JP2000508179A - コルヒチノイド化合物を対応する３―グリコシル誘導体類にバイオトランスフォーメーションする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コルヒチノイド化合物を、対応する３−Ｏ−グリコシル誘導体に、Bacillus megaterium株の手法によりトランスフォームする。

Description

【発明の詳細な説明】 コルヒチノイド化合物を対応する３−グリコシル誘導体類にバイオトランスフ ォーメーションする方法 本発明は、選択した微生物菌により行う、コルヒチノイド化合物を対応の３− Ｏ−グリコシル誘導体類にするバイオトランスフォーメーション（生物変換）に 関する。本発明の方法は、コルヒチン、チオコルヒチン又はそれらの誘導体から 出発して、もっぱら芳香族環ＡのＣ−３でグリコシル化されたコルヒチノイド化 合物を、高収率に高純度で与える。 ベンゼン環のＣ−３でグリコシル化されたコルヒチノイド化合物は、それらの 高い有効性のため、又は新しい医薬の調製において、薬理学的に非常に重要であ る。 特に、チオコルヒコシド（３−Ｏ−グルコシルチオコルヒチン）は、製薬分野 、主に筋−骨格系の病気の治療において、そして新規な抗腫瘍、免疫抑制、抗乾 癬、及び抗炎症薬剤の製造の出発物質として、著しく重要な用途の活性成分であ る。 化学的反応又はバイオトランスフォーメーションのいずれかの手段によって、 過去に数多くの努力が３−グリコシルコルヒチノイド化合物の製造のためになさ れてきた。 化学的経路は、複雑で非特異的な反応の連続からなり、それはグリコシル化さ れた誘導体類の混合物を導き、その誘導体のいくつかは不活性である。したがっ て、その芳香族環のＣ−３で特異的にグリコシル化された有効な生成物への変換 収率は非常に低い。 生物学的なアプローチは、チオコルヒチンを、Centella Asiaticaの培養によ り、芳香族環のＣ−２及びＣ−３でモノグリコシル化された誘導体類にバイオト ランスフォーメーションすることに実質的に関し；そのようなトランスフォーメ ーションは、したがって、高選択的ではなく、ほんのわずかな収率及び生産性を 与える(Solet，J．M．et al.，Phytochemistry 33，4，817-820，1993)。 コルヒチノイド化合物をバイオトランスフォームすることについてのほかの努 力は、芳香族環に結合したメトキシ基（Ｃ−２及びＣ−３で）の単純な脱メチル 化のみを与え、どちらにしても、制限された収率及び生産性、並びに低い位置選 択性（regioselectivity）により必ず特徴づけられていた。 こうして、Streptomyces griseus及び／又はStreptomyces spectabilisを用い るHufford C．D.ら(J．Pharm．Sc.，68，10，1239-1242，1959)、並びに異なる 系統のStreptomyces及びほかの種類の細菌や真菌を用いるBell et P.ら（GB-923 421，1959）は、コルヒチン及びその誘導体類を対応する３−脱メチル化誘導体 類にトランスフォームすることを試みた。これらの既知の方法の結果は、係わっ ている微生物酵素の非選択性（例えばアルカロイド分子のＣ−２、Ｃ−３又はＣ −１０における）との関連において、先に記載したことを確認している。更に、 前記の触媒系の生産性レベルはどちらかといえば低く、それは変換収率の低さ、 減少した使用可能な基質濃度、そして頻繁なトロポロン環の分解に起因している 。 更に最近では、Poulev et al．(J．Ferment．Bioeng．79，1，33-38，1995)が 、細菌微生物の特異的なバイオトランスフォーメーションを得ているが、まだど ちらかといえば低い収率及び生産性である。 上記のものと同様な微生物（Streptomyces、Bacillusなど）からの酵素活性を 、マイタンシノイド類（maytansinoids）のようなほかの化合物のバイオトラン スフォーメーションに適用している(米国特許第４３６１６５０号:Izawa，M.，e t al.，J．Antibiotics，34，12，1587-1590，1981)。この場合、その触媒反応 はもっぱら脱メチル化からなり、低い変換収率及び低い生産性により特徴づけら れる。 Bacillus megateriumからのα−アミラーゼのグリコシルトランスフェラーゼ の活性が、記載されており(Brumm，P．J.，et al.，Starch，43，8，319-323，1 991);転位酵素反応の受容体特異性は(グルコース又はグルコシド類に限定的)、 特に高い。同一の微生物源により製造されたシクロデキストリン−グリコシルト ランスフェラーゼは、デンプンから出発するルブソシド（rubusoside）(１３− Ｏ−β−Ｄ−グルコシル−ステビオール（steviol）β−Ｄ−グルコシルエステ ル)のα−１，４−トランスグルコシル化を促進する。このバイオコンバージョ ンにおいては、また、転移酵素反応の受容体は基質グルコシド画分である(Daris e， M.，et al.，Agric．Bioel．Chem.，48，10，2483-2488，1984)。シクロデキス トリン−グリコシルトランスフェラーゼは、デンプンからのシクロデキストリン 類Ｇ６、Ｇ７及びＧ８の製造に以前は用いられていた(Kitahata,S.,Okada,S.，A gric．Biol．Chem.，38，12，2413-2417，1974)。 これらの例は、Bacillus megateriumにより発現されるグリコシルトランスフ ェラーゼ活性の基質特異性の高さを裏付けており、それはグルコシド受容体類の みを伴い、したがって、コルヒチノイドのような、異なる複雑な分子構造を有す る二次代謝物とのいかなる反応も伴わない。事実、コルヒチノイド類を３−グリ コシル誘導体類に酵素変換する前記の微生物の用途の例は全く知られていない。 高濃度コルヒチン及びチオコルヒチンの存在下で増殖できるBacillus megater ium 菌株は、コルヒチノイド基質をもっぱら芳香族環のＣ−３でグリコシル化さ れた誘導体類にする、顕著に高く、かつ非常に特異的なバイオトランスフォーメ ーション活性を有することが今見い出された。そのようなバイオトランスフォー メーションは非常に短い時間で起こり、驚くほど高い収率により特徴づけられて いる。 したがって、本発明は、式（Ｉ）： （式中、Ｒ¹は、ｏＯ−グリコシド基であり、Ｒ²は、水素又はＣ₁−Ｃ₇アシルで あり、Ｒ³は、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ又はＣ₁−Ｃ₆チオアルキルである） で示される３−Ｏ−グリコシルコルヒチノイド化合物の製造方法であって、Baci llus megaterium によりＲ¹がＯＨ又はメトキシである化合物のバイオトランスフ ォーメーションを含む方法に関する。Bacillus megateriumは、細胞直径１．０μm以上の細菌を発生するグラム陽性 芽胞であり；数多くの培養液において好気的に増殖し；カタラーゼ陽性；ゼラ チンを加水分解する。 本発明で用いることができるBacillus megaterium菌株は、増殖試験及び顕微 鏡分析により裏付けられたように、充分に増殖し、また、高濃度コルヒチン及び／ 又はチオコルヒチン（３g/l以上）で生存し続けることを示した。 Bacillus cereusのような同属の種は、基質濃度１．５g/lで既に増殖困難性を 示し(吸光度は、対照の１５〜２５％)、それは著しい自己消化が生起する場合に 濃度３g/lで更により顕著になる。Bacillus megateriumの選択培養液は、対照的 に、Bacillus cereusと比較して、より高い増殖レベルに（２倍から３倍）上記 の濃度で到達することができる。 バイオトランスフォーメーションの高い選択性及び高い有効性は、その収率レ ベルが８０〜１００％の範囲であり、通常、約９０〜９５％の範囲であるので、 驚くべきことであり、普通ではない。 更に、バイオコンバージョンに用いられた微生物は、発酵工程の繰り返しにお いてさえも、その触媒活性を恒久的に維持することができ、したがって、半回分 （fed-batch）及び連続法において特異的なバイオコンバージョンを与える。し たがって、この方法は、高い生産性レベル及び高い再現性（reproducibility） レベルを与える。 顕著な反応位置選択性は、著しく高い生産収率に加えて、得られる生成物の高 い品質及び高い純度を保証し、つまり、簡単な下流処理により生成物を純度１０ ０％で与える。 更に、重要な利点は、生成物の精製及び回収工程のトラブルが減少すること、 本方法の経済性、並びに使用することのアフィダビリティ(affidability)、及び 安全性である。 本発明の方法において用いることができる細菌株の選択のための操作順列は、 以下を含んでいる。 Ａ） 高濃度のコルヒチン基質の存在下で増殖することができる、天然源又は採 取株から出発するBacillus megateriumの培養液を選択すること。 Ｂ） 特異的な基質上でのバイオコンバージョンアッセイの手段により、徐々に 増加する濃度で投与して、コルヒチンを対応する３−Ｏ−グリコシルコルヒチノ イド誘導体類にするトランスフォーメーション活性を調査して、確認するため、 Ａ）からの単離物を選択すること。 Ｃ） Ｂ）において選択した菌株の微生物特性試験すること(microbiological c haracterization)。 Ｄ） Ｂ）からの細菌集団をターゲット−特異的に選択する手段により、バイオ トランスフォーメーション収率を段階的に増加させること。 Ｅ） バイオトランスフォーメーションを最適化するため、発酵の臨界パラメー ターを研究し、かつ最適化すること。 Ｆ） 工業的規模での生産適用（productive application）のために安定で均一 な接種物を保証するため、高生産性の培養液を保存する方法を研究し、かつ最適 化すること。 Ｇ） 回分、半回分、及び連続法において発酵器をスケールアップすること。 Ｈ） 下流処理法及び生成物の回収法を行ない、最適化すること。 特別には、本発明において利用可能な微生物は、菌株の寄託所(strain deposi t center)から得られた収集培養液から、又は種々の源の土壌試料から出発し、 有機窒素源(ペプトン類、イースト抽出物類、肉抽出物類、アスパラギンなど)、 炭素源（グリセリン、デンプン、マルトース、グルコースなど）を含有している 別個の寒天培地においてpH５〜８、好ましくは６〜７での選択的な回収により選 ぶことができる。インキューベーション温度は２０〜４５℃、好ましくは２８〜 ４０℃の範囲である。 有毒な濃度のコルヒチン系基質の存在下で増殖するトランスフォームさせる培 養体の性能は、その一部にコルヒチン又はチオコルヒチンが０．１〜３g/lの濃 度で（微生物の主要部分の増殖を阻害するため）予め添加されている別個の寒天 化基質上でのスカラ希釈及び平行プレーティングの手法により評価する。 上記の条件下で増殖することができるコロニーを無菌の状態でとりだし、異な る寒天培地において、それらの純度及び増殖の均一度（homogeneity）を調査し て、確認する。 培養体を保存するために用いた培養基は、典型的な微生物基質であり、有機窒 素源(ペプトン類、イースト抽出物類、トリプトン、肉抽出物類など)、炭素源 １種（グルコース、マルトース、グリセリンなど）を含有し、pH５〜８、好まし くは６〜７である。インキューベーション温度は２０〜４５℃、好ましくは２８ 〜４０℃の範囲である。 選択した微生物を、その後、深部培養における増殖能、コルヒチノイド化合物 の存在下での増殖能、及び後者を対応する３−グリコシル誘導体類にトランスフ ォームする性能について分析する。 前記の分析を、異なる培地処方を含有し、１種以上の有機窒素源(イースト抽 出物類、ペプトン類、トリプトン、カゼイン水解物類、肉抽出物、トウモロコシ 精製リキュールなど)、１種以上の炭素源(グルコース、グリセリン、デンプン、 サッカロースなど)、無機リン源及び無機窒素源、並びに様々なイオン（Ｋ⁺、Ｎ ａ⁺、Ｍｇ⁺⁺、Ｃａ⁺⁺、Ｆｅ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺など）の無機塩を含む液体培地２０mlを 含有する１００ml容のフラスコ内で行った。 培養試料は、場合により、慣用の突然変異誘発手法（ＵＶ線での放射など）の 手段により突然変異誘発処理に付して、上記と同一の手法で評価することができ る特異なバイオコンバージョン活性を有する突然変異体を誘発することができる 。 それぞれのバイオコンバージョンアッセイからの培養試料は、３−グリコシル 誘導体類の生成を評価するために、ＴＬＣ及びＨＰＬＣのようなクロマトグラフ ィーの手段により分析した。 選択した微生物のコルヒチン基質を対応する３−グリコシル誘導体類にトラン スフォームする能力を、選択操作で用いたのと同一の培養ブロスでのフラスコ内 バイオコンバージョンアッセイの手段により、３００ml規模（scale）において 確認した。 陽性の応答を与えた微生物を、３００ml規模での異なる培養ブロス中のバイオ コンバージョンの最適化試験に用いた。研究した主要な培養及び発酵パラメータ ーは、有機窒素源、炭素源、無機塩(mineral salt)、温度、撹拌−通気、pH、イ ンキュベーション時間、接種物比、副培養操作、トランスフォームされる基質の 添加時間である。 本発明のバイオトランスフォーメーションを行うことが可能な選択した細菌微 生物は、１種以上の有機窒素源、好ましくはイースト抽出物、肉抽出物、ペプト ン、トリプトン、カゼイン水解物類、トウモロコシ精製リキュールなどを含有す る固体及び液体培養基質の両方に増殖することができる。増殖及びバイオトラン スフォーメーションに有用な炭素源数種は、グルコース、フルクトース、サッカ ロース、麦芽抽出物などであり、好ましくはグルコース、フルクトース及びグリ セリンである。培養基は、更に、無機リン源及びＫ⁺、Ｎａ⁺、Ｍｇ⁺⁺、ＮＨ₄ ⁺の 塩を含有する。 選択した微生物を、温度２０〜４５℃、好ましくは２８〜４０℃で、pH５〜８ 、好ましくは６〜７で増殖させることができる。同一の条件下で、考慮した微生 物はコルヒチノイド化合物を対応する３−グリコシル誘導体類にトランスフォー ムすることができる。前記のトランスフォーメーションは、回転する振動基での インキュベーションされたフラスコ内に１５０〜２５０rpmで撹拌しながら深部 培養中に起こる。 バイオトランスフォーメーションに関する微生物の増殖に関する特殊な熱力学 のため、バイオトランスフォーメーション目的用の最適な条件は、増殖に最適な ものと同一条件である。したがって、上記の有機及び無機成分をベースとしたも ののような、良好な微生物増殖を促進するのに有用な培養基は、また、関係基質 のバイオトランスフオーメーションの良好な活性にも有用である。後者を、始ま りの発酵操作において培地に添加する。 本発明のバイオトランスフォーメーションは、バイオコンバージョンに基づい ており、それは指数的増殖相（growth exponential phase）の間に始まり、その 増殖と平行プログレッションを続け：3-グリコシル誘導体類への変換の最大レベ ルは（非常に高い：９５〜１００％まで）最初の２４〜３０時間以内に到達され る。バイオトランスフォーメーションの位置選択性は絶対的であり：２−グリコ シル誘導体類の存在は全く裏付けられていない。得られる生成物は、もっぱら細 胞外である。 本発明のバイオトランスフォーメーションは、特に培養基、温度及び工程時間 に関する限り、培地条件を変化させずに、発酵器レベルまでスケールアップする ことができる。良好な増殖を得るためには、適切な撹拌−通気レベルが重要であ り、特に毎分培地１Ｌ当たり空気１〜２L（vvm）の通気レベル、好ましくは １．５〜２vvmが必要である。 バイオコンバージョンから得られる生成物を遠心分離及び上澄み液の回収によ るか、又はマイクロろ過及び透過液の回収により液体画分からのバイオマスの分 離の後に、培養ブロスから抽出する。生成物の最適な回収のために、培養液をア ルコール処理してもよい。 バイオトランスフォーメーション生成物の精製及び回収は、吸着樹脂での分離 、及びアルコール類、好ましくはメタノールでの溶離にクロマトグラム手法を用 いて行ってもよい。生成物を含有しているメタノール水性溶液を、更に、親油性 有機溶媒、好ましくは塩化メチレンでの抽出により精製することができる。アル コール類及び有機溶媒類の混合物での更なる処理の後、得られるアルコール溶液 からの結晶化により、生成物を純粋な状態で得ることができる。 そのバイオトランスフォーメーション方法は、トロポロン基を含有している基 質に特異的であり、コルヒチン、チオコルヒチン、３−脱メチルコルヒチン、３ −脱メチルチオコルヒチン、Ｎ−脱アセチルチオコルヒチン及び他の各種の置換 コルヒチン類のような多数のコルヒチノイド化合物に適用することができる。 トロポロンを有さないほかの天然化合物は、Bacillus megateriumによりグリ コシル化されない。 グルコースは、グリコシルトランスフェラーゼの活性低下を起こさないで、フ ルクトース又はガラクトースのようなほかの糖類により置換することができる。 以下の例は、本発明を更に詳細に記載している。 例１ 耕作土壌（agriculture soil）から単離したBacillus megateriumの培養アリ コートを、無菌サリン２０mlに再懸濁し、次いで希釈因子１：１０，０００，０ ００までスカラ希釈（scalar dilution）に付す。様々な希釈度の懸濁液を、Ｌ Ｂ−寒天培基に、及び順にコルヒチン又はチオコルヒチンを添加したＬＢ−寒天 に、最終濃度２g/l(表を参照)まで載せる。培養体を＋２８℃で暗所内に３日間 インキュベーションする。コルヒチノイドを添加した選択培地上に増殖したコロ ニーを単離し、非選択培地上に載せる手段により精製する；前記の試料を上記の ようにインキュベーションするが、より短時間（２４時間）で ある。続けて、培養体を試験管内の同一の寒天培地に移動し、次いで上記のよう に２４時間インキュベーションする。 上記のように選択した培養のアリコートは、最終濃度０．４mg/mlまでコルヒ チン又はチオコルヒチンを添加した培基ＳＴ（表）２０mlを含有する１００ml容 エーレンマイヤーフラスコを接種するのに用いる。前記の培養を、２００rpmの ロータリーシェーカー上、２８℃で一晩インキュベーションする。 コルヒチン基質のトランスフォーメーションは、アセトン：酢酸エチル：水＝ ５：４：１溶離システムでシリカゲルでのＴＬＣによる、３〜４時間毎にとる培 養ブロスのアリコート分析により検査する。 ４日間のインキュベーション後、3-グリコシル誘導体に対して確固とした触媒 活性を示した培養類のアリコートを、試験管内に新規な接種物の調製のために、 上記のスカラ希釈の手法によりプレート上に回収する。顕著により高いコルヒチ ン及びチオコルヒチン最終濃度（1mg/ml）を用いる以外は、上記と同一の条件で 、フラスコ内のバイオトランスフォーメーションアッセイを繰り返す。最も活性 な単一の培地を(基質変換率は、８０％、又はそれ以上)、例３に記載したように 凍結氷管（cryotube）内での接種の準備のために用いる。表 培養基の処方 １） ＬＢ−寒天（殺菌：１２１℃×２０'）−pH7 トリプトン １０g/l イースト抽出物 ５g/l ＮａＣｌ １０g/l 寒天−寒天 １５g/l ２） ブロスＳＴ（殺菌：１２１℃×２０'）−pH7 グルコース ２０g/l グリセリン １０g/l ペプトン １５g/l イースト抽出物 ５g/l ＮａＣｌ ３g/l ＮH₄Ｃｌ ３g/l Ｋ₂ＨＰＯ₄ ８g/l ＫＨ₂ＰＯ₄ ３g/l ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５g/l 例２ 例１に記載の手順を繰り返し、Bacillus megaterium培養体から出発して、下 記の収集菌株から誘導する〔Deutsche Samm1ung von Mikroorganismen，Braunsc hweig,Germany(ドイツ国ブラウンシュバイグ、ドイツ微生物寄託所)〕：ＤＳＭ ９０、５０９、３２２、３３３、１６６７、１６７０、１６７１。 ＤＳＭ ９０ ＤＳＭ ５０９ ＤＳＭ ３２２ ＤＳＭ ３３３ ＤＳＭ １６６７ ＤＳＭ １６７０ ＤＳＭ １６７１ 例１のように選択され、チオコルヒチン（1mg/ml）を添加した培地を、液体培 養中に４日間インキュベーションする：そのＴＬＣ分析は、５０％（株ＤＳＭ１ ６７１）〜７０％(株ＤＳＭ９０)、８０％まで及びそれ以上（株ＤＳＭ３３３、 ＤＳＭ５０９、ＤＳＭ１６６７、ＤＳＭ１６７０）に広がる変換収率で基質のチ オコルヒコシドへのトランスフォーメーションが起こったことを検出する。 例３ 上記の例に記載したように選択した試験管内の培養試料のアリコートを、ブロ スＳＴ２０mlを含有する１００ml容エーレンマイヤーフラスコを接種するのに用 いる。 その培養ブロスを、２００rpmのロータリーシェーカー上、＋３０℃で一晩イ ンキュベーションする。インキュベーションの後、培養液にグリセリド無菌溶液 を、最終濃度２０％まで添加する。培養液を、その後、２ml容氷管に分配し、次 いで直ちに液体窒素に浸す。 数日後、培養液の１０％を３７℃で急速に解かす。それぞれの氷管のアリコー トは、続けて＋２８℃、２００rpmで一晩インキュベーションしてある培地ＳＴ （前培養）の２０mlを含有している１００ml容エーレンマイヤーフラスコを接種 するのに用いる。インキュベーション後に、それぞれの前培養２mlを、新鮮な培 地ＳＴ２０mlに無菌で移動させ、今回はコルヒチン又はチオコルヒチンを最終濃 度１g/lまで添加する。バイオトランスフォーメーションを、例１に記載した条 件で、行ない、かつ検査した。分析は、基質の３−グリコシル誘導体へのトラン スフォーメーションは上記に記載した定量的な形態で起こる（８０％及びそれ以 上）ことを確認し、そうして凍結培養液の触媒安定性を証明している。 解かした直後にＬＢ寒天に置かれた培養ブロスの平行対照は、凍結培養液のバ イアビリティ、均一性及び純度を確認する。 例４ 氷管内の培養のアリコートを、解かした後、培地ＳＴ（前培養）５０mlを含有 している３００ml容エーレンマイヤーフラスコを接種するのに用いる。３０℃、 ２５０rpmで一晩インキュベーションした後、コルヒチンを最終濃度１g/lまで添 加された同一の培地５０mlに前培養５mlを移動させる。培養液を上記と同一の条 件下、２日間インキュベーションする。４時間毎に、試料は増殖レベル(６００n mでの吸光度を測定する)、コルヒコシド生成(ＴＬＣ及びＨＰＬＣ)、無菌性（Ｌ Ｂ寒天上）を評価するため、そして顕微鏡形態調査用にとる。 ＨＰＬＣ分析用に、培養ブロス１ml画分に、メタノール９mlを添加し、１３， ０００rpmで２分間遠心分離する。コルヒコシド上澄み液中の成分を、水：アセ トニトリル８０：２０系の溶離剤の手法によるイソクラクティック溶離で逆相Ｈ ＰＬＣにより分析する。 そのＨＰＬＣ分析は、コルヒチンのコルヒコシドへの変換の進行は成長のそれ に平行であることを証明する。約２６時間のインキュベーション後に、バイオコ ンバージョンは完了する。 コルヒコシドの最終収率は、８０〜８５％の範囲である。 例５ 培養液にコルヒチンの代わりに、チオコルヒチンを同一の最終濃度（１g/l） で添加した以外は、例４に記載した手法を繰り返す。 その培養体の増殖及び生成応答は、コルヒチンで得られたものに類似しており 、チオコルヒコシド収率は約９０％である。 例６ 培養体にコルヒチンの代わりに、３−脱メチルチオコルヒチンを同一の最終濃 度（１g/l）で添加する以外は、例４に記載した手法を繰り返す。その培養体の 増殖及び生成応答は、コルヒチンで得られたものに類似しており、チオコルヒコ シド収率は約９０％である。 例７ 培養体にコルヒチンの代わりに、Ｎ−ホルミルチオコルヒチンを同一の最終濃 度（１g/l）で添加する以外は、例４に記載した手法を繰り返す。その培養体の 増殖及び生成応答は、コルヒチンで得られたものに類似しており、チオコルヒコ シド収率は約９０％である。 例８ エーレンマイヤーフラスコ内のＳＴブロス１Lを、細胞株ＤＳＭ１６７０の氷 管培養で接種する。そのフラスコを＋３０℃、２５０rpmで一晩インキュベーシ ョンする。接種物を、最終濃度１g/lまでチオコルヒチンを添加した無菌ブロス ＳＴ９Lを含有する１４L容の発酵槽に無菌状態で移動させる。適切な撹拌−通気 レベル（撹拌９００rpmまで、通気１〜１．５vvm、培養体の増殖に依存して）を 保持しながら、発酵を行う。２時間毎に、試料を培養ブロスからとり、下記の分 析に付す： −６００nmでの光学的密度（ＯＤ）； −ＬＳ寒天上の細菌株の無菌度及び純度分析； −顕微鏡形態学(グラム菌)； −ＴＬＣ及びＨＰＬＣによるチオコルヒコシド含量分析。 ２８時間の発酵後、チオコルヒコシドへのトランスフォーメーションはほぼ終 了している。最終収率は約９０％である。 例９ ２８時間の発酵後、培養ブロス９０％のみを回収して、生成物（画分１）を抽 出する以外は、例８に記載した手法を繰り返す。残る１０％を、チオコルヒチン １０ｇを含有する新鮮な無菌培地ＳＴ９Lを有する発酵槽中に無菌で添加する。 例８に記載したように、発酵を行う。２６時間後、培養ブロス９Lを回収し、抽 出する(画分２)。残る容積分の培養ブロスに、チオコルヒチン（１０ｇ）を含有 する新鮮な無菌培地ＳＴを更に９Lと無菌で添加する。上記のように発酵を行う 。２６時間後、培養ブロスを完全に回収し、抽出する(画分３)。その細胞株のバ イオトランスフォーメーション活性は、変換収率約９０％、かつ単一バッチ法で 得られるものと比較して、ほぼ３倍の全チオコルヒコシド生成で、３回の運転中 すべてにおいて安定を保った。 例１０ 発酵（全量：約２７L）からの最終培養ブロスを、０．２２μmセラミックカー トリッジでの向流式マイクロろ過（cross-flow microfiltration）に付して、ブ ロスから細胞を分離する。浸透液を、三菱吸収樹脂、ＨＰ２１で充填したカラム で吸収する。水洗の後、生成物をメタノールで溶離する。メタノール溶離液を真 空下に蒸発乾固し、その後、メタノールに再溶解する。塩化メチレンでの抽出を 繰り返した後、そのアルコール画分を濃縮乾固し、次いでエタノール−塩化メチ レン、１：１混合物中に再溶解する。シリカゲルでの精製（clarification）後 、その溶液を真空下に濃縮し；塩化メチレンを、その後、エタノール置換する。 得られる懸濁液を濃縮し、放置して結晶化させる。エタノール−クロロホルム混 合物中の固体の更なる再溶解操作及びシリカゲルでの精製の後、エタノールでの ２回目の結晶化を行う。 得られる生成物は、ＨＰＬＣ、Ｃ−ＮＭＲ、Ｈ−ＮＭＲ及び質量スペクトルに より分析して、チオコルヒコシドの標準物と同一であることが分かった。

【手続補正書】 【提出日】１９９９年８月１９日（１９９９．８．１９） 【補正内容】 （１）明細書５頁下から６行及び８頁下から６行に記載の「スカラ希釈」を「段 階希釈」と補正する。 （２）同５頁下から６行に記載の「平行プレーティング」を「重複培養」と補正 する。 （３）同６頁上から８〜９行に記載の「トウモロコシ精製リキュール」及び７頁 上から４行に記載の「麦芽抽出物」を「コーンスチープリカー」と補正する。 （４）同６頁下から４行に記載の「副培養操作」を「継代手段」と補正する。 （５）同７頁上から１３行に記載の「熱力学」を「カイネティックス」と補正す る。 （６）同７頁下から１１行に記載の「バイオコンバージョン」を「酵素コンバー ジョン」と補正する。 （７）同７頁下から１０行に記載の「指数的増殖相」を「指数的増殖期」と補正 する。 （８）同８頁下から７行に記載の「無菌サリン」を「無菌生理食塩水」と補正す る。 （９）同８頁下から５行に記載の「寒天培基」を「寒天培地」に補正する。 （１０）同９頁下から１１行及び下から６行に記載の「殺菌」を「滅菌」と補正 する。 （１１）同１１頁上から１２行及び下から１４行に記載の「解かした」を「融か した」と補正する。 （１２）同１３頁上から１行に記載の「ＬＳ寒天」を「ＬＢ寒天」と補正する。 （１３）同１３頁上から２行に記載の「グラム菌」を「グラム染色」と補正する 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式（Ｉ）： （式中、Ｒ¹は、Ｏ−グリコシド基であり、Ｒ²は、水素又はＣ₁−Ｃ₇アシルであ り、Ｒ³は、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ又はＣ₁−Ｃ₆チオアルキルである） で示される３−Ｏ−グリコシルコルヒチノイド化合物の製造方法であって、Bacillus megaterium により、Ｒ¹がＯＨ又はメトキシである化合物をバイオトラ ンスフォーメーションすることを含む方法。 ２．Ｒ¹が、Ｏ−グルコシド基である化合物（Ｉ）の製造用の請求項１に記載の 方法。 ３．コルヒコシド及びチオコルヒコシドの製造用の請求項２記載の方法。 ４．バイオトランスフォーメーションを、深部培養において、pH６〜７、温度２ ８〜４０℃で、グルコース、フルクトース、又はグリセリンを炭素源として用い て行う、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 ５．用いる培養基が、Ｒ¹がヒドロキシ又はメトキシである化合物（Ｉ）を０． １〜３g/l含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。