JP3278151B2

JP3278151B2 - 有機化合物に関する改良

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Publication number: JP3278151B2
Application number: JP29871190A
Authority: JP
Inventors: ロベルト・ウイレム・ゴルドバッハ; ディルク・ペーテルス; ヨハネス・ヤコブス・ルドヘルス・ヒーレン; ペトルス・テオドルス・デ・ハーン; アーノルデュス・ヨハネス・コール; マルチヌス・クイリヌス・ヨセフ・マリエ・ファン・ヘリンスフェン
Original assignee: ノバルティス・セーズ・ベスローテン・フェンノートシャップ
Priority date: 1989-11-03
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 2002-04-30
Anticipated expiration: 2017-04-30
Also published as: AU6574990A; HUT57265A; TR27515A; AP166A; DE69033830D1; KR100228326B1; ATE207121T1; MY104590A; JPH03228679A; CA2029241A1; EP0426195B1; AU646231B2; KR910009931A; AP9000217A0; JP2002223785A; ES2165838T3; DK0426195T3; EP0426195A1; HU906519D0; IL96203A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］この発明は、トスポウイルス感染に対する感受性が低
い植物、この耐性を生み出すのに使用される遺伝物質、
単離または診断用プローブ並びに上記植物および遺伝物
質およびプローブを得る方法に関するものである。

［従来の技術］一般に、ウイルス感染は、例えば植物の生長、形態お
よび収量に対して様々な有害な影響を与える。また、ウ
イルス感染の結果として、感染植物の他の植物病原体お
よび植物害虫に対する感受性が高められることが多い。
植物ウイルスの伝染は、一般に昆虫もしくは真菌媒介体
によるか、または機械的に行なわれる。

植物品種改良家は、特定ウイルス株に対する耐性また
は抵抗性を示す種類の農作物品種の開発を絶えず試みて
いる。伝統的に、ウイルス耐性遺伝子は、品種改良によ
って野生近縁体から商業的品種へ導入される。野生近縁
体の遺伝子プールから栽培変種への既存抵抗性の導入
は、まず耐性遺伝子（複数も可）を供給源（ドナー）で
ある植物の種類中において同定することを要し、耐性遺
伝子を商業的品種の完全な遺伝子プールと結び合させな
ければならない冗長なプロセスである。この方法で生み
出された抵抗性または耐性は、多くの場合問題のウイル
スのうちの１種または数種に対してしか活性を示さな
い。また、特定種類のウイルスへの耐性に関する品種改
良による栽培変種は、農作物の種類内においてこの耐性
に関する遺伝子供給源が欠如していることにより制限さ
れることが多い。植物に対するウイルス病の影響を阻止
または低減化するための他の方法は、ウイルス媒介体に
対して作用する化学薬品または他の方法の使用、例えば
殺虫剤、殺菌剤または良好な植物衛生作用条件の使用で
ある。しかしながら、化学薬品を用いて媒介体を殺すこ
とによりウイルス病と闘う方法は、政府が強要するます
ます厳しい使用規制を受けなければならず、栽培者は、
許容された化学植物保護剤の領域の減少に直面すること
になる。

別法として、「交差防御」と呼ばれるシステムが使用
され得る。交差防御とは、植物が一ウイルス株に感染す
ることによって、第２の関連ウイルス株による重感染か
ら植物が保護される現象である。すなわち、この後記方
法では、優先的に無毒性ウイルス株を用いて植物を感染
させ、同ウイルスの毒性株による２次感染を阻止する。
しかしながら、この天然交差防御システムの使用は幾つ
かの不利益を有する。この方法は、植えられた農作物全
ての接種を必要とするため非常に面倒であり、また突然
変異の結果、前記無毒性株がさらに毒性の高い株になる
ことにより、それ自体による病気が発生するという危険
が生じる。また、ある種の植物については無毒性のウイ
ルス株が別種の植物については毒性株として作用する可
能性がある。

幾つかの研究は、防御性ウイルスのウイルスコート蛋
白質が交差防御において重要な役割を演じること、およ
び定住ウイルスおよび攻撃性ウイルスが同一または密接
に関連したコート蛋白質構造を有する場合に防御が行な
われることを示した。

遺伝子操作および植物形質転換システムの最近の進展
により、ウイルス抵抗性を生み出す新たな方法が出現し
た。遺伝子工学による交差防御は、表現型的に天然交差
防御と似ているウイルス抵抗性の一形態であるが、遺伝
子操作による植物のゲノムからのウイルスコート蛋白質
の遺伝子情報の発現により達成される。遺伝子工学によ
るウイルス抵抗性の発生に成功した最初の実験は、ビー
チー等（1985）およびアベル等（1986）により遂行され
た。彼等は、トランスジェニック植物のゲノムからタバ
コ・モザイク・ウイルス株U1（TMV−U1）コート蛋白質
遺伝子を発現させた結果、TMV株による感染後に症状の
発現が遅れることを示した。アルファルファ・モザイク
ウイルス（AMV）、ジャガイモウイルスＸ（PVX）および
キュウリ・モザイクウイルス（CMV）におけるコート蛋
白質介在防御に関しても似た結果が得られた。

TMV、CMV、AMVおよびPVXは異なるウイルス群に属する
が、それらは共通の構造を共有する。これら全てのビリ
オンにおいて、ウイルスRNAは、個々独立ではあるが同
一の多数のウイルスコート蛋白質から成るウイルスコー
トにより包膜された正鎖RNAである。

トスポウイルス（Tospovirus）は、本質的にはこれら
の植物ビリオンとは異なる。トスポウイルス属は、ブニ
ヤビリダエ（Bunyaviridae）に属する。トスポウイルス
は全てアザミウマにより伝染する。ウイルス粒子は球形
状（直径80−120nm）であり、糖蛋白質表面突起が散在
した脂質エンベロープにより囲まれた内部ヌクレオカプ
シドを含む。マルチパータイト（multipartite）ゲノム
は、陰性またはアンビセンス（ambisense）極性の線状
１本鎖RNA分子により構成される。これらのRNA分子の末
端ヌクレオチドは、5'AGAGCAAUX…………GAUUGCUCU 3'
（ここで、ＸはＣまたはＵである）という共通配列を特
徴とする。トスポウイルスの代表的構成員は、トマト・
スポッテド・ウイルトウイルス（TSWV）、およびTSWVア
イ（eye type）型としても知られているホウセンカ属
（インペイシャンズ、Impatiens）ネクローシス・スポ
ット・ウイルスである。

TSWVビリオンは、４つの異なる構成蛋白質を含む。す
なわち、29kdの内部ヌクレオカプシド蛋白質Ｎ並びに２
つの膜糖蛋白質：約78kdのG₁および約58kdのG_2oさら
に、少量の巨大蛋白質Ｌ（約260kd）がウイルス粒子か
ら検出された。TSWVのゲノムは、±2900nt（S RNA）、
±5000nt（M RNA）および±7500nt（L RNA）の３種の線
状１本鎖RNA分子により構成され、各々ヌクレオカプシ
ド蛋白質および数コピーのＬ蛋白質と堅く結合して環状
ヌクレオカプシドを形成している。TSWVビリオンの大部
分の特性を概説する概要構造を第１図に示す。これらお
よび他の特性に基づき、TSWVは、トスポウイルス群の代
表とし分類されている。さらに、TSWVは、トスポウイル
スの型構成員として考えられる。M RNAコード化遺伝子
が、直接的または間接的にG₁膜糖蛋白質の合成に関与す
ることを示唆する情況証拠のみが提示された（バークレ
イジおよびピーターズ、1983）。他のRNA分子の暗号化
特性およびゲノムRNAの極性はこの発明以前にはまだ未
知であった。

先に述べた通り、TSWVなどのトスポウイルスは、ある
種のアザミウマにより伝染する。TSWVの媒介体はスリビ
ダエ（Tripidae）科に属し、タバコ・スリップス（フラ
ンクリニエラ・フスカ（ヒンズ）、Frankliniella fusc
a（Hinds.））、ウエスタン・フラワー・スリップス
（エフ・オクシデンタリス（ペルガンテ）、F.occident
alis（Pergande））、コモン・ブロッサム・スリップス
（エフ・シュルツェイ（トリボム）、F.Schultzei（Try
bom））、チリ・スリップス（シルトスリップス・ドル
サリス（フード）、Scirtothrips dorsalis（Hoo
d））、スリップス・セトスス（モールトン）（Thrips
setosus（Moulton））、オニオン・スリップス（ティー
・タバシ（リンデマン）、T.tabaci（Lindeman））、エ
フ・イントンサ（F.intonsa）およびティー・パルミ
（T.palmi）を含む。アザミウマは、それらの幼虫期中
にのみウイルスを獲得する。幼虫は、それらがふ化する
前にウイルスを伝染させ得るが、より一般的には成虫が
ウイルスを伝染させる。成虫は、寿命のある間終始感染
性を残し得る。

TSWVは、今や全ての大陸全土にわたって分布している
ため、最も広く分布した植物ウイルスの一つとなってい
る。このウイルスは、世界中の温帯、亜熱帯および熱帯
気候領域に広まっている。単子葉植物および双子葉植物
の両方を含め、50科の植物を代表する少なくとも370種
の植物が自然感染している。TSWVは、食物および鑑賞作
物の生産に深刻な影響を与える。植物がTSWV株により感
染すると、一般に例えば発育阻害、論紋、暗紫色−褐色
の窪んだ斑点、茎の褐変、花の亀裂、壊死および色素病
変およびパターン、黄色および非壊死的斑点、緑葉にお
けるモザイクが現れるか、さらに植物全体の死に至る。
大部分の宿主はこれらの兆候の一部しか呈しない。TSWV
により生じる広範な兆候は診断を複雑にするため、個々
の病気に幾つかの異なる名称が与えられてしまう。ま
た、同種の植物内におけるTSWV兆候は、植物の年齢、植
物の生活環中における感染時間、栄養レベルおよび環境
条件、特に温度により異なり得る。

TSWVは何年も前から知られており、広く分布し、農作
物および鑑賞植物において経済的に重大な病気を誘発し
ているが、TSWV耐性遺伝子の供給源の同定における進歩
は限られている。多遺伝子TSWV耐性はリコペルシコン・
ペルビアヌム（Lycopersicon peruvianum）において同
定されたが、この耐性はまだ品種改良されたトマトには
導入されておらず、他の種類の作物に関する耐性供給源
も同定されてはいない。天然交差防御システムを用いて
きついTSWV株による損害を減少させる方法についてあま
り詳しくは記録されていない。限られた陽性結果は、ト
マトおよびレタスについて報告されている。

従って、遺伝子操作手段によりトスポウイルス感染に
対する耐性を与える遺伝情報を植物遺伝子プールへ導入
することにより、品種改良家および栽培者にトスポウイ
ルス病と闘う新たな方法が提供される。

［発明の構成］この発明は、ａ）トスポウイルスのRNA配列またはそれに相同的なRNA
配列、ｂ）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コドン
（すなわち、同じアミノ酸または終止シグナルに対応す
るコドン）により置換されている、トスポウイルス蛋白
質をコードするａ）記載のRNA配列、またはその一部
分、またはそれに相同的なRNA配列、ｃ）ａ）またはｂ）記載のRNA配列に相補的なRNA配列への転写をコードするDNA配列を含み、前記DNAが植物に
おいて機能するプロモーターの発現制御下におかれ、植
物において機能するターミネーターを有するものであ
る、組換えDNA構築物を提供する。

便宜上、上記ａ）、ｂ）およびｃ）記載のDNA配列を
以後「TSWV関連DNA配列」と称する。所望ならば、この
発明によるTSWV関連DNA配列を修飾することにより、こ
の配列に相同的な突然変異体または修飾配列が作成され
得、それらは当業界の熟練者に周知の方法、例えば部位
突然変異を用いてTSWV関連DNA配列から誘導される。従
って、それらの突然変異体または修飾暗号化配列は、こ
の発明の意図および範囲内に含まれる。

トスポウイルスのRNA配列という語は、トスポウイル
スのＳ、ＭまたはL RNA鎖、特にＳまたはL RNA鎖、好ま
しくはS RNA鎖の配列を意味する。

トスポウイルスのRNA配列に相同的なRNA配列という語
は、若干のヌクレオチドが欠失および／または付加され
ているが、まだ適当なハイブリダイゼーション条件下に
おいてトスポウイルスのRNA配列に相補的なヌクレオチ
ド配列とハイブリダイゼーションし得るトスポウイルス
のRNA配列を意味する。この発明の目的において、適当
なハイブリダイゼーション条件としては、好都合には５
×標準食塩水くえん酸（SSC）、0.5％ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）、５×デンハード溶液、50％ホルムアミ
ドおよび100μg/m担体DNAを含む緩衝系（以後、緩衝
系と称す）中16時間42℃でインキュベーションし、次い
で65℃で毎回約１時間１×SSCおよび0.1％SDSを含む緩
衝液により３回洗浄する。

この発明の目的に関して好ましいハイブリダイゼーシ
ョン条件では、緩衝系中49℃で16時間インキュベーショ
ンし、55℃で毎回約１時間0.1×SSCおよび0.1％SDSを含
む緩衝液により３回洗浄する。この発明の目的において
最も好ましいハイブリダイゼーション条件では、緩衝系
中で55℃で16時間インキュベーションし、65℃で毎回約
１時間0.1×SSCおよび0.1％SDSを含む緩衝液により３回
洗浄する。

TSWV関連DNA配列の長さは、後の記載から明らかな通
り、特に従う予定の特定戦略により異なる。一般に、TS
WV関連DNA配列は少なくとも20個、好適には50個または
それ以上のヌクレオチドを含むのが望ましい。

この明細書で使用されているプロモーターという語
は、mRNAのリーダー配列（レーダー配列は、リボソーム
結合部位を含み、AUG出発コドンから翻訳を開始する）
をコードする領域を含む転写に必要とされる全調節領域
を含む、転写出発部位から上流のヌクレオチド配列を包
含する。

この発明のDNA構築物での使用に適したプロモーター
の例には、植物細胞において機能するウイルス、真菌、
動物および植物誘導性プロモーターがある。プロモータ
ーは、構成的または差次的にDNAを発現し得る。DNA発現
を差次的に調節するプロモーターの適当な例は、病気媒
介体、例えばアザミウマにより誘導され得るプロモータ
ー、例えばいわゆる創傷誘導性プロモーターである。使
用されるプロモーターは、形質転換植物のトスポウイル
ス感受性の低減化に必要なRNAの量を生産させるのに充
分な割合でTSWV関連DNA配列の発現を誘発すべきである
ものとする。転写されるRNAの必要量は、関与する植物
の型により異なり得る。特に好ましいプロモーターに
は、カリフラワー・モザイク・ウイルス35S（CaMV35S）
プロモーター、その誘導体、および病気媒介体、例えば
アザミウマによる創傷後に誘導され得るプロモーター、
例えば創傷誘導性プロモーターがある。

この明細書で使用されているターミネーターという語
は、転写の終結を表示する転写単位の最後のDNA配列を
意味する。ターミネーターは、ポリアデニル化シグナル
を含むDNA3'−非翻訳配列であり、ポリアデニル化配列
を１次転写物の3'−末端に付加させる。植物細胞におい
て活性を示すターミネーターは公知であり、文献に記載
されている。それらは、例えば細菌、真菌、ウイルス、
動物および植物から単離され得る。この発明のDNA構築
物における使用に特に適したターミネーターの例は、エ
ー・ツメファシエンス（A.tumefaciens）のノパリン・
シンターゼ・ターミネーター、CaMVの35Sターミネータ
ーおよびゼア・メイス（Zea mays）由来のゼイン・ター
ミネーターである。

この明細書で使用されている用語法によると、RNA配
列は、適当なハイブリダイゼーション条件（上記）下で
の塩基対合律に従い、それが別のRNA配列との水素結合
複合体を結合し得る場合、そのRNA配列に相補的であ
る。

この発明はまた、植物中にこの発明のDNA構築物を導
入させ得るベクターおよび前記ベクターの製造方法を提
供する。

この明細書で使用されているベクターという語は、そ
のDNAフラグメントが宿主生物に組み込まれ得る手段に
よる媒体を包含する。

植物という語は、この明細書では広い意味で使用され
ており、適当な条件下で成熟植物、その子孫およびその
一部分、例えば前記植物の伐採物および果実に発展し得
る分化植物および非分化植物素材、例えばプロトプラス
ト、植物細胞、種子、苗木等を包含する。

さらに、この発明は、ゲノムにこの発明のDNA構築物
を含む植物、および前記植物の製造方法を提供する。

この発明による植物は、トスポウイルスにより誘導さ
れる疾患に対する感受性が低く、上述の古典的方法によ
り得られる植物の不利点および限界をもたない。

トスポウイルス、例えばTSWVに対して感受性を示す植
物の例には、アゲラツム（Ageratum）、アルファルフ
ァ、ヒユ属（Amaranthus）、アンシリヌム（Anthirrhin
um）、アキレギア（Aquilegia）、ナス、ビート、ベコ
ニア（Begonia）、ソラマメ、ブロッコリ、芽キャベ
ツ、キャベル、カリフラワー、セロリ、チコリ、キク属
（Chrysanthemum）、シネラリア（Cineraria）、クロー
バー、コスモス（Cosmos）、ササゲ、キュウリ、シクラ
メン、ダリア（Dahlia）、チョウセンアサガオ属（Datu
ra）、デルフィニューム属（Delphinium）、エンダイ
ブ、ガーベラ（Gerbera）、グラジオラス（Gladiolu
s）、オオイワギリソウ（Gloxinia）、ヒョウタン、ア
メリカホドイモ（groundnut）、ヒッペアストラム属（H
ippeastrum）、ホウセンカ属（Impatiens）、レタス、
メロン、メセンブリアンテマ（Mesembryanthemum）、玉
ねぎ、パパイヤ、エンドウ、落花生、コショウ、ペチュ
ニア、パイナップル、ジャガイモ、プリムラ（Primul
a）、セントポーリア（Saint Paulia）、サフラワー、
サルピグロッシス属（Salpiglossis）、さや豆、大豆、
ホウレンソウ、カボチャ、テンサイ、ヒマワリ、マンジ
ュギク属（Tagetes）、タバコ、トマト、バーベナ属（V
erbena）、ツルニチニチソウ属（Vinca）、スイカ、百
日草（Zinnia）があるが、これらに限定されるわけでは
ない。この発明は、特に植物ゲノム中にこの発明のDNA
構築物を含むこれらの列挙された植物に関するものであ
る。

TSWVはトスポウイルスのタイプメンバーであるため、
以下、トスポウイルスの詳しい特徴を、一例としてTSWV
を用いることにより説明を行う。

Ｓ、ＭおよびL RNAは１本鎖RNA分子である。S RNAは
約2900ヌクレオチド長であって２個の遺伝子を含み、そ
の一方はウイルス・センスで非構造的蛋白質（NSs）を
コードし、他方はウイルス相補的センスでヌクレオカプ
シド蛋白質（Ｎ）をコードする。NSs−およびＮ−遺伝
子間の遺伝子間領域は、ヘアピン構造に折り畳まれ得
る。S RNAの5'−および3'−末端配列は、最初のヌクレ
オチドが前記S RNA鎖の最後のヌクレオチドの反対に
（および相補的に）なる形で互いにハイブリダイゼーシ
ョンし得る。以後、両RNA末端のハイブリダイゼーショ
ンにより得られる２本鎖構造を便宜上「パン−ハンド
ル」と称する。

M RNA鎖は約5000ヌクレオチドを有する。それは、ウ
イルス相補的センスで１つの長い転写解読枠を含む。こ
の転写解読枠は、形成期ポリペプチド鎖が共翻訳的に開
裂されて各々スパイク蛋白質G₁およびG₂が形成される小
胞体に位置するポリソームにおいて翻訳される。S RNA
と同様に、M RNA鎖の末端は、互いに相補的であり、同
じくハイブリダイゼーションすることにより「パン−ハ
ンドル」を形成し得る。

L RNA鎖は約7500ヌクレオチドを有し、ウイルス相補
的センスで１つの転写解読枠を含む。この転写解読枠
は、恐らく約260kdの推定分子量を有するウイルス転写
酵素をコードする遺伝子と一致すると思われる。突然変
異株の中には、野生型完全長L RNAに加えて短いL RNA分
子が見出される場合もある。しかしながら、これらの短
いL RNAは、常に特徴的な末端ヌクレオチド配列を有す
るとは限らないため、「パン−ハンドル」構造を形成し
得る。それらはまた、ヌクレオカプシド蛋白質により包
膜され、ウイルス粒子に含まれる。それらの存在が兆候
の発現を抑制する結果、深刻で有害な影響は低下する。
従って、これらの短いL RNA分子は、当業界の熟練者に
周知の用語である欠損干渉性（DI）RNAとして見なされ
得る。

この発明の好ましい態様は、「パン−ハンドル」のト
スポウイルス−RNA配列またはそれに相同的なトスポウ
イルス−RNA配列への転写をコードするこの発明のDNA構
築物に関するものである。

この発明の別の好ましい態様は、ウイルス相補的セン
スでの（すなわち、陰性極性を有する）転写解読枠のト
スポウイルス−RNA配列、または１個もしくはそれ以上
のコドンがそれらの同義コドンにより置換された対応す
るRNA配列、またはそれらに相同的なRNA配列への転写を
コードするこの発明のDNA構築物に関するものである。

この発明のさらに別の好ましい態様は、ヘアピンのト
スポウイルス−RNA配列またはそれに相同的なRNA配列へ
の転写をコードするこの発明のDNA構築物に関するもの
である。

好ましくは、上記トスポウイルス−RNA配列は、少な
くとも20個、さらに好ましくは少なくとも50個のヌクレ
オチドを有する。

この発明による使用に適したDNA構築物の例として
は、下記配列への転写をコードするTSWV関連DNA配列が
ある（S RNAヌクレオチド配列については第４図、M RNA
ヌクレオチド配列については第6A図およびL RNAヌクレ
オチド配列については第6B図を参照）。

ｉ） S RNAヌクレオチド配列１〜2915、 ii） S RNAヌクレオチド配列89〜1483、 iii） S RNAヘアピン、 iv） S RNA「パン−ハンドル」、ｖ） S RNAヌクレオチド配列2763〜1987、 vi） L RNAヌクレオチド配列4462〜１、 vii） L RNAヌクレオチド配列41〜２、 viii） L RNAヌクレオチド配列3980〜46、 ix） L RNAヌクレオチド配列（6706＋ｎ）〜（4462＋
ｎ）（ここで、ｎは、第6B図に示されたヌクレオチド44
62（Ｕ）およびその後に示されたヌクレオチド（Ｃ）間
のギャップのヌクレオチドの数である）、ｘ） L RNAヌクレオチド配列（6706＋ｎ）〜（6016＋
ｎ）（ここで、ｎは上記の意味を有する）、 xi） L RNA「パン−ハンドル」、 xii） S RNAヌクレオチド配列1987〜2763に相補的なRN
A配列、 xiii） S RNAヌクレオチド配列89〜1483に相補的なRNA
配列、 xiv） L RNAヌクレオチド配列１〜4462に相補的なRNA
配列、 xv） L RNAヌクレオチド配列２〜41に相補的なRNA配
列、 xvi） L RNAヌクレオチド配列46〜3980に相補的なRNA
配列、 xvii） L RNAヌクレオチド配列（4462＋ｎ）〜（6706
＋ｎ）に相補的なRNA配列（ただし、ｎは上記の意味を
有する）、 xviii） L RNAヌクレオチド配列（6016＋ｎ）〜（6706
＋ｎ）に相補的なRNA配列（ただし、ｎは上記の意
味）、 xiv）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コ
ドンにより置換されている、S RNAヌクレオチド配列89
〜1483、 xx）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コド
ンにより置換されている、S RNAヌクレオチド配列2763
〜1987、 xxi）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コ
ドンにより置換されている、L RNAヌクレオチド配列398
0〜236、 xxii）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コ
ドンにより置換されている、L RNAヌクレオチド配列446
2〜236、 xxiii）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義
コドンにより置換されている、L RNAヌクレオチド配列
（6672＋ｎ）〜（4462＋ｎ）（ただし、ｎは上記の意
味）、 xxiv）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コ
ドンにより置換されている、L RNAヌクレオチド配列（6
672＋ｎ）〜（6016＋ｎ）（ただし、ｎは上記の意
味）、 xxv） M RNAヌクレオチド配列（ｍ−574）〜ｍ（ここ
で、ｍは、M RNAのヌクレオチドの総数を示す）、 xxvi） M RNAヌクレオチド配列（ｍ−574）〜ｍ（ただ
し、ｍは上記の意味）に相補的なRNA配列、 xxvii）上記ｉ）〜xviii）、xxv）またはxxvi）項記
載のヌクレオチド配列に相同的なRNA配列、 xxviii）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義
コドンにより置換されている、M RNAヌクレオチド配列
（ｍ−26）〜（ｍ−574）（ただし、ｍは上記の意
味）、 xxix）上記ｉ）〜xxviii）項記載のDNA配列のフラグ
メント。

好ましいTSWV関連DNA配列は、上記ii）、iii）、i
v）、ｖ）、viii）、ix）またはxi）によるRNA配列、ま
たはそれらに相同的なRNA配列、または少なくとも20
個、さらに好ましくは50個のヌクレオチドを含むそれら
のフラグメントへの転写をコードする。

この発明の別の好ましい態様によると、この発明のDN
A構築物は、ウイルスＳ、ＭまたはＬの各RNA、さらに好
ましくはＳまたはL RNA、特にS RNAの5'および3'末端配
列の組み合わせへの転写をコードするTSWV関連DNA配列
を含む。

さらにこの発明は、トスポウイルス、例えばTSWVによ
る感染が疑われる植物を診断するためのプローブを提供
する。それらのプローブは、トスポウイルス、例えばTS
WVのRNA配列に相補的な（相補的という語の定義につい
ては上記参照）標識オリゴヌクレオチド（RNAまたはDN
A）配列を含む。配列の望ましい長さおよびプローブの
診断的用途に関する適当な方法は、当業界の熟練者には
公知のものである。適当なプローブは、好都合にはトス
ポウイルス、例えばTSWVのRNA配列に相補的な、少なく
とも15個、好ましくは30個より大、さらに好ましくは約
400〜600個のヌクレオチドを含む。

この発明によるプローブは、当業界の熟練者がそれら
を用いることにより、例えば病気の兆候が完全に発現す
る前の診断を目的として、感染した植物におけるトスポ
ウイルスRNAまたはその一部分の同定が可能になる点で
有用である。

従って、この発明はまた、ドット−ブロット・タイプ
検定においてこの発明のプローブを用いることによりト
スポウイルス複製型を検出することを含む、植物におけ
るトスポウイルス感染を測定する診断的方法を提供す
る。

この発明によるプローブは、当業界の熟練者がそれら
を用いることにより、トスポウイルスのRNA配列に対応
するDNA配列を含むキメラ遺伝子を構築し、使用するこ
とが可能になる点で有用である。

この発明のDNA構築物は、適当な発現ベクターにTSWV
関連DNA配列を挿入することにより得られ、その場合、
それは植物において機能するプロモーターの発現制御下
で行なわれ、その転写はターミネーターにより終結され
る。

ここで使用されている適当な発現ベクターという語
は、植物細胞において機能するプロモーターおよびター
ミネーターを含むベクターを指す。

適当な発現ベクターへのTSWV関連DNA配列の挿入は、
自体公知の方法で行なわれ得る。また、適当な方法は後
記実施例で説明されている。

同様に、適当な発現ベクターの構築は、自体公知の方
法で行なわれ得る。

この発明による植物は、ａ）植物細胞のゲノム中にこの発明によるDNA構築物を
挿入し、ｂ）形質転換細胞を得、そしてｃ）形質転換細胞から遺伝子的に形質転換された植物を
再生させることにより製造され得る。

この発明のDNAベクターは、TSWV感染に感受性のある
植物の植物ゲノム中に挿入され得る。前記植物形質転換
は、植物の形質転換に関する自体公知の技術、例えばア
グロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium
tumefaciens）、エー・リゾゲネス（A.rhizogenes）か
ら誘導されたTiプラスミドまたはその修飾体を含む植物
形質転換技術、単離された植物細胞または組織された植
物構造の裸のDNA形質転換またはエレクトロポレーショ
ン、DNAを送達するためのマイクロ−発射体の使用、レ
ーザー・システム、リポソーム、または形質転換ベクタ
ーとしてのウイルスもしくは花粉の使用などの技術を用
いて実施され得る。

この発明の植物は、当業界で公知の方法、例えばノー
ザン分析、サザーン分析、PCR技術および／または免疫
学的技術によりTSWV関連DNA配列の発現についてモニタ
ーされ得る。この発明の植物は、病気徴候の割合が接種
物におけるTSWV濃度と一次的に相関する範囲の濃度で優
先的に前記植物をTSWVに暴露する試験により立証された
通り、TSWV感染に対して低い感受性を示す。

TSWV接種に適した方法は当業界において公知であり、
機械的接種および特に適当なベクターの使用が含まれ
る。

勿論、この発明の植物はまた、この発明に従って得ら
れた植物を別の植物と交差させて、植物ゲノム中にこの
発明のDNA構築物を有する植物を生成させることにより
得られる。

以下、非限定的実施例および添付図面によりこの発明
について説明する。

第１図は、トマト・スポッテド・ウイルトウイルスの
構造の概観を示す。

第２図は、TSWV S RNAに使用されるクローニング戦略
の概略を示す。

第３図は、TSWV L RNAに使用されるクローニング戦略
の概略を示す。

第４図は、TSWV S RNAの配列およびゲノム組織を示
す。非構造蛋白質NSsのアミノ酸配列（89−1483）は上
に表示され、ヌクレオカプシド蛋白質Ｎ（2763−1987）
のアミノ酸配列は対応するRNAヌクレオチド配列の下に
表示されている。

第５図は、S RNA（第5A図）およびL RNA（第5B図）の
全解読枠に関する翻訳開始および終止コドンの分布を示
す。太い棒線は停止コドンを示し、細い棒線はATG出発
コドンを示す。

第６図は、現在までに解明されたTSWV MRNA（第6A
図）およびL RNA（第6B図）のヌクレオチド配列を示
す。

第７図は、適当な発現ベクター（pZU−Ａ）の構築の
概略図を示す。

第８図は、適当な発現ベクター（pZU−Ｂ）の構築の
概略図を示す。

第９図は、ヌクレオカプシドＮ蛋白質遺伝子を含む適
当なプラスミド（pTSWV−Ｎ）の構築の概略図を示す。

第10図は、ヌクレオカプシドNSs−蛋白質遺伝子を含
む適当なプラスミド（pTSWV−NSs）の構築の概略図を示
す。

第11図は、この発明によるDNA構築物、植物形質転換
ベクターpTSWV−NABの構築の図解例を示す。

第12図は、この発明によるDNA構築物、植物形質転換
ベクターpTSWV−NmutBBの構築の図解例を示す。

第13図は、この発明によるDNA構築物、植物形質転換
ベクターpTSWV−NSsABの構築の図解例を示す。

第14図は、この発明によるDNA構築物、植物形質転換
ベクターpTSWV−NSsmutBBの構築の図解例を示す。

第15図は、TSWV S RNAの「パン−ハンドル」領域を示
す。

第16図は、TSWV S RNAのヘアピン領域を示す。

第17図は、被疑植物のドット・ブロット分析を示す。

S RNAまたはそれに相同的なRNA配列のヘアピン構造の
配列への転写をコードする好ましいTSWV関連DNA配列の
適当な例は、S RNAの1583−1708ヌクレオチド配列、S R
NAの1709−1835ヌクレオチド配列、S RNAの1583−1835
ヌクレオチド配列またはそれらの配列に相同的な配列を
コードする配列である。

S RNAまたはそれに相同的なRNA配列の「パン−ハンド
ル」領域の配列への転写をコードする好ましいTSWV関連
DNA配列の適当な例は、S RNAの１−70および2850−2916
ヌクレオチド配列またはそれらの配列に相同的な配列を
コードする配列の組み合わせである。

L RNAまたはそれに相同的なRNA配列の「パン−ハンド
ル」領域への転写をコードする好ましいTSWV関連DNA配
列の適当な例は、ウイルスL RNAの5'−末端から最初の8
0、特に最初の65ヌクレオチドおよびウイルスL RNAの3'
−末端から最後の80、特に最後の65ヌクレオチド、また
は上記配列に相同的な配列またはそれらの誘導体をコー
ドする配列の組み合わせである。

この発明の他の目的、特徴、利点は下記実施例から明
白になる。

参考文献は省略して最初の著者名だけとし、参考文献
の詳細は後で列挙する。

（原材料および方法）ここに示されたTSWV RNA誘導配列は全て、単に一律性
のみを目的としたDNA配列として描かれている。当技術
分野に精通しておれば、これは便宜上為されたものに過
ぎないことは明白である。

植物形質転換試験で使用されるニコチアナ・タバクム
（Nicotiana tabacum）およびペチュニア・ヒブリダ（P
etunia hybrida）の栽培変種を標準温室条件下で育て
る。適当な植物ホルモンおよびしょ糖濃縮物を含む標準
MS培地（ムシラゲおよびスクーグ、1962）上で、無菌外
植体を育てる。

エシェリヒア・コリ（E.coli）菌を、標準LB−培地中
37℃で回転震とう器上において培養する。アグロバクテ
リウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）株を、0.1％グルコースを補ったMinA培地（アウスベ
ル等、1987）中28℃で培養する。

全クローニング方法において、エシェリヒア・コリ株
JM83、（Ｆ−、Δ（lac−pro）、ara、rpsL、φ80、dla
cZM15）を、組換えプラスミドの受容体として使用す
る。

バイナリーベクターを、ヘルパー株としてプラスミド
pRK2013を含む、エシェリヒア・コリHB101を用いた標準
３親交配においてTi−プラスミドvir領域を含む株（ホ
エケマ等、1983）、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス株LBA4404にコンジュゲートする。（フィグルスキ
ーおよびヘリンスキー、1979）。適当なアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス受容体が、リファンピシン（50
μg/m）およびカナマイシン（50μg/m）を含む培地
から選択される。

ベクターpUC19（ヤニシュ−ペロン等、1985）、pBlue
script（ストラタジーン）、pBIN19（ベバン等、1984）
または誘導体におけるフラグメントのクローニング、DN
Aの制限酵素分析、エシェリヒア・コリ受容体への形質
転換、小および大規模でのプラスミドDNAの単離、ニッ
ク翻訳、インビトロ転写、DNA配列決定、サザーン・ブ
ロッティングおよびDNAゲル電気泳動は、標準的方法に
従い行なわれる（マニアチス等、1982、アウスベル等、
1987）。

［実施例］実施例１ TSWV粒子およびそこに存在する遺伝物質の単離。

トマト・スポッテド・ウィルトウイルス株CPNH1とい
うトマトからのブラジル産分離株を、移植によりトマト
上で維持する。本質的にタス等（1977）の記載に従って
機械的接種をした後、全体的に感染したニコチアナ・ル
スティカ（Nicotiana rustica）の葉からウイルスを精
製する。この単離方法において使用される全物質を４℃
で維持することが不可欠である。12日後、100グラムの
感染した葉の接種物を採取し、ワーリング・ブレンダー
において５倍容量の抽出緩衝液（0.1モルNaH₂PO₄、0.01
モルNa₂SO₃、pH7）中、低速度設定で５−10秒間粉砕す
る。懸濁液をチーズクロスによりろ過し、ろ液を16000
×ｇで10分間遠心分離する。生成した沈澱物を、３倍容
量の再懸濁緩衝液（0.01モルNaH₂PO₄、0.01モルNa₂S
O₃、pH7）に再懸濁する。沈澱物を４℃で注意深く撹は
んしながら溶かす。12500×ｇで10分間遠心分離後、沈
澱物を捨て、上清を再び50000×ｇで20分間遠心分離す
る。沈澱物を0.2容量の再懸濁緩衝液（0.01モルNaH₂P
O₄、0.01モルNa₂SO₃、pH7）に再懸濁し、氷上で30分間
保つ。非感染ニコチアナ・ルスティカからの物質に対し
ウサギにおいて生じた抗血清を前記溶液に加え、１時間
注意深く撹はんし、16000×ｇで10分間の遠心分離によ
り非ウイルス性複合体を沈澱させる。澄んだ上清を、再
懸濁緩衝液（0.01モルNaH₂PO₄、0.01モルNa₂SO₃、pH7）
中一次５−40％しょ糖勾配上に載せ、95000×ｇで45分
間回転させる。TSWVビリオンを含むオパールのような光
彩を発する帯を注射器により注意深く集め、再懸濁緩衝
液で４回洗浄する。洗浄したビリオンを21000×ｇで1.5
時間の遠心分離により沈澱させ、１容量の再懸濁緩衝液
に再懸濁する。一般的に、100グラムの葉材料から、約
0.5mgのTSWVビリオンが得られる。SDS−フェノール抽
出、次いでエタノール沈澱によりTSWV RNAを精製ウイル
ス標本から優先的に回収する。1mgのTSWVから１−５μ
ｇのRNAが抽出される。単離されたRNA分子の無傷状況を
アガロース・ゲル電気泳動により分析する。各々2900ヌ
クレオチド（S RNA）、5000ヌクレオチド（M RNA）およ
び7500ヌクレオチド（L RNA）の見かけ上のサイズを有
する３つの異なるRNA分子が同定される。

実施例２ TSWVウイルスRNAの3'−末端の配列決定。

直接RNA配列決定を行うため、本質的にバークレイジ
等（1983）に従い、TSWV RNAを精製ヌクレオカプシドか
ら抽出する。接種の12日後、感染した葉100グラムを採
取し、ワーリング・ブレンダーにおいて４倍容量のTAS
−Ｅ緩衝液（0.01モルEDTA、0.01モルNa₂SO₃、0.1％シ
ステイン、0.1モルトリス、pH8）中に、低速度設定で
５−10秒間粉砕する。懸濁液をチーズクロスによりろ過
し、1100×ｇで10分間遠心分離する。66000×ｇで30分
間の遠心分離によりヌクレオカプシドをこの上清から回
収する。沈澱物を１容量のTAS−Ｒ緩衝液（１％ノニデ
ットNP−40、0.01モルEDTA、0.01モルNa₂SO₃、0.1％シ
ステイン、0.01モルグリシン、0.01モルトリス、pH
7.9）に注意深く再懸濁する。沈澱物を、４℃で30分間
注意深く撹はんすることにより溶かす。16000×ｇで10
分間の遠心分離により上清を透明にする。105000×ｇで
１時間30％しょ糖緩衝剤による沈降により、粗ヌクレオ
カプシドを透明上清から集める。ヌクレオカプシド沈澱
物を400μの0.01モルNaくえん酸、pH6.5に再懸濁し、
20−40％しょ糖（0.01モルNa−くえん酸pH6.5中）上で
層状に重ね、280000×ｇで２時間回転させる。３つの異
なるオパールのような光彩を発する帯である、Ｌ、Ｍお
よびＳの各ヌクレオカプシドを別々に集める。SDS−フ
ェノール抽出、次いでエタノール沈澱により、TSWV RNA
を精製ヌクレオカプシド標本から優先的に回収する。常
用の手順により、100グラムの感染した葉から100μｇの
RNAが得られる。RNAリガーゼおよび5'−［³²P］pCpを用
いて、個々のTSWV RNAの3'−末端を標識する。これらの
末端標識RNA分子を、低ゲル化温度アガロースゲル（ビ
ースランダー、1979）上で分離する。クラークス−バン
・ハースターおよびビショップ（1980）およびクラーク
ス−バン・ハースター等（1982）により記載された酵素
的方法を用いて、ＳおよびＭの両RNAの3'−および5'−
末端の30末端ヌクレオチドを決定する。

市販されているシステム（アプライド・バイオシステ
ムズ）を用いて、3'−末端に相補的な合成オリゴヌクレ
オチドを合成し、逆転写酵素によるジデオキシ−配列決
定に使用する。

実施例３ TSWV遺伝物質のcDNAクローニング。

ＳおよびL RNAの3'−末端に相補的なオリゴヌクレオ
チドを、第１鎖cDNA合成のプライミングに使用する。原
則としてグプラーおよびホフマン（1983）に従い、これ
らのプライマーを用いて、２本鎖DNAがTSWV RNAに合成
される。２つの異なる方法を用いて、TSWVウイルスRNA
に対するcDNAクローンを生成される。分断化１本鎖うし
胸腺DNAを用いたTSWV RNAのランダム・プライミング、
次いで第１および第２鎖cDNA合成により第１シリーズの
クローンが得らせる。T4−DNAポリメラーゼを用いてcDN
Aをブランド末端にし、T4リガーゼによりpUC19のSma I
部位にライゲーションする。TSWV RNAの3'−末端におけ
る20個の末端ヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチ
ドで第１鎖DNA合成をプライミングすることにより、第
２シリーズのTSWV cDNAクローンが得られる。第２の鎖
合成、T4 DNAポリメラーゼで処理してブランド端を作
成後、本質的にヒュイン等（1985）に従い、燐酸化EcoR
IリンカーをcDNAの末端にライゲーションする。EcoR I
によりこれらのcDNA分子を制限した後、cDNAフラグメン
トをラムダgt10のEcoR I部位においてライゲーションす
る。本質的に、プローブとして［³²］Ｐ−標識無作為に
プライムした第１鎖cDNAを用いたグルンスタインおよび
ホグネス（1975）の方法に従い、ウイルス挿入体を含む
両シリーズからのcDNAクローンをコロニー・ハイブリダ
イゼーションにより選別する。サザーン分析、次いでプ
ラスミドおよび／またはファージ・ウォーキングによ
り、部分重複するcDNAクローンのセットを選別すること
により、Ｓ（第２図）およびL RNA（第３図）のcDNA誘
導配列に基づいた制限地図を構築する。

実施例４ TSWV S、ＭおよびL RNAの配列決定。

S RNAの配列を決定するため、選別された４つのcDNA
クローンをM13mp18においてサブクローニングすると、
上記の通り、プラスミドpS614、pS608、pS520およびpS5
14が得られる（第２図）。ヤニシュ−ペロン等（1985）
の標準プロトコルを用いて、これらのクローンを両方向
で配列決定する。S RNAの3'−末端のヌクレオチド配列
を、3'−末端の20ヌクレオチドに相補的な合成オリゴヌ
クレオチドS1（5'd（GAGCAATCGTGTCAATTTTG））のプラ
イマー伸長により決定する。ウイルスS RNAの5'−末端
からヌクレオチド30〜50に相補的な第２合成ヌクレオチ
ドS3を用いて、S RNAの5'−末端配列をプライマー伸長
により証明する。TSWV S RNA（2916nt）からの配列デー
タを第４図に要約する。

ウイルス鎖およびウイルス相補鎖における６つの異な
る解読枠をコンピューターでシミュレーション翻訳する
と、２つの推定されている転写解読枠の存在が示される
（第5A図参照）。ウイルス鎖において、恐らく分子量5
2.4kdの464アミノ酸から成る蛋白質をコードすると思わ
れる。89位から始まり、1483位のUAA停止コドンで終わ
る転写解読枠が見出される。この蛋白質は、恐らく仮に
NSsと命名された非構造蛋白質であると思われる。他の
転写解読法は、2763〜1987位のウイルス相補鎖に位置
し、分子量28.8kdを有する258アミノ酸長のポリペプチ
ドをコードする。この転写解読枠は、恐らくウイルス・
ヌクレオカプシド蛋白質Ｎをコードすると思われる。

この仮定を証明するため、複製ヌクレオカプシド蛋白
質のアミノ酸組成を測定し、配列データから誘導された
組成と比較する。また、推定されているヌクレオカプシ
ド暗号化Ｎ蛋白質遺伝子をpBluescriptに挿入する。T7
RNAポリメラーゼを用いて、Ｎ蛋白質遺伝子をインイト
ロ転写する。続いて、このインビトロ合成転写物を、［
³⁵S］標識メチオニンの存在下インビトロうさぎ網状赤
血球リゼイト（ニューイングランド・ヌクリアー:NEN）
システムにおいて翻訳する（NEN）。本質的に上述した
方法（バン・グリスベン等、1986）に従い、精製ヌクレ
オカプシド蛋白質に対して産生した抗体を使用すると、
天然ヌクレオカプシド蛋白質と同じ分子量を有する蛋白
質が合成放射性蛋白質から沈澱し得る。これは、Ｎ蛋白
質遺伝子がウイルス・ヌクレオカプシド蛋白質をコード
することを示す。第5A図は、各々NSsおよびＮ蛋白質遺
伝子を示す。S RNAのウイルス性およびウイルス性相補
鎖の暗号化能力を示し、両遺伝子はサブゲノムmRNAから
発現される。すなわち、植物ウイルスRNAがアンビセン
ス遺伝子配列を有するという特有の状況が生じる。この
S RNA配列の他の重要な特徴は、いわゆる「パン−ハン
ドル」構造を形成し得る相補的末端反復の存在である。
これらの構造は、ウイルスRNAの複製および転写におい
て重要な役割を演じる。別の推定的調節要素は、S RNA
の遺伝子間領域におけるヘアピン構造であり、恐らく各
々ＮおよびNSs−蛋白質をコードする、両サブゲノムmRN
Aに関する転写終結シグナルを含むと思われる。

同じ戦略および方法を用いてS RNAのヌクレオチド配
列を測定することにより、TSWV MおよびL RNAのヌクレ
オチド配列が解明された。第３図は、L RAN誘導部分重
複cDNAクローンに関するクローニング戦略を示す。TSWV
MおよびL RNAの要約した配列データを各々第6A図およ
び第6B図に示す。コンピューターでシミュレーションし
た翻訳は、このウイルスL RNAが、ウイルスRNAの3'−末
端から34のヌクレオチドより出発し、ウイルスRNAの5'
−末端からヌクレオチド236で止まる単一転写解読枠を
含む陰性極性を有することを示唆している（第5B図）。
恐らくこの転写解読枠を含むmRNA（ウイルスL RNAに相
補的）は、ウイルス転写酵素に翻訳されると思われる。

実施例５発現ベクターpZU−Ａの構築。

35Sカリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）プロ
モーター・フラグメントを、組換えプラスミドpZO27、
すなわち444bpHind III−Pst IフラグメントとしてCaMV
株のCabb−Ｓの35SプロモーターのHinc II−Hph I領域
を含むpUC19の誘導体から単離する（フランク等、198
0）。CaMV株のヌクレオチド配列は、異なる株の場合と
非常に似ている。ポリリンカー領域の一部分、非転写領
域の437bp、転写開始部位および非翻訳リーダー領域の7
bpは含むが、35S翻訳イニシエーターは一切含まない472
bpEcoR I−Pst Iフラグメントとして、pZO27から35Sプ
ロモーター・フラグメントを削り取る。この35Sプロモ
ーター・フラグメントを、T4リガーゼを用いてEcoR I−
Pst I線状化pZO008にライゲーションする。このプラス
ミドpZO008は、270bpPst I−Hind IIIフラグメントとし
てノパリン・シンターゼ（NOS）ターミネーターをも
つ。生成した組換えプラスミドpZU−Ａは、35Sプロモー
ター、特有のPst I部位およびNOSターミネーターを有す
る（第７図）。植物発現ベクターpZU−Ａにおいて使用
される35Sプロモーターの配列は次の通りである。

ベクターpZU−Ａにおいて使用されるNOSターミネータ
ーからの完全な配列は次の通りである。

実施例６発現ベクターpZU−Ｂの構築。

組換えプラスミドpZO347は、タバコ・モザイク・ウイ
ルスの非翻訳リーダー領域、いわゆるΩ−領域の67bpフ
ラグメントに結合された、CaMV株のCabb−Ｓの426bp35S
プロモーター・フラグメント（Hinc IIフラグメント）
を含む496bpBamH I−Sma IフラグメントをもつpBluescr
iptの誘導体である。この結果、TMVの非翻訳リーダーに
対するCaMVのプロモーター間の完全な転写融合体を伴う
キメラ・プロモーターが得られる。インビトロ突然変異
を用いることにより、TMV ATG開始コドンの本来の位置
がSma I部位に変化する。

プラスミドpZO008は、260bpPst I−Hind IIIフラグメ
ントとしてノパリン・シンターゼ（NOS）ターミネータ
ーをもつ。このPst I−Hind IIIフラグメントをzPO008
から削り取り、T4リガーゼを用いてPst I−Hind III線
状化pZO347にライゲーションする。生成した組換えプラ
スミドpZU−Ｂは、別の植物発現ベクターである。植物
発現ベクターpZU−Ｂにおいて使用されるこの35S−Ωプ
ロモーターの配列は、次の通りである。

生成した組換えプラスミドpZU−Ｂは、35SHinc II−T
MVΩ融合体（35S−Ω）、特有のSma IおよびPst I部位
およびNOSターミネーターを含む（第８図）。この発現
ベクターは、キメラ・プロモーター35S−Ωの下流に発
現される遺伝子の翻訳的融合体の構築において優先的に
使用される。

実施例７ TSWV−Ｎ蛋白質遺伝子のサブクローニング。

cDNAクローンpS614およびpS520の融合により、TSWV−
Ｎ蛋白質暗号化配列が得られる（第２図参照）。cDNAク
ローンpS520をEcoR I−Hind III二重消化に付し、TSWV
−Ｎ蛋白質遺伝子の3'−末端を含むフラグメントを電気
泳動により分離し、DEAE膜（NA−45、シュライヒェルお
よびシュール）を用いてゲルから精製し、EcoR I−Hind
III線状化pBluescript（ストラタジーン）においてク
ローン化すると、組換えプラスミドpS520E/Hが得られ
る。TSWV−Ｎ蛋白質の5'−末端含有フラグメントを、Ec
oR I消化によりpS614から取り出す。このフラグメント
を電気泳動により分離し、DEAE膜（NA−45、シュライヒ
ェルおよびシュール）を用いてゲルから精製し、EcoR I
線状化pS520E/Hにおいてクローン化すると、組換えプラ
スミドpTSWV−N3が得られる。TSWV−Ｎ遺伝子含有プラ
スミドpTSWV−N3を、Pvu IIによる消化により線状化す
る。Pst Iリンカー5'd（CCTGCAGG）を、T4リガーゼによ
り線状DNAのブラント末端にライゲーションする。続い
て、前記DNAをPst Iにより消化し、TSWV−Ｎ蛋白質配列
含有フラグメントを電気泳動により分離し、ゲルから取
り出す。TSWV−Ｎ蛋白質遺伝子含有フラグメントを、Ps
t I線状化ベクター、例えばpBluescript（ストラタジー
ン）にライゲーションすることにより、組換えプラスミ
ドpTSWV−Ｎが得られる（第９図）。この制限部位の付
加により、さらに別のプラスミドの構築が容易になる。
（別法として、異なる方法、例えば部位突然変異または
他の合成オリゴヌクレオチド・リンカーのライゲーショ
ンにより部位を付加することもできるが、これらに限定
されるわけではない。これらの方法は全て当業界の熟練
者に周知のものである）。

実施例８ TSWV S RNAのTSWV非構造蛋白質遺伝子（NSs−遺伝子）
のサブクローニング。

非構造蛋白質NSsの配列を、cDNAクローンpS514から単
離する。NSs−蛋白質遺伝子は、EcoR Iフラグメント上
に位置する。EcoR IによるcDNAクローンpS514に制限
後、T4DNAポリメラーゼで処理すると、ブラント末端が
作成される。NSs遺伝子含有フラグメントをアガロース
ゲル電気泳動により分離し、ゲルから取り出す。このNS
s−蛋白質遺伝子を含むブラント末端化フラグメント
に、合成Pst Iリンカー（5'd（CCTGCAGG）−3'）を、T4
ポリメラーゼを用いてライゲーションする。Pst Iによ
り制限後、NSs−蛋白質遺伝子含有フラグメントをPst I
線状化pBluescriptにおいてライケーションすると、組
換えプラスミドpTSWV−NSsが得られる（第10図）。

実施例９ TSWV配列を含む植物形質転換ベクターの構築。

実施例9A:pZU−ＡにおけるＮ−蛋白質遺伝子構築物。

35Sプロモーターにより推進され、NOSターミネーター
により終結されるＮ蛋白質遺伝子を含む植物形質転換ベ
クターを作成するため、pTSWV−ＮのPst Iフラグメント
を単離し、Pst I線状化pZU−Ａに挿入することにより、
キメラ遺伝子カセット・ベクターpTSWV−NAを作成す
る。35Sプロモーター、Ｎ−蛋白質遺伝子およびNOSター
ミネーターを含むカセットを、Xba Iにより制限によりp
TSWV−NAから取り出し、ベバン等により開発された（19
84）バイナリー形質転換ベクターである、pBIN19の特有
なXba I部位においてライゲーションする。生成したプ
ラスミドpTSWV−NAB（第11図）は、当業界の熟練者によ
く知られた方法を用いて植物形質転換実験で使用され
る。

実施例9B:pZU−ＢにおけるＮ−蛋白質構築物。

Ｎ蛋白質遺伝子からのATG出発コドンが35S−Ωプロモ
ーターのTMV非翻訳リーダーの3'−末端に直接融合され
ている融合体を作成するためには、Ｎ遺伝子の出発コド
ンを突然変異させなければならない。部位突然変異を用
いて、pTSWV−Ｎにおける配列5'd（ACGATCATCATGTCT）
を5'd（ACGATATCATGTCT）に突然変異させることによ
り、Ｎ遺伝子のATG出発コドンに隣接してEcoR V部位:5'
d（GATATC）が作成される。生成した組換えプラスミド
をpTSWV−Nmutと呼ぶ。突然変異Ｎ蛋白質遺伝子を、Eco
R V−Pst I消化によりこのプラスミドから取り出す。こ
のフラグメントを単離し、Sma I−Pst I線状化pZU−Ｂ
に挿入すると、組換えプラスミドpTSWV−NmutBが得られ
る。35S−Ωプロモーター、突然変異Ｎ遺伝子およびNOS
ターミネーターを含むキメラ・カセットを、BamH I/Xba
I消化によるプラスミドpTSWV−NmutBから取り出す。次
いで、単離されたキメラ遺伝子カセットをBamH I/Xba I
線状化pBIN19に挿入することにより、バイナリー形質転
換ベクターpTSWV−NmuBBが作成される。生成したプラス
ミドpTSWV−NmutBB（第12図）は、当業界の熟練者によ
く知られた方法を用いて植物形質転換実験で使用され
る。

実施例9C:pZU−ＡにおけるNSs−蛋白質遺伝子構築物。

35Sプロモーターにより推進され、NOSターミネーター
により終結されるNSs−蛋白質遺伝子を含む植物形質転
換ベクターを作成するため、pTSWV−NSsのPst Iフラグ
メントを単離し、Pst I線状化pZU−Ｂに挿入することに
より、キメラ遺伝子カセット・ベクターpTSWV−NsAが作
成される。35Sプロモーター、NSs−蛋白質遺伝子および
NOSターミネーターを含むカセットを、EcoR IおよびXba
Iによる制限によりpTSWV−NsAから取り出し、EcoR I−
Xba I線状化pBIN19にライゲーションする。生成したプ
ラスミドpTSWV−NsAB（第13図）は、当業界の熟練者に
よく知られた方法を用いて植物形質転換実験で使用され
る。

実施例9D:pZU−ＢにおけるNSs−蛋白質遺伝子構築
物。

NSs−蛋白質からのATG出発コドンが35S−Ωプロモー
ターのTMVリーダーの3'−末端に直接融合されている融
合体を作成するためには、NSs遺伝子の出発コドンを突
然変異させなければならない。当業界の熟練者に周知の
方法である部位突然変異を用いて、配列5'd（AACCATAAT
GTCT）を5'd（AACCATATGTCT）に突然変異させることに
より、NSs蛋白質遺伝子のATG出発コドンを含むNde I部
位:5'd（CATATG）が作成される。生成した組換えプラス
ミドをpTSWV−NSsmutと呼ぶ。プラスミドpTSWV−NSsmut
をNde Iにより線状化し、次いでT4DNAポリメラーゼで処
理することにより、ブランド端を作成する。この線状化
DNAをPst Iで消化し、突然変異NSs遺伝子を含むフラグ
メントを単離し、Sma I−Pst I線状化pZU−Ｂに挿入す
ると、組換えプラスミドpTSWV−NsmutBが得られる。35S
−Ωプロモーター、突然変異NSs−蛋白質遺伝子およびN
OSターミネーターを含むキメラ・カセットを、BamH I/X
ba I消化によりプラスミドpTSWV−NsmutBから取り出
す。次いで、単離されたキメラ遺伝子カセットをBamH I
/Xba I線状化pBIN19に挿入することにより、バイナリー
形質転換ベクターpTSWV−NsmutBBが作成される。生成し
たプラスミドpTSWV−NsmutBB（第14図）は、当業界の熟
練者によく知られた方法を用いて植物形質転換実験で使
用される。

実施例9E:pZU−ＡおよびpZU−Ｂにおける5'−および3'
−末端「パン−ハンドル」構築物。

DNA分析プログラムを用いることにより、ウイルスTSW
V S RNAにおける「パン−ハンドル」ループの場所を探
し出す。検出される最強の「パン−ハンドル」ループ
は、ウイルスS RNAの5'−末端における最初の70個のヌ
クレオチド（１〜70）およびウイルスS RNAの3'−末端
における最後の67個のヌクレオチド（2850〜2916）を含
む（第15図）。ウイルスS RNAにおけるこの「パン−ハ
ンドル」ループを含むDNA配列は次の通りである。

DNA分析プログラムを用いることにより、ウイルスTSW
V L RNAにおける「パン−ハンドル」ループの場所を探
し出す。検出される強い「パン−ハンドル」ループは、
ウイルスL RNAの5'−末端における最初の80個のヌクレ
オチド（１〜80）およびウイルスL RNAの3'−末端にお
ける最後の80個のヌクレオチドを含む。ウイルスL RNA
におけるこの「パン−ハンドル」ループを含むDNA配列
は次の通りである。

これらの領域を市販のDNAシンセサイザーにおいて合
成し、適当なリンカー配列を加える。ＳおよびL RNAの
「パン−ハンドル」ベクターの構築の結果、各々pTSWV
−termSおよびpTSWV−termLが得られる。適当な制限酵
素の組み合わせを用いることにより、これらのフラグメ
ントは、pZU−ＡのCaMV35SプロモーターおよびNOSター
ミネーター間またはpZU−Ｂの35S−Ωプロモーターおよ
びNOSターミネーター間に挿入され、キメラ・カセッ
ト、pTSWV−termSA、pTSWV−termLA、pTSWV−termSBお
よびpTSWV−termLBが生成される。次に、適当な酵素の
組み合わせを用いて、これらのカセットをバイナリー形
質転換ベクターpBIN19に導入すると、プラスミドpTSWV
−termSAB、pTSWV−termLAB、pTSWV−termSBBおよびpTS
WV−termLBBが得られる。別法として、上記よりも大き
いか、または他のDNA配列により分離された3'−および
5'−末端を含む「パン−ハンドル」構築物を設計するこ
とにより、組換え遺伝子から生成された転写物の植物に
おける安定性を高めることが可能である。「パン−ハン
ドル」構築物は全て短いトスポウイルスRNA、各TSWV RN
A分子と似ているため、欠損干渉性RNAと見なされ得る。

実施例9F:pZU−ＡおよびpZU−ＢにおけるTSWV S RNAヘ
アピン領域を含む構築物。

DNA分析プログラムを用いることにより、ウイルスTSW
V S RNAにおけるヘアピン・ループの場所を探し出す。
検出される最強のヘアピン・ループは、ヌクレオチド15
92から出発し、ヌクレオチド1834で終わる（第16図）。
このヘアピン・ループを含む配列は次の通りである。

ヘアピン領域を有する526pbのHind IIIフラグメント
をpS514から単離する。このフラグメントをアガロース
・ゲルから取り出し、続いてT4ポリメラーゼで処理する
ことにより、ブラント端が作成される。次の段階では、
Pst Iリンカーをこれらのブラント端にライゲーション
する。Pst Iで消化後、フラグメントをPst I線状化pZU
−Ａにおいてクローン化すると、組換えプラスミドpTSW
V−HpSAが得られる。プラスミドpTSWV−HpSAをHind III
で消化し、キメラ遺伝子を含むフラグメントをアガロー
ス・ゲルから取り出し、Hind III線状化pBIN19にライゲ
ーションすると、形質転換ベクターpTSWV−HpSABが得ら
れる。

別法として、pS514のHind IIIフラグメントをT4ポリ
メラーゼで処理することによりブラント端を作成し、続
いて発現ベクターpZU−ＢのSma I部位でクローン化する
と、組換えプラスミドpTSWV−HpSBが得られる。プラス
ミドpTSWV−HpSBをHind IIIで消化し、キメラ遺伝子を
含むフラグメントをアガロース・ゲルから取り出し、Xb
a I線状化pBIN19にライゲーションすると、形質転換ベ
クターpTSWV−HpSBBが生成される。

（当業界の熟練者であれば、他のフラグメントもま
た、機能に接触することなく上記ヘアピン領域を含むTS
WV S RNAのcDNAクローンから単離され得ることは明らか
である。また、ヘアピン領域を含むフラグメントはDNA
シンセサイザーを用いて合成され得る）。

実施例10 植物材料へのバイナリーベクターの形質転換。

バイナリーベクターを植物材料へ導入する方法は充分
に確立されており、当業界の熟練者に周知である。例え
ば使用される栽培変種および植物の種類によって使用さ
れるアグロバクテリウム株、外植材料の供給源、再生シ
ステムが異なるため、方法の変形が存在する。

上記バイナリー植物形質転換ベクターは、次の手順に
よる植物形質転換実験で使用される。構築されたバイナ
リーベクターを三親交配により受容体アグロバクテリウ
ム・ツメフェシエンス株に導入し、次いで接合完了体の
サザーン分析による受容株への構築物の適切な導入を証
明し、選抜されたアグロバクテリウム・ツメファシエン
ス株を用いて無菌外植材料の接種および共培養（cocult
ivation）を行い、適当な抗生物質により使用されたア
グロバクテリウム・ツメファシエンス株を選択的に殺
し、カナマイシン含有選択培地での培養により形質転換
細胞を選抜し、発芽誘導培地へ組織を導入し、選択され
た苗条を根付き培養培地へ導入し、土壌へ苗木を導入
し、トランスジェニック植物から単離された総DNAのサ
ザーン分析により構築物の無傷状況について検定し、蛋
白質のノーザン分析および／または酵素検定およびウエ
スタン・ブロット分析により挿入されたキメラ遺伝子の
正しい機能について検定する。

実施例11 植物細胞におけるTSWV RNA配列の発現。

次のプロトコルを用いて再生植物の葉からRNAを抽出
する。液体窒素中で200mgの葉材料を微細粉末に粉砕す
る。800μのRNA抽出緩衝液（100ミリモルのトリス−H
Cl（pH8.0）、500ミリモルNaCl、２ミリモルEDTA、200
ミリモルβ−メルカプト−エタノール、0.4％SDS）を加
え、フェノールによりホモジネートを抽出し、アルコー
ル沈澱により核酸を集める。核酸を0.5mの10ミリモル
・トリス−HCl（pH8.0）、１ミリモルEDTAに再懸濁し、
LiClを加えて２モルの最終濃度とし、最大４時間氷上で
放置し、遠心分離によりRNAを集める。400μの10ミリ
モル・トリス−HCl（pH8.0）、１ミリモルEDTAに再懸濁
し、アルコールにより沈澱させ、最後に50μの10ミリ
モル・トリス−HCl（pH8.0）、１ミリモルEDTAに再懸濁
する。RNAをグリオキサル／アガロース・ゲル上で分離
し、バン・グリンスベン等（1986）による記載に従いジ
ーンスクリーンにブロットする。［³²P］、［³⁵S］また
は非放射性標識技術の使用により標識されたDNAまたはR
NAプローブを用いることにより、TSWVウイルスRNAが検
出される。これらのノーザン分析に基づき、再生植物が
どの程度キメラTSWV遺伝子を発現するかが測定される。

また、TSWV蛋白質遺伝子を含むキメラ構築物により形
質転換された植物をウエスタン・ブロット分析にかけ
る。ラエムリ（1970）に従い試料緩衝液中で粉砕するこ
とにより、形質転換植物の葉から蛋白質を抽出する。本
質的にラエムリ（1970）による記載に従い、50μｇ分量
の蛋白質を12.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動に付す。トーピン等（1979）による記載に従い、分離
された蛋白質を電気泳動的にニトロセルロースに移動さ
せる。トービン等（1979）に従い、移動した蛋白質を、
精製TSWVヌクレオカプシドに対して産生した抗血清と反
応させる。ウエスタン分析の結果に基づき、形質転換植
物が挿入されたキメラ遺伝子によりコードされたTSWV蛋
白質を実際に含むことが測定される。

実施例12 TSWV感染に対する植物の抵抗。

標準検疫条件下、温度で形質転換植物を生育すること
により、病原体による感染を完全に阻止する。形質転換
体を自家授粉させ、種子を採取する。子孫植物の挿入遺
伝子の分離について分析し、続いて機械的接種によりTS
WVに感染させる。TSWVにより全体的に感染した植物から
の組織を、５倍容量の氷冷接種緩衝液（１％Na₂SO₃を補
った10ミリモル燐酸緩衝液）中で粉砕し、約５週令の実
生の最初の２枚の充分に広がった葉をカーボランダム粉
末の存在下でこすり合わせる。接種後３週間、接種され
た植物を徴候発現についてモニターする。

TSWV関連DNA配列を含む植物は、徴候発現の遅延が例
証する通り、TSWV感染に対して低い感受性を示すが、非
形質転換対照植物は接種後７日以内に重い全体的TSWV徴
候を示す。

実施例13 診断用としての合成オリゴヌクレオチドの使用。

次のプロトコルに従い、被疑植物の葉からRNAを抽出
する。優先的に病気の徴候を示す１グラムの葉材料を3m
の100ミリモル・トリス−HCl、50ミリモルEDTA、1.5
モルNaClおよび２％CTAB（pH8.0）中で粉砕する。粉砕
後、1mのホモジネートをクロロホルム抽出に付し、65
℃で10分間インキュベーションする。次いで、無機相を
集め、フェノール／クロロホルム（1:1）により抽出
し、次にクロロホルムにより最後の抽出をする。LiClを
加えて２モルの最終濃度とすることにより、核酸全部を
含む無機相からリボ核酸を分離する。この標本を４℃で
１時間インキュベーションした後、リボ核酸を遠心分離
により集める。リボ核酸沈澱物を25μの10ミリモル・
トリス−HCl、１ミリモルEDTA（pH8.0）に再懸濁する。
リボ核酸を標準アルコール沈澱により回収する。リボ核
酸沈澱物を25μの10ミリモル・トリス−HCl、１ミリ
モルEDTA（pH8.0）に再懸濁する。

１μの精製リボ核酸を落としてナイロン・ブロッテ
ィング膜（例、ハイボンド−Ｎ、アマーシャム、イギリ
ス）上に斑点を付ける。ビリオンから単離された配列の
一部分（複数も可）を用いるかまたは優先的にはプロー
ブとして開示された配列情報に基づいて合成オリゴマー
を設計することにより、標準ハイブリダイゼーションを
用いて植物からTSWVの存在が検出される。（別法とし
て、TSWVゲノム領域のインビトロ転写物を用いて、病気
の植物からTSWV関連RNA配列を検出する）。病気の植物
からのRNA物質を含むドットにおけるハイブリダイゼー
ションの発生により病気の植物を診断する。

この明細書に記載された方法を用いて、畑から選ばれ
たウイルス感染の疑いがある12のコショウ植物（A1−D
3）からRNAを単離する。同様に、３つのTSWV接種したタ
バコ植物（E1−E3）および３つの非接種タバコ植物（F1
−F3）からRNAを抽出する。各植物から得られた１μ
のRNA試料をハイボンド膜上にたらす。このフィルター
を、標準条件下、T3ポリメラーゼおよび放射性標識とし
てα−［³²P］UTPを用いてcDNAクローンpS614から合成
されたインビトロ転写物とハイブリダイゼーションさせ
る。対照非感染植物（F1−F3）はシグナルを示さず、対
照TSWV感染植物（E1−E3）は実際に強いシグナルを示す
が、被疑コショウ植物は全て、強さが弱〜強の範囲のシ
グナルを示す（第17図参照）。

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【図面の簡単な説明】

第１図は、トマト・スポッテド・ウイルトウイルスの構
造の概略図である。第２図は、TSWV S RNAに使用されるクローニング法の概
略図である。第３図は、TSWV L RNAに使用されるクローニング法の概
略図である。第４図は、TSWV S RNAの配列およびゲノム構成を示す。第5A図および第5B図は、それぞれ、S RNAおよびL RNAの
全解読枠に関する翻訳開始および終止コドンの分布を示
す図である。第6A図および第6B図は、それぞれ、TSWV M RNAおよびL
RNAのヌクレオチド配列を示す図である。第７図は、適当な発現ベクター（pZU−Ａ）の構築の概
略図を示す。第８図は、適当な発現ベクター（pZU−Ｂ）の構築の概
略図を示す。第９図は、ヌクレオカプシドＮ蛋白質遺伝子を含む適当
なプラスミド（pTSWV−Ｎ）の構築の概略図を示す。第10図は、ヌクレオカプシドNSs−蛋白質遺伝子（TSWV
−Ｎ蛋白質遺伝子）を含む適当なプラスミド（pTSWV−N
Ss）の構築の概略図を示す。第11図は、この発明によるDNA構築物である植物形質転
換ベクターpTSWV−NABの構築の例を示す概略図である。第12図は、この発明によるDNA構築物である植物形質転
換ベクターpTSWV−NmutBBの構築の例を示す概略図であ
る。第13図は、この発明によるDNA構築物である植物形質転
換ベクターpTSWV−NSsABの構築の例を示す概略図であ
る。第14図は、この発明によるDNA構築物である植物形質転
換ベクターpTSWV−NSsmutBBの構築の例を示す概略図で
ある。第15図は、TSWV S RNAの「パン−ハンドル」領域を示す
図である。第16図は、TSWV S RNAのヘアピン領域を示す図である。第17図は、被疑植物のドット・ブロット分析を示す図で
ある。

フロントページの続き (72)発明者ディルク・ペーテルスオランダ国エヌ・エル‐6703 エー・イックスワゲニンヘン、エデルマンラーン４番 (72)発明者ヨハネス・ヤコブス・ルドヘルス・ヒーレンオランダ国エヌ・エル‐1602 ヘー・セーエンクフイゼン、ヤン・ホースカーイ 73番 (72)発明者ペトルス・テオドルス・デ・ハーンオランダ国エヌ・エル‐6668 アー・ハーランドウイク、プリンス・ベルンハルドストラート 32番 (72)発明者アーノルデュス・ヨハネス・コールオランダ国エヌ・エル‐1602 エル・イェーエンクフイゼン、ケルケランド 74番 (72)発明者マルチヌス・クイリヌス・ヨセフ・マリエ・ファン・ヘリンスフェンオランダ国エヌ・エル‐1602 エム・アーエンクフイゼン・ウェゼンランド５番 (56)参考文献Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．79（1989）ｐ．1309−1313 Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．78，ｎｏ．12−ｐａｒｔ１（1988) ｐ．1599 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】植物中で機能するプロモーターおよびター
ミネーターの発現制御下にあるDNA配列を含む組換えDNA
構築物であって、当該DNA配列が下記のいずれかの配列
への転写をコードし、当該DNA構築物がトスポウイルス
による感染に対する抵抗性を植物に付与することができ
る、組換えDNA構築物：ａ）次のトスポウイルスの配列から選択されたRNA配
列：ｉ）第４図に示す、S RNAヌクレオチド配列１〜2915、 ii）第４図に示す、S RNAヌクレオチド配列2763〜198
7、ｂ）トスポウイルス蛋白質をコードするａ）記載のRNA
配列であって、その中で１つまたはそれ以上のコドンが
同じアミノ酸または終止シグナルをコードするコドンに
より置換されているものまたはその部分であって少なく
とも20のヌクレオチドを有するもの、またはそれらのい
ずれかに相同的な、少なくとも20のヌクレオチドを有す
るRNA配列であって、その中で１つ以上のヌクレオチド
が削除および／または付加されているが、（ａ）記載の
RNA配列に相補的なヌクレオチド配列に、５×標準食塩
水くえん酸、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デン
ハード溶液、50％ホルムアミドおよび100μg/ml担体DNA
を含む緩衝系中16時間42℃でインキュベーションし、次
いで65℃で毎回約１時間１×SSCおよび0.1％SDSを含む
緩衝液により３回洗浄することを含むハイブリダイゼー
ション条件で、ハイブリダイズすることが出来るもの；
またはｃ）ａ）またはｂ）記載のRNA配列に相補的なRNA配列。
【請求項２】DNA配列が下記のいずれかの配列への転写
をコードするものである、請求項１記載のDNA構築物：ｉ）S RNAヌクレオチド配列１〜2915、 ii）S RNAヌクレオチド配列89〜1483、 iii）S RNAヌクレオチド配列2763〜1987、 iv）L RNAヌクレオチド配列4462〜１、ｖ）L RNAヌクレオチド配列41〜２、 vi）L RNAヌクレオチド配列3980〜46、 vii）S RNAヌクレオチド配列1987〜2763に相補的なRNA
配列、 viii）S RNAヌクレオチド配列89〜1483に相補的なRNA配
列、 ix）L RNAヌクレオチド配列１〜4462に相補的なRNA配
列、ｘ）L RNAヌクレオチド配列２〜41に相補的なRNA配列、 xi）L RNAヌクレオチド配列46〜3980に相補的なRNA配
列、 xii）１つまたはそれ以上のコドンが同じアミノ酸また
は終止シグナルをコードしているコドンにより置換され
ている、S RNAヌクレオチド配列89〜1483、 xiii）１つまたはそれ以上のコドンが同じアミノ酸また
は終止シグナルをコードしているコドンにより置換され
ている、S RNAヌクレオチド配列2763〜1987、 xiv）上記ｉ）〜xiii）のいずれかに記載のヌクレオチ
ド配列に相同的なRNA配列。
【請求項３】ウイルス相補的センスにおける転写解読枠
（open reading frame）のトスポウイルス−RNA配列、
または１つもしくはそれ以上のコドンが同じアミノ酸も
しくは終止シグナルをコードするコドンにより置換され
た対応するRNA配列、またはそれらのいずれかに相同的
なRNA配列への転写をコードする、請求項１記載のDNA構
築物。
【請求項４】トスポウイルス−RNA配列、または１つま
たはそれ以上のコドンが同じアミノ酸もしくは終止シグ
ナルをコードするコドンにより置換されたトスポウイル
ス−RNA配列、または少なくとも20のヌクレオチドを有
するそれらのいずれかに相同的なRNA配列への転写をコ
ードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNA構
築物。
【請求項５】トスポウイルス−RNA配列、または１つま
たはそれ以上のコドンが同じアミノ酸もしくは終止シグ
ナルをコードするコドンにより置換されたトスポウイル
ス−RNA配列、または少なくとも50のヌクレオチドを有
するそれらのいずれかに相同的なRNA配列への転写をコ
ードする、請求項４記載のDNA構築物。
【請求項６】プロモーターが植物細胞中で機能するウイ
ルス、真菌、細菌、動物または植物プロモーターであ
る、請求項１〜５のいずれか１項に記載のDNA構築物。
【請求項７】ターミネーターが植物細胞中で機能するウ
イルス、真菌、細菌、動物または植物ターミネーターで
ある、請求項６記載のDNA構築物。
【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載のDNA構築
物をそのゲノム中に含む双子葉植物。
【請求項９】ａ）植物細胞のゲノムに請求項１記載のDN
A構築物を挿入し、ｂ）形質転換細胞を得、ｃ）この形質転換細胞から遺伝学的に形質転換された植
物を再生させることを特長とする、請求項８記載の植物の製造法。