールド電気泳動を行なった。その255kbのSgrA1断片の物理的地図上のAFLPマーカーEM01〜EM18の位置を決定するために、２つの型のハイブリダイゼーション分析を行なった。Sambrookら（ Molecular cloning:a laboratory manual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている標準的なハイブリダイゼーション技術を用いて、まず最初に、MluIおよびSalIの部分消化物上で該AFLPマーカーをプローブとして使用し、ついでコスミドコンティグのＤＮＡ上で該AFLPマーカーをプローブとして使用した。 MluIおよびSalIに関するSgrA1断片の詳細な物理的地図および18個のAFLPマーカーEM01〜EM18の位置を図４に示す。実施例８：形質転換アグロバクテリウム・ツメファシエンス中へのコスミドの導入実質的にDeblaereら（1987,Methodsin Enzymology 153,277-292）に従うヘルパー株HB101（pRK2013）を用いる三親交配での接合導入により、該コスミドクローンをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriumtumefaciens）中に導入した。５mg/lテトラサイクリンで補足したLB培地（１％バクト−トリプトン、0.5％バクト−酵母エキスおよび１％NaCl、pH7.5）中、37℃で大腸菌(E.col i)を増殖させた。ヘルパー株HB101(pRK2013)を、100mg/l硫酸カナマイシンで補足したLB培地中、同じ条件下で増殖させた。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株C58C1Ri^R（pGV3101）（Van Larebekeら,1 974,Nature,252,169-170）を、100mg/lリファンピシンで補足したLB培地中、28 ℃で増殖させた。一晩培養を4000r.p.m.で５分問の遠心分離により集め、補足無しのLB培地に再懸濁し、該アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養、該ヘルパー株培養およびコスミド株培養のそれぞれを混合し、抗生物質を含まないLB寒天プレート上にプレーティングした。28℃で一晩インキュベートした後、該混合物を、100mg/lリファンピシンおよび５mg/lテトラサイクリンを含有するLB寒天プレート上にプレーテイングして、選択寒天プレートによる連続継代における単一の接合完了アグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーを選択した。エイ・ツメファシエンス接合完了体の特徴付け選択されたコロニーから、小規模培養を成長させ、10mg/lテトラサイクリンを含有するLB培地中で成長させた。Ish-Horowiら（1981,Nucl.Acids Res.9,2989-2 997）に記載されている方法によるアルカリ溶解により、プラスミドＤＮＡを単離し、標準的な技術によりBglIIで消化した。さらに、実施例７に記載されているとおり、EcoRI/MseIの酵素の組み合わせおよび選択ヌクレオチドを有さないプライマーを用いて、エイ・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のミニプレップＤＮＡ上で制限断片増幅を行なった。ついで、該エイ・ツメファシエンス（A.tu mefaciens）接合完了体のBglII制限酵素パターンおよびＤＮＡフィンガープリントを、該コスミドを含有する大腸菌（E.coli）株のミニプレップＤＮＡのものと比較した。対応する大腸菌(E.coli)株培養と同じＤＮＡパターンを有するコスミドを保持するエイ・ツメファシエンス（A.tumefaciens）接合完了体のみを使用して、感受性トマト系統を形質転換した。感受性トマト系統の形質転換感受性トマト系統52201（Rijk Zwaan）の種子を２％次亜塩素酸ナトリウム中で10分間表面滅菌し、無菌蒸留水中で３回洗浄し、ガラスジャーまたはポリプロピレン培養容器中の発芽培地［１％（w/v）ショ糖および0.8％寒天を含有するMu rashigeおよびSkoog（1962,Physiol.Plant.15,473-497）による半効力（half-st rength）のMS培地よりなる］上に載せた。発芽させるために、それらを８日間放置した。培養条件は、25℃、30μmol.m^-2.s^-1の光子流速密度および16/24時間の光周期であった。トマトの形質転換は、Koornneefら（1987,Tomato Biotechnology，169-178,Al an R.Liss,Inc.）に従い行なった。その概要を以下に記載する。10.7μMのα− ナフタレン酢酸および4.4μMの６−ベンジルアミノプリンで補足されたMS20培地［２％（w/v）ショ糖および0.8％寒天を含有するMurashigeおよびSkoog（1962,P hysiol.Plant.15,473.497）による培地］上にプレーティングされたペツニア・ヒブリダ（Petunia hybrida）浮遊細胞のフィーダー層を含有するペトリ皿中、８日齢の子葉外植片を24時間、前培養した。ついでコスミドクローンAA12、DD2、CC14、A52、B22、A55、CC16、A44、A29、CC3、AA2、AA9、BB8またはコスミドベクターpJJ04541を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の希釈された一晩培養を該外植片に５〜10分間感染させ、該外植片を無菌濾紙上に乾燥ブロッティング（blotted dry）し、もとのフィーダー層プレート上で48時間共生培養した。培養条件は、前記と同じであった。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien s）の一晩培養を、液体MS20培地［２％（w/v）ショ糖を含有するMurashigeおよびSkoog(1962,Physiol.Plant.15,473-497)による培地,pH5.7］中で0.8のO.D.₆₀₀ まで希釈した。共生培養の後、4.56μMゼアチン、67.3μMバンコマイシン、418.9μMセホタキシムおよび171.6μM硫酸カナマイシンで補足されたMS20よりなる選択培地を含有するペトリ皿に該子葉外植片を移し、前記の培養条件下で培養した。該外植片を３週間毎に新鮮な培地上に継代培養した。発生したシュートを、下部のカルスから切り離し、ゼアチンを含まない選択培地を含有するガラスジャーに移して、根を形成させた。硫酸カナマイシンを含有する培地中での根の形成は、問題のシュートがトランスジェニック性であることを示すものであるとみなされた。頂端分裂組織および副芽を、ゼアチンを含まない新鮮な選択培地を含有するガラスジャー継代培養することにより、真にトランスジェニックな再生体をインビトロで繁殖させた。種子生産個々の各形質転換体のうち、１個または２個のクローンをインビトロで維持し、一方、残りのシュートは、土壌中に鉢植えし、20℃で、85％を超える相対湿度および16/24時間の光周期で７〜10日間馴化させ、温室に移して、種子生産させた。成熟したトマト植物を、Son-Tランプ（Philips,Eindhoven,The Netherlands ）からの補助電照のある通風温室内で25〜32℃で成長させた。それらに毎日水をやり、うどん粉病およびトリアレウロデス（Trialeurodes）の発生に対して処理し、振動させて、開花時に優れた結実が保証されるようにした。成熟した果実を収穫し、種子を採取し、１％HCl中で１時間洗い、水洗し、乾燥した。実施例９：相補性分析抵抗性に関して形質転換植物をスクリーニングすることによる抵抗性遺伝子を有するコスミドの同定形質転換実験の形質転換植物（R₀植物）を、実施例８に記載のとおりに温室内で成長させて結実させた。コスミドAA12、DD2、CC14、A52、B22、A55、CC16、A4 4、A29、CC3、AA2、AA9、BB8またはpJJ04541のそれぞれについて、20個のR₀植物を成長させた。I-2抵抗性遺伝子を有するコスミドを同定するために、各コスミドの少なくとも９個のR₁系統を、病状に関して試験した(ただし、pJJ04541の場合には、４個の植物を試験した)。各R₁系統の20〜25個の実生に、実施例１に記載のとおりに接種し、評価した。全体で、前記の14個の異なるコスミド形質転換の144個のR₁系統が試験されており、13個のコスミドは、トマト挿入ＤＮＡを含有し、１個のコスミド（pJJ04541）は、挿入ＤＮＡを含まない。その結果を表２に示す。128個のトランスジェニックR。植物が感受性であるらしかった。なぜなら、それらのR₁系統は、完全に又はほとんど完全に（それらの実生の少なくとも 80％）罹患していたことが明らかだからである。16個のR₀植物は、それらのR₁系統が分離していたため、抵抗性である。R₁統のほとんどは、抵抗性および感受性の実生が約１：３の比で分離した。残りのR₁系統は、少数の感受性の実生を有していたが(５：１および10：１の分離比)、このことは、対応するR₀植物内に該挿入断片の複数コピーが存在することを示すものである。その16個の抵抗性R₀植物は、コスミドA52、B22およびA55（これらの３つのコスミドは互いに重複している）の１つによる形質転換から誘導されていた。これらの同定されたコスミドを、さらなる分子解析に使用した。抵抗性表現型を有する形質転換植物の分子解析重複コスミドA52、B22およびA55の１つで形質転換したトランスジェニック植物の抵抗性表現型が、それらの種々コスミド中に存在するゲノム挿入により決定されることを確認するために、AFLPマーカーEM04、EM06およびEM14によるAFLP分析を行なった。AFLPマーカーEM14およびEM06は、プラスミドA52およびB22上に位置し、一方、EM06およびEM04は、コスミドA55上に位置していた（図５を参照されたし）。 BernatzkiおよびTanksley（1986,Theor.Appl.Genet.72,314-321）に記載されているとおりに、抵抗性R₀植物に由来する抵抗性および感受性のR₁植物の若葉からＤＮＡを単離した。コスミドA52またはB22で形質転換されたR₀植物の場合にはマーカーEM14およびEM06を同定するプライマーの組み合わせにより、また、コスミドA55で形質転換されたR₀植物の場合にはマーカーEM06およびEM04を同定するプライマーの組み合わせにより、選択的な制限断片増幅を行なった。どちらの場合においても、また、どちらのマーカーについても、得られたＤＮＡフィンガープリントから、該抵抗性植物内には該マーカーが存在し、該感受性植物内には該マーカーが存在しないことが示され、このことは、３つの重複コスミドA5 2、B22およびA55がI-2抵抗性遺伝子を含むことを示すものである。形質転換植物の第２世代における抵抗性表現型の確認コスミドA52、B22およびA55上のI-2抵抗性遺伝子の存在に関する追加的な遺伝的証拠が、R₁植物の次の世代において得られた。３：１（またはそれ以上）の比で分離したA52、B22またはA55で形質転換されたR₁系統の抵抗性植物を、実施例８に記載されているとおりに温室内で成長させて結実させた。すべての植物を自殖させ、それらの植物のほとんどを、雄親として感受性系統52201（本発明における最初の形質転換トマト遺伝子型）と戻し交雑した。遺伝子移入されたI-2抵抗性遺伝子の遺伝を確認するために、各抵抗性R₀植物のうち、少なくとも２つの R₂系統(R₁植物の自殖から生じたもの)、および入手可能であれば２つのR₁BC系統（52201と戻し交雑したR₁から生じたもの）を、フザリウム（Fusarium）２抵抗性に関して試験した。実施例１に記載のとおりに、R₂系統およびR₁BC系統の実生に接種し、評価した。各被検系統の実生の少なくとも半数が、抵抗性であるようであった。ほとんどのR₂系統は３：１で分離するか又は完全に抵抗性であり、一方、ほとんどのR₁BC 系統は１：１で分離するか又は完全に抵抗性であった。その結果は、R₁植物が、 I-2抵抗性遺伝子に関してヘテロ接合であるか(R₂では３：１、R₁BCでは１：１の分離)、I-2抵抗性遺伝子に関してホモ接合である（R₂およびR₁BCのすべての実生が抵抗性であった）ことを示す。実施例10： I-2抵抗性遺伝子を含有する重複コスミドクローンの物理的地図コスミド挿入のサイズは13〜24kbの範囲内であるため、該コスミドベクターのポリリンカー配列内に存在する制限酵素による単一、二重および部分消化分析などの標準的な技術を、Sambrookら（Molecular cloning:a laboratory manual,19 89,Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているとおりに行なった。コスミドA52、B22およびA55（一部）の物理的地図を作製し、抵抗性表現型を与えるそれらの３つのコスミド（A52、B22およびA55）の間の重複を、感受性表現型を表す隣接コスミドクローンCC16に対して決定し、それを図５に示す。コスミドA52およびB22中の挿入サイズは、計算可能であり、それぞれ、23および17kbとなった。コスミドB22の植物挿入断片は、コスミドA52内に完全に適合するようであった。I-2抵抗性遺伝子を含有する最小ＤＮＡセグメントは、約８kb のサイズの領域に及ぶコスミドA55の左端からコスミドB22の右端までの範囲であった。実施例11：I-2抵抗性遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸コスミドB22の８kbＤＮＡセグメントの種々の断片を、Sambrookら（Molecular cloning:a laboratory manual,1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている標準的な技術により大腸菌（E.coli）ベクターpBluescript（S tratagene,La Jolla,CA,USA）中にサブクローニングし、Pharmacia Autoread Se quencing KitおよびPharmacia LKB A.L.F.DNA Sequencer装置（Pharmacia LKB,U ppsala,Sweden）を用いる配列分析に使用した。コスミドB22のHindIII部位の上流の約600ヌクレオチドから３'末端までの範囲の6.5kbのヌクレオチド配列を決定した。それを図６に示す。1266アミノ酸のタンパク質をコードする3798ヌクレオチドの大きなオープンリーディングフレームを推定することができた。実施例12：転写産物のマッピング I-2抵抗性遺伝子の５'および３'末端を位置づけ、I-2抵抗性遺伝子がイントロンを含むか否かを判定するために、転写産物マッピング研究を行なった。I-2抵抗性遺伝子からの転写産物の一部を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を、この目的に利用した。抵抗性トマトE22品種の葉組織からの全ＲＮＡを、Sambrookら（Molecular clo ning:a laboratory manual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているホット（hot）フェノール法により単離した。Dynabeads M-280Stre ptavidin（DYNAL A.S.,Oslo,Norway）に結合したビオチン化オリゴ（dT）を製造業者の指示に従い使用してポリA＋RNAを単離した。Life technologies,Inc.（Ga ithersburg,MD,USA)からのSuperscript RNase H Reverse Transcriptase cDNAキットおよび該製造業者から供給されたプロトコールを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築した。種々のPCR反応におけるオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型として、そのｃＤＮＡを使用した。これらのプライマーは、図６に示すヌクレオチド配列に基づいて設計されたものであり、I-2抵抗性遺伝子のコード配列をカバーする６個のプライマーセットを使用した。さらに、Clontech（Paolo Alto,CA,USA）からのM arathon ｃＤＮＡ増幅キットを使用して、５'および３'RACE産物を得た。ついで、６個の内部プライマーセットを用いて得た種々のPCR断片、および５'および３ 'RACE断片を、TAクローニングベクターpCRII（Invitrogen Corporation,San Die go,CA,USA）中にクローニングし、標準的なプロトコールを用いて配列決定した。得られたヌクレオチド配列を、6.5kbのゲノム配列と整列させ、３個のイントロン配列を推定することができた。86ヌクレオチドのイントロンは、ATG開始コドンの直ぐ上流のヌクレオチド1703〜1788位に位置していた(図６)。Marathon ｃＤＮＡ増幅キットで検出された最大転写産物の５'末端は、16個の各形質転換体の分析後に、ヌクレオチド1597位に位置づけられる。したがって、本発明者らは、I-2抵抗性遺伝子の転写開始部位は、ヌクレオチド1597またはその上流に位置すると結論づけた。 399ヌクレオチドおよび82ヌクレオチドのサイズを有する他の２つのイントロン配列は、それぞれヌクレオチド5628〜6026位および6093〜6174位の３'非翻訳領域に位置していた。該転写産物の３'末端は、３'末端RACE産物の配列に基づき、ヌクレオチド6491位に位置づけられた。したがって、本発明者らは、I-2抵抗性遺伝子の転写終結部位は、ヌクレオチド6491またはその直ぐ下流に位置すると結論づけた。推定ポリアデニル化シグナル（AAUAAA）は、転写終結部位およびＵ残基の伸長の約80ヌクレオチド上流のヌクレオチド6406〜6411位に位置する。種々のイントロンならびに転写開始および終結部位の位置を図６に示す。鋳型としてのｃＤＮＡ由来の内部PCR産物のＤＮＡ配列は、I-2抵抗性遺伝子がコード領域内にイントロンを全く含有していないことを示した。実施例13：I-2抵抗性遺伝子を含むＤＮＡセグメント I-2抵抗性遺伝子を含む３個の重複コスミドクローンの物理的地図に基づき、I -２抵抗性遺伝子を含むＤＮＡヤグメントは、約８kbのサイズの領域に及ぶコスミドA55の左末端からコスミドB22の右末端までの範囲に限定されると推定することができた。1266アミノ酸のタンパク質をコードする3798ヌクレオチドのサイズを有する１つの大きなオープンリーディングフレームは、この８kb領域から推定することができた。この８kbのＤＮＡセグメントの一部を感受性トマト系統5220 1中に形質転換した。ＤＮＡセグメントのサブクローニングのための出発ベクターとして、コインテグレートベクターpKG1505を使用した。このベクターは、Deblaereら（1987,Meth ods in Enzymology,153,277-292）に記載されている原型コインテグレートベクターであるプラスミドpGV1500の誘導体である。そのベクターは、一般的なクローニングベクターであるpBR322に基づく。それは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）中の選択マーカーとして使用されるストレプトマイシン／スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含有し、該コインテグレート構造を維持する。該ベクターは、オクトピンT_L-DNAの左（LB）および右（ RB）境界反復配列を含有する。ベクターpKG1505は、それらの境界反復配列間に残留T-DNAを含有しないが、その代わりに、植物内でのカナマイシン抵抗性のためのnos-nptII-nosカセットおよび合成ポリリンカー配列を含有する点でpGV1500と異なる。 Sambrookら（Molecuiarcloning:a laboratory manual,1989,Cold SpringHarbo r Laboratory Press）に記載されている組換えＤＮＡ分子の構築のための標準的な技術を用いて、プラスミドpKG6016（図７）を構築した。プラスミドpKG6016は、I-2抵抗性遺伝子のコード配列を含むコスミドB22からの6.2kbのScal/SalI断片ならびに1.3kb上流および1.1下流のＤＮＡ領域を含む。この構築のために、コスミドB22からの3.8kbのBamHI/SalI断片をpKG1505中にクローニングして、プラスミドpKG6014を得た。この3.8kbのＤＮＡセグメントは、I-2抵抗性遺伝子の後半部および1.1kbの３'非翻訳領域を含有する。さらに、コスミドB22からの2.4kbのScaI/BamHI断片を、pBluescript（Stratagene,La Jol la,CA,USA）のEcoRV/BamHI部位中にクローニングして、プラスミドpKG6015を得た。ついで、pKG6015をXhoIおよびBamHIで切断し、1.3kbの上流プロモーター領域を含むI-2抵抗性遺伝子の前半部を含有する2.4kbのＤＮＡセグメントをpKG60l 4中に導入して、プラスミドpKG6016を得た。既に記載されているヘルパー株HB101（pRK2013）を用いる三親交配での接合導入により、プラスミドpKG6016をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrob acterium tumefaciens）株C58C1Rif^R（pGV2260）（Deblaereら,1987,Methods in Enzymology 153,277-292）中に導入した。選択は、300μg/mlのスペクチノマイシンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含有するプレート上で行なった。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）接合完了体は、プローブとしてSm遺伝子を使用する染色体ＤＮＡのサザンブロット分析により特徴付けた。したがって、染色体ＤＮＡは、LichtensteinおよびDraper （DNA cloning,1985,第II巻,67-119,D.M.Glover編，IRL Press）に記載されている方法により単離し、制限酵素EcoRIまたはHindIIIで消化し、ニトロセルロースメンブレン（Gene Screen Plus,DuPont NEN,Boston,MA,USA）上にブロッティングした。組込みプラスミドの１コピーを含有する接合完了体を選択して、既に記載されているプロトコールを用いて感受性トマト系統52201を形質転換した。個々の形質転換体を温室内に移し、そのうちの15個のR₀植物を種子生産のために成長させた。６個のR₀植物のR₁系統を病状に関して試験した。各R₁系統の20〜 30個の実生に、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（Fu sarium oxysporum f.sp.lycopersici）レース２を接種し、評価した。萎凋ている植物は感受性だとみなし、一方、萎凋ていない植物は抵抗性だとみなした。それらの観察から、そのＤＮＡセグメントが抵抗性に関与していることが示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フォス、ピーターオランダ国、エヌエル−3927 ビーディー・レンスワウデ、ドルプスストラート 22 (72)発明者シモンズ、グースオランダ国、エヌエル−6715 ジェイエル・エーデ、ゾーテンダール 11 (72)発明者グローネンディエク、ジョンオランダ国、エヌエル 6703−エーティー・ワーヘニンヘン、ウイルヘルミナベーク２−ビー

Claims

【特許請求の範囲】１．図６に記載のＤＮＡ配列またはそれと相同ないずれかのＤＮＡ配列の少なくとも一部であるＤＮＡ配列を有する核酸。２．図６のＤＮＡ配列と相同な前記ＤＮＡ配列もまた、図６のＤＮＡ配列によって抵抗性にされやすい宿主植物に導入されると、それをフザリウム（Fusarlum ）２に対して抵抗性にする能力を有する、請求項１に記載の核酸。３．植物病原体に感受性の宿主植物に導入されると、該宿主植物を該植物病原体に対して抵抗性にする能力を有する、請求項１に記載の核酸。４．該ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド1798からヌクレオチド5598までのコード配列またはそれと相同ないずれかのＤＮＡ配列に対応する、請求項１に記載の核酸。５．該ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド1798の５'上流に位置するプロモーター配列またはそれと相同ないずれかのＤＮＡ配列に対応する、請求項１に記載の核酸。６．該ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド464からヌクレオチド6658までの配列またはそれと相同ないずれかのＤＮＡ配列に対応する、請求項１に記載の核酸。７．該ＤＮＡ配列が、コスミドB22中に存在するゲノム挿入断片の少なくとも一部に対応し、好ましくは、コスミドB22とコスミドA55との間で重複するゲノムＤＮＡ配列またはそれと相同ないずれかのＤＮＡ配列に対応する、請求項１に記載の核酸。８．前記の重複するゲノムＤＮＡ配列が、コスミドA55中に存在するゲノム挿入断片の左末端と、コスミドB22中に存在するゲノム挿入断片の右末端とにより範囲が限定される、請求項７に記載の核酸。９．請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる組換えＤＮＡ構築物。 10．該核酸が、植物細胞中で機能的なプロモーターの制御下にあり、該プロモーターが、該植物細胞に対して内因性または外因性であり、該植物細胞中での該ＤＮＡ配列の転写を制御するのに有効である、請求項９に記載の組換えＤＮＡ構築物。 11．該プロモーターが、図６に示されるヌクレオチド1797の５'上流に位置するプロモーター配列またはそれと相同ないずれかのＤＮＡ配列に対応する、請求項10に記載の組換えＤＮＡ構築物。 12．請求項９〜11のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含んでなり、植物細胞の形質転換に適したベクター。 13．第CBS546.95号で寄託されているプラスミドpKGI2-B22。 14．第CBS820.96号で寄託されているプラスミドpKGI2-A55。 15．請求項12〜14のいずれか１項に記載のベクターまたはプラスミドを含んでなる細菌細胞。 16．請求項９〜11のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物が取込まれてなる組換え植物ゲノム。 17．請求項９〜11のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる植物細胞。 18．請求項17に記載の植物細胞を含んでなる植物。 19．フザリウム（Fusarium）２に対する感受性が減少している、請求項18に記載の植物。 20．該植物がトマトであり、該フザリウム（Fusarium）２が、フザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（Fusarium oxysporum f.sp.lycope rsici）レース２である、請求項19に記載の植物。 21．請求項９〜11のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる種子。 22．植物細胞環境中の、請求項16に記載の組換え植物ゲノム。 23．真菌に対する感受性が減少した植物の生産方法であって、 i）請求項９〜11のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を植物細胞のゲノム中に挿入する工程と、 ii）形質転換された植物細胞を得る工程と、 iii）前記の形質転換された植物細胞から、遺伝的に形質転換された植物を再生させる工程と、 iv）所望により、該植物を繁殖させる工程とを含んでなる生産方法。 24．さらに、該真菌に対する感受性が減少した形質転換植物を選択することを含んでなる、請求項23に記載の生産方法。 25．該真菌が土壌真菌、好ましくは、萎凋を誘発する真菌である、請求項23または24に記載の生産方法。 26．該植物がトマトであり、該真菌がフザリウム・オキシスポラム・エフエスピー・リコペルシチ（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）レース２である、請求項23〜25のいずれか１項に記載の生産方法。 27．栽培中の植物を真菌感染から防御する方法であって、 i）請求項９〜11のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を植物のゲノムに付与する工程と、 ii）該植物を成長させる工程とを含んでなる方法。 28．請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を単離する方法であって、 i）請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列で、植物のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする工程と、 ii）該ＤＮＡ配列とハイブリダイズする陽性クローンを同定する工程と、 iii）該陽性クローンを単離する工程とを含んでなる方法。 29．該ライブラリーが第１の植物に由来し、該ＤＮＡ配列が第２の植物に属する、請求項28に記載の方法。 30．AFLPマーカーEM01〜EM18の少なくとも１つを同定するプライマーの組み合わせを用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を同定するための選択的制限断片増幅方法。 31．前記のプライマーの組み合わせが、AFLPマーカーEM06を同定する、請求項 30に記載の方法。 32．請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸の少なくとも一部に対応するＤＮＡ配列を含んでなるオリゴヌクレオチド。 33．厳密なハイブリダイゼーション条件下で請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列と選択的にハイブリダイズするのに十分なサイズを有する、請求項32に記載のオリゴヌクレオチド。 34．該ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド3470からヌクレオチド3565までの配列に対応する、請求項32に記載のオリゴヌクレオチド。 35．該ＤＮＡ配列が３'末端に位置し、好ましくは、ＤＮＡの合成を引き起こしうる配列5'-AATTCAGA-3'に対応する、請求項32に記載のオリゴヌクレオチド。 36．該ＤＮＡ配列が３'末端に位置し、好ましくは、ＤＮＡの合成を引き起こしうる配列5'-TAATCT-3'に対応する、請求項32に記載のオリゴヌクレオチド。 37．請求項35に記載の第１のオリゴヌクレオチドと、請求項36に記載の第２のオリゴヌクレオチドとを含んでなるプライマーの組み合わせ。 38．請求項32〜36のいずれか１項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでなる診断キット。 39．請求項37に記載のプライマーの組み合わせを含んでなる診断キット。 40．請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列の存在または不存在を、特に植物ＤＮＡにおいて、請求項38または39に記載の診断キットを用いて検出する方法。 41．図６に記載の配列、または請求項１または２に記載の対応する相同配列にコードされる配列を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。 42．受容体分子として請求項41に記載のポリペプチドを用いるエリシター分子の同定方法。 43．請求項１または２のＤＮＡ配列の一部または全部の転写産物のリボ核酸配列を有するＲＮＡ。