JP2000508530A - スーパーオキシドジスムターゼ複合体製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 スーパーオキシドジスムターゼ即ちＳＯＤを開示する。スーパーオキシドジスムターゼの原料として、発芽した種子を本発明に従って用い、その後、ペルオキシダーゼ及び酵素補因子と複合化させることができる。従って、抗フリーラジカル活性を有する化粧用、医薬用又は食用組成物を得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 スーパーオキシドジスムターゼ複合体製品 本発明は、ＳＯＤに基づく複合体製品、これを含有する化粧用、医薬用及び食 用組成物、並びに、抽出方法に関する。 本発明は、また、発芽した植物の種子からスーパーオキシドジスムターゼを抽 出／精製する方法、及び、Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤、特にペルオキシダーゼとその組み合わ せであって好ましくはその酵素補因子を組み合わせたものにも関する。この酵素 複合体は極めて安定であり、組成物、特に、化粧用、医薬用又は食用組成物にお いて使用可能である。導入部 より正確には、本発明は、発芽した植物の種子、即ち、発芽工程を経た植物の 種子からスーパーオキシドジスムターゼ（以後、ＳＯＤとして略記する）を得る ことを目的とするものであり、植物の種子の発芽後に得られるこのＳＯＤは、ス ーパーオキシド不均化反応の副生物、主に過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を分解すること ができるカタラーゼやペルオキシダーゼ等の他の酵素と組み合わせて、抗ラジカ ル性組成物において用いた場合、高い酵素活性及びより優れた安定性を有する。 従って、本発明は、化粧用組成物、医薬用若しくは皮膚科用組成物、又は、食用 組成物における好適な用途を見出した。 フリーラジカルが、外殻軌道に不対電子を持つ原子又は分子であることはよく 知られている。これは、その電子を対にするため、ほとんどの安定な分子と反応 し得る極めて不安定な化合物である。 酸素のフリーラジカルは、ミトコンドリア内や食作用の過程を通じて、生体内 で連続的に生成している。紫外線照射への曝露及び人間の活動する環境等の物理 的要因が、生体内化合物のレベルで多量のフリーラジカルを産出する要因でもあ る。この要因としては、例えば、自動車による汚染、タバコ、電離放射線等があ る。 酸素のフリーラジカルは、分子状酸素の一部還元により形成される。酸素が電 子を捕捉することにより、スーパーオキシドラジカルＯ₂ ^・-が生成する。このア ニオンは余り反応性の高いものではないが、極めて反応性の高いラジカル種を産 出することができる。ＳＯＤによるスーパーオキシドアニオンの酵素的不均化は 過酸化水素の形成につながり、この過酸化水素は、第一鉄の存在下でフェントン 反応を経て、極めて反応性の高いヒドロキシルラジカルＯＨ^・形成する。 フリーラジカルは、その高い反応性のために、全ての細胞成分を攻撃すること ができ、重大な変性を引き起こすことができる：皮膚では、フリーラジカル、特 にスーパーオキシドアニオンの主な標的はコラーゲンであるが、エラスチン繊維 、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカン、細胞内のＤＮＡ、細胞膜のリン 脂質等をも攻撃する。 コラーゲン及びエラスチン繊維が、生成したフリーラジカルを直接捕捉すると 、種々の劣化：ペプチド鎖の断裂、及び、非特異的なプロテアーゼにより分解さ れた低ペプチドの放出、弾性を減少させる鎖間の結合等が生じる結果になる。 また、酸素の活性状態が持つ破壊的作用を打ち消すことを目的として、化粧品 、医薬品又は食品等の各分野において、抗酸化剤に基づく組成物を調製する必要 性がますます高くなっている。化粧品では、このような組成物が既に市販されて おり、抗老化用製品として知られている。従来技術 化粧品又は医薬品で現在利用されている抗酸化剤は、フリーラジカルを捕捉す る化学物質か、又は、常温でも非常に安定性の乏しいという大きな欠点を持つ酵 素系のいずれかである。 利用されている親油性捕捉剤としては、通常、生成する過酸化ラジカルを減少 させることにより脂質の過酸化から細胞膜を保護する細胞膜成分であるビタミン Ｅ及びβ−カロチンがある。 利用されている親水性抗酸化剤としては、通常、水性媒体中でスーパーオキシ ド及びヒドロキシルラジカルに対抗する作用があるビタミンＣを含むが、グルタ チオン及び亜鉛等の酵素補因子をも含む。グルタチオンは、抗ラジカル性の防御 に関与する多数の酵素（グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオントランス フェラーゼ等の酵素）の補因子であるが、亜鉛は銅−亜鉛ＳＯＤの補因子である 。 ＳＯＤは化粧品又は医薬品で用いられている酵素であり、その役割は、生体及 び皮膚組織にとって潜在的に有害であるスーパーオキシドラジカルをほぼ瞬時に 分解することである。ＳＯＤが触媒する反応は、以下の化学反応に従って過酸化 水素を与えるスーパーオキシドアニオンの不均化である。 スーパーオキシドジスムターゼのイソ酵素としても知られ、主に小麦の胚芽か ら単離された酵素が、種々存在しており、当業者は、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅ ｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１９７３年、３１７巻、５０〜６４頁に記 載されたＢｅａｕｃｈａｍｐの論文を参照することができる。この論文において 、Ｂｅａｕｃｈａｍｐは３つのＳＯＤ酵素を単離したと報告した。その内の１つ は、ＭｎＳＯＤとして知られるもので、マンガンに対して感受性を持ち、０．２ ｍＭのシアン化物で阻害されないが、クロロホルム及びエタノールに基づくツチ ハシ（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ）の処理により不活性化される。他の２つのＳＯ ＤはＣｕ−ＺｎＳＯＤタイプのもので、シアン化物で阻害されるが、クロロホル ム及びエタノールによる処理では影響を受けない。後者の２つの酵素は、プロト マー当たりＣｕ²⁺イオン１つとＺｎ²⁺イオン１つを含んでおり、およそ３０００ ０ダルトンの分子量を持つ。 皮膚組織に存在するＣｕ−ＺｎＳＯＤが、紫外線によって生じるフリーラジカ ルに対して酵素が行う最初の防衛線を形成することに注目されたい。しかしなが ら、興味深いことに、この酵素は、紫外線の照射後にその無毒化能力が著しく減 少する。また、この事実によって、化粧学又は薬理学の専門家達は、皮膚組織に 存在するフリーラジカル量を減少させるために、調剤にＳＯＤを配合することを 試みた。 Ｌ’Ｏｒｅａｌは、ＵＳ−Ａ−４１２９６４４号で、化粧用組成物において、 並びに、毛髪のケラチン構造を維持するため又はこのようなＳＯＤの塗布により 皮膚及び毛髪を保護するための利用方法において、スーパーオキシドジスムター ゼ酵素を使用することを提案している。ここでは、主にウシ血液又は各種菌株（ クレーム２〜５）から、ＳＯＤを入手している。 Ｌ’Ｏｒｅａｌは、更に、ＷＯ９２／１９２２４号で、ある種の金属錯化不活 性剤が、有害なヒドロキシルラジカル（ＯＨ^・）の産出を減少させる場合がある という証拠に基づいて、皮膚の老化に対抗し、かつ、照射から皮膚を保護するこ とを目的とした、様々な由来（動物、ヒト、細菌、酵母又は生物工学的）のＳＯ Ｄと、金属錯化剤としてのホスホン酸誘導体とに基づく局所用抗フリーラジカル 性組成物も提案している。 また、ＦＲ−Ａ−２６３４１２５号ニッポン（Ｎｉｐｐｏｎ）より、ＳＯＤ、 ホスフェート、アルカリ金属塩化物及びショ糖（クレームを参照）からなる安定 化されたスーパーオキシドジスムターゼ組成物が知られている。実際に、ＳＯＤ がヒトの血液から抽出されている 更に、ＦＲ−Ａ−２６９３２０８号イノコスム（Ｉｎｏｃｏｓｍ）より、小麦 の胚芽等の穀類から、液体アルコールを用いた抽出、ポリアミド又はポリビニル ピロリドン等の固着剤を用いたポリフェノールの除去、洗浄、そして最後に、液 体アルコールを再び用いたタンパク質及び酵素の抽出によって、植物由来のＳＯ Ｄの酵素組成物を得る方法が知られている。得られたＳＯＤ活性は非常に低く、 溶媒の使用がこのＳＯＤ抽出物の使用を困難にしている。 現在まで、工業的なＳＯＤは、屠殺場で多量に入手できるウシの赤血球から抽 出することにより入手していた。 他方で、少なくともＢｅａｕｃｈａｍｐらのＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１９７３年、３１７巻、５０〜６４頁で、小 麦の胚芽からＳＯＤを抽出することが知られており、そしてまた、少なくとも１ つの同様の特許が１９９２年にイノコスム（Ｉｎｃｏｓｍ）（ＦＲ−Ａ−２６９ ３２０８号）によって提出されていることが知られているのであるが、穀物の胚 芽に含まれるＳＯＤの割合が低く、また、低い収率の溶媒媒体で抽出する方法を 用いるために、植物由来のＳＯＤの抽出割合が非常に低いことが明らかにされて いる。 従って、本発明は、特に化粧用、医薬用又は食用分野において、工業的規模で 使用できるように、極めて高収率で多量に植物由来のＳＯＤを得ることができる 溶液を提供するという新規の技術的課題を解決することを主要目的とするもので ある。 本発明は、また、極めて活性が高くしかも極めて安定な植物由来のＳＯＤを得 ることができる溶液、好ましくは、常温で１か月間（３５日間）その活性の８０ ％を、４５℃ではその活性の５０％を保持することができるため、抗ラジカル性 組成物、特に化粧用、医薬用又は食用組成物に効率よく配合することができる溶 液を提供するという新規の技術的課題を解決することを目的とするものでもある 。 これらの技術的課題は全て、本発明により、簡便、安全かつ確実な方法で初め て解決されたものであり、このことは、当業者にとって自明でない予想外の技術 結果となる。 すなわち、第１の態様において、本発明は、Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤、好ましくはペルオ キシダーゼ、より好ましくは植物のペルオキシダーゼ、更に好ましくはペルオキ シダーゼ特異還元物質として公知のペルオキシダーゼ補因子、により安定化され たスーパーオキシドジスムターゼ即ちＳＯＤに基づく複合体製品に関する。 上記ＳＯＤは植物由来のものが好ましい。 ある実施の形態によれば、上記ＳＯＤは、発芽後の植物の種子から抽出により 得られる。 別の実施の形態によれば、上記植物の種子は、穀類の粒又はマメ科の植物の種 子若しくは油料植物の種子である。 本発明においては、「種子」及び「粒」という言葉は同意義である。 穀類としては、いずれの穀類も用いることができるが、特に、ライ麦、トウモ ロコシ、小麦又は大麦であり、好ましくは大麦であり、使用可能な大麦の品種の 中でも、春又は冬の品種を用いることができる。マメ科の植物については、マメ 科の植物の種子はいずれも用いることができるが、ヒラマメ又はエンドウマメが 好ましい。油料植物の種子については、いずれの油料植物の種子も用いることが できるが、好ましくは大豆の種子である。 他の実施態様においては、上述した発芽は管理されて行われるものであり、好 ましくは発芽を促す薬剤の存在下に、水分で湿らせた媒体又は空気中で、４℃〜 ５０℃の温度、好ましくは常温で又は冷却して、１日以上かけて行われる。 他の実施の形態によれば、Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤の量は、用いられるＳＯＤにより生じ たＨ₂Ｏ₂を捕捉するのに充分な量であり、上記Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤がペルオキシダーゼ である場合、上記ペルオキシダーゼの量は、ＳＯＤの１単位当たりペルオキシダ ーゼ約０．０１〜約１単位、好ましくはＳＯＤの１単位当たりペルオキシダーゼ ０．０１〜０．５単位である。 他の実施の形態によれば、ＳＯＤとＨ₂Ｏ₂捕捉剤、特にペルオキシダーゼとの 複合体は、０．００１Ｍ〜１Ｍの濃度で存在する酵素補因子、特にペルオキシダ ーゼ酵素補因子により安定化される。 他の実施の形態によれば、上述したペルオキシダーゼは、西洋ワサビのペルオ キシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、又は、 脊髄からのペルオキシダーゼ（即ちミエロペルオキシダーゼ）からなる群より選 択されるものであり、上記ペルオキシダーゼ特異還元物質は、好ましくは、グル タチオン、フェノール、グアイアコール、ピロガロール、メシトール、３，５− ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸（ＤＣＨＢＳ）、アニリン、ｐ− トルイジン、ｏ−フェニレンジアミン、メシジン、アスコルビン酸、ジヒドロキ シマレイン酸、チトクロムＣ、ヨウ化物、尿酸、フェノールフタレイン、２，２ ’−アジド−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン）酸（ＡＢＴＳ） 、及び、ＳＣＮ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-又はＩ^-等の化合物から選択されるものである。 他の実施の形態によれば、上記Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤は、植物のペルオキシダーゼであ り、好ましくは黒ラディッシュから抽出される。 他の実施の形態によれば、上述したペルオキシダーゼ補因子は、尿酸、アスコ ルビン酸又はジヒドロキシマレイン酸からなる群より選択される。 他の実施の形態によれば、ＳＯＤとＨ₂Ｏ₂捕捉剤、特にペルオキシダーゼとの 複合体であって所望によりペルオキシダーゼ補因子と組み合わせたものは、特に 、粗抽出物の状態又は精製された状態にあるＳＯＤ複合体の１０〜５０重量％ の濃度で、少なくとも１つの糖、特に単糖若しくは二糖、及び／又は、少なくと も１つのポリオールで特に分子量が５０〜１０００ｇ／モルであるものによって 更に安定化される。 他の実施の形態によれば、上記複合体製品は、有効抗酸化量で、抗酸化剤、好 ましくは親油性抗酸化剤、より好ましくは、トコフェロール類及びその誘導体、 特に酢酸エステル、リノレン酸エステル又はリン酸エステル等のエステル体から 選ばれるものを更に含有する。 本発明の他の特徴は、請求の範囲及び明細書の記載からも明らかになるであろ う。 第二の態様によれば、本発明は、また、組成物、特に抗フリーラジカル活性を 有する組成物、例えば、化粧用、医薬用又は食用組成物の活性素即ち活性成分の １つとしての、上述したＳＯＤに基づく複合体の使用にも関する。 第三の態様によれば、本発明は、更に、Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤、好ましくはペルオキシ ダーゼ、より好ましくは植物のペルオキシダーゼ、更に好ましくは、ペルオキシ ダーゼ特異還元物質として公知のペルオキシダーゼ補因子、により安定化された スーパーオキシドジスムターゼ即ちＳＯＤに基づく複合体製品を、活性成分の１ つとして含有することを特徴とする組成物、特に抗フリーラジカル活性を有する 組成物、例えば、化粧用、医薬用又は食用組成物にも関する。 ある好適な実施の形態によれば、ＳＯＤの割合は、全組成物重量の０．０１〜 １０重量％である。 この第三の態様において、上記配合割合は変更可能であり、予測される用途に より決定する。通常、ＳＯＤの配合割合は０．０１〜３０重量％であるが、０． １〜１０重量％がより良く、およそ１〜５％が更に良い。 ペルオキシダーゼは、本明細書の始めに記載したように、スーパーオキシドア ニオンがＳＯＤに触媒されて過酸化水素を与える不均化反応で産出される過酸化 水素（Ｈ₂Ｏ₂）の分解を、ペルオキシダーゼ補因子として公知の特異還元物質の 存在下で触媒する。 ペルオキシダーゼは数多く存在し、当業者に良く知られている。ペルオキシダ ーゼは、現在、脊椎（ミエロペルオキシダーゼ）、ミルク（ラクトペルオキシダ ーゼ）、ウシ、時にはヒトの赤血球（グルタチオンペルオキシダーゼ）、又は、 本発明で好ましいものとして黒ラディッシュ（西洋ワサビのペルオキシダーゼ） から抽出されている。 更に、上記ペルオキシダーゼの特異還元物質は、当業者に良く知られており、 好ましくは、グルタチオン、フェノール、グアイアコール、ピロガロール、メシ トール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸（ＤＣＨＢＳ） 、アニリン、ｐ−トルイジン、ｏ−フェニレンジアミン、メシジン、アスコルビ ン酸、ジヒドロキシマレイン酸、チトクロムＣ、ヨウ化物、尿酸、フェノールフ タレイン、２，２’−アジド−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン ）酸（ＡＢＴＳ）、及び、ＳＣＮ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-又はＩ^-等の化合物から選択さ れる。 本発明においては、特に化粧品、医薬品又は食品での使用において、好ましく は黒ラディッシュから抽出された植物のペルオキシダーゼとＳＯＤとの複合体を 調製することが好ましく、その補因子、好ましくは尿酸、アスコルビン酸又はジ ヒドロキシマレイン酸からなるものと組み合わせるのが有利である。 上記ＳＯＤに添加されるペルオキシダーゼの量は、上記ＳＯＤが放出する過酸 化水素の量、即ちその酵素活性の関数である。上記ＳＯＤ溶液に添加されるペル オキシダーゼの単位数は、ＳＯＤの１単位当たりペルオキシダーゼ約０．０１〜 約１単位、好ましくはＳＯＤの１単位当たりペルオキシダーゼ０．０１〜０．５ 単位である。 上述したようなペルオキシダーゼの酵素補因子は、好ましくは尿酸であってよ いが、０．００１Ｍ〜１Ｍの濃度で、酵素複合体に添加される。 本発明の好ましい実施態様においては、ＳＯＤ、又は、ＳＯＤ／ペルオキシダ ーゼ／ペルオキシダーゼ補因子の複合体は、粗抽出物の状態又は精製された状態 にあるＳＯＤ又は目的複合体に対して１０〜５０重量％の濃度で添加される、少 なくとも１つの糖及び／又は少なくとも１つのポリオールによって更に安定化さ れてもよい。 糖としては、特に単糖又は二糖、中でもトレハロースを用いることができ、ポ リオールとしては、特に平均分子量が５０〜１０００ｇ／モルであるポリオール 、 例えば、グリセロール、ソルビトール、マルチット及びマンニトールを用いるこ とができる。糖又はポリオールの添加により、全く予想外に、ＳＯＤの安定化を 達成することができる。 また、本発明の更に別の好ましい実施の形態においては、好ましくは親油性抗 酸化剤、より好ましくはトコフェロール類及びその誘導体、例えば、酢酸エステ ル、リノレン酸エステル又はリン酸エステル等のエステル体から選ばれる１種が 添加される。本発明者らは、全く予想外なことに、このような抗酸化剤がＳＯＤ のより大きな安定性を招来することを見い出したものである。リン酸トコフェロ ールについては、例えば、ＬＶＭＨ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅの米国特許５３８７５ ７９号に記載されている。この結果は、ＳＯＤ酵素の安定性が酸化の問題に関わ っていないので全く予想外であり、この事実から、その作用機構が現在まで不明 である。この抗酸化剤が好ましくは親油性であることを考慮して、油相で、即ち エマルションを形成させることにより、上記組成物に添加する。抗酸化剤の濃度 は、目的組成物の全重量に対して、通常、０．０１〜３重量％であり、好ましく は０．１〜１重量％である。 第四の態様によれば、本発明は、更に、植物の種子を常温で一日以上の間、水 分で湿らせた空気又は媒体と接触させることにより、発芽中に最大のＳＯＤ活性 を得るように、及び、上記ＳＯＤ活性が最大になる時点で上記ＳＯＤ活性を抽出 するように管理された発芽工程を経た植物の種子を原料として用いることを特徴 とする、スーパーオキシドジスムターゼ即ちＳＯＤの抽出方法であって、ＳＯＤ 抽出工程は、発芽した種子を用いて行うものであり、上記発芽した種子をすりつ ぶし、次いで、ＳＯＤ抽出を行うのに充分な時間、通常は数十分〜１時間以上か けて、４℃〜５０℃、好ましくは常温の水溶液を用いて抽出を行い、次に、濾過 、及び、ＳＯＤを含有する濾液の回収を行うことからなることを特徴とする抽出 方法にも関する。 ある好適な実施の形態においては、上記発芽工程は、常温で数日間、上記植物 の種子を水溶液の懸濁中に放置することからなる。 好ましい実施の形態においては、上記発芽工程は、発芽を促す薬剤、より好ま しくはジベレリン類に属する化合物からなる薬剤の存在下で行われる。 本方法の好適な実施態様においては、上記発芽工程以前に、常温又は冷却下の 水溶液で一日以上、例えば二日間に及ぶ浸漬工程が行われる。 本発明の方法の更に別の実施態様においては、発芽した種子からＳＯＤを抽出 する工程は、上記発芽した種子をすりつぶし、次いで、ＳＯＤ抽出を行うのに充 分な時間、通常は数十分〜１又は数時間かけて、常温でｐＨが８付近の緩衝水溶 液を用いて抽出し、次に、濾過、及び、ＳＯＤを含有する濾液の回収を行うこと からなる。 本抽出方法の好適な実施の形態においては、ＳＯＤのより完全な精製が、プロ テアーゼや更にはリポキシゲナーゼ等の望ましくないタンパク質を除去すること ができる沈殿剤を用いて濾液を処理し、非沈殿留分、すなわち、ＳＯＤを含有す る上澄みからなる留分を回収することにより行われる。 他のより一層好適な実施形態においては、ＳＯＤを含有する非沈殿留分の透析 が、好ましくは分離値が６０００〜８０００ダルトンである膜を用いた、水又は 水溶液に対する透析によって行われる。 更に別の特に好ましい態様においては、透析された溶液の補充の精製が、更に 、適切な溶離液を用いて、本発明においてはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ）ＱＡＥカラムからなるのが好ましいクロマトグラフィーカラムで、精製を実施 することにより行うことができる。 本発明の方法の他の好適な実施の形態においては、得られたＳＯＤの安定化は 、上述した抽出工程の後、即ちより完全な精製の前に、又は、精製の後に、ペル オキシダーゼ、好ましくは（ペルオキシダーゼ特異還元物質としても公知の）ペ ルオキシダーゼ補因子、等のＨ₂Ｏ₂捕捉剤を添加することにより直接行うことが できる。本発明においては、ＳＯＤに添加されるペルオキシダーゼの量は、ＳＯ Ｄの単位数に対するペルオキシダーゼの単位数の比で表すと、１０〜４００であ るのが好ましいが、ペルオキシダーゼの酵素補因子については、０．００１Ｍ〜 １Ｍの濃度で存在していることが好ましい。 本発明の方法の他の好適な実施の形態においては、ＳＯＤの安定化は、抽出工 程の後又は精製工程の後に、少なくとも１つの糖、特に単糖若しくは二糖、及び ／又は、少なくとも１つのポリオール、特に平均分子量が５０〜１０００ｇ／モ ルであるポリオールを添加することによっても行うこともできる。糖又はポリオ ールは、精製された又は粗抽出物の状態にあるＳＯＤ又は目的ＳＯＤ複合体に対 して１０〜５０重量％の濃度で添加されるのが好ましい。 精製を伴うか伴わない抽出の後、ＳＯＤを含有する抽出物が得られるが、これ は、Ｎｅｂｏｔ Ｃ．らのアナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９３年、２１４巻、４４２〜４５ １頁記載の、当業者に周知の方法で測定される。 Ｎｅｂｏｔの方法は、アルカリ性のｐＨで、ＳＯＤ活性を持つ触媒が、以下の 反応に従って、反応物Ｒ１を可視光を吸収する発色化合物に変化させる自動酸化 を促進するという特性に基づいたものである： ＳＯＤ−５２５法は、また、第二の反応物Ｒ２も開発し、これにより、以下の 反応に従う非常に速いアルキル化反応を用いて、分析されるサンプルに存在する メルカプタンに起因する、グルタチオン等の重大な障害物を取り除くことができ る： 例えば、銅−亜鉛ＳＯＤ、マンガン又は鉄ＳＯＤ等の公知の天然ＳＯＤを不活 性化させない測定において最適感度を考慮すると、ＳＯＤ活性の測定は、ｐＨ８ ．８で行われる。 オキシス・インターナショナル・Ｓ．Ａ．（Ｏｘｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌ Ｓ．Ａ．）（９４３８５ Ｂｏｎｎｅｕｉｌ ｓｕｒ Ｍａｒｎｅ、フ ランス）が市販している測定セットでは、このＳＯＤ−５２５法によるＳＯＤ活 性の分光光度測定を行うことができる。このセットは、２つの反応物Ｒ１及びＲ ２、並びに、緩衝溶液、バッファー３からなり、これらはそれぞれ、 Ｒ１：上述した式で表される発光反応物Ｒ１の、３．２ｘ１０^-2ＭのＨＣｌ溶液 ； Ｒ２：メルカプタン捕捉剤Ｒ２の、２５％（ｗ／ｖ）エチレングリコールを含有 するＤＭＳＯ溶液； バッファー３：０．１１ｍＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を 含有する（３７℃で）ｐＨが８．８の緩衝液 である。 ＳＯＤ−５２５セットという名前で市販されているこのオキシス・インターナ ショナル社製のセットを用いて、波長５２５ｎｍで、光路が１ｃｍのガラス製の セルで分光光度測定を行う。吸光度の変化の速度測定は、３７℃で１分間行う。 各測定において、反応速度は、得られた曲線の最大勾配を求めることにより決 定した。この勾配はＲ１の自動酸化段階に相当する。１分当たりの吸光度の単位 で結果を表示する。 酵素活性の算出は以下のようにして行う： Ｖｃ及びＶｓは、それぞれ、コントロール及びサンプルに相当する反応速度であ る。分析されるサンプルのＳＯＤ活性は、次式から導かれる、実験比Ｖｓ／Ｖｃ とＳＯＤ活性との対応関係を算出することにより決定する： オキシスにより定義されたＳＯＤ−５２５の１単位は、上記条件下で、Ｖｓ／ Ｖｃ比が２である場合に相当する。 次いで、得られた値に、測定方法におけるサンプルの希釈率（率２５）を掛け る。サンプル１ｍｌ当たりのＳＯＤ−５２５活性の単位数で結果を表示する。 本発明においては、ＳＯＤの酵素活性は、ＳＯＤ活性と正確な対応関係を確立 することができるＶｓ／Ｖｃ比の値となるように、得られたＳＯＤ溶液を希釈し た後に測定する。 本発明においては、Ｖｓ／Ｖｃ比が１〜２の範囲内で得られるように、抽出方 法から生じた精製の度合いの関数として、率３００までで、得られたＳＯＤ溶液 を希釈する。 ＳＯＤ溶液の活性は、測定手順におけるサンプルの希釈率（率２５）及びＳＯ Ｄ溶液自身の希釈率（例えば、３００までの率）を考慮して決定する。 測定例は、以下の実施例において記載する。 本発明は、更に、活性成分の１つとして、発芽工程を経た植物の種子から得ら れる植物ＳＯＤを含有することを特徴とする、特に抗フリーラジカル活性を有す る組成物、例えば、化粧用、医薬用又は食用組成物にも関する。 本発明の他の目的、特徴及び利点は、本発明の実施例を参考にしてなされた以 下の記載により明らかになるが、これらは単に例示として記載したものであり、 決して本発明の範囲を限定するものではない。実施例においては、特に記載がな ければ、比率は重量基準で表示する。また、特に記載がなければ、最初の温度は セ氏で表示し、常温であり、気圧は大気圧である。 以下の実施例は、本発明の必要不可欠な一部であり、従来技術と比較して新規 と考えられる本実施例の特徴は全て、そのまま請求項に記載された本発明の一般 的な特徴を構成する。実施例１ 発芽した大麦からのＳＯＤの抽出 このＳＯＤの抽出は以下のようにして行った： ａ）大麦の発芽： 市販されている大麦、例えば、ダラス（Ｄａｌｌａｓ）種の春大麦を使用し、 冷却下、例えば１５℃の水溶液、例えば水道水、好ましくは脱塩水に１日以上、 例えば２日間浸漬した。 種子を膨潤させて発芽を準備させることを目的とする浸漬の後、適切には発芽 工程と名付けられる工程を、乾燥した最初の穀類１ｋｇ当たり０．１ｍｇの濃度 で、ジベレリン酸等の発芽促進剤が好ましくは存在する中、数日、例えば５日間 にわたって行った。 ｂ）抽出手順： モルトとしても知られる発芽した大麦から抽出する手順は、以下の通りである ： 大麦の種子が発芽した後、モルトをすりつぶして、次いで、好ましくは５０ｍ ＭのトリスＨＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる、ｐＨがおよそ８の緩衝水溶液 を用いて、常温で約１時間かけて抽出を行った。 次に、抽出物を濾過して殻を取り除き、４０００Ｇで２０分間遠心分離にかけ て多糖部分を取り除き、回収した濾液又は上澄み液について、オキシス・インタ ーナショナル（９４３８５ Ｂｏｎｎｅｕｉｌ ｓｕｅ Ｍａｒｎｅ、フランス ）社製の市販セットを用いて、上述したＮｅｂｏｔ Ｃ．ら（１９９３）の方法 によりＳＯＤ活性を測定した。乾燥した出発原料１ｇ当たりのＳＯＤ−５２５活 性を得た。 ＳＯＤ抽出物１ｍｌを水１４ｍｌで希釈した後、ＳＯＤ活性を測定した。この 希釈溶液４０μｌを用いた。測定したＶｓ／Ｖｃ比は１．９５であった。１２頁 で上述した式（１）から、ＳＯＤ活性は０．９５ＳＯＤ−５２５単位であった。 従って、ＳＯＤ活性は、０．９５×２５×１５＝３５６２５ＳＯＤ−５２５単位 ／ｍｌであり、この実施例では、乾燥した出発原料１ｇ当たり１４８２ＳＯＤ− ５２５単位となる。 ｃ）補充精製 プロテアーゼ又はリポキシゲナーゼ等の望ましくないタンパク質を取り除くた めに、沈殿剤、例えば、濃度が３９０ｇ／ｌの硫酸アンモニウムを用いて、上記 遠心分離で得られた濾液又は上澄み液に沈殿を生じさせた。 ４０００Ｇの遠心分離を２０分間２０℃で行い、沈殿物を取り除き、ＳＯＤを 含有する上澄み液からなる液体留分を回収した。 この上澄み液は、好適に透析を行うことにより、高濃度で存在する、分子量が ６０００ダルトン未満の低分子及び塩を除去することができる。この透析は、分 離値が６０００〜８０００ダルトン、例えば、６０００ダルトンである膜を用い て、脱塩水に対して行った。ＳＯＤは、実際、分子量がおよそ３００００である ので、このような膜の細孔を通過せず、このことにより、この酵素の特異的活性 を上昇させることができる。 上述の方法に従って透析液について測定したＳＯＤ活性は、乾燥した出発原料 １ｇ当たり７５００ＳＯＤ−５２５単位であった。 ｄ）カラムによる任意の補充精製 上記工程ｃ）で得られた透析液をクロマトグラフィーカラムで処理することに より、更に完全な精製を行うことも可能である。 クロマトグラフィーは、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＱＡＥ カラムで行うことができ、これにより、ＳＯＤを精製し、抽出物に含まれるタン パク質の不純物を全て除去することができた。実施例２ 大豆種子からのＳＯＤの抽出 実施例１に記載した方法で行った。 工程ｂの後、乾燥した出発原料１ｇ当たり１８０ＩＵ_SODというＳＯＤ活性が 得られた。実施例３ 発芽した小麦種子からのＳＯＤの抽出 実施例１に記載したものと同じ手順を用い、工程ｂの抽出で得られた物につい てＳＯＤ活性を測定すると、乾燥した出発原料１ｇ当たり１１６ＩＵ_SODという ＳＯＤ活性が得られた。実施例４ 発芽したえんどう豆からのＳＯＤの抽出 市販されている白えんどう［ピスム・サチブム（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ ）］を用いた。 実施例１に記載したものと同じ手順を用い、工程ｂで得られた物についてＳＯ Ｄ活性を測定した。乾燥した出発原料１ｇ当たり８０ＩＵ_SODというＳＯＤ活性 が得られた。実施例５ ジベレリン類に属する化合物等の発芽活性剤が存在する又はしない時に、異なる 発芽期間で又は各種大麦の品種を用いたＳＯＤ活性の変化の測定 実施例５−ａ 異なる発芽期間でのＳＯＤ活性の変化の測定 発芽期間を変化させて、実施例１−ａの発芽手順におけるこれ以外の一般的条 件は変更せずに、発芽した大麦のダラス種についてＳＯＤ活性を測定した。 得られた結果を以下の表Ｉに示す。 表Ｉの結果から分かるように、ＳＯＤ活性は発芽の１日後に、２倍以上となり 、発芽の３日目の後に、再び２倍以上となり、４日目及び５日目には、再びかな りの程度増加した。実施例５−ｂ 大麦の品種がＳＯＤ活性に与える影響の測定 大麦の品種がＳＯＤ活性に与える影響を測定し、得られた結果を以下の表IIに 示した。この比較は、５日間という一定の発芽期間で行ったが、発芽促進剤は用 いず、発芽手順のその他の条件は実施例１−ａのものと同じであった。 表IIの結果から分かるように、各種大麦の品種について、得られたＳＯＤ活性 の結果にわずかな変化があったが、これらの結果は完全に符合したものであるの で、本発明の発芽方法の再現性が証明された。実施例５−ｃ ジベレリン類の化合物が存在することによる影響 ジベレリン酸等の発芽促進剤が存在することによる影響についても測定し、そ の結果を表IIIに示した。これらの実験は、実施例１の手順に従って、発芽期間 を５日として、春大麦（ナターシャ種）について行った。 表IIIの結果から、発芽促進剤の存在により、全く予想外にＳＯＤの産出量が 増加することが分かる。実施例６ ポリオールによるＳＯＤの安定化 実施例１の工程ｂ）で得られた粗抽出物の状態にあるＳＯＤは、２０℃の４６ 日後に、その酵素活性の６０％を保持していた。 この粗抽出物の目的溶液に対して２０重量％のソルビトールをこの粗抽出物に 添加すれば、即ち、工程１−ｂのＳＯＤ抽出物＋目的溶液の２０重量％のソルビ トールであれば、ＳＯＤ酵素の安定性が予想外に上昇して、２０℃で４６日後に 、最初の活性の７６％を示すことが分かった。実施例７ 糖によるＳＯＤの安定化 ＳＯＤの酵素活性は、好ましくは単糖又は二糖である糖の添加により安定化し 得ることを発見した。この実施例では、トレハロースを用いた。 目的溶液の重量に対して３０重量％のトレハロースを、実施例１の工程ｂ）で 得られたＳＯＤ粗抽出物に添加した以外は、実施例６の記載と同様に行うと、２ ０℃で４６日後に、最初の活性の７５％を示し、安定性が著しく上昇することが 分かった。実施例８ ペルオキシダーゼ及び補因子によるＳＯＤの安定化 工程１−ｄで得られた又は実施例１の前の工程で得られたＳＯＤの濃縮液を、 生成した過酸化水素を分解することができる他の酵素と複合体化し又は組み合わ せる。 この意図で用いることができる酵素は、Ｈ₂Ｏ₂をＨ₂ＯとＯ₂に変換するカタラ ーゼであってもよいが、カタラーゼは、化粧品において非認可品のリストに挙げ られている限り用いられない。Ｈ₂Ｏ₂の分解を同様に触媒するペルオキシダーゼ も用いることができるが、特異還元物質即ち補因子の存在を必要とする。ペルオ キシダーゼ及び補因子のリストは本明細書の導入部で既に記載した。 この実施例においては、ペルオキシダーゼとして、黒ラディッシュから抽出さ れる植物のペルオキシダーゼ（即ち西洋ワサビのペルオキシダーゼ）（以後、Ｈ ＲＰと略称する）を、尿酸からなる酵素補因子と組み合わせて用いた。 この実施例においては、ＳＯＤに添加するペルオキシダーゼの量は、ＳＯＤ４ ００単位に対してペルオキシダーゼ約１０単位であった。ＳＯＤの単位数は、上 述した方法に従って決定し、ペルオキシダーゼの単位数は、「酵素分析の方法」 （１９７４）、１巻、第２版、４９４頁でＢｅｒｇｍｅｙｅｒ Ｈ．Ｕ．が記載 した方法によって決定した。 ここではペルオキシダーゼの酵素補因子として尿酸を用い、０．０１Ｍ〜１Ｍ 、好ましくは０．５Ｍの濃度で、ＳＯＤ／ペルオキシダーゼの酵素複合体に添加 し た。 このようにして製造した複合体は、目的溶液の３０重量％というこの実施例に おいて選択された濃度で、糖又はポリオールを添加することにより、更に安定化 されることが好ましい。 このＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子の複合体はそのまま、化粧用、医薬用 又は食用組成物等である、抗ラジカル活性又はフリーラジカル捕捉活性を有する 組成物に配合するために用いることができる。この複合体をまた、以下の実施例 ９、１０及び１１において、それぞれ、安定性、抗ラジカル能及び毒性試験の対 象とした。実施例９ 安定性試験 実施例８で製造した複合体の酵素活性の安定性を２０℃と４５℃でそれぞれ測 定し、得られた結果を以下の表IVに示す。 表IVから分かるように、３５日目で酵素活性の８０％が保持されていたので、 酵素活性は２０℃では１か月間安定であり、一方、４５℃では、およそ５０％の 活性の低下が見られたが、これはこの温度における酵素の活性において非常にわ ずかな低下である。 従って、植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子というこの複合体が、特に４ ５℃で優れた安定性を有することが観察されたが、このことは当業者にとって予 想外のことである。実施例１０ 抗ラジカル活性又はフリーラジカル捕捉活性の測定 １°．試験管内におけるラジカル捕捉を評価するため３種類の方法を用いた： ａ）第一の方法は、基質であるキサンチンを酸化してスーパーオキシドラジカル を生成させるキサンチンオキシダーゼからなる酵素系を用いた。スーパーオキシ ドラジカルは、チトクロムＣ（Ｆｅ³⁺）をチトクロムＣ（Ｆｅ²⁺）に還元するこ とができ、この反応速度は、５５０ｎｍでＵＶ−可視分光光度法により追跡する ことができる。スーパーオキシドラジカルはまた、スーパーオキシドラジカルの 捕捉及び除去に関して、チトクロムＣと競合することもできるＳＯＤのラジカル 基質でもある。ＳＯＤ活性を有する調剤を添加すると、これらの還元速度は低下 する。ＳＯＤ活性の算出は、テストするＳＯＤが、チトクロムＣの還元を阻害す る割合を算出することにより行った。 国際単位で表示するＳＯＤの１単位（１ＩＵ_SOD）は、温度が２５℃でｐＨが ７．８の条件で、チトクロムＣの還元量を５０％減少させるのに必要な活性に相 当する。 １国際単位に相当する、チトクロムＣの還元の５０％阻害が得られる条件を決 定できるように、テストされるサンプルを希釈した。 次いで、測定したサンプルの体積をサンプルの全体積分に戻して、かつ、サン プルの最初の希釈率を考慮して、テストされるサンプルのＳＯＤ全活性を決定し た。 実施例８で製造した複合体のＳＯＤ活性をこの方法で測定すると、４４５５Ｉ Ｕ_SOD単位／ｍｌであった。 ｂ）第二の方法は、ＳＯＤ活性を有する触媒がいずれもテトラサイクリックカテ コール誘導体（５，６，６ａ，１１ｂ−テトラヒドロ−３，９，１０−トリヒド ロキシベンゾフルオレン）の自動酸化を促進できるという性質に基づいて、ＳＯ Ｄ−５２５セットという商品名でオキシス・インターナショナルから市販されて いる測定セットを用いることからなる。 この測定方法では、カテコール誘導体の酸化量を２倍にするジスムターゼの量 として定義されるＳＯＤ−５２５単位という形で、ＳＯＤ活性を決定することが できる。 実施例８で製造した複合体のＳＯＤ活性をこの方法で測定すると、４３７５Ｓ ＯＤ−５２５単位／ｍｌであった。 従って、上記２つの方法で得られたＳＯＤ活性の値は、本質的に同一であるこ とが分かった。 ｃ）第三の方法では、電子スピン共鳴（略称ＥＳＲ）を用いる。 ＥＳＲは、分子の単一電子のスピン状態を評価できる技術であり、より具体的 には、フリーラジカルの特性評価に用いられる技術である。実施例８で得られた ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子という複合体の抗ラジカル活性をＥＳＲで評 価すると、スーパーオキシドとヒドロキシルラジカルの捕捉活性を区別すること が可能になる［Ｒｏｓｅｎ Ｇ．Ｍ．及びＲａｕｃｋｍａｎ Ｅ．Ｊ．の「メソ ッド・イン・エンジマトロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）、１９８４年、１０５巻、１９８〜２０９頁］。 ＯＨ・で約１０^-11秒という非常に短いフリーラジカルの寿命が、フリーラジ カルを検出する能力を制限している。このため、Ｏ₂ ^・-及びＯＨ^・ラジカルは、ス ピントラップを用いて観察する。この化合物は、フリーラジカルの存在下で共鳴 して、ＥＳＲで検出できる特徴的なスペクトルを有する複合体として、フリーラ ジカルを安定化させる。 テストされる物のトラップ効果は、スピントラップ化合物が照射するシグナル の強度が減少することで直接証明される。 ＥＳＲ測定は、室温で、Ｂｒｕｃｋｅｒ ＥＳＰ１０６分光計を用いて行い； 用いられるスピントラップは、５，５−ジメチル−１−ピロリン−１−オキサイ ド（ＤＭＰＯ）であった。 スーパーオキシドアニオンは、ＤＭＰＯ（８０ｍＭ）及び５０％（ｖ／ｖ）エ タノールの存在下で、キサンチン（１．５ｍＭ）／キサンチンオキシダーゼ（１ ２ｍＵ／ｍｌ）酵素系によって産出される。実施例８で得られたＳＯＤ／ペルオ キシダーゼ／補因子の複合体を、様々な濃度で超純水に溶解させた。 ヒドロキシルラジカルは、ＤＭＰＯ（１６０ｍＭ）の存在下で、水溶液中の０ ．２％（ｖ／ｖ）過酸化水素を光分解（ＵＶＢ）することにより産出される。実 施例８で得られたＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子の複合体を、様々な濃度で 超純水に溶解させた。 ＥＳＲのシグナル強度は、最小電界スペクトル線の二重積分により算出した。 テスト品の保護の割合は、テスト品を含まないブランクの値から求めた。Ｓ_product：テスト化合物又はブランクで得られたＥＳＲシグナルの積分 Ｓ_blank：ブランクで得られたＥＳＲシグナルの積分 Ｓ_o：フリーラジカル不在で得られたＥＳＲシグナルの積分スーパーオキシドラジカルに対する効果 実施例８で得られたＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子は、使用量に応じて、 スーパーオキシドアニオンのＥＳＲシグナルを減少させた。５及び１０％（ｖ／ ｖ）で、この複合体はＥＳＲシグナルを４４％及び５４％阻害した。ヒドロキシルラジカルに対する効果 実施例８で得られたＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子の複合体は、使用量に 応じて、ヒドロキシルラジカルのＥＳＲシグナルを減少させた。０．３％（ｖ／ ｖ）の濃度で、ＥＳＲシグナルを９３％阻害したのでその効果は絶大である。 実施例８で得られたＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子の複合体は、化粧用組 成物で一般に用いられる低濃度でも、スーパーオキシドアニオン及びヒドロキシ ルラジカルに対して非常に興味深い抗ラジカル効果を有している。 ２°．培養標準ヒト繊維芽細胞で用いられた抗ラジカル活性の生体外における評 価方法 ＵＶＡを照射した後、ヒト繊維芽細胞の培養株で生じたフリーラジカルを適切 な方法で定量化した。抗ラジカル剤の使用は酸化ストレスを減少させることがで き、実施例８による植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子という複合体の効力 を様々の濃度で算出した。 ０．０１、１及び１０％（ｖ／ｖ）の、実施例８の植物ＳＯＤ／ペルオキシダ ーゼ／補因子という複合体の存在下で、脱塩水中、標準ヒト繊維芽細胞を一時間 培養した。この細胞を、ＵＶＡ光線（１０Ｊ／ｃｍ²）により誘発したラジカル ストレスに曝した。ヒドロペルオキシドの存在下で、定量可能な蛍光化合物に変 化する適切なプローブを用いて、生じたフリーラジカル（ヒドロペルオキシド） を検出した。 結果は、まず、培養ピット当たりの蛍光量を任意の単位で表した。次に、次式 を利用して効力を算出した。 Ｅ（％）＝［（ＩＴＦ−ＩＦ）／（ＩＦ−ＮＩＦ）］ｘ（−１００） 式中： Ｅ：効力の割合 ＮＩＦ：照射しなかった繊維芽細胞で観察された蛍光量 ＩＦ：照射した繊維芽細胞で観察された蛍光量 ＩＴＦ：照射し処置した繊維芽細胞で観察された蛍光量 本発明により製造された植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子の複合体を１ ％含有する水溶液は、ＵＶＡ光線により生じた酸化ストレスと直結する有害な作 用を８０％以上減少させることができた。 この効力は、特に効力があると認識されていたが安定性で重大な問題があった 参考混合物であるグルタチオン／ビタミンＣで観察されるものよりも優れている 。 従って、最小の使用濃度から、実施例８の植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補 因子の複合体は、ＵＶＡ光線による酸化ストレスの後に培養されたヒト繊維芽細 胞を効率的に保護することができる。 ３°．抗ラジカル活性の生体内評価方法は、健康なボランティアの皮膚組織に関 して用いられた。 ＵＶＡ照射後に生じたフリーラジカルは、皮膚組織の不飽和脂質を過酸化する 。皮膚を剥離して、過酸化したものと共に角質細胞を取り出した。反応媒体にお いて、過酸化物の存在量に直接比例する蛍光を放射する蛍光プローブを用いて、 過酸化物を視覚化した。 II又はIIIのフォトタイプを有する、即ち、標準的なコーカソイド人種の皮膚 を有する、年齢が２０〜３８才の七人の女性ボランティアを選択した。 前腕で３つの区分を限定して、３つの区分の内２つに、ＵＶＡ Ｓｕｎ３００に赤いマークは、照射後その日の内に見えなくなり、炎症作用は観察されなかっ た。 本発明により製造された植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子を１％含有す る水溶液を２時間おきに４回塗布した（２μｌ／ｃｍ²）。 ＵＶＡ照射の２４時間後、連続して２回皮膚を剥離して、角質層のサンプリン グを行った。 第２の剥離について、過酸化作用に対して全般的に反応する蛍光プローブを用 いて、生じた過酸化物を視覚化した。 結果は、まず、蛍光量を任意の単位で表示した。次に、下式を適用して効力を 算出した。 Ｅ（％）＝［（ＴＩＺ−ＩＺ）／（ＩＺ−ＮＩＺ）］ｘ（−１００） 式中： Ｅ（％）：効力の割合 ＴＩＺ：処置した照射区分で測定した蛍光量 ＩＺ：照射区分で測定した蛍光量 ＮＩＺ：非照射区分で測定した蛍光量 本発明により製造された植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子の複合体を１ ％含有する水溶液は、６５％の効力で、ＵＶＡ照射により誘発された皮膚のラジ カルストレスを保護することができた。実施例１１ 毒物学 ウサギ（９ａ）の皮膚に対する一次刺激性の評価に関して、ウサギ（９ｂ）の 眼に対する刺激性の評価に関して、並びに、ラット（９ｃ）への一度の経口投与 による異常毒性の不在に関して、又は、モルモット（９ｄ）での感作力について の実験によって、実施例８で得られた本発明による複合体の毒性実験を行った。 １１ａ−ウサギの皮膚に対する一次刺激性の評価 「皮膚に対する刺激性／急性腐食作用」の実験に関するＯＥＣＤ指導書Ｎｏ． ４０４推奨の方法に従って、実施例８で得られた調剤を希釈せずに、３匹のウサ ギの皮膚に用量０．５ｍｌで塗布した。 この実験の結果によって、本発明の実施例８で得られた調剤が希釈していない 状態でも刺激性がないと考えられるという結論に達した。 １１ｂ−ウサギの眼に対する刺激性の評価 「眼に対する刺激性／急性腐食作用」の実験に関する１９８７年２月２４日の ＯＥＣＤ指導書Ｎｏ．４０５推奨の方法に従って、実施例８で得られた同調剤０ ．１ｍｌを純粋な状態で、一度だけ、３匹のウサギに点眼した。 このテストの結果より、純粋な状態即ち希釈していない本発明の実施例８で得 られた調剤は、指導書９１／３２６ＥＥＣの意味において、眼に刺激性がないと 考えられるという結論に達した。 １１ｃ−ラットへの一度の経口投与による異常毒性の不在に関するテスト １９８７年２月２４日のＯＥＣＤＮｏ．４０１の指導書に基づき、化粧品に適 合させた手順に従って、５匹の雄のラットと５匹の雌のラットに、体重１ｋｇ当 たり５ｇの用量で、一度、本発明の実施例８で得られた調剤を経口投与した。 このテストの結果により、この実験条件下では、本発明の実施例８で得られた 調剤は異常な毒性を何ら有しないという結論に達した。 １１ｄ−モルモットでの感作力についての実験 実施例８で得られたＳＯＤ複合体溶液を、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１９ ６９年、５２巻、２６８〜２７６頁記載のＭａｇｎｕｓｓｏｎとＫｌｉｇｍａｎ の方法に従って、感作力の試験の対象とした。３５匹のモルモットを予めフロイ ントアジュバントで処理し、参考群と処理群という２つの実験群に分けて、この ＳＯＤ複合体の溶液をそのままこれらの皮膚に塗布した。 ２つの実験群に反応は見られなかった。 得られた結果から、本発明により製造された植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／ 補因子の複合体が何ら感作反応の様子を生じさせないことが分かった。実施例１２ 本発明による植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子の調剤を含有する化粧用エ マルションとしての組成物の製造 クリームの全重量に対して５重量％の濃度で、本発明の実施例８で得られた調 剤をクリームに配合した。 このクリームは以下の組成を有する： ＩＮＣＩ名： Ａ−ステアレス（Ｓｔｅａｒｅｔｈ）−２ ３％ ステアレス−２１ ２％ ポリプロピレングリコール−１５ステアリルエーテル ９％ セテアリルアルコール ２．５％ Ｂ−ブチレングリコール ４．５％ 水 ７３．３％ Ｃ−パラベン及びフェノキシエタノールからなる防腐剤 ０．５％ Ｄ−トコフェロール ０．２％ Ｅ−実施例８の本発明による植物ＳＯＤ／ ５％ ペルオキシダーゼ／補因子の複合体 このクリームの酵素活性は、以下の特定条件で行った水相と油相の分離後に測 定した：ｐＨが８．５の０．２Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝 液８ｇで、クリーム２ｇを５倍に希釈した後、１０％のＮａＣｌを加えた。この 混合物に５分間（Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒａｘを用いて得られるような）激しく攪拌 を加えた後、２５分間５０００ｒ／分で遠心分離にかけた。抽出した水相で酵素 活性を直接測定した。 上で記載した、クリームに配合された実施例８で得られた調剤の酵素活性の安 定性は、４０日かけて２０℃及び４５℃で調査した。 結果を表Ｖに示した。 ２０℃で４０日後のクリームで得られた酵素活性は、安定化した状態のＳＯＤ の６０％であった。更に注目すべきことに、４５℃で４０日間保存されたクリー ムで得られた酵素活性は５０％であったが、安定化していない状態では、この温 度に耐えられなかった。 クリームに配合された本発明の複合体の安定性調査により、この複合体は、２ ０℃で際立った安定性、及び、４５℃で全く予想外の安定性を有することが証明 された。実施例１３ 各種ペルオキシダーゼを用いた植物ＳＯＤ複合体の製造 実施例１３Ａ ＳＯＤ複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ 実施例１の工程ｌｃで得られたＳＯＤ溶液を用いて、ここに、ＳＯＤの単位数 に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の単位数の比が１０〜４００と なる量で、ＨＲＰを投入した。 こうして得られた植物ＳＯＤ／西洋ワサビペルオキシダーゼの調剤は、そのま まか、又は、尿酸、アスコルビン酸又はジヒドロキシマレイン酸等の酵素補因子 と好ましくは組み合わせて用いることができる。実施例１３Ｂ 植物ＳＯＤ／アルスロマイセス・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏ ｓｕｓ）ペルオキシダーゼの複合体 市販のアルスロマイセス・ラモサスから得られる、シグマＰ４７９４という名 前のペルオキシダーゼを用いた以外は、実施例１３Ａと同様に行った。実施例１３Ｃ 植物ＳＯＤ／大豆ペルオキシダーゼの複合体 市販の大豆から抽出される、シグマＰ１４６２という名前のペルオキシダーゼ を用いた以外は、実施例１３Ａの記載と同様に行った。実施例１４ 糖又はポリオールを用いた、植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子の複合体の 安定化 以下の実施態様に従って、糖又はポリオールの少なくとも一方を添加すると、 植物ＳＯＤ／ペルオキシダーゼ／補因子の酵素複合体の安定性が上昇した：実施例１４Ａ グリセロールの添加 本発明の実施例８で得られた調剤に、室温で攪拌しながら、目的溶液の３０重 量％というこの実施例で選択された濃度でグリセロールを添加した。実施例１４Ｂ ソルビトールの添加 ソルビトールを用いた以外は、実施例１４Ａと同様に行った。実施例１４Ｃ マルチットの添加 マルチットを用いた以外は、実施例１４Ａと同様に行った。実施例１４Ｄ マンニトールの添加 マンニトールを用いた以外は、実施例１４Ａと同様に行った。実施例１４Ｅ トレハロースの添加 トレハロースを用いた以外は、実施例１４Ａと同様に行った。実施例１５ 各種ペルオキシダーゼ補因子を用いた酵素複合体の製造 実施例８では尿酸を用いたが、ここでは尿酸以外のペルオキシダーゼ補因子を 用いたこと以外は、実施例８の記載と同様に行った。実施例１５Ａ アスコルビン酸 尿酸の代わりに、０．０１〜１Ｍ、好ましくは０．５Ｍの濃度でアスコルビン 酸を用いたこと以外は、実施例８の記載と同様に行った。実施例１５Ｂ ジヒドロキシマレイン酸 尿酸の代わりに、０．０１〜１Ｍ、好ましくは０．５Ｍの濃度でジヒドロキシ マレイン酸を用いたこと以外は、実施例８の記載と同様に行った。実施例１６ 最も好ましくは、皮膚の抗老化、抗しわ及び抗ストレスのための抗ラジカル性化 粧用調剤として用いられるＯ／Ｗエマルションタイプの化粧用組成物 以下に示す百分率の組成を有する５つの下記成分Ａ，Ｂ，Ｃ、Ｄ及びＥから、 古典的な方法を用いて、Ｏ／Ｗエマルションである組成物を調製した。 ＩＮＣＩ名： Ａ−ステアレス（Ｓｔｅａｒｅｔｈ）−２ ３％ ステアレス−２１ ２％ ポリプロピレングリコール−１５ステアリルエーテル ９％ セテアリルアルコール ２．５％からなる油相 Ｂ−ブチレングリコール ４．５％ 水 ７３．３％ Ｃ−パラベン及びフェノキシエタノールからなる防腐剤 ０．５％ Ｄ−トコフェロール ０．２％ Ｅ−実施例８の本発明による植物ＳＯＤ／ ５％ ペルオキシダーゼ／補因子の複合体 油相と水相を別々に８０℃に加熱した後、相Ｂを相Ａ、次いで相Ｃ、相Ｄ、更 に相Ｅと混合して、Ｏ／Ｗエマルションを得た。実施例１７ 抗炎症活性を有する医薬用組成物 この医薬用組成物は、古典的な医薬用活性成分とともに、本発明の実施例８で 得られたような調剤を５重量％、薬理学的に許容される賦形剤と混合して含有す る。実施例１８ 酸化に対して安定な食用組成物 この食用組成物は、悪臭の発生に対して安定性を有し、古典的な食用活性成分 とともに、本発明の実施例８で得られた調剤を５重量％含有しており、この調剤 は他の活性成分と同時に配合される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年５月１８日（１９９８．５．１８） 【補正内容】 請求の範囲 １． Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤、好ましくはペルオキシダーゼ、より好ましくは植物のペル オキシダーゼ、更に好ましくは、ペルオキシダーゼ特異還元物質として公知のペ ルオキシダーゼ補因子、により安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓ ＯＤ）を、活性素又は活性成分の１つとして含有する組成物であって、前記ＳＯ Ｄは、少なくとも１つの糖、特に単糖若しくは二糖、及び／又は、少なくとも１ つのポリオール、特に分子量が５０〜１０００ｇ／モルであるポリオールによっ て更に安定化されたものであることを特徴とする組成物、特に抗フリーラジカル 活性を有する組成物、例えば、化粧用、医薬用又は食用組成物。 ２． 単糖若しくは二糖及び／又はポリオールの濃度は、粗抽出物の状態又は精 製された状態にあるＳＯＤ又はＳＯＤ複合体に対して１０〜５０重量％である請 求項１記載の組成物。 ３． ＳＯＤの割合は、組成物の全重量の０．０１〜１０重量％である請求項１ 又は２記載の組成物。 ４． ＳＯＤに添加されるペルオキシダーゼの量は、ＳＯＤの１単位当たりペル オキシダーゼ約０．０１〜約１単位、好ましくはＳＯＤの１単位当たりペルオキ シダーゼ０．０１〜０．５単位である請求項１、２又は３記載の組成物。 ５． ペルオキシダーゼ酵素補因子は、０．００１Ｍ〜１Ｍの濃度で存在する請 求項１、２、３又は４記載の組成物。 ６． 抗酸化剤、好ましくは親油性抗酸化剤、より好ましくはトコフェロール類 及びその誘導体、特に、酢酸エステル、リノレン酸エステル又はリン酸エステル 等のエステル体から選ばれるものが、特に、目的組成物の全重量に対して０．０ １〜３重量％、好ましくは０．１〜１重量％の濃度で添加される請求項１、２、 ３、４又は５記載の組成物。 ７． ペルオキシダーゼは、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシ ダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、及び、脊髄のペルオキシダーゼ（即ち ミエロペルオキシダーゼ）からなる群より選択されるものであり、ペルオキシダ ーゼ特異還元物質は、好ましくは、グルタチオン、フェノール、グアイアコール 、ピロガロール、メシトール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスル ホン酸（ＤＣＨＢＳ）、アニリン、ｐ−トルイジン、ｏ−フェニレンジアミン、 メシジン、アスコルビン酸、ジヒドロキシマレイン酸、チトクロムＣ、ヨウ化物 、尿酸、フェノールフタレイン、２，２’−アジドージ（３−エチルベンゾチア ゾリン−６−スルホン）酸（ＡＢＴＳ）、及び、ＳＣＮ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-又はＩ^- 等の化合物から選択されるものである請求項１、２、３、４、５又は６記載の組 成物。 ８． ＳＯＤは、発芽後の植物の種子から抽出により得られたものである請求項 １、２、３、４、５、６又は７記載の組成物。 ９． 植物の種子は、穀類の粒又はマメ科の植物の種子若しくは油料植物の種子 である請求項８記載の組成物。 １０． 穀類は、小麦又は大麦、好ましくは春又は冬の品種の大麦からなり；マ メ科の植物の種子は、ヒラマメ又はエンドウマメからなり；油料植物の種子は、 大豆の種子からなる請求項９記載の組成物。 １１． 発芽は、管理されて行われるものであり、好ましくは発芽を促す薬剤の 存在下に、水分で湿らせた媒体又は空気中で、４℃〜５０℃の温度、好ましくは 常温で又は冷却して、１日以上かけて行われるものである請求項８、９又は１０ 記載の組成物。 １２． ＳＯＤは、植物の種子から抽出されたものであり、尿酸、アスコルビン 酸又はジヒドロキシマレイン酸から構成されたペルオキシダーゼ補因子と組み合 わせた、好ましくは黒ラディッシュから抽出された植物のペルオキシダーゼによ って安定化されているものである請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、 １０又は１１記載の組成物。 １３． ペルオキシダーゼ補因子は、尿酸、アスコルビン酸又はジヒドロキシマ レイン酸からなる群より選択されるものである請求項１、２、３、４、５、６、 ７、８、９、１０、１１又は１２記載の複合体品。 １４． ＳＯＤの割合は、組成物の全重量のおよそ５重量％である請求項１、２ 、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３記載の組成物。 １５． 植物の種子を常温で一日以上の間、水分で湿らせた空気又は媒体と接触 させることにより、発芽中に最大のＳＯＤ活性を得るように、及び、前記ＳＯＤ 活性が最大になる時点で前記ＳＯＤ活性を抽出するように管理された発芽工程を 経た植物の種子を原料として用いることを特徴とする、スーパーオキシドジスム ターゼ即ちＳＯＤの抽出及び安定化方法であって、ＳＯＤ抽出工程は、発芽した 種子を用いて行うものであり、前記発芽した種子をすりつぶし、次いで、ＳＯＤ 抽出を行うのに充分な時間、通常は数十分〜１時間以上かけて、４℃〜５０℃、 好ましくは常温の水溶液を用いて抽出を行い、次に、濾過、及び、前記ＳＯＤを 含有する濾液の回収を行うことからなり；次いでＳＯＤの安定化は、少なくとも １つの糖、特に単糖若しくは二糖、及び／又は、少なくとも１つのポリオール、 特に５０〜１０００ｇ／モルの平均分子量を有するポリオールを添加することに よることを特徴とする、スーパーオキシドジスムターゼ即ちＳＯＤの抽出及び安 定化方法。 １６． ＳＯＤは、Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤、例えばペルオキシダーゼ、好ましくはペルオ キシダーゼ特異還元物質として公知のペルオキシダーゼ補因子、によって安定 化される請求項１５記載の方法。 １７． 発芽工程以前に、常温又は冷却下の水溶液で一日以上の浸漬工程が行わ れる請求項１５又は１６記載の方法。 １８． 発芽工程は、発芽促進剤、より好ましくはジベレリン酸から構成される ものの存在下で行われるものである請求項１５、１６又は１７記載の方法。 １９． ＳＯＤのより完全な精製が、プロテアーゼや更にはリポキシゲナーゼ等 の望ましくない不純物を除去することができる沈殿剤を用いて濾液を処理し、非 沈殿留分、すなわち、ＳＯＤを含有する上澄みからなる留分を回収することによ り行われる請求項１５、１６、１７又は１８記載の方法。 ２０． ＳＯＤを含有する非沈殿留分の透析が、好ましくは分離値が６０００〜 ８０００ダルトンである膜を用いた、水に対する透析によって行われる請求項１ ９記載の方法。 ２１． 透析された溶液の補充の精製が、クロマトグラフィーカラムでの精製を 実施することにより行われる請求項２０記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２９ 39/06 ６３９Ｃ Ａ６１Ｋ 31/195 31/195 31/23 31/23 31/375 31/375 35/78 35/78 Ｊ Ｕ Ｙ Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｎ 9/08 9/96 9/96 (72)発明者 ペリエ エリック フランス国 38138 レ コートダレー カルチェ サン マルタン (72)発明者 アムベール ジェラール フランス国 54140 ジャルビル ラ マ ルグランジュ 11 リュ ポール ヴァレ リー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤、好ましくはペルオキシダーゼ、より好ましくは植物のペル オキシダーゼ、更に好ましくはペルオキシダーゼ特異還元物質として公知のペル オキシダーゼ補因子により安定化された、スーパーオキシドジスムターゼ即ちＳ ＯＤに基づく複合体製品。 ２． ＳＯＤは、発芽後の植物の種子から抽出により得られたものである請求項 １記載の複合体製品。 ３． 植物の種子は、穀類の粒又はマメ科の植物の種子若しくは油料植物の種子 である請求項２記載の複合体製品。 ４． 穀類は、小麦又は大麦、好ましくは春又は冬の品種の大麦からなり；マメ 科の植物の種子は、ヒラマメ又はエンドウマメからなり；油料植物の種子は、大 豆の種子からなる請求項３記載の複合体製品。 ５． 発芽は、管理されて行われるものであり、好ましくは発芽を促す薬剤の存 在下に、水分で湿らせた媒体又は空気中で、４℃〜５０℃の温度、好ましくは常 温で又は冷却して、１日以上かけて行われるものである請求項２、３又は４記載 の複合体製品。 ６、 Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤の量は、用いられるＳＯＤにより生じたＨ₂Ｏ₂を捕捉するの に充分な量であり、前記Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤がペルオキシダーゼである場合、前記ペル オキシダーゼの量は、前記ＳＯＤの１単位当たりペルオキシダーゼ約０．０１〜 約１単位、好ましくは前記ＳＯＤの１単位当たりペルオキシダーゼ０．０１〜０ ．５単位である請求項１、２、３、４又は５記載の複合体製品。 ７． ＳＯＤとＨ₂Ｏ₂捕捉剤、特にペルオキシダーゼとの複合体は、０．００ １Ｍ〜１Ｍの濃度で存在する酵素補因子、特にペルオキシダーゼ酵素補因子によ り安定化されたものである請求項１、２、３、４、５又は６記載の複合体製品。 ８． ペルオキシダーゼは、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシ ダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、又は、脊髄からのペルオキシダーゼ（ 即ちミエロペルオキシダーゼ）からなる群より選択されるものであり、ペルオキ シダーゼ特異還元物質は、好ましくは、グルタチオン、フェノール、グアイアコ ール、ピロガロール、メシトール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼン スルホン酸（ＤＣＨＢＳ）、アニリン、ｐ−トルイジン、ｏ−フェニレンジアミ ン、メシジン、アスコルビン酸、ジヒドロキシマレイン酸、チトクロムＣ、ヨウ 化物、尿酸、フェノールフタレイン、２，２’−アジド−ジ（３−エチルベンゾ チアゾリン−６−スルホン）酸（ＡＢＴＳ）、及び、ＳＣＮ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-又 はＩ^-等の化合物から選択されるものである請求項１、２、３、４、５、６又は ７記載の複合体製品。 ９． Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤は、植物のペルオキシダーゼであり、好ましくは黒ラディッ シュから抽出されたものである請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の 複合体製品。 １０． ペルオキシダーゼ補因子は、尿酸、アスコルビン酸又はジヒドロキシマ レイン酸からなる群より選択されるものである請求項１、２、３、４、５、６、 ７、８又は９記載の複合体製品。 １１． ＳＯＤとＨ₂Ｏ₂捕捉剤、特にペルオキシダーゼとの複合体であって所望 によりペルオキシダーゼ補因子と組み合わせたものは、特に、粗抽出物の状態又 は精製された状態にあるＳＯＤ複合体に対して１０〜５０重量％の濃度における 、少なくとも１つの糖、特に単糖若しくは二糖、及び／又は、少なくとも１つの ポリオールで特に分子量が５０〜１０００ｇ／モルであるものによって更に安定 化されたものである請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０記載 の複合体製品。 １２． 抗酸化剤、好ましくは親油性抗酸化剤、より好ましくは、トコフェロー ル類及びその誘導体、特に酢酸エステル、リノレン酸エステル又はリン酸エステ ル等のエステル体から選ばれるものを有効抗酸化量で更に含有する請求項１、２ 、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１1記載の複合体製品。 １３． 組成物、特に抗フリーラジカル活性を有する組成物、例えば、化粧用、 医薬用又は食用組成物の活性成分の１つとしての、請求項１、２、３、４、５、 ６、７、８、９、１０、１１又は１２記載のＳＯＤに基づく複合体の使用。 １４． Ｈ₂Ｏ₂捕捉剤、好ましくはペルオキシダーゼ、より好ましくは植物のペ ルオキシダーゼ、更に好ましくは、ペルオキシダーゼ特異還元物質として公知の ペルオキシダーゼ補因子により安定化されたスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓ ＯＤ）を、活性素又は活性成分の１つとして含有することを特徴とする組成物、 特に抗フリーラジカル活性を有する組成物、例えば、化粧用、医薬用又は食用組 成物。 １５． ＳＯＤの割合は、全組成物重量の０．０１〜１０重量％である請求項１ ４記載の組成物。 １６． ＳＯＤに添加されるペルオキシダーゼの量は、ＳＯＤの１単位当たりペ ルオキシダーゼ約０．０１〜約１単位、好ましくはＳＯＤの１単位当たりペルオ キシダーゼ０．０１〜０．５単位である請求項１４記載の組成物。 １７． ペルオキシダーゼ酵素補因子は、０．００１Ｍ〜１Ｍの濃度で存在する 請求項１４、１５又は１６記載の組成物。 １８． ＳＯＤ、又は、前記ＳＯＤとＨ₂Ｏ₂捕捉剤、特にペルオキシダーゼと の複合体であって所望によりペルオキシダーゼ補因子を組み合わせたものは、特 に、粗抽出物の状態又は精製された状態にある前記ＳＯＤ又は前記ＳＯＤ複合体 に対して１０〜５０重量％の濃度における、少なくとも１つの糖、特に単糖若し くは二糖、及び／又は、少なくとも１つのポリオールで特に分子量が５０〜１０ ００ｇ／モルであるものによって安定化されたものである請求項１４、１５、１ ６又は１７記載の組成物。 １９． 抗酸化剤、好ましくは親油性抗酸化剤、より好ましくはトコフェロール 類及びその誘導体、特に、酢酸エステル、リノレン酸エステル又はリン酸エステ ル等のエステル体から選ばれるものが、特に、目的組成物の全重量の０．０１〜 ３重量％、好ましくは０．１〜１重量％の濃度で添加される請求項１４、１５、 １６、１７又は１８記載の組成物。 ２０． ペルオキシダーゼは、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、ラクトペルオキ シダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、又は、脊髄のペルオキシダーゼ（即 ちミエロペルオキシダーゼ）からなる群より選択されるものであり、ペルオキシ ダーゼ特異還元物質は、好ましくは、グルタチオン、フェノール、グアイアコー ル、ピロガロール、メシトール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンス ルホン酸（ＤＣＨＢＳ）、アニリン、ｐ−トルイジン、ｏ−フェニレンジアミン 、メシジン、アスコルビン酸、ジヒドロキシマレイン酸、チトクロムＣ、ヨウ化 物、尿酸、フェノールフタレイン、２，２’−アジド−ジ（３−エチルベンゾチ アゾリン−６−スルホン）酸（ＡＢＴＳ）、及び、ＳＣＮ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-又は Ｉ^-等の化合物から選択されるものである請求項１４、１５、１６、１７、１８ 又は１９記載の組成物。 ２１． ＳＯＤは、植物の種子から抽出されたものであり、尿酸、アスコルビン 酸又はジヒドロキシマレイン酸から構成されたペルオキシダーゼ補因子と組み合 わせた、好ましくは黒ラディッシュから抽出された植物のペルオキシダーゼによ って安定化されているものである請求項１４、１５、１６、１７、１８、１９又 は２０記載の組成物。 ２２． ＳＯＤの割合は、組成物の全重量の０．１〜１０重量％である請求項１ ４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１記載の組成物。 ２３． ＳＯＤの割合は、組成物の全重量のおよそ５重量％である請求項１４、 １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２記載の組成物。 ２４． 植物の種子を常温で一日以上の間、水分で湿らせた空気又は媒体と接触 させることにより、発芽中に最大のＳＯＤ活性を得るように、及び、前記ＳＯＤ 活性が最大になる時点で前記ＳＯＤ活性を抽出するように管理された発芽工程を 経た植物の種子を原料として用いることを特徴とする、スーパーオキシドジスム ターゼ即ちＳＯＤの抽出方法であって、ＳＯＤ抽出工程は、発芽した種子を用い て行うものであり、前記発芽した種子をすりつぶし、次いで、ＳＯＤ抽出を行う のに充分な時間、通常は数十分〜１時間以上かけて、４℃〜５０℃、好ましくは 常温の水溶液を用いて抽出を行い、次に、濾過、及び、前記ＳＯＤを含有する濾 液の回収を行うことからなることを特徴とする抽出方法。 ２５． 発芽工程以前に、常温又は冷却下の水溶液で一日以上に及ぶ浸漬工程が 行われる請求項２４記載の方法。 ２６． 発芽工程は、発芽促進剤、より好ましくはジベレリン酸から構成される ものの存在下で行われるものである請求項２４又は２５記載の方法。 ２７． ＳＯＤのより完全な精製が、プロテアーゼや更にはリポキシゲナーゼ等 の望ましくない不純物を除去することができる沈殿剤を用いて濾液を処理し、非 沈殿留分、すなわち、ＳＯＤを含有する上澄みからなる留分を回収することによ り行われる請求項２４、２５又は２６記載の方法。 ２８． ＳＯＤを含有する非沈殿留分の透析が、好ましくは分離値が６０００〜 ８０００ダルトンである膜を用いた、水に対する透析によって行われる請求項２ ７記載の方法。 ２９． 透析された溶液の補充の精製が、クロマトグラフィーカラムでの精製を 実施することにより行われる請求項２８記載の方法。 ３０． ＳＯＤは、好ましくはペルオキシダーゼ特異還元物質として公知のペル オキシダーゼ補因子であるペルオキシダーゼ等のＨ₂Ｏ₂捕捉剤によって安定化さ れる請求項２４、２５、２６、２７、２８又は２９記載の方法。 ３１． ＳＯＤは、少なくとも１つの糖、特に単糖若しくは二糖、及び／又は、 少なくとも１つのポリオールで特に平均分子量が５０〜１０００ｇ／モルである ものを添加することによって安定化される請求項２４、２５、２６、２７、２８ 、２９又は３０記載の方法。