PL187106B1

PL187106B1 - Sposób wytwarzania związków 3-O-glikozylokolchicynoidowych

Info

Publication number: PL187106B1
Application number: PL97331942A
Authority: PL
Inventors: Ezio Bombardelli; Cesare Ponzone
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 1996-10-07
Filing date: 1997-10-02
Publication date: 2004-05-31
Also published as: CZ295451B6; EP0931161B1; PL331942A1; CN1094978C; KR20000022478A; DE69710744T2; HUP9903806A2; CA2252725A1; HK1019620A1; NO991633L; DK0931161T3; NO319286B1; ATE213782T1; AU714810B2; DE69710744D1; HU224896B1; CZ118799A3; ES2171906T3; CN1218514A; KR100311067B1

Abstract

1. Sposób wytwarzania zwiazków 3-O-glikozylokolchicynoidowych, o wzorze (I) w którym R 1 oznacza reszte O-glikozydu, R2 oznacza atom wodoru lub C1-C7 acyl, R3 oznacza grupe C 1 -C6 alkoksylowa lub C1 -C6 tioalkilowa, znamienny tym, ze prowa- dzi sie biotransformacje zwiazków, w których R 1 oznacza OH lub grupe metoksylowa, za pomoca Bacillus megaterium. PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy biotransformacji związków kolchicynoidowych, prowadzonej za pomocą wybranych szczepów bakteryjnych, w odpowiednie pochodne 3-O-glikozylowe. Sposób według wynalazku zapewnia związki kolchicynoidowe glikozylowane wyłącznie przy atomie węgla C-3 pierścienia aromatycznego A, wychodząc z kolchicyny, tiokolchicyny lub ich pochodnych, z dużą wydajnością i czystością..

Związki kolchicynoidowe glikozylowane przy atomie węgla C-3 pierścienia benzenowego mają duże znaczenie farmakologiczne ze względu na ich dużą skuteczność lub do wytwarzania nowych leków.

Zwłaszcza, tiokolchikozyd (3-O-glikozylotiokolchicyna) jest substancją czynną o bardzo ważnym zastosowaniu w dziedzinie farmacji, głównie w leczeniu chorób układu mięśniowo-kostnego, i jako materiały wyjściowe do wytwarzania nowych leków przeciwnowotworowych, immunosupresyjnych, przeciwłuszczycowych i przeciwzapalnych.

W przeszłości prowadzono liczne próby wytwarzania związków 3-glikozylokolchicynoidowych albo za pomocą reakcji chemicznych albo przez biotransformację.

Droga chemiczna polega na sekwencji kompleksowych, niespecyficznych reakcji, prowadzących do mieszaniny glikozydowanych pochodnych, przy czym niektóre z nich są nieaktywne. Dlatego, wydajność konwersji do skutecznego produktu specyficznie glikozydowanego przy atomie węgla C-3 pierścienia aromatycznego, jest bardzo mała.

187 106

Podejście biologiczne zasadniczo dotyczy biotransformacji tiokolchicyny, przez hodowlę Centella Asiatica, w monoglikozydowane pochodne przy atomach węgla C-2 i C-3 pierścienia aromatycznego; dlatego taka transformacja nie jest wysoce selektywna i zapewnia niewielką wydajność i zdolność wytwórczą (Solet, J.M., et al., Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993).

Inne usiłowania biotransformowania związków kolchicynoidowych powodowały po prostu demetylację grup metoksylowych związanych z pierścieniem aromatycznym (przy atomach węgla C-2 i C-3), a w każdym razie zawsze charakteryzowało się ograniczoną wydajnością i zdolnością produkcyjną, a także złą regioselektywnością.

I tak, Hufford C.D. et al. (J. Pharm. Sc., 68, 10, 15 1239-1242, 1979), stosując Streptomyces griseus i/lub Streptomyces spectabilis, i Bellet P. et al., (GB 923421, 1959), stosując różne szczepy Streptomyces i inne szczepy bakterii i grzybów, próbowali przekształcić kolchicynę i jej pochodne w odpowiednie 3-demetylowane pochodne. Rezultaty uzyskane za pomocą tych znanych sposobów potwierdzają to, co powiedziano wyżej w związku z nieselektywnością uwikłanych w reakcję drobnoustrojowych enzymów, np. przy atomach węgla C-2, C-3 lub C-10 cząsteczki alkaloidu. Co więcej, zdolności produkcyjne wspomnianych układów katalitycznych są raczej złe, ze względu na niską wydajność konwersji, zmniejszone stężenia substratów, które można stosować, i częstą degradację pierścienia tropolonowego.

Ostatnio, Poulev et al. (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38, 1995) uzyskali specyficzną biotransformację drobnoustrojów bakteryjnych, ale ciągle ze złą wydajnością i zdolnością produkcyjną.

Aktywność enzymów pochodzących z drobnoustrojów podobnych do wspomnianych wyżej (Streptomyces, Bacillus, i podobne) stosowano do biotransformacji innych związków, takich jak maytansinoidy (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4361650: łzawa, M., et al., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). W tym przypadku reakcja katalityczna również polega wyłącznie na demetylacji, charakteryzując się niską wydajnością konwersji i zdolnością produkcyjną.

Aktywność transferazy glikozylowej α-amylazy pochodzącej z Bacillus megaterium została opisana (Brumm, P.J., et al.V, Starch, 43, 8, 319-323, 1991); przy czym specyficzność akceptora reakcji transferazy (wyłącznie glikoza lub glikozydy) jest szczególnie duża.

Transferazy cyklodekstrynowo-glikozylowe, wytwarzane przez te same źródło drobnoustrojowe, katalizują a-1,4-transglikozylację rubusozydu (ester p-D-glikozylowy 13-0-p-D-glikozylostewiolu), gdy wychodzi się ze skrobi. Także w tej biokonwersji akceptorem w reakcji transferazy jest substrat stanowiący frakcję glucydową (Darise, M., et al., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984). Transferazy cyklodekstrinowo-glikozylowe stosowano wcześniej do wytwarzania cyklodekstryn G6, G7 i G8 ze skrobi (Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. (Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).

Przykłady te świadczą o dużej specyficzności substratu aktywności transferazy glikozylowej eksprymowanej przez Bacillus megaterium, wymagającej tylko akceptorów glucydowych, i dlatego niezwiązanej z żadnymi reakcjami z udziałem drugorzędowych produktów metabolizmu o różnych, kompleksowych strukturach molekularnych, takich jak kolchicynoidy. W rzeczywistości, nie są znane przykłady stosowania tych drobnoustrojów do enzymatycznej konwersji kolchicynoidów w 3-glikozylowe pochodne.

Obecnie stwierdzono, że szczepy Bacillus megaterium zdolne do wzrastania w obecności dużych stężeń kolchicyny i tiokolchicyny, wykazują znacznie wyższą, bardzo specyficzną aktywność biotransformacji substratów kolchicynoidowych w pochodne glikozylowane wyłącznie przy atomie węgla C-3 pierścienia aromatycznego. Takie przekształcenie zachodzi w bardzo krótkim czasie i charakteryzuje się nieoczekiwanie dużą wydajnością.

Dlatego, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania związków 3-O-glikozylokolchicynoidowych o wzorze (I)

187 106

w którym Ri oznacza resztę O-glikozydu, R₂ oznacza atom wodoru lub C1-C7 acyl, R3 oznacza grupę C1-C6 alkoksylową lub C1-C6 tioalkilową, polegającego na tym, że prowadzi się biotransformację związków, w których R1 oznacza OH lub grupę metoksylową, za pomocą Bacillus megaterium.

Bacillus megaterium jest Gram-dodatnią bakterią tworzącą spory, o średnicy komórki większej niż 1,0 pm; wzrastającą aerobowo na licznych pożywkach hodowlanych; katalazododatnią; hydrolizującą żelatynę.

Szczepy Bacillus megaterium, które można stosować zgodnie z wynalazkiem, okazały się być zdolne do wzrastania zadawalająco i do zachowywania żywotności także przy dużych stężeniach kolchicyny i/lub tiokolchicyny (powyżej 3 g/litr), jak to potwierdziły badania wzrostu i analiza mikroskopowa.

Szczepy tego samego gatunku, takie jak Bacillus cereus, już przy stężeniach substratu 1,5 g/litr wykazują trudności we wzroście (absorbancje rzędu 15 - 25% kontroli), co staje się nawet wyraźniejsze przy stężeniach 3 g/litr, gdy następuje bardzo silna autoliza. Wybrane hodowle Bacillus megaterium, w przeciwieństwie do tego, przy wspomnianych stężeniach mogą osiągnąć znacznie wyższe poziomy wzrostu (dwukrotnie do trzykrotnie) w porównaniu z Bacillus cereus.

Duża selektywność i skuteczność biotransformacji jest nieoczekiwane i niezwykłe, gdyż wydajność wynosi od 80% do 100%, zwykle około 90 - 95%.

Co więcej, drobnoustroje stosowane w biokonwersji są zdolne do utrzymywania stale aktywności katalitycznej, nawet podczas powtarzanych etapów fermentacji, zapewniając tym samym specyficzną biokonwersję w procesach okresowych i ciągłych. Dlatego, sposób ten zapewnia wysoką zdolność produkcyjną i powtarzalność działania.

Znaczna regioselektywność reakcji zapewnia, oprócz znacznych wydajności produkcji, wysoką jakość i czystość powstałego produktu, zapewniając jego 100% czystość, w prostym procesie współprądowym.

Ponadto, ważnymi zaletami są zmniejszona przypadkowość etapu oczyszczania i odzyskiwania produktu, ekonomiczność procesu i łatwość stosowania procesu i jego bezpieczeństwo.

Kolejność czynności do selekcji szczepów bakterii dających się stosować w sposobie według wynalazku obejmuje:

A) Selekcję hodowli Bacillus megaterium zdolny do wzrostu w obecności wysokich stężeń substratu kolchicynowego, wychodząc ze źródeł naturalnych lub z kolekcji szczepów.

B) Selekcje izolatu z A), aby zweryfikować aktywność transformacji kolchicyny w odpowiednie pochodne 3-O-glikozylowe, za pomocą prób biokonwersji na specyficznych substratach, podawanych w stopniowo wzrastających stężeniach.

C) Mikrobiologiczną charakteryzację szczepów wyselekcjonowanych według punktu B).

D) Stopniowe zwiększanie wydajności biotransformacji, za pomocą celowo-specyficznej selekcji populacji bakterii z punktu B).

E) Badanie i optymalizację krytycznych parametrów fermentacji, aby zoptymalizować biotransformację.

F) Badanie i optymalizację sposobów konserwacji hodowli o dużej zdolności produkcyjnej, aby zagwarantować trwałe, homogeniczne inokula do zastosowań produkcyjnych na skalę przemy słową.

187 106

G) Powiększanie skali procesu w fermentatorze w procesach okresowych, półciągłych i ciągłych. H) Wypracowanie i optymalizację sposobów dla procesu współprądowego i odzyskiwania produktu.

Konkretnie, drobnoustroje dające się stosować w niniejszym wynalazku można wybrać, wychodząc z kolekcji hodowli otrzymanych z centrów deponowania szczepów, lub z próbek gleby różnego pochodzenia, przez selektywne odzyskiwanie na różnych pożywkach agarowych zawierających organiczne źródło azotu (peptony, ekstrakty drożdżowe, ekstrakty mięsne, asparaginę, i podobne), źródło węgla (glicerynę, skrobię, maltozę, glikozę, i podobne), przy pH 5 do 8, korzystnie 6-7. Temperatura inkubacji waha się od 20° do 45°C, korzystnie 28°-40°C.

Zdolność hodowli do wzrastania w obecności toksycznego stężenia substratu kolchicynowego, który ma być przekształcany, i ocenia techniką rozcieńczania skalarnego i posiewania bakterii równolegle na różnych agarowanych stałych substratach, do których części dodano wcześniej kolchicynę lub tiokolchicynę, w stężeniach od 0,1 to 3 g/litr (tak aby zahamować wzrost większości drobnoustrojów).

Kolonie zdolne do wzrastania w opisanych warunkach usuwa się w warunkach jałowości i umieszcza na różnych agarowanych pożywkach, aby zweryfikować ich czystość i jednorodność wzrostu.

Pożywki hodowlane stosowane do konserwacji hodowli są typowymi substratami mikrobiologicznymi, zawierającymi organiczne źródła azotu (peptony, ekstrakty drożdżowe, trypton, ekstrakty mięsne, i podobne), źródło węgla (glikozę, maltozę, glicerynę, i podobne), przy pH 5 do 8, korzystnie 6-7. Temperatura inkubacji waha się od 20° do 45°C, korzystnie 28°-40°C.

Wyselekcjonowane drobnoustroje bada się następnie pod kątem zdolności wzrastania w hodowli podpowierzchniowej, w obecności związków kolchicynoidowych, i przekształcania tych ostatnich w odpowiednie pochodne 3-glikozylowe.

Próby te prowadzi się w kolbach o pojemności 100 ml, zawierających 20 ml ciekłej pożywki, o różnych składach, zawierających jedno lub większą liczbę organicznych źródeł azotu, (ekstrakty drożdży, peptony, trypton, hydrolizaty kazeiny, ekstrakt mięsa, wyciąg namokowy kukurydzy, i podobne), jedno lub większą liczbę źródeł węgla (glikoza, gliceryna, skrobia, sacharoza, i podobne), nieorganiczne źródła fosforu i źródła azotu, i nieorganiczne sole różnych jonów (K+, Na+, Mg‘^H’, Ca+, Fe++, Mn, i podobne).

Próbki hodowli można ewentualnie poddawać obróbce mutagenicznej, za pomocą znanych technik mutagenezy (napromieniowanie promieniami UV, i podobne) aby wywołać powstanie mutantów o specyficznej aktywności biokonwersji, którą można oceniać w taki sam sposób jak opisano wyżej.

Próbki hodowli z każdej próby biokonwersji analizowano, aby ocenić wytwarzanie pochodnych 3-glikozylowych, za pomocą chromatografii TLC i HPLC.

Zdolność wyselekcjonowanych drobnoustrojów do transformowania substratów kolchicynoidowych w odpowiednie pochodne 3-glikozylowe potwierdzono za pomocą prób biokonwersji w kolbach, w skali 300 ml, w tym samym bulionie hodowlanym jak stosowany w etapie selekcjonowania.

Drobnoustroje reagujące dodatnio stosowano w próbach optymalizacji biokonwersji, w różnych bulionach hodowlanych, w skali 300 ml. Głównymi badanymi parametrami hodowli i fermentacji są: organiczne źródła azotu, źródła węgla, sole mineralne, temperatura, mieszanie-napowietrzanie, pH, czas inkubacji, stosunek inokulum, etapy podhodowli, czas dodawania przekształcanego substratu.

Wyselekcjonowane drobnoustroje bakteryjne, zdolne do przeprowadzenia biotransformacji według wynalazku, mogą wzrastać zarówno na stałych jak i ciekłych substratach hodowlanych, zawierających jedno lub większą liczbę organicznych źródeł azotu, korzystnie ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsa, pepton, trypton, hydrolizaty kazeiny, wyciąg namokowy kukurydzy, i podobne. Źródłami węgla, przydatnymi do wzrostu i biotransformacj i są glikoza, fruktoza, sacharoza, gliceryna, ekstrakt słodu, i podobne, korzystnie

187 106 glikoza, fruktoza i gliceryna. Pożywka hodowlana zawiera ponadto nieorganiczne źródła fosforu i sole K+, Na+, Mg⁺⁺, NH4 , i podobne.

Wyselekcjonowane drobnoustroje mogą wzrastać w temperaturze od 20° do 45°C, korzystnie od 28° do 40°C, przy pH od 5 - 8, korzystnie 6 - 7. W tych samych warunkach rozważane drobnoustroje są zdolne do transformowania związków kolchicynoidowych w odpowiednie pochodne 3-glikozylowe. Przekształcenia te zachodzą w hodowli podpowierzchniowej, w kolbach inkubowanych na wstrząsarce obrotowej, z mieszaniem z prędkością od 150 do 250 obrotów/minutę.

Dzięki szczególnej kinetyce omawianej biotransformacji, związanej ze wzrostem drobnoustroju, optymalne warunki biotransformacji są takie same jak warunki optymalne dla wzrostu. Dlatego, pożywki hodowlane przydatne do promowania dobrego wzrostu drobnoustroju, takie jak te, które są oparte na wspomnianych wyżej składnikach organicznych i nieorganicznych, są także przydatne dla dobrej aktywności biotransformacji przedmiotowego substratu. Ten ostatni dodaje się do hodowli w etapie rozpoczęcia fermentacji.

Biotransformacja według wynalazku oparta jest na konwersji enzymatycznej, rozpoczynającej się podczas wykładniczej fazy wzrostu i jest kontynuowana z progresją równoległą do tego wzrostu; maksymalne poziomy konwersji do pochodnych 3-glikozylowych (bardzo wysokie: aż do 95 - 100%) osiąga się w ciągu pierwszych 24 - 30 godzin. Regioselektywność biotransformacji jest absolutna: zawsze brak jest obecności pochodnych 2-glikozylowych. Powstałe produkty są wyłącznie produktami pozakomórkowymi.

Skalę biotransformacji według wynalazku można powiększać aż do prowadzenia jej w fermentatorze, utrzymując niezmienione warunki hodowli, zwłaszcza jeśli chodzi o pożywkę hodowlaną, temperaturę i czas prowadzenia procesu. Dla uzyskania dobrych wzrostów ważny jest odpowiedni poziom mieszania - napowietrzania, zwłaszcza wymagany jest poziom napowietrzania wynoszący 1-2 litrów powietrza na litr hodowli na minutę (vvm), korzystnie 1,5-2 vvm.

Produkty powstające w wyniku biokonwersji ekstrahuje się z brzeczki hodowlanej po oddzieleniu biomasy od ciekłej frakcji przez odwirowanie i odzyskuje się Supematant, lub przez mikrofiltrację i odzyskuje się przepuszczalną warstwę. Hodowlę można traktować alkoholami, mając na względzie optymalne odzyskanie produktu.

Oczyszczanie i odzyskiwanie produktów biotransformacji można prowadzić, stosując techniki chromatograficzne rozdzielania na żywicach absorpcyjnych i eluowania alkoholami, korzystnie metanolem. Roztwory wodno-metanolowe zawierające produkt można dalej oczyszczać przez ekstrakcję lipofilowymi rozpuszczalnikami organicznymi, korzystnie chlorkiem metylenu. Po dalszym traktowaniu mieszaninami alkoholi i rozpuszczalników organicznych, produkt można otrzymywać w stanie czystym z powstałych roztworów alkoholowych przez krystalizację.

Proces biotransformacji jest specyficzny w odniesieniu do substratów zawierających grupę tropolonową i może być stosowany w odniesieniu do licznych związków kolchicynoidowych, takich jak kolchicyna, tiokolchicyna, 3-dezmetylokolchicyna, 3-dezmetylotiokolchicyna, N-deacetylotiokolchicyna i inne różnie podstawione kolchicyny.

Inne związki naturalne pozbawione tropolonu nie są glikozylowane przez Bacillus megaterium.

Glikoza może być zastąpiona innymi cukrami, takimi jak fruktoza lub galaktoza, bez powodowania utraty aktywności transferazy glikozylowej.

Następujące przykłady ujawniają wynalazek bardziej szczegółowo.

Przykład I.

Małe próbki hodowli Bacillus megaterium, wyizolowanego z gleby uprawnej, zawieszono ponownie w 20 ml jałowej solanki, i poddano skalarnemu rozcieńczaniu do wskaźnika rozcieńczenia 1:10.000.000. Zawiesiny o różnych rozcieńczeniach umieszczano na płytkach z pożywką hodowlaną LB-Agar i na pożywce hodowlanej LB-Agar odpowiednio z dodatkiem kolchicyny lub tiokolchicyny, do końcowego stężenia 2 g/litr (patrz tablica). Hodowle inkubowano w ciemności w ciągu 3 dni w temperaturze +28°C. Wyizolowano kolonie wzrastające na selektywnej pożywce z dodatkiem kolchicynoidu, i oczyszczano je za pomocą umieszczania

187 106 na płytkach na nieselektywnej pożywce; przy czym próbki te inkubowano jak opisano wyżej, ale przez krótszy czas (24 godziny). Następnie hodowlę przenoszono do takiej samej pożywki agarowej, w probówkach do badań, i inkubowano w ciągu 24 godzin jak opisano wyżej.

Małe próbki hodowli, wyselekcjonowane jak opisano wyżej, stosowano do zaszczepienia kolb Erlenmeyera o pojemności 100 ml, zawierających 20 ml pożywki hodowlanej ST (patrz tabela), z dodatkiem kolchicyny lub tiokolchicyny, do końcowego stężenia 0,4 mg/ml. Hodowle te inkubowano w ciągu nocy w temperaturze 28°C, na wstrząsarce obrotowej, przy 200 obrotach/minutę. Transformację substratu kolchicynowego sprawdzano, poddając analizie małe próbki brzeczki hodowlanej, pobierane co 3 - 4 godziny, metodą chromatografii TLC na żelu krzemionkowym, stosując układ eluujący aceton : octan etylu : woda 5:4: 1. Po 4 dniach inkubacji, podpróbki hodowli, które wykazywały oczywistą aktywność katalityczną w odniesieniu do pochodnej 3-glikozylowej, odzyskiwano na płytkach za pomocą rozcieńczania skalarnego jak opisano wyżej, w celu sporządzenia nowego inokulum w probówce do badania. Próbę biotransformacji w kolbie powtórzono w takich samych warunkach jak opisano wyżej, lecz stosując znacznie wyższe stężenia kolchicyny i tiokolchicyny (125 mg/ml). Najaktywniejsze pojedyncze kultury (konwersja substratu równa lub wyższa niż 80%) stosowano do sporządzania inokulum w zamrożonych krioprobówkach, jak opisano w przykładzie III.

Tabela

Skład pożywki hodowlanej

LB-Agar (Sterylizacja: 121°C w ciągu 20 minut) - pH 7
Trypton Ekstrakt drożdży NaCl Agar Agar	10,0 g/litr 5,0 g/litr 10,0 g/litr 15,0 g/litr
Bulion ST (Sterylizacja: 121°C w ciągu 20 minut) - pH 7
Glikoza	20,0 g/litr
Glicerol	10,0 g/litr
Pepton	15,0 g/litr
Ekstrakt drożdży	5,0 g/litr
NaCl	3,0 g/litr
NH4CI	3,0 g/litr
K2HPO4	8,0 g/litr
KH2PO4	3,0 g/litr
MgSO4 · 7H2O	0,5 g/litr

Przykład II.

Postępowano jak w przykładzie I, wychodząc z kultur Bacillus megaterium, pochodzących z następującej kolekcji szczepów (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Niemcy): DSM 90, 509, 322, 333, 1667, 1670, 1671.

DSM	90,
DSM	509,
DSM	322,
DSM	333,
DSM	1667,

187 106

DSM 1670,

DSM 1671.

Hodowle selekcjonowano jak w przykładzie I z dodatkiem tiokolchicyny (1 mg/ml) inkubowano w ciągu 4 dni w ciekłej hodowli: analiza metodą TLC wykryła następującą transformację substratu w tiokolchikozyd, przy czym wydajność konwersji wahała się od 50% (szczep DSM 1671) do 70% (szczep DsM 90), do 80% i więcej (szczepy DSM 333, DSM 509, DSM 1667, DSM 1670).

Przykład III. Podpróbki próbek hodowli w probówkach, wyselekcjonowanych jak opisano w powyższych przykładach, stosowano do zaszczepienia kolb Erlenmeyera o pojemności 100 ml, zawierających 20 ml bulionu ST.

Hodowle bulionowe inkubowano w ciągu nocy w temperaturze +30°C, na wstrząsarce obrotowej przy szybkości 200 obrotów/minutę. Po inkubacji, do hodowli dodano wyjałowiony roztwór glicerolu do końcowego stężenia 20%. Hodowle umieszczano następnie w probówkach do zamrażania o pojemności 2 ml i niezwłocznie zanurzano w ciekłym azocie.

Po kilku dniach, 10% hodowli rozmrożono szybko w temperaturze 37°C. Podpróbki z każdej z probówek do zamrażania stosowano do zaszczepiania kolb Erlenmeyera o pojemności 100 ml, zawierających 20 ml pożywki ST, które następnie inkubowano przez noc w temperaturze +28°C, (prehodowla), przy 200 obrotach/minutę. Po inkubacji, 2 ml każdej prehodowli przenoszono w sterylnych warunkach do 20 ml świeżej pożywki ST, do której tym razem dodano kolchicynę lub tiokolchicynę, do końcowego stężenia 1 g/litr. Biotransformację prowadzono i kontrolowano w warunkach opisanych w przykładzie I. Analiza potwierdziła, że przekształcanie substratu w pochodną 3-glikozylową zachodzi z wydajnością ilościową podaną wyżej (80% i wyższą), co dowodzi trwałości katalitycznej zamrożonych hodowli.

Równoległe próbki kontrolne hodowli bulionowych umieszczonych na płytkach z agarem LB Agar niezwłocznie po rozmrożeniu potwierdziły żywotność, homogeniczność i czystość zamrożonych hodowli.

Przykład IV. Podpróbki hodowli w probówkach do zamrażania stosowano, po szybkim rozmrożeniu, do zaszczepiania kolb Erlenmeyera o pojemności 300 ml, zawierających 50 ml pożywki ST (prehodowla). Po inkubowaniu przez noc w temperaturze 30°C, przy 250 obrotach/minutę, 5 ml prehodowli przenoszono do 50 ml tej samej pożywki z dodatkiem kolchicyny do końcowego stężenia 1 g/litr. Hodowle inkubowano w ciągu 2 dni, w takich samych warunkach jak opisano wyżej. Co 4 godziny pobierano próbki dla oceny poziomu wzrostu (oznaczanie absorbancji przy 600 nm), wytwarzania kolchikozydu (TLC i HPLC), jałowości (na agarze LB Agar), i do mikroskopowych badań morfologicznych.

Dla celów analizy metodą HPLC, do 1 ml frakcji bulionu hodowlanego dodawano 9 ml metanolu i wirowano je w ciągu 2 minut przy 13000 obrotach/minutę. Zawartość kolchikozydu w supematancie analizowano metodą chromatografii HPLC z odwróconymi fazami, z eluowaniem izokratycznym, za pomocą układu rozpuszczalników woda : acetonitryl 80 : 20.

Analiza metodą HPLC dowiodła, że konwersja kolchicyny w kolchikozyd postępuje z progresją równoległą z progresją wzrostu. Po około 26 godzinach inkubacji, biokonwersja zostaje zakończona.

Końcowa wydajność kolchikozydu wynosi od 80° do 85%.

Przykład V.

Postępowano jak w przykładzie IV, dodając do hodowli tiokolchicynę zamiast kolchicyny, w takim,samym końcowym stężeniu (1 g/litr).

Wzrost i reakcje produkcyjne hodowli są podobne do uzyskiwanych w przypadku stosowania kolchicyny, przy czym wydajność tiokolchikozydu wynosi około 90%.

Przykład VI.

Postępowano jak w przykładzie IV, dodając do hodowli zamiast kolchicyny 3-demetylotiokolchicynę, w takim samym końcowym stężeniu (1 g/litr).

Wzrost i reakcje produkcyjne hodowli są podobne do uzyskiwanych wyżej, przy czym wydajność tiokolchikozydu wynosi około 90%.

187 106

Przykład VII. Postępowano jak w przykładzie IV, dodając do hodowli zamiast kolchicyny N-formylotiokolchicynę, w takim samym końcowym stężeniu (1 g/litr). Wzrost i reakcje produkcyjne hodowli są podobne do uzyskiwanych wyżej, przy czym wydajność tiokolchikozydu wynosi około 90%.

Przykład VIII. Jeden litr bulionu ST w kolbie Erlenmeyera zaszczepiono hodowlą z probówki do zamrażania szczepu DSM 1670. Kolby inkubowano przez noc w temperaturze +30°C, przy 250 obrotach/minutę. Inokulum przeniesiono w warunkach jałowości do fermentatora o pojemności 14 litrów, zawierającego 9 litrów jałowego bulionu ST, do którego dodano tiokolchicynę do końcowego stężenia 1 g/litr. Fermentację prowadzono, utrzymując stały poziom mieszania/napowietrzania (mieszanie z szybkością do 900 obrotów/minutę; napowietrzanie 1 do 1,5 vvm, w zależności od wzrastania hodowli). Co 2 godziny pobierano próbki brzeczki hodowlanej i poddawano je następującej analizie:

- Badaniu gęstości optycznej (OD) przy 600 nm;

- Analizie sterylności i czystości szczepu na Agarze L9;

- Badaniu mikroskopowemu morfologii (barwienie Grama);

- Badaniu zawartości tiokolchikozydu metodą chromatografii TLC i HPLC.

Po 28 godzinach fermentacji, transformacja w tiokolchikozyd zostaje niemal zakończona. Końcowa wydajność wynosi około 90%.

Przykład IX.

Powtórzono sposób postępowania z przykładu VIII, ale po 28 godzinach fermentacji odzyskiwano tylko 90% brzeczki hodowlanej, aby wyekstrahować produkt (frakcja 1). Pozostałe 10% dodano w warunkach jałowości do fermentatora zawierającego 9 litrów świeżej jałowej pożywki ST zawierającej 10 g tiokolchicyny Fermentację prowadzono jak opisano w przykładzie VIII. Po 26 godzinach zebrano 9 litrów brzeczki hodowlanej i ekstrahowano (frakcja 2). Do pozostałej objętości brzeczki hodowlanej w jałowych warunkach dodano dalszych 9 litrów świeżej jałowej pożywki ST zawierającej świeżą tiokolchicynę (10 g). Fermentację prowadzono jak wyżej. Po 26 godzinach zgromadzono całość brzeczki hodowlanej i ekstrahowano (frakcja 3). Aktywność biotransformacji szczepu pozostawała stała we wszystkich trzech etapach, z wydajnością konwersji około 90%, i z zasadniczo potrojonym wytwarzaniem tiokolchikozydu, w porównaniu z uzyskiwanymi w pojedynczym procesie okresowym.

Przykład X.

Końcową brzeczkę hodowlaną z procesu fermentacji (całkowita objętość: około 27 litrów) poddano mikrofiltracji z przepływem poprzecznym na wypełnieniu ceramicznym 0,22 pm, aby oddzielić komórki od brzeczki. Przesiąkliwy materiał absorbowano na kolumnie wypełnionej żywicą absorbującą HP 21, produkcji firmy Mitsubishi. Po przemyciu wodą produkt eluowano metanolem. Eluat metanolowy zatężano do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym ponownie rozpuszczano go w metanolu. Po powtórnych ekstrakcjach chlorkiem metylenu frakcję alkoholowe zatężono do sucha i ponownie rozpuszczono w mieszaninie 1 : 1 etanol - chlorek metylenu. Po klaryfikacji żelem krzemionkowym, roztwór ten zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem; chlorek metylenu zastępowano następnie etanolem. Powstałą zawiesinę zatężono i pozostawiono to do krystalizacji. Drugą krystalizację z etanolu prowadzono po dalszych operacjach ponownego rozpuszczania substancji stałej w mieszaninach etanol - chloroform i klaryfikacji na żelu krzemionkowym.

Powstały produkt, analizowany metodami HPLC, C-NMR, H-NMR i spektroskopii masowej okazał się być taki sam jak standard tiokolchikozydowy.

Claims

1. Sposób wytwarzania związków 3-O-glikozylokolchicynoidowych, o wzorze (I) w którym Ri oznacza resztę O-glikozydu, R2 oznacza atom wodoru lub C1-C7 acyl, R3 oznacza grupę C1-C6 alkoksylową lub C1-C6 tioalkilową, znamienny tym, że prowadzi się biotransformację związków, w których R1 oznacza OH lub grupę metoksylową, za pomocą Bacillus megaterium·.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się związki o wzorze (I), w których R1 oznacza resztę O-glikozydu.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wytwarza się kolchikozyd i tiokolchikozyd.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację prowadzi się w hodowli podpowierzchniowej w temperaturze od 28 do 40°C, przy pH od 6 do 7, a jako źródło węgla stosuje się glikozę, fruktozę lub glicerol.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą 0,1 do 3 g/litr związków o wzorze (I), w których R1 oznacza grupę hydroksylową lub metoksylową.