JPS60500892A - マルチチエインポリペプチドまたは蛋白質およびそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マルチチェイン？リペデチドまたは 蛋白質およびそれらの製造方法 本発明はマルチチェイン（ｍｕｌｔｌｃｈａｌｎ　）　ｆＲポリペプチドたは蛋 白質および組換えＤＮＡ技術で形質転換された宿主生物の細胞中でそれらを生産 する方法する方法に関している。

近年の組換えＤＮＡ技術を基礎とする分子生物学における進歩は、異質性（外来 性）ポリペプチドまたは蛋白質の生成をコードする異質ＤＮＡ配列で形質転換さ れた宿主細胞中にそれらを生成さす方法を提供した。

理論的には、適切なりＮＡコード配列が同定されそして宿主細胞を形質転換する のに用いうる限り、組換ＤＮＡのアプローチを、適当な宿主細胞中での、いずれ の異質、］（ＩＪペプチドまたは蛋白質の生産に応用しうるであろう。実際には 、商業的に有用な生成物の生産に組換えＤＮＡのアプローチをまず試みた時に、 いずれかの特定の、４５１Ｊペプチドまたは蛋白質の生産にそれを応用すること は、特殊な問題および難点を呈した。そして、いずれかの特定のポリペプチドま たは生成物の生産にこのアプローチを適用することの成否は容易に予知しうるも のでなかった。

しかし、今や、多数の異質シングルチェイン（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎ　）ポリ ペプチドまたは蛋白質が、組換えＤＮＡ技術により形質転換された宿主細胞によ り生産されている。そのような異質シングルチェインポリペプチドまたは蛋白質 の例には、ヒトインターフェロン、ヒトインスリンのＡおよびＢ鎖、ヒトおよび ウシの生長ホルモン、ソマトスタチン、ウシプロキモシンオヨヒウロキナーゼが ある。このような形質転換された宿主細胞は、産業規模の発酵技術を用いる産業 規模で生産されうる異質ｙＷ　＋）ペゾチドまたは蛋白質の標準品を再現性よく 供給する。

指摘すべきこととして、これらのボリペフ０チドのあるものだとへばウロキナー ゼは、宿主細胞により分泌されたあと２本鎖分子として現われる。しかし、その ような場合、分子は、１本のＤＮＡの配列によりコードされる１本鎖ポリペプチ ドとして宿主細胞により合成され、これが宿主細胞中で切断されて２本鎖の構造 となる。

ヒトおよび動物のシステム中において、マルチチェイン構造を有し、その構造に おいて、それらの鎖が１本のＤＮＡ配列によりコードされる１本鎖ポリペプチド の切断に由来するものでない、いくつかのホリベブチドまたは蛋白質が知られて いる。そのような場合、鎖のそれぞれについての遺伝子は同じ染色体の異なる点 に位置するかまたは異なる染色体上に存在する場合さ６ 成し、それから組上げて完全な分子とする。これまで、単一の宿主細胞より組換 えＤＮＡ技術により、そのようなマルチチェインポリペプチドが生産されたこと はなかった。

そのようなマルチチェインポリペプチドまたは蛋白質の例に特に免疫グロブリン がある。

免疫グロブリンは、一般に抗体といわれ、細菌、ウィルスおよび外来蛋白質のよ うな外来抗原によりチャレンジされた動物においてＢ−淋巴球により生成される 蛋白質分子である。免疫グロブリンはヒトおよび動物の免疫系において不可欠の 役割を担っている。免疫グロブリンは外来物質の特異的部分を認識し、それらに 結合する。特異的部分はふつう抗原決定基または抗体結合サイトとして知られる 。ある抗原物質は、ある数の異なる抗原決定基を有するようである。

第１図に典型的な免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を示す。

これを参照して説明する。Ｉｇ分子は約６００アミノ酸残基の、２本の同じポリ ペプチド鎖（ふつう重鎖Ｈと称する）を有する。これらは相互にジスルファイド 結合で結ばれている。そして、また、約２２０アミノ酸残基の、２本の同じより 短かいポリペプチド鎖（ふつう軽鎖りと称する）を含有し、これらは、示すよう に各重鎖の一方の端にジスルファイド結合している。

Ｉｇ分子が正しく折れると、６鎖は一定数の明瞭な球状域を形成する。これらは ふつうドメイン（ａｏｍａｉｎ）４　特表昭ＧＯ−５（１０８９２（３）として 知られ、より直線状のボリベフ０チド鎖により連結される。Ｌ鎖は２個のそのよ うなドメインを有し、ひとつは、可変配列Ｖ１．を有し、他は不変配列ＣＬを有 する。Ｈ鎖は、Ｌ鎖の可変ドメインＶＬに隣接して、ひとつの可変ドメインＶＨ を有し、そして、６または４個の不変配列ドメインＣｌ−１１−３、ｌ：　タハ 。を有する。

Ｈ鎖およびＬ鎖共にその上の可変ドメインは、それぞれに３個の超可変性領域（ ＨＶｌ−３）を含有し、それらは、工８分子が正しく折りたたまれた晴に相互に 隣接して位置し抗原結合サイトを形成する。１８分子が特異的である抗原決定基 を認識しそれに結合するのはこの領域である。

１８分子の不変ドメインは抗原決定基への結合にあづからず、−分子の抗原決定 基への結合により引き金を引かれる作用を媒介する。この引き金は、Ｉｇり子が 抗原決定基に結合することでおこるアロステリック効果によりひかれると信ぜら れる。不変ドメインは、工８分子が補体を結合することを可能としたり、マスト 細胞にヒスタミンを放出させたりし５る。

工、は、それらの含有するとされるＨ鎖不変ドメインの数に応じてクラスまたは サブクラスに分類しうる。

マウスでは８個のそうしたＨ鎖が可能である。たとへばμＨ鎖を有する工８分子 は、クラスＩ　ｇＭに属し、そしてγｌＨ鎖を有するものはクラス１ｇＧ１　に 属する。

１ｇはまた２個のし鎖（Ｋおよび２Ｌ鎖と称する）の１個を含有し５る。それら は異なる不変ドメイン、および可変ドメインの異なったセットを有して℃・る。

１８分子の構造およびそれの種々のドメインなコードする遺伝子の位置は、Ｅａ ｒｉｙおよびＨｏｏｄにより、Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＥｎＦｌｉｎｅｅｒｉｎｇ、　 Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、３巻、１５３−１５８頁（Ｓ ｅｔｌｏｗおよびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　）によ り詳しく論ぜられている。

工８分子を選択された酵素で消化すると、一定数の免疫学的に機能するフラグメ ントを生ずることが知られている。２つのそのようなフラグメントはＦａｂおよ び（Ｆａｂ′）２　として知られる。Ｆａｂフラグメントは、第１図に示すよう に、Ｈ鎖のｖＨおよびＣＨニドメインに連結して１個のＬ鎖を含有する。（Ｆａ ｂ’）２　フラグメントは、第１図に示すように、Ｈ鎖の小さい追加の部分によ り相互に連結されている２個のＦａｂフラグメントより本質的に成立っている。

これらのフラグメントおよび他の類似のフラグメントは、種々の試験および診断 および医学的方法に有用でありうる。

■、を生産するために用いる主な方法は、感受性の動物を抗原物質で免疫して免 疫反応をおこすことである。うつう工、の収量を改良するのに２度免疫する。

ついで動物から採血し、血清より１８を採取する。

しかし、この方法による生成物は均質蛋白質でない。

動物は種々のクラスの■８そしてまた抗原物質上の種種の抗原決定基のそれぞれ に特異的の１８を生成する。

それで血液は工、の不均質な混合物を含有することになる。そのような混合物よ り特定のクラスのそして望む特異性を有する特異的■８ををうろことは、非常に 困難で面倒な精製操作を必要とする。

最近、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６　＋４ ９５−４７９．１９７５）により最初に記載された技術により、ひとつのクラス に属しそしてひとつの特異性を有する均質工、を生産することが可能となった。

この技術では、ひとつの工、−生産性親細胞を癌細胞と融合させ、そのＸｇを生 産するモノクローナルハイプリドーマ細胞とする。この技術で生成される工、は ふつうモノクローナル抗体として知られる。モノクローナル■８の性質は、親細 胞の生成する工、のクラスおよび特異性で定まる。

最近、Ｉｇ分子のフラグメントを生成さすのに組換えＤＮＡ技術を用いようとす る試みがある。たとへば、Ａｍ５ｔｅｒ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　、　８　、　Ａ　９　＋１９８０．２０５５から２０６５頁）は、 マウスＩｇＬ鎖をコードする２本鎖ＣＤＮＡ配列をプラスミド中にクローニング することを記載している。このプラスミドで形質転換された！６図ｕ株は、Ｌ鎖 の全不変ドメインおよび可変部の約４０個のアミノ酸残基を含有すると思われる 蛋白質を合成した。

ＫｅｍｐおよびＣｏｗｍａｎ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 。

ＵＳＡ、７８，１９８’１．４５２０より４５２４頁）は、７ マウスＨ鎖フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列のクローニングおよびＥ、　 ｃｏｌｉの形質転換、それにょるＨ鎖ポリペプチドフラグメントの合成を記載し ている。

これらの両方のケース共、ポリペプチドは融合蛋白質として生成され、Ｉｇ　＄ リペデチドのフラグメントは、追加の非エ　ポリペプチド配列および不完全の可 変ドメインと融合している。それで、これらの研究で生成されたポリペプチド鎖 は、相補的なＨ鎖またはＬ鎖と組合わさり、インタクトの抗原結合サイトおよび 免疫学的機能を有する一分子を提供しえないので、免疫学的機能をするポリペプ チドとならない。

哺乳動物システムでも研究はなされている。たとへぼ、ＦａｌｋｎｅｒおよびＺ ａｃｈａｕ　（Ｎａｔｕｒｅ　、２９８　。

１９８２．２８６から２８８頁）の報告によると、マウｘ　Ｌ　鎖ヲ−ｙ　−ト スるｃＤＮＡ配列をデラスミドニクローニングし、それを用いてｒツム性の真核 細胞をトラスフエクションした。細胞は、一過性にＬ鎖を合成しえた。

ＲｉｃｅおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ　’（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７９，１９８２．７８６２から７８６５頁）は、機能的に再編成された ＫＬ鎖■８遺伝子を、ネズミ白梅球ウィルスで形質転換された淋巴球セルライン にトランスフェクションした。細胞は連続的に遺伝子を発現しうるようにな１つ だ。これら両方の場合共、哺乳動物細胞にトランスフェクションするに用いたに 遺伝子は、８ｙｙｓａｒ、ｏ−５ｏｏ８ｓ２（４）骨髄腫細胞より得られそして 生成Ｋ　、ｆ　＋）ペプチドは中間的免疫学的機能を有するものであった。

さらに別のアプローチを示すと、Ｖａｌｌｅ等の１連のは、マウス骨髄腫ライン から分離された、楡〇ＨまたはＬ鎖をコードするｍＲＮＡをアフリカッメガエル の卵細胞にミクロインジェクションしている。条件により完全な１８分子が形成 された。しかしｍＲＮＡは骨髄腫細胞より得られＩ８分子の免疫学的機能は中間 的であつ゛た。

それで、組換えＤＮＡ技術により機能重工、は生成され得なかったとみなしうる 。

本発明の第１の特徴は、単一の宿主細胞中に異質性のマルチチェインポリペプチ ドまたは蛋白質を生成する方法を提供することである。その三方法では、ポリペ プチド鎖のそれぞれをコードするＤＮＡ配列で宿主細胞を形質転換し、該形質転 換された宿主細胞中に該ポリペプチド鎖を発現させる。

本発明の第２の特徴は、単一宿主細胞より、組換えＤＮＡ技術により生成される 異質性マルチチェインポリペプチドまたは蛋白質を供給することである。

本発明は上記した型の工６分子および免疫学的に機能する楡フラグメントの生成 に特に応用されうるが、それらに限定されるわけでない。しかし、本発明が他の マルチチェインポリペプチドまたは蛋白質の生成に応用されうろことはもちろん である。

本発明に準する１８分子の生成物に関しては、機能的分子を生成するために宿主 細胞を形質転換するに用いるＤＮＡ配列が工５分子の少なくともＶＬおよびＶＨ ドメインをコードする必要があろうことはもちろんである。されらに、これらの ドメインは、２つのポリペプチド鎖が相互に折れたたまれた時に、あらかじめ定 められた特異性を有する抗原結合サイトを形成するように、相補的である必要が あろう。

なるべくは、Ｉｇ分子またはフラグメントは、完全なし鎖、および、Ｈ鎖の顔　 ドメインに加えて少なくＣＨニドメインを含有するようにする。工８分子がイン タクトであるのがもつとも有利である。

本発明により、インタクトの可変ドメインを有する個々のＨ鎖およびＬ鎖を生成 することが今や可能となった。これは従来は不可能であった。そこで、本発明の 第３の特徴はインタクトの可変ドメインを有する、ＩｇＨまたはＬ鎖またはそれ らの７ラグメントを、組換えＤＮＡ技術の生成物として提供することである。

有利には、本発明に準する工８分子またはそれの機能的フラグメントは、臨床的 または産業的に重要な抗慮決定基に対する結合サイトを定める、ＶＬおよびｖＨ ドメインにより形成される可変域を有するようにする。

そのような分子を生成するに必要なりＮＡコード配列は、望む特異性を有する、 天然に存在するがまたはハイプリドーマ（モノクローナル）■８−生成性の細胞 に由来しうる。

工８分子またはフラグメントの不変ドメインは、もしそれが存在するならば、可 変域と同じセルラインに由来しうる。しかし、不変ドメインは特異的に改変され うる。あるいは、部分的にまたは完全に省略しうるし、または、異なるクラスの １８を生成するセルラインに由来するものとし、そうして、望む性質のＩ８分子 またはフラグメントとなしうる。

たと１へば、望む特異性を有するモノクローナル抗体よりのものと同じ可変ドメ イン（ＶＨおよびＶＬ）を有しそして望む性質、たとへはヒトへの適合性または 補体結合サイトを提供するような、別のモノクローナル抗体よりの不変ドメイン を有する工８分子を生成させうる。

不変ドメインのアミノ酸配列のそのような改変は、適当な変異または部分合成そ して相当するＤＮＡコード配列適切な領域の置き代えまたは部分的または完全な 置換で達成されうる。不変ドメインの置換は、和合性の、組換えＤＮＡ配列によ り得られる。

本発明は、免疫精製、イムノアッセイ、細胞化学的ラベリングおよびターゲツテ ィング法および診断または治療に有用な一分子またはフラグメントの生成に１１ 用い５る。たとへぼ、楡分子またはフラグメントはインターフェロンまたはファ クター■のような血液凝固因子といった治療活性のある蛋白質に結合させうるの で、蛋白質の免疫精製またはアッセイに用いるためのアフイニテイクロマトグラ フィーの媒体となし５る。

不変域のひとつに付着した別のペプチド結合を有する１８分子を宿主細胞により 合成させうる。それらのさらに加えたペプチド結合は細胞毒性でも酵素的でもあ りうる。別様には、そのような結合は、細胞または組織のような生物学的基体ま たはクロマトグラフィー媒体のような非生物学的基体に１ｇ分子を付着さすのに 有用でありうる。そのようなペプチド結合は、本明すでにこの方面で技術で知ら れているように、ふつうのペプチド化学の方法で、細胞毒性、酵素的または構造 性ペプチド結合を工８分子に付着さすことも考慮される。

１分子またはフラグメントはまた治療剤そのものを含有しうる。たとへばＤ血液 群抗原に特異的の１８分子またはフラグメントは、新生児の溶血性の病気の予防 に有用でありうる。

本発明のマルチチェインポリペプチドまたは蛋白質の生成には任意の適当な組換 えＤＮＡ技術を用いうる。

ポリペプチドまたは蛋白質の鎖のそれぞれをコードするＤＮＡ配列を含有するプ ラスミドのような代表的な発現ベクターを構築する。

１本より多くの鎖をコードするＤＮＡ配列を含有する単一ベクターを構築しうろ ことはもちろんである。たとへば、ＩｇのＨおよびＬ鎖をコードするＤＮＡ配列 を、同じプラスミドの異なる位置に挿入しうろことはもちろんである。

別様には、それぞれの鎖をコードするＤＮＡ配列を個別的にプラスミドに挿入し 、それぞれに特定の鎖をコードする、一定数の構築プラスミドを生成させうる。

なるべくは配列を挿入するプラスミドは和合性とする。

構築されたデシスミ１ド（単または複数）を用いて宿主を形質転換し、ポリペプ チドまたは蛋白質の鎖のそれぞれをコードす−るＤＮＡ配列を宿主細胞が含有す るようにする。

細菌システムにおいてクローニングするに用いうる適当な発現ベクターには、Ｃ ｏｌ　Ｅｌ、　ｐｃＲｌ、　ｐＢＲ３２２゜ｐＡＣＹＣ１８４およびＲＰ４．フ ァージＤＮＡまたはそれらのいずれかの誘導物といったプラスミドがある。

酵母システムにおいてクローニングするのに用いるためには、適当な発現ベクタ ーは、２ミクロンオリジンにもとづくデラスミ・ドである。

適当な哺乳動物遺伝子プロモーター配列を含有するプラスミドならいずれも、哺 乳動物システム中にクロロ たとへばｐＢＲ３２２、ウシ乳頭腫ウィルス、レトロウィルス、ＤＮＡウィルス およびワクシナウィルスに由来するプラスミドがある。

異質マルチチェインポリペプチドまたは蛋白質の発うな酵母、昆虫または哺乳動 物セルラインのような真核細胞がある。適当な細菌性宿主細胞には、Ｅ、　ｃｏ ｌｉＨＢＩ　０１、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｘ　１７７’６、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｘ　２ ８　Ｂ　２、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＰＳ　４１０、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＲＣ１、Ｅ、 　ｃｏｌｉ　ＲＶ　３０８、旦、ｃｏｌｉＥ１０３Ｓおよび旦、　ｃｏｌｉ　Ｂ 　７￥ある。

本発明はさらに、本発明のマルチチェインポリペプチドまたは蛋白質を生成さす に用℃・るための構築されたベクターおよび形質転換された宿主細胞に関する。

同じ宿主細胞中で個々の鎖を発現させたあと、それらを採取して、活性型の完全 なマルチチェインｙｌｅ　’）ペプチドまたは蛋白質、たとへばあらがしめ定め た免疫学的機能のある楡分子が得られる。

本発明の有利な形として、個々の鎖は宿主細胞により処理されて完全なポリペブ チｒまたは蛋白質となり、それらは有利には宿主より分泌されるであろう。

しかし、個々の鎖が不溶なまたは膜に結合した形で生成されうる。それで個々の 鎖を可溶化し、溶液中で鎖をふたたび折りたたませ活性のあるマルチチェインポ リペプチドまたは蛋白質を形成させる。不溶または膜結合型に発現されたポリペ プチド鎖を可溶化するための適当な操作は、我々の特許願（蛋白質の採取、Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ、　Ａｇｅｎｔ’ｓ　Ｒｅｆ、　（）Ｆ’４０２ １２　’０および４０２１２１）に記載されている。

組上げられて完全なマルチチェインポリペプチドまたは蛋白質を形成するような 別々のポリペプチドの２個またはそれより多くくを発現するように宿主細胞を形 質転換しうろことを本騎許願がが始めで示したことを理解されたい。それぞれの 宿主細胞より単一鎖異質ポリペプチドまたは蛋白質の生成のみに関連する従来法 において、本発明の内容は明らかにされなかったし、示唆されていなかまた。

本発明は、図面を参照しながら、例を用いて記載してゆく。

第１図は、代表的なインタクトの１ｇ分子を図解したものである。

第２図は、且、正見中にλＬ鎖を直接に合成するためのプラスミドの構築を示す 。

第６図は、旦０羽旦中にμＨ鎖を直接に合成するためのプラスミドの構築を示す 。

第４図は、開始コドンのまわりのμｍＲＮＡ配列を図示する。

第５図は、開始コドンのまわりの改変された２次構造を有するプラスミドの構築 を示す。

１５ 分布を示すポリアクリルアミドデルである。

第７図は、見、ｃｏｌｉ　Ｂおよび見、φメリュＨＢ　Ｉ　Ｄ　ｉ　中のμ蛋白 質のパルスチェイスオートラジオダラムを示すポリアクリルアミドデルである。

第８図は、旦、並置中の２遺伝子発現の結果を示すポリアクリルアミドゲルであ る。

第９図は、可溶性および不溶性細胞分画のあいだの組換えλＬ鎖ポリペプチドの 分配を示すポリアクリルアミドデルである。

第１０図は、旦、ｃｏｌｉ　Ｅ　１０ろＳよりのλ蛋白質の発現および分布を示 すポリアクリルアミドゲルである・第１１図は、見、ｃｏｌｉ　Ｂにより発現さ れたμおよびλ蛋白質のＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌ上の分画の結果を示す。

第１２図は、再構成された工８分子の特異的ノ・フ０テン結合を示す。

第１６図は、再構成されたＩｇ分子のノ・ブテン結合のへテロクリット（ｈｅｔ ｅｒｏｃｌｉｔｉｃ　）性を示す。

以下の例では、Ｅ、ｃｏｌｉおよびＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主細胞に用 い、抗原決定基４−ヒドロキシ−ろ−ニトロフェニルアセチル（ＮＰ）を認識し そして結合するモノクローナル抗体に由来する工ｇＬおよびＨ鎖ポリペプチドの 生成を記載する。ここで組換えＤＮＡを用いて、宿主細胞に両方の、１５１Ｊペ プチド鎖を発現させた。

本発明が、以降に記載する具体的方法および構成に限定されぬことはもちろんで ある。

１６　符表昭６０−５００８９２　（６）ラムダ−Ｌ鎖発現プラスミドの構築 第２図は、λＬ鎖発現プラスミドを構築するために用いる方法を模式的に示す。

真核性シグナルペプチドを欠くがアミノ末端にメチオニンイニシェーター残基（ ｍｅｔ、−ラムダ）を含有する遺伝子の直接的発現によりＥ、ｃｏ、リユ中にラ ムダ遺伝子を発現さすことにした。

ｍｅｔ−ラムダの細菌的合成に用〜・るアプローチとして、ｃＤＮＡクローンの 制限フラグメントよりインビトロ−で遺伝子を再構築しそして細菌プラスミドｐ ＣＴ　５４中に挿入するための合成りＮＡフラグメントな用いることである（　 Ｅｍｔａｇｅ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、 。

炙」、３６７１から３６７５．１９８ろ）。このベクターは、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｔ ｒｐプロモーター、オペレーターおよびリーダーリポゾーム結合サイトを含有す る。さらにリボゾーム結合サイトより１４ヌクレオチド下流には、イニシエータ ーＡＴＧがあり、すぐにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトおよびバクテ リオファージＴ７よりのＥ、ｃｏｌｉ　ＲＮＡポリメラーゼのためのターミネー タ−がある。

Ｌ鎖の材料には、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ　Ｉサイト中にクローン化された完全長 λＩＬ鎖ｃ　ＤＮＡを含有するデラスミ）ｌ’ｐＡＢλト１５を用いた。この２ １Ｌ鎖は、４−ヒドロキシ−６−ニトロフェニルアセチル（ＮＰ　）ハプテンを 結合する、Ｓ４３と称するモノクローナル抗体に由来スル。ｐｃ’ｒ　５４のＨ ｉｎｄ　ＩＩＩサイト中に挿入するための７ Ｈｉｎｄ　Ｉｎサイト６′をラムグー遺伝子の末端に創出するために、ＰｓｔＩ を用いてｐＡＢλト１５よりｃ　ＤＮＡを切り出した。接着末端は、ＤＮＡ１ｅ ｌＪメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用い配列５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧ Ｇ　−３’　ノ合成ＨｉｎｄＩＩＩ　リンカ−分子をりｒ−ジョンさせて平滑末 端Ｌ　ｔ、　タ。ＤＮＡ　ハＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化しそして８５０　ｂｐラム グー遺伝子をゲル電気泳動で分離し、Ｈｉｎ４ＩＩＩで切断したｐＡＴ　１５３ にクローン化してプラスミドｐＡＴλ１−１５とした。ｐＡＴλ１−１５よりラ ムグー遺伝子３／末端を、ＨｉｎｄＩＩＩによりそして部分的５ａｃＩ消化によ り６３０　ｂｐ　５ａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（第２図の２）として 分けた。Ｈｉｎｄｍ接着末端は、引き続く反応においてこの末端での望ましから ぬりケゞ−ジョンを防ぐために、フラグメントを分離するあいだにウシ小腸アル カリホスファターゼで脱リン酸化した。

ＨｉｎｆＩ制限サイトは、コドン７および８とラムグー配列とのあいだに位置す る。ラムグー遺伝子の５′末端は、１４８　ｂｐのＨｉｎｆ　Ｉからｓａｃ　Ｉ へのフラグメント（第２図の１）として分離した。

２つのオリゴデオキシヌクレオチドは、コドン１−８を恢復しそしてイニシエー ターＡＴＧならびにＢｃｌＩおよびＨｉｎｆ　Ｉ接着末端を提供するようにデザ インした。

２つの化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、遺伝子の組立てを容易にする ようにしたもので、つぎの配列を有する。

Ｒ４５５’　−ｐＧＡＴＣＡＡＴ（）ＣＡ（）ＧＣＴＣ）ＴＴ（）Ｔ（）　３’ Ｒ４４３’　ＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＣＣＴＴＡｐ　−５’ｐＣＴ　５ ４はＢＣＩ　１およびＨｉｎｄＩＩＩの両方で切り生ずる直線状分子を分離し、 ２個のオリゴデオキシリボヌクレオチドリンカ−Ｒ４４およびＲ４５、およびフ ラグメント１および２の両方と混合し、’ｐ　４１Ｊが−ゼを用いてリテーショ ンさせた（第２図）。この混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ工を形質転換しア ンピシリン抵抗性とした。ｐｃ’ｒ　５４中の組換えクローンは、ｐＡＴλ、− １，インサートに由来するニック−トランスレーションプローブへ、ニトロセル ロース上のレプリカプレートされたコロニーよりのＤＮＡをハイブリダイゼーシ ョンさせて同定した。

ラムダ−ｃＤＮＡにハイブリダイゼーションしそして予期される制限フラグメン トパターンを示したクローンを同定した。このプラスミド（ｐＣＴ５４１９−１ と称する）をＣ１ａＩサイトより配列を決めると、第４コドンでＣＴ（）からＡ ＴＣ）に変わり、この点でのアミノ酸がバリンよりメチオニンに変わったことを 除いて、予期された配列を有した。

この部分の配列はつぎのようである。

、、、Ｇ！Ａ島、ｃＡＧ、ＧＣＩ’、ＧＩＴ、ＡＴＧ、Ａｆａｒ、ＣＡＧ、ＱＡ Ａ、ＴＣＴ、０ＣＡ−ＣＴＣ，ＡＣＣ，ＡＣＡ、’Ｉ℃Ａｍｅｔ　ｇＩｎ　ａＩ ａ　ｖａｌ　ｍｅｔ　ｔｈｒ　ｇｌｎ　ｇｌｕ　ｓｅｒ　ａｌａ　ｌｅｕ　ｔｈ ｒ　ｔｈｒ　ｓｅｒリボ・戸−ム結合に重要な、５ｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒ ｎ。

配列のあいだのｐｃ’ｒ　５４中の制限酵素サイト（ＡＡＧＧ）１９ およびＡＴＧは、発現率を決めるに重要なパラメーターである５Ｄ−ＡＴＧ距離 の調整を可能とする。５Ｄ−ＡＴＧ距離を減少さすには、デラスミｒをＣ１ａＩ またはＢｃｌ工で切りＳ１ヌクレアーゼで消化して平滑末端を有する種とする。

Ｃ］、ａＩで切ったＤＮＡの２μ２を、標準緩衝条件を用（・て３０℃で６０分 Ｓ１ヌクレアーゼの２００単位で消化した。溶液をフェノールで除蛋白し、エタ ノール沈殿でＤＮＡを採取した。このＤＮＡをＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ再リ す−ションし、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１株を形質転換し、Ｃ１ａ■またはＢ ｃｌＩサイトを失なったある数のプラスミドを生成させた。Ｃ１ａＩサイトを失 なったプラスミドは、イニシエーターＡＴＧのまわりの領域で配列高レベルの発 現を達成するためには、いくつかの別のアプローチも行なった。第１に、Ｂａｌ ろ１エクンヌクレアーゼでｃ　ＤＮＡの３′未翻訳領域のより多くを除いた１連 の構築物を得た。第２にλＣＤＮＡを含有するコピー数の高いプラスミドを構築 した。このプラスミドは、パーｙｖ　（ｐａ丁）機能（Ｍｅａｃｏｃｋ、　Ｐ、 　Ａ、およびＣｏｈｅｎ。

Ｓ、Ｎ、、　Ｃｅ１ｌ、　２０．　５２９−５４２．　１９８０　）を、高コ２ −数とあわせて有した。第３に、ｐＮＰろプラスミドは、プロテアーゼを欠如す るドミナントとして作２Ｏｆｆ１Ｍ６Ｏ−５００８９２（７）用するプラスミド （Ｇｒｏｓｓｍａｎ、　Ａ、　Ｄ、等、Ｃｅ１ｌ、　３２＋１５１−１５９．１ ９８３）とあわせて、ある数のプロテアーゼ欠如株またはＨＢ　１０１　の形質 転換に用いた。

μＨ鎖発現プラスミドの構築 ＮＰ結合性のモノクローナル抗体Ｂ１−８に由来する完全長μＨ鎖ｃＤＮＡをＩ ）ＢＲ３２２のＰｓｔＩサイトにクローン化しｐＡＢμｍ１１と称するプラスミ ドとした高レベルの発現を達成するには真核性リーグを欠くμｃＤＮＡをｐＣ’ Ｔ　５４中に再構築した。μＨ鎖発現デラスミｒの構築は、第６図に示した。２ つの化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、これを容易にした。これらは、 つぎの配列を有する。

Ｒ４５５’　ＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡ　５’Ｒ４６３’ 　ＴＴＡＣＧＴＣＣＡＡＧＴＣＧ　５’これらはＴ　４　ＤＮＡリガーゼを用い てＢｃｌ　Ｉ切断ｐＣＴ　５４にリゾ−ジョンした。生ずるプラスミドはｐＣＴ ５４　Ｐｓｔ。

と称した。ｐＣＴ　５４中のＢｃｌ　ＩサイトとＡＴＧとのあいだの配列をおき 代えて内部ＰｓｔＩサイトを供給しモしてｐＡＢ　−１１５’よりＰｓｔＩサイ トまでコドン＋１までの配列を再創出するためにデザインした。ｐＣＴ　５，４ 　ＰｓｔはＰｓｔＩで短時間切り、アルカリホスファターゼで処理し、１チアが ロースデルより完全長ＤＮＡグラスを分１ 離した。同様にしてｐＡＢμｍ１１をＰｓｔＩで短時間切り、アがロースゲル電 気泳動を用いて完全長μインサートを分離した。標準条件でＴ　４　ＤＮＡ　Ｉ Ｊガーゼを用いてμｃＣＮＡを完全長ｐＣＴ　５４　Ｐｓｔフラグメントとリゲ ーションさせそしてｐＣＴ　５４μと称するプラスミドを同定した。これは制限 酵素分析で完全長μインサートを含有することが示された。５′リンカ−領域の まわりのプラスミドの配列定め予期された配列 ５’　、　、　、　、ＴＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡ（）ＧＴＴＣＡｔ）ＣＴＧＣＡｆ ｌＧＧ（）（Ｘ）ＧＯＡＴＧＧＧＡＴＧ（）ＡＧ、　、　、　、３’を有するこ とが分った。このことは、それがまさに完全長クローンであることを示す。ｐｃ ’ｒ　５４μの完全ＰｓｔＩ消化で１．４Ｋｂ　フラグメントが遊離した。これ は０．８％７ガロースデル電気泳動およびガラス粉末分離により精製した。この ものは、標準条件でＴ　４　ＤＮＡ　リが−ゼを用いＰｓｔＩ切断ｐＣＴ　５４ ’　ｐｓｔ　（上記をみよ）とりｒ−ジョンさせ、それでＨＢ　１０１　を形質 転換した。

１）ＮＰ　１と称するプラスミドを分離した。これは制限エンドヌクレアーゼパ ターン分析で、適切な配向で１．４Ｋｂ　ｐｃＤＮＡフラグメントを含有するこ とが示された（第６図）。ｐＮＰ　１は発現のための適切な５′末端より成立つ プラスミドで、他方ｐＣＴ　５４は、適切な６′末端を含有した。完全長遺伝子 は、プラスミド中でひとつモしてμ遺伝子中でひとつ切断するＡｖａ　Ｉでｐｌ ｉＰ　１およびｐＣＴ　５４μの両方を切断することによりｐＣＴ　５４中に再 構築した。両方の消化物は１％アがロケ８ルに処し、ｐＮＰ　１より１．９ｋｂ フラグメントをそしてｐＣＴ　５４μより５．６５　ｋｂフラグメントを分離し た。６．６５　ｐＣＴ５４μフラグメントをアルカリホスファターゼ処理してか う、ＤＮＡの２つの片は相互にリゾ−ジョンさせそしてＨＢ　１０１を形質転換 した。ｐ、ＮＰ　２と称するプラスミドを同定した。これは正しく・制限エンド ヌクレアーゼパターンを示した。イニシェークーＡＴ（）のまわりの領域でそれ の配列を定めたところ、予期された配列５’　、’　、ＴｒＧＡＴＣＡＡＴＧＣ ＡＧＧＴＴＣＡＯＣＴＧＣＡ（）ＣＡＧＣＣＴＧｆｌＧＧＣＴＧＡＧＣＴＴＧＴ ＧＡＡＧ、　、　、　３’を有することが分った。ベクターｐｃ’ｒ　５４は、 Ｓ−Ｄ配列（ＡＡ（）Ｃ）　）と開始コドンとのあいだに２つの制限サイ）　（ ＢＣＩ　１およびＣ１ａ　１　）を含有し、これら２つの配列要素のあいだの距 離を変えうるように構築した。

大部分のＥ、　ｃｏｌｉ　ｍＲＮＡはＳ−Ｄ配列とＡＵＧのあいだに６−１１ヌ クレオチド有するので、Ｉ）ＮＦ２中の距離は、Ｃ１ａ　１で切断しＳｌとイン キュベートした。Ｓ１ヌクレアーゼの量は、酵素による１＼ニゾリングｎｉｂｂ ｌｉｎｇ　〃の結果として１から２個の余分の塩基対をある数のＤＮ八へ子が失 なうように調節した。このＤＮＡをＴ　４　ＤＮＡ　リが−ゼで再すケ９−ジョ ンし、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＨＢ　１０１を形質転換することにより、Ｃ１ａ　１サイ トを失なったプラスミドを含むコロニーのいくつかを得た。４個のプラスミドｐ ＮＰ　２２ろ、ｐＮＰ　２６１、ｐＮＰ　９およびｐＮＰ２８２のまわりの開始 コドンを決定し、下記の表１、パートＡに示した。これらの構築物のＥ、　ｃｏ ｌｉ　Ｂ　中の発現を６回の実験で調べ、μ蛋白質の濃度はＥＬＩＳＡで測定し 、ｐＮＰ　９に対して、標準化したμ濃度の尺度としての相対的単位（ｒｕ）で 表わした。結果は表１に示す。

誘導を行なうのに、Ｋ）（２ＰＯ４（３ｔ　／ｌ　）、Ｎａ２ＨＰＯ４＜６１／ ｌ）、Ｎａｃｌ　（０，５ｔ／　Ｌ　）、Ｄｉｆｃｏビタミンアッセイカサミノ 酸（ろＤｒ／Ａ）、１ｔＨ，ａｌ（４ｔ　／Ｌ）、グリセロール（１６９／Ｌ） 、プロリン（０，５２／ｌ）、Ｄｉｆｃｏ酵母エキス（１ｇ／ｚ）、ＣａＣｌ２ 　’６Ｈ２０（０，０２２ｆ／”）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０（０，０２５２／ｌ ）、チアミン（０，０１，ｆ／ｌ　）およびカルベニシリン（０，１９／ｌ　） より成立つ誘導培地に、１度培養の細胞を１対５０に希釈した。培養物は３７℃ で振り、遠心採取した。

Ｐａｔｅｌ等の記載（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１ル５ ６０５から５６２０．１９８２）に本質的に準じてＦ、ＬＩＳＡ分析を行なった 。アフイニテイ精製ヒツジ抗マウスＩｇＭ　（Ｔａｇｏ　）およびアフイニテイ 精製ヒツジ抗５ マウスＸｇＭ　（Ｔａｇｏ　）のパーオキシダーゼ複合物を用い、に用いた。細 菌細胞ペレットは９Ｍ尿素（ＢＲＬ　）中で２分間煮沸し、ＥＬＩＳＡにじかに 加えた。ウェルはすべて２．２５　Ｍ尿素、１０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ ７，８，１５０ｍＭＮａＣ１，０，０５％ＮＰ　４　Ｑおよび０．５　％カゼイ ン（Ｈａｍｍａｒｓｔｅｎ、　Ｂ、　Ｄ、　Ｈ，）を含有するようにした。

ヌクレアーゼＳ１を用いてＳ−ＤからＡＴＧまでの距離を変えると、親プラスミ ドｐＮＰ　２に比してμ発現のレベルが増加することが分ったが、その程度は少 ない（ｐＮＰ　９と比較せよ）。ｐＮＰ　９およびｐＮＰ　２６１におけるよう にＳ−ＤからＡＵＧまでの至適距離は９−１０ヌクレオチドであった。

２次構造の解析 Ｄｒ、　Ｒｏｙｅｒ　５ｔａｄｅｎの開発した＝＋７ピユーター７０グラムＨＡ 　Ｉ　ＲＧＵを用いてヘアピンループを同定、した。

Ｔｒｉｏｃｏ等記載（Ｎａｔｕｒｅ　ＮＢ、　２４６．４０−４１　＋１９７３ ）に記載のようにΔＧ値を計算した。Ｉ）ＮＰ　２およびｐＮＰ　９　（Ｉ）Ｎ Ｐ　２の８１誘導物のひとつ）によりコードされるｍＲＮＡに可能の２次構造の 解析は、一連の可能なヘアピンループを明らかにした。Ｓ−Ｄ配列および開始コ ドンを２次構造に取り込むと翻訳の開始を阻止することがありうるので、リボ・ アーム結合サイトを含むこのｍＲＮＡの領域に留意した。開始コドンの６ ＵおよびＧを含むヘアピンループが形成されることが分った（第４図をみよ）。

このヘアピンループバコード配列中に完全に形成されΔＧ　−一７．６ｋｃａｌ である。

Ｓ−Ｄ配列をおおってしまうような２次構造はまったく見出だされなかった。ま た、上記のヘアピンループを相互に排除する、より低いΔＧを有する構造もなか った。リボゾーム結合領域中の可能な２次構造を変えるようにデデインされた変 化によりμ蛋白質の発現が影響されるとかどうかみるために、我々はμｍＲＮＡ のこの領域を変異さすために合成オリゴヌクレオチドを用いた。Ｉ）ＮＰ　２中 のμの平滑化されたＣ］、ａＩザイトと５′Ｐｓｔサイトとのあいだに対のオリ ゴヌクレオチドを挿入してプラスミドを構築した（第５図をみよ）。しかし、こ れを達成するためのクローニングの戦略は、ｐＮＰ　２中に４個のＰｓｔサイト が存在するので多段階となった。Ｃ１ａＩおよびＰｓｔＩ　サイトを欠くベクタ ーｐＡＣＹＣ１８４ＣＭをまず構築するのに、Ｔ）ＡＣＹＣ１８４をそれに独特 の０１ａＩサイトで切断し、Ｔ　４　ＤＮＡ　Ｊリメラーゼを用いて接着末端を みたし、再すケゞ−ジョンした。ついでＰＡＣＹＣ１８４ＣＭをＢａｍＦ、Ｉで 切り、そして、５′μ配列を有するｐＮＰ　２よりのＢａｍＨＩフラグメントを 、挿入して、ｐＣＭμとした（第４図をみよ）。ベクターｐＣＭμは、オリゴヌ クレオチドクローニングに必要な、独特のＣ１ａＩおよびＰｓｔサイトを含有し た（第５図をみよ）。ｐｃＭμはＣ１ａＩで完全に切り、ヌクレアーゼＳ１で平 滑とし、ついでＰｓｔＩで切った。切ったプラスミオチドの対（１００倍モルと する）と別々にリゲーションさせた。用いたオリゴヌクレオチＶの対は、Ｒ１ろ １およびＲ１３２（ｐＮＰ　１１　）　；　Ｒ１９６およびＲ１９７（ｐＮＰ　 １２　）およびＲ２０２およびＲ２０６（ｐＮＰ　１４　）であった。それらは 下記の配列を有する。

ＴＧＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡ　（Ｒ１３１）、　ＧＴＴ （）ＣＡＣＴＴＧＣＡＴＡＴ（）ＴＧＣＡ　（Ｒ１３２）。

ｏｃＴｏＭｃｃＴｏｃＡＴＡＴＧＴｏｃＡ（Ｒ１９６）、　ＴＧＣＡＣＡＴＡＴ ＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡ　（Ｒ１９７）。

ｏｍｏｃＡｃＴＴｏｃＡ實ｏＡＴｃ　（Ｒ２０２）、　ＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＡ （）ＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡ　（Ｒ２Ｏ３）このリゾ−ジョン混合物を用いてＨＢ 　１０１を形質転換した。各対のオリゴヌクレオチドのひとつをデローテニ用い 、ニトロセルロースフィルター上でのコロニーハイｊリダイゼーションにより組 換えクローンを見出だした。陽性クローンの配列を定めた。正しいヌクレオチド 配列を有していた。クローン化オリゴヌクレオチドを含有するμ配列は、Ｅｃｏ 　ＲＶ　−Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントに切った。それをＥｃｏ　ＲＶ　−Ｂｇｌ 　ＩＩ切断ｐＮＰ　２にリケ゛−ジョンさせ完全長μ遺伝子を再構築した（第５ 図をみよ）。３個の異なるプラスミドをこれらの操作で創出した。上記表１に示 すヌクレオチド配列を有するｐＮＰ　１１、ｐＮＰ　１２およびｐＮＰ　１４で ある。

構築物ｐＮＰ　１１において、ｐＮＰ　２の有害な可能性のあるヘアピンループ は、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　）忙中の６個のコドンの残基を変え、異なる Ｓ−ＤからＡＵ（）までの配列を導入することにより消失させた。これらの変化 は、Ｓ−ＤとＡＵ（）とのあいだの領域をμコード配列の５′末端と塩基対形成 させ、ΔＧ−７．８　Ｋｃａｌのヘアぎンルーデを形成させる。これはｐＮＰ　 ２の値と同じ位で、しかも、ＡＵＧおよびＳ−Ｄ配列を露出させたままに残す（ 第５図をみよ）。唯一の他の相互に排除するヘア２ンルーデはΔａ＝−２，６、 −６，６および＋０．４　Ｋｃａｌのものである。

ｐＮＰ　１２構築物はｐＮＰ　ｉ　１のＳ−ＤがらＡＵ（）までの配列を留保す るがｐＮＰ　２のコード配列を有し、それでｐＮＰ　２のヘアピンループを形成 しうる（第４図をみよ）。

最後のμ構築物はｐＮＰ　１４で、これは、ｐＮＰ　９のＳ−ＤカラＡＵＧ配列 ヲ有スルが、ｐＮＰ　１１　（１）　５’：＋　−ｙ配列を有する。それでＩ） ＮＰ　１２のヘアピンループは形成しえなかった。ｐＮＰ　１４構築物は、Ｓ− ＤまたはμＡＵＧを埋め込むような２次構造を有しない。

異なるｍＲＮＡ　２次構造を有する構築物よりのμ蛋白質の発現 プラスミドｐＮＰ　９、ｐＮＰ　１１、ｐＮＰ　１２およびｐＮＰ１４を含有す るＥ、　ｃｏｌｉ　Ｂ　株を誘導培地に発育させ、試料を採取しＥＬＩＳＡ分析 に処した。ｐＮＰ　９に比しｐＮＰｌｌを含有する旦、ｃｏｌｉ　Ｂ細胞中でμ の濃度は６が７倍に増加した（表１、パートｂをみよ）。Ｉ）ＮＰ　１１のＳ− ＤからＡＵＧまでの配列を有するがｐＮＰ　９のコード配列を有するプラスミド ｐＮＰ　１２は、ｐＮＰ９に比してμ発現は２倍のみの上昇であった。

１）ＮＰ　９のＳ−ＤからＡＵＧまでの配列を有するがｐＮＰ１１０５′μコー ド配列を有するプラスミドｐＮＰ　１４は、ｐＮＰ　９とは６個の残基において のみ異なるのみであるがｐＮＰ　９におけるよりも９０倍以上のμ蛋白質を発現 することが分った。

プラスミドｐＮＰ　８もまた構築し、それよりμを発現させた。やはり、ｔｒｐ Ｅのアミノ末端５６個のアミノ酸とμのカルざキシル末端５０６個のアミノ酸と を含有するｔｒｐ　Ｅ−μ融合蛋白質の部分としての■プロモーターより発現さ せた。このような融合遺伝子を作った理由は、効率のよい細菌リボゾーム結合サ イトよりの方が、効率の不明のものまりも、μが翻訳されるであろうからである 。それで、ｐＮＰ８より生成された」トμの量を異なる構築物より生成されたμ の量と比較して、リボゾーム結合効率の相対的な評価をした。

ｐＮＰ　３中のｔｒｐＥ−／７遺伝子を誘導し、生成物をＥＬＩＳＡで定量した ところ、Ｉ）ＮＰ　８およびＩ）ＮＰ　１４を含有する株におけるμ発現が非常 に似ていることが分った（表１、パー）Ｂ）。開始コドンが２次構造中に取り込 まれてしまうと翻訳の開始を阻止するという仮設を調べ開始コドンな遊離さすこ とで開始率を増加させようと、ｐＮＰ　１１．１）ＮＰ　１２およびｐＮＰ　１ ４のりボデーム結合サイ）　（ＲＢＳ　）配列をデヂインした。ｐＮＰ　１１に おいて、３個のコドンの縮重位での５′μコ一ド配列を変えることにより￥］Ｎ Ｐ　２およびｐＮＰ　９のＲＢＳヘアピンループが消失された。さらに、Ｓ−Ｄ からＡＵ（）までの配列を変えてこの領域と５′コ一ド配列との塩基対形成を可 能とした。これらの変化の結果として、ステムの底の部分にＳ−Ｄ配列を有する ヘアピン、のルーツにおいて開始コドンが露出される（第４図をみよ）。このヘ アピンループのΔＧはｐＮＰ　９ヘアぎンルーデのΔＧに大体等しいＤＮＰ　１ １を含有する株はｐＮＰ　９に比して６から７倍のμを生成した。このことが、 開始コドンの露出でなくむしろＳ−ＤからＡＴＧまでの配列の変化によるのかど うかをみるために、対照としてｐＮＰ　１２を構築した。このものは、ｐＮＰｌ ｌのＳ−ＤからＡＵ（）までの配列を有したが、ｐＮＰ　９の５′μコ一ド配列 を保留した。

それでＩ）ＮＰ　１１のＲＢＳヘアピンループを形成しえないが、ｐＮＰ　９の 不利な可能性のあるループを形成する。

ＩＩ）ＮＰ　１２より発現されるμのレベルは、ｐＮ　９に比して２倍上昇した のみであった。この増加は恐ら（Ｓ−ＤからＡＵＧまでの距離の変化、開始コド ン対し５′にすぐμがあること、Ｓ−ＤからＡＵＧまでの配列がＧを多く有しな いことのそれぞれが有利に影響したためであろう。それゆえに、ｐＮＰ　１１よ りの発現の増加は、有利なｍＲＮＡ　２次構造によるであろう。ｐＮＰ　９０Ｆ ｔＢＳヘアピンループはおそらく翻訳を阻止するように作用し、他方、別のヘア ピンループは開始コ１ンを露出させ、３１ 発現を増加さすのであろう。

ｐＮＰ　９のＳ−ＤがらＡＵＧまでの配列を有しながらｐＮＰ　１１のコード配 列を有するプラスミドｐＮＰ　１４を構築した。それで、発現プラスミドＩ）Ｎ Ｐ　１４　ハ、ｐＮＰ９と６個の残基のみにおいて異なった。それらは、縮重位 における６個である。しかも、ｐＮＰ　１４を含有する株は、ｐＮＰ　９を含有 するものより９ｏ倍以上を発現した。発現におけるこの増加は、３個の残基の変 化がコドンの利用を至適とすることで説明できない。というのも、強く発現され る旦、刈息遺伝子におけるそれらの存在の頻度より判断して、より有利でないコ ドンを導入することになっているからである。

この発現の増加は、ｐＮＰ　９中のＲＢＳヘアＶンルーデの消失でもつとも良く 説明される。観察された発現増加の程度および導入された残基の変化がほとんど ないことは、結果を、ｍＲＮＡの安定性の変化で説明することをむづかしくする 。

本来のつＥＲＢＳよりｔｒｐ　Ｅ−ｐ融合蛋白質をコードするｐＮＰ　８の発現 も調べてみた。そしてｌ：ｌＮＰ　１４とほぼ同じレベルに発現することが分っ た。このことは、それらのＲＢＳ配列の使用を阻害する２次構造を有しないこと が分った。

ろ２　特表昭ＧＯ−５００８９２（１ｏ）旦、翌見におけるμ蛋白質の発現 μ発現プラスミドｐＮＰ　１１を含有するＥ、　ｃｏｌｉ　Ｂ細胞を誘導条件で 培養し、可溶性および不溶性抽出物を調製し、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した 。不溶性分画よりの蛋白質を含有するレーンにおいてケゞルをＣｏｏｍａｓｓｉ ｅｂｌｕｅ　で染色したあと新しいバンドを見出だした（第６図、レーン２をみ よ）。このバンドは、ｐｃＴ７ｏを有する細胞よりの同じ分画よりの蛋白質を含 有するマイナスの対照のレーンには見られながった（第６図、レーン６）。この 新しいバンドは、６２．５　Ｋａの非グリコジル化μの実際の分子量の５係以内 だけ少ない分子量の蛋白質に対応する位置に移動した。レーンの２本分をニトロ セルローズに移し、Ｗｅｓｔｅｒｎデロソトした。染色されたケ９ルおよびプロ ットオートラジオダラムを並べてみて、この新しいバンドがＩ、Ｍと抗原的に関 連していることが分った（第６図、レーン４および８）。ｐＣＴ　７０を含有す る細胞よりの抽出物にバンドは見出だされなかった（第６図、レーン５および７ ）。

可溶性分画にはわづが少量のμが見出だされた（第６図、レーン６）。

ＨＢ　１０１に比して旦、ｃｏｌｉＢにおいてμの発現はおおいに増加したこと が分った。パルスチェイス分析では、最初のラベル時間のあとにみられた（第７ 図、レーン１）のと同じレベルのμ蛋白質が６０分のチェイスのあとに検出され た（第７図、レーン３）。ＨＢ　１０１ろ３ では、しかし、最初のラベル時間のあとに検出された量（第７図、レーン５）に 比して、１０分間のチェイスのあとごく僅かのμ蛋白質（第７図、レーン７）が 見出だされ、６０分後にはまったく見出だされなかった（第７図、レーン８）。

パルスチェイス分析のためには、上記のように誘導を設定した。ただし、用いた 培地はつぎのようである。

プロリン（０，３ｆ／Ｌ　）、ロイシン（０，１ｆ／Ｌ）、Ｄｉ　ｆｃｏメチオ ニン分析培地（５９／Ｌ）、グルコース（６０＋ｖ／Ｌ）、チアミン（１０ｍｐ ／Ｌ）、ＣａＣ１２（２２巧／Ｌ）、ＭｇＳＯ４（０，２５２／Ｌ）およびカル ベニシリン（０，１ｆ／Ｌ　）。対数発育期に、細胞を６０μＣｉ／−のＬ（３ ５８）メチオニンで２分間パルスラベし、それから未ラベルメチオニン（１００ μ２膚）を加え、示した時間のあいだ誘導した。

ｐＮＰ　１４を含む誘導Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｂ細胞は、位相差顕微鏡で調べると、 封入体を含有していた。

Ｅ、　ｃｏｌｉにおけるλＬ鎖の発現 調べるプラスミドを含有するＥ、　ｃｏｌｉ　Ｉ（１３１０１またはＲＶろ０８ の新鮮な１−１夜培養物を、カルベニシリンを１００μｍ／−に加えたし一プロ ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ　−ｒａｔ、ｏｒｙ、　１９８２　）に 発育させた。

この培養物を、グルコース、ビタミンＤ２、カルベニシリン、ロイシンおよびプ ロリンを補充したＭ９培地（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　１９８２　＋　上記引用）で １：１００に希釈し、５−６時間６７℃で振とうした。そこで３５８−メチオニ ンを加え５から２０分処理した。細胞は遠心採取し、１％ＳＤＳ中２分間煮沸し て溶解させ、２チＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００，５Ｄ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８ ，０，１５Ｍ　ＮａＣ１および０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡより成立つ緩衝液を加え て希釈した。ラベルされた貝、汐叩抽出物の試料に抗血清を加えて免疫沈降を行 なった。４℃で１夜インキユベートしてから、免疫複合物を、５ｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕ、ｓ固定セルに結合させて分離した。１０チグリセロ ール、６％ＳＤＳ　、および５係メルカテトエタノールを含有する６　Ｑ　ｍＭ 　Ｔｒｉｓ　ｐＨ６，８緩衝液中で煮沸して複合物を解離さ、せた。そして遊離 された蛋白質は１０％または１２．５％アクリルアミド／　ＳＤＳケ９ル上で分 析した（Ｌａｅｍｍｌｉ、　ＵＫ、　Ｎａｔｕｒｅ、２２７．　６８０−６８５ ゜１９７０）。ゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒｉ工１ｉａｎ　ｂｌｕｅで染色 し蛋白質のバンドを可視化し、他方、ラベルされた蛋白質は、Ｆｕｊ　ｉ−Ｒχ フィルム上で、１１Ｚサリシル酸ナトリウムを用いるフルオルグラフィで検出し た。

ｐＮＰ　３および他のプラスミドを含有するＨＢ　１０１細胞を誘導条件で０Ｄ ６ｏｏ−０，６まで発育させた。存在する蛋白質は上記に実質的に準する特異的 免疫沈降でしらべた。結果を第８図に示す。ここに、レーン１および２は、それ ぞれ、ｐＣＴ　５４〜１９およびｐＮＰ　３よろ５ りの抽出物を正常ウサギ血清で免疫沈降させたものである。レーンろ、４および ５は抽出物をウサギ抗ラムダ血清で沈降させたもので、Ｉ）Ｎ、Ｐ　４　（レー ンろ）、ｐＮＰ　３　（ｖ−ｙ４　）およびｐＣＴ　５４−１９　（Ｖ　７５　 ）を表わす。ＭＯＰＣ１０４Ｅよりの未ラベルラムダ蛋白質の位置は、第８図の 左側に示しである。プラスミドのすべてがウサギ抗マウスλＬ鎖血清と反応しそ してマウス骨髄腫ＭＯＰＣ１０４Ｅよりの標準λ、Ｌ鎖と同じに移動した。しか し、ｐＮＰろがこの蛋白質をもっとも多く生成した（第８図のレーン４をレーン ６および５と比較せよ）。正常のウサギ血清を用いる対照免疫沈降では、そのよ うなバンドは見出だされなかった（第８図、レーン１および２）。３５Ｓ−メチ オニンの短時間パルスを用いついで過剰のコールドメチオニンを用いるチェイシ ングで、組換えλＬ鎖は約２０分の半減期を有することを示した。

は、λＬ鎖標品と同じに移動する蛋白質をｐＮ’Ｐ　３がコードしていることを 示した。この２５Ｋｄ　生成物は、この数字は、式 ％式％（１１） により算出された、±／　ビボー合成組換えλ生成物のパーセン）（０，４−２ ％）とよく一致する。

細胞の破壊に用いた操作はっぎのようである（　Ｅｍｔａｇｅ、　Ｊ、　Ｓ、等 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、、＋　８　ＣＬ３６７１ −３７１５＋、１９８３’）。誘導条件で発育させたＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１ ０１　／　ｐＮＰ　３を採取し、１３０ｔ／ｍｇのリゾチームを含有する０、０ ５　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ３，０，２３３ＭＮａＣ１，５％グリセロールに再懸濁 させ４°Ｃが室温で２０分インキュベートした。ナトリウムデオキシコレートを 加えて最終濃度０．．０５　％とし、匹６鵠カニ　の湿重量２あたり１０μ２の ＤＮＡアーゼ１（牛すい臓より）を加えた。溶液を１．５−？ｃで６０分インキ ュベートすると溶液の粘度は著しく減少した。抽出物は遠心した（小容量（１− ）で１−０．．０００　ｘグで１５分、より大量では１時間）、溶解部および不 溶部とした。

免疫沈降のためには、溶解分画を上記のＴｒｉｔｏｎ含有緩衝液中で希釈し、不 溶分画は１％ＳＤＳ中で煮沸し可溶化してがらＴｒｉｔｏｎ含有緩衝液中で希釈 した。

ｐＮＰろまたはｐＮＰ　４を含有するＨＢ　１０１細胞は誘導条件でインキュベ ートし、〔３５ｓ〕メチオニンでパルスラベルし、可溶性および不溶性分画に分 はナトリウムドデシルスルフニー）＆リアクリルアミドダル電気泳動で分析した 。結果は第９図に示す。ここでレーン１および６は、正常ウサギ血清およびウサ ギ抗ラムダ血清でそれぞれ免疫沈降されたＨＢ　１０１−　ｐＮＰ、３よりの７ 可溶分画に相当する。レーン２および４は、正常ウサギ血清およびウサギ抗ラム ダ血清で免疫沈降させたＨＢ　’１０１−　ｐＮＰろより不溶性分画を示す。レ ーン５および７は、正常ウサギおよびウサギ抗ラムダ血清でそれぞれ免疫沈降さ れたＨＢ　１０１−　ｐＮＰ　４よりの不溶性分画に相当する。レーン９はＨＢ 　１０１−　ｐＮＰ　３よりの可溶性分画に対応する。レーン１０はＨＢ　１０ １−ｐＮＰ３よりの可溶性分画に対応る。ＭＯＰＣ１０４Ｅよりの未ラベルラム ダ蛋白質の位置は第９図の左側に示しである。

ｐＮＰろを用いてそのような操作を行なうと、組換えλＬ鎖蛋白質は、可溶分画 （第９図、レーンろ）よりむしろ不溶分画゛（第９図、レーン４）に存在した。

可溶性または不溶性分画のいずれでも正常のウサギ血清を用いて免疫沈降させた 場合に、λ、Ｌ鎖標品と同じに移動する２　５　ｘａ　バンドは存在しなかった 。おそらく、この特別の例におけるようにＩ　ｇＬ鎖のすべてが分画に分れるで あろう。特異的免疫沈降が存在しないと、ｐＮＰ　３を含有するＨＢ　１０１の 抽出物から新規蛋白質バンドは見出だせないし、λ蛋白質の蓄積も見出だされな い。しかし、Ｋ１２株Ｅ１０３ＳでｐＮＰ　５を誘導した時には劇的な差があっ た。この株では、ＥＬＩＳＡで測定して、λ蛋白質は誘導中蓄積し細胞が定常期 に達しく第１０図、レーン３−５）、ＨＢ　１０１におけるより約１５０倍のレ ベル達することが分った。これらの細胞は封入体を含有し、光学顕微鏡で屈折性 にみえる。

これは外来蛋白質を高レベルに発現している特徴的現象であった。組換えλ蛋白 質の全Ｅ、　ｃｏｌｉ蛋白質中でのパーセントは、蛋白質をゲル電気泳動で分け 、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　で染め、染色されたゲルをＪｏｙｃｅ　−Ｌ ｏｅｂｌクロモスキャン（ｃｈｒｏｍｏｓｃａｎ　）　３で走査することで得ら れた。この方法で、λが存在する主要蛋白質で（第１０図、レーン゛５）、全旦 、笠抹蛋白質の１６係を占めた。λ蛋白質はＨＢ　１０１中で２０分の半減期で あったがＥ１０３．ｓ中で非常に高いレベルに蓄積し、ラムグー蛋白質が後者の 材料でずっと安定なことを示した。細胞を溶解させｐＮＰ　３を含有するＨＢ　 １０１またはＥ１０３ｓを遠心したあと、λＬ鎖は不溶分画に検出された（第１ ０図、レーン７および１０）が可溶分画にないこと（第１０図、レーン６）がＣ ｏｏｓｍａｓｉｅｂｌｕｅ染色で分った。主なＣｏｏｓｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ 　染色バンドのλ蛋白質としての同定はウェスターン　プロット分析で確かめら れた（第１０図、レーン８−１０）。

このような免疫反応性バンドの存在はｐＮＰ　３含有細胞に特異的であった。ゾ ロキモシン（ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ　）　発現プラスミドである１）ＣＴ　７ ０含有細胞よりの抽出物を同じ分析に処してもバンドは検出されなかった。この より感受性の技術は、可溶性分画に少量のλ蛋白質が存在することを示した（第 １０図、レーン９）。完全長蛋白質より小型の顕著の反応性蛋白質がいくつがみ いだされた。これらは、・λ蛋白質の蛋白分解、転写の早すぎる終結または翻訳 の内部からの開始によるのかもしれない。

同一細菌細胞中でのμおよびラムダホリペデチドの発現 発現プラスミド中のＩｇμおよびλ遺伝子のそれぞれを同じ旦、刈旦細胞中に入 れて形質転換し１μおよびλボリペゾチドの合成を行なわせた。プラスミドの不 和合性を克服し第２の抗生物質抵抗性マーカーを与えるために、Ｉ（ｉｎｄ　Ｉ ＩＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントにおいて、ｐＮＰ　３よｌ：）ｔｒｐｒロモー ターおよびλ配列を切り出し、ｐＡＣＹＣ１８４のＢｉｎｄＩｎ　−ＢａｍＨＩ フラグメントに挿入した。生ずるプラスミドｐＡＣＹＣλは旦９匹貝の発育をき わめて貧弱とした。この弱い発育は、ＲＮＡポリメラーゼが複製の原点まで読み すごされてしまうためと考えられた。しかし、発育の阻害は、プラスミドｐＡＣ ＹＣλ　のＨｉｎｃＬ　ＩＩＩサイトにバクテリオファージエフ翻訳ターミネー タ−をクローニングすることで除かれるように見えた。

このターミネータ−は両方の配向にお℃・て機能した。

生ずるプラスミドｐＡＣλＴ７−１はクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を有し 、Ｉｇμ発現プラスミドである。

ｐＮＰ　１４上Ｆ）　ｐＢＲ３２２由来オリジンと相客れる第１ノジンを有した 。同じＥ、ｃｏｌｉＢ中での両方のプラスミドによる形質転換は２段階で達成さ れた。まずＩ）ＮＰ　１４を導入しついでｐＡＣλＴ７−１を順次に導入する形 質転換で、アンピシリンおよびクロラムフェニコールに抵抗性のクローンを与え た。

このダブル形質転換クローンに由来する旦、ｃｏｌｉＢ細胞は封入体の存在を示 し、溶解のあと、染色されたゲル上に不溶不画の２つの新規ホリペデチドバンド を示した。これらの２つのバンドは、Ｗｅｓｔｅｒｎプロッティングにより、免 疫学的活性でＩμおよび■８λおよびおよびそれら期待される分子量に対応した 。それでダブル形質転換されたクローンは、異質異伝子の両方を発現した。この ことは、今まで示されたことがない。

不溶性分画中にλＬ鎖の存在することは、それにより蛋白質が濃縮され、旦１匹 ｎ０可溶性蛋白質の全体より分けられるので精製に有用であった。

λＬ鎖をさらに精製するために、細胞残置を１３　ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８ ，Ｑ、２５％ホルムアミド、７Ｍ尿素、ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２　ｍＭジチ オスレイトールに溶解した。

このものを、９Ｍ尿素、１０　ｍＭ　）リス−Ｉ（ＣＩ　ＰＨ８，０，１ｍＭ　 ＥＤＴＡおよび２ｍＭ　ＤＴＴ中で平衡させたＤＥＡＥ　５ｅ−ｐｈａｃｅ１カ ラム（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　（Ｉ　Ｘ　２５　ｃｍ　５　ｍ１７時流速）に 移した。ＤＥＡＥ　３ｅｐｈａｃｅｌカラムは、平衡用緩衝液中０−　ｔ５０　 ｍＭのＮａＣ１のグラジェントで展開した。溶出されるλＬ鎖免疫反応性の２− り部分（蛋白質の主要ピークに相当）を希釈して、２．２５Ｍ尿素、１０　ｍＭ 　）リス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、２　ｍＭ　ＤＴＴ１ としオクチルセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）（２，５Ｘ　Ｉ　Ｄ ｔｙｎ）に移した。２．２５−９　Ｍの尿素グラジェントで溶出した。−一りを 集め重炭酸アンモニウムに対し透析し、凍結乾燥した。この段階のあと、組換え λ蛋白質に相当するＣｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ染色性物質のただひとつのバ ンドをＳＤＳ　−ＰＡＧＥで可視化した。

陰イオン交換クロマトグラフィーおよびクロマトフオーカシング（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ　）で、ペレットより９Ｍ尿素で可溶化したものを精製してＰＨ鎖を得た 。

μおよびλの同時発現が機能的ｊｇＭの形成に導びくどうかをみることに大きな 興味が持たれた。そのためハプテン化されたウシ血清アルブミン（ＮＩＰ−カプ ロエート−ＢＳＡ　）に結合するμ鎖を検出する２サイトサンドイツチＥＬＩＳ Ａを用いた。

ＮＩＰ結合アッセイにおいて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）を１０ｍＭ　リ ン酸塩緩衝液中ｐＨ７，５で当モル量のＮＩＰ　−ｃａｐ　−Ｎ−ヒドロキシ− スクシンイミドと反応させた。生ずるＮＩＰ　−ｃａｐ　−ＢＳＡは、Ｇ−５０ ｓｅｐｈａａｅｘカラム上で遊離ＮＩＰ　−ｃａｐと分けた。

ミクロタイタープレート（９６ウエルＮｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎ。

Ｐｌａｔｅ　１　（ｌを、炭酸ナトリウム／ｉ炭酸ナトリウム０．１　Ｍ、　ｐ Ｈ９，６緩衝液（被覆緩衝液）中１０　ｐ９／ｍ１ＮＩＰ　−ＢＳＡの溶液の１ ００μｔで被覆した。

被覆されたプレートは、被覆緩衝液（ブロッキング緩衝液）中０．５　％カゼイ ンの１ｏｏμｔを加え６７°Ｃで１時間インキュベートして、非特異的結合に対 しゾロツクした。

被覆されブロックされたプレートは１５０　ｍＭ　Ｎａ、Ｃ１゜０．０５％ＮＰ 　４　［］、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　、　ｐＨ７，８＝緩衝液（洗浄 緩衝液）で６度洗った。

洗ったプレートを振って過剰の洗浄緩衝液を除き、試料をそれらの緩衝液または 代表的には０．５％カゼイン含有洗浄緩衝液（試料用緩衝液）に加えて最終容量 １００μｔとした。

ＮＩＰ　−ＢＳＡへの結合の性質を示すために、試験試料にはＮＩＰまたはＮＰ を種々の濃度（ＮＩＰは６ｏがら０ろμＭＸＮＰは６００から３μＭ）に加えた 。

試料を含むプレートは６７℃で１時間インキュベートしそれから洗浄用緩衝液で ６度洗った。

洗ったプレートには試料用緩衝液中杭μｍパーオキシダーゼ複合物（１：１００ ０希釈、ＴＡＧｏ社）ノ１００μｔを接種し、６７℃で１時間インキュベートし た。プレートは洗浄緩衝液で６度洗った。

洗ったプレートには、３．１Ｍ酢酸ナトリウム−くえん酸塩、ＰＨ６，０，０， １■／−テトラメチルベンジジン、１３　ｍＭ　Ｈ２Ｏ２（ハｉ　キシダーゼ基 質）　ノ１００　ｐｔを接種し室温で１時間インキュベートした。２５μｔの２ ．５　Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を止めた。

４３ ミクロタイタープレートを、６３０ｎｍ　をリファレンスとして４５０　ｎｍで プレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　）で読む。　４５０と標準蛋白質、Ｂｌ 　−８抗−Ｎ工ＰＩｇＭのレベルと関連づけた。

このアッセイはＢｌ　−８Ｉ、Ｍの６０　ｐｇに対する感受性を示した抽出物は 可溶性および不溶性物質として調製した。不溶物は溶解に用いたのと同じ緩衝液 に８Ｍ尿素を含めたもので可溶化した。ついで希釈してアッセイに用いた。

一μおよび２の活性を知るために不溶物を抽出し、ジスルファイＶの交換がより 高い頻度でおこるような緩衝液の条件で透゛析した。

Ｈ鎖およびＬ鎖の両方を発現するようなＥ、　ｃｏｌｉよりの機能的抗体の生成 は、細胞を溶解し、上清を遠心により清澄化することにより達成した。不溶物は 洗い、音波処理（３分間、３回）し、最後に９Ｍ尿素、５０ｍＭグリシン−Ｎａ ＯＨｐＨ１０，８，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　□および２０ｍＭ　２−メルカプエタノ ールに溶解した。この抽出物は、１００ｍＭｘｃ１．５０　ｍＭグリシン−Ｎａ ＯＨｐＨ１０，８，５チグリセロール、Ｑ、Ｑ’５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５ｍ Ｍ　還元グルタチオンおよび０．ｉｍＭ酸化グルタチオンの２０容量倍を３回交 換しながら４０時間透析した。透析物は３０．０．０　Ｏｆで１５分遠心して澄 明化しＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｃｅｌにじかに加え、１０　＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ　− ＨＣＩ、［１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ　。

ｐＨ８，０中０−０．５　Ｍ　ＫＣＩ直線グラジェントで展開した◇４４　特表 昭ＧＧ−５００８９２（１３）精製へμおよびλは上記のように処理した。しか し、陰イオン交換クロマトグラフは行なわなかった。調製物は最後にリン酸塩緩 衝水溶液、５チグリセロール、０．０１％ナトリウムアジドおよび０．５　ｍＭ 　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，４に対し透析した。

このように処理した材料をアッセイした結果、ある程度の活性が示された。この ようにして得られた活性のレベルはあまり低くて詳しい研究はできなかったので 、透析物は陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した（第１１図）。その結果 、バックラウンドのＢＳＡに対する結合より著しく高いＮＩＰ　−Ｃａｐ　−Ｂ ＳＡ結合活性が分離できた（第１１図）。分画を工、μレベルについてアッセイ し、Ｂｌ　−ｓ　１ｇＭ相当量で表わすと、活性は２つの−一りを示した。これ は、ｗ６ｓｔｅｒｎプロティングによる完全技工、μと関連しなかった。第１の ピークは工、μのフラグメントであろう。完全長Ｉｇｐおよび蛋白質の大部分か らＮＩＰ　−Ｃａｐ　−ＢＳＡ結合活性を分けてみると、低い効率で生成される 特定の分子種にノ・ブテン結合活性が含まれもことが分った。

旦１匹旦中のＩｇＭ発現より得られる不溶物を処理すると、類似のＩｇＭ蛋白質 プロフィールが得られたがＮＩＰ　−Ｃａｐ　−ＢＳＡ結合活性はなかった。こ のことは、得られた活性が、合併された免疫グロブリンの発現によるのであって 、ある種の旦１匹旦因子がＩ８μＨ鎖単独によるのでないことを示した。

５ ハプテン（ＮＸＰ　−ｃａｐ　−ＢＳＡ　）結合の特性についてさらに研究した 。もとの抗体とまったく似た具合に、試料のを希釈すると、ハプテン結合性は減 少した（第１２図）。未希釈および希釈試料の両方において、遊離ハプテンは結 合活性の大部分を阻止した。Ｉ　ｇＭおよびハプテン結合の両方に対してＢ１− ８抗体を標準に用いて、組上げられた抗体の比活性は１．４　ｘ　１０’グラＶ グラムＩｇＭ当量であった。この値は活性の回収効率のよくないことを示す。し かし恐らくは、上記したように、これらの分画における完全技工、μを過当評価 しているので比活性を低く評価していることもありうる。

組換え抗体のヘテロクリソ）　（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔ　）性遊離ＮＩＰ　−Ｃ ａｐおよびＮＰ　−ｃａｐ　の存在での、組上げられた抗体をＢｌ　−８ＩｇＭ と比較してＮＩＰ−ｃａｐ　−ＢＳＡへの結合特異性を詳しく調べた（第１６図 ）。

Ｂ１．−８　ＩｇＭおよび組上げられた抗体共に、ＮＩＰ　−ｃａｐ−ＢＳＡ結 合を阻止するのにＮＰ　−ｃａｐがＮＩＰ　−ｃａｐ　がより高い濃度を要した 。

５０チ阻止におけるＮＩＰとＮＰとのモル比によりヘテロクリット性が示された 。表２に示すように、５０チ阻止（工５０）におけるＮＩＰおよびＮＰの濃度は 、Ｂ１−８および組上げられた抗体の両方について類似していた。ＮＰＩ　／　 ＮＩＰ　１．。比も似ていた（表２）。

０ 表２　抗体のＮＩＰ　−ｃａｐ　−ＢＳＡ固体相への結合を５０チ阻止するハプ テン濃度（Ｉ、。）ＳＤ−標準偏差Ｂｌ　−８ＩｇＭ　０．１３（ＳＤ、０．０ ５）　３．７（ＳＤ、２．９）　２９分画２６　０．３４（ｓｐ、０．０９）　 Ｌ、９（ｓＤ、０．４）　６分画２７および２８０．１１（ｓｐ、００２）　１ ゜１（＋ｓｐ、０．３）　１０精製μおよびλ　０．４　０．８４　２２インタ クトの可変ドメインを有するμおよびλ蛋白質を発現しうるのみならず、同じ細 胞中の和合性のシラスミド上にμおよびλ蛋白質の両方を発現できることが示さ れた。後者のことはこれまでに明らかにされなかったし、示唆されもしなかった 。さらに、μおよびλ蛋白質の両方を発現した。Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞より機能的 １８分子を導び（ことが可能であると分った。

か（して、本発明方法により、組換えＤＮＡ技術により機能的１８分子を生成す ることが示された。

酵母のための発現プラスミドの構築 酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｊ、ｓｊ、ａｅ　）　中での発 現に用いるためのシラスミドはｐＢＲ３２２および酵母２ミクロンプラスミドを 基礎としている。−Ｉ′シラスミド、ヨーロッパ特許願ＥＰ　Ｄ　０７ろ　６３ ５の主題で、この内容も参考として引用する。酵母ホスホグリセレートキナーゼ 遺伝子（ＰＧＫ　）は転写の開所のために必要な４７ ５′配列を与えそして、上記ヨーロッパ特許願に記載のプラスミドｐＭＡ　３０ １３中の独特のＢｇＩ　ＩＩサイトに遺伝子を挿入しうる。このプラスミドは以 降１：１ＭＡ　９１　トあらためて命名することにする。

ａ）　ｍｅｔ　−ｍｕ（μ） Ｂｇｌ　ＩＩおよびＢｃｌ　Ｉは相客れる５’−ＧＡＴＣ末端を与える。ｐＮＰ 　２よりのｍｅｔ−μ遺伝子は部分的ＢｄＩフラグメントにおいて切り、ｐＭＡ 　９１の独特のＢｇｌ　ＩＩサイトにリゲーションした。

ｂ）　Ｐｒｅ−ｍｕ（μ） 完全長ｐｒｅ−μｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＴ　５４　ｕを）Ｌｉｎｄ 　ＩＩＩで消化した。これはμｃＤＮＡの３′サイドを切る。４ヌクレオチドす べての存在でＴ４ＤＮＡ　！リメラーゼと共にインキュベーションすることによ りＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトをＢｃｌ　Ｉサイトに変えた。上記に得たＤＮＡに内 部Ｂｃｌ　Ｉを含有するＴＴＴＴ（）ＡＴＣＡＡＡＡの配列のリンカ−Ｒ１０７ をリダーションした。サケ９−シヨンのあと生ずるＤＮＡの１部をＢｃｌ　Ｉお よびＡｃｃＩで消化しμＡｃｃ　Ｉ　−Ｂｃｌ　Ｉフラグメントを生ずる混合物 よりゲル電気泳動で分けた。生ずるＤＮＡの別の１部をＭｂＯＩＩで消化し、接 着末端Ｂｃｌ　ＩおよびＭｂｏ　ＩＩを有する化学合成オリゴヌクレオチドリン カーＲ１２１およびＲ１１２とリゾ−ジョンさせた。

Ｒ１２１５’　Ｇ、ＡＴＣＡＡＴＧＧＧＡＴＧ（）ＡＧＣＴＧＴ　ろ′Ｒｉ　１ ２　５’　ＴＴＡＣＣＣＴＡＣＣＴＣＧＡＣ６′４８　鮎町０−５００８９２　 （１４）すｒｅ−ジョン反応を終結させ生ずるＤＮＡはＡｃｃ　Ｉで消化しμＭ ｂｏ　ＩＩ　−Ａｃｃ　Ｉ　フラグメントとし、これは、５チメリアクリルアミ ドデル上ケゞル電気泳動で生ずる混合物より分けた。

得た２つのμフラグメントは相互にりｒ−ジョンしＢｃｌ　Ｉで消化して望まぬ リテー／ヨン生成物を除き、そのあとで生ずるｐｒｅ−μＤＮＡをＢｇｌ　ＩＩ で切ったプラスミドｐＭＡ　９１にリゲーションした。

生ずるＩＪ　ｐ、’Ｉ−ジョン混合物で、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１をアンピシ リン抵抗性に形質転換した。形質転換されたコロニーを分けたところ、予期され る消化パターンを示−ｊ−プラスミドを含有した。このプラスミドよりの挿入Ｄ ＮＡの５′末端の配列を決めたところｐｒｅ−μｃＤＮＡに予期される配列を有 した。

ｃ）　ｍｅｔ−ラムダ（λ） ｍｅｔ−λＤＮＡをプラスミドｐＭＡ　９１のＢｇｌ　ＩＩサイトにクローン化 した。プラスミドｐＣＴ　５４クローン１をＨｉｎｄＩＩＩで切りｍｅｔ　−２ ｃＤＮＡの６′サイドとした。この切断サイトを、Ｉ）ＮＦ２について前記した ようにＢｃｌＩサイトに変えた。そのあとフ０ラスミドＤＮＡをＢｃｌＩサイト でλ遺伝子の５′で切り生ずるλＤＮＡをｐＭＡ９１のＢｇｌ　ＩＩサイトへク ローン化した。

ｄ）　Ｐｒｅ−ラムダ（λ） つぎのように、ｐｒｅ−λをｐＭＡ　９１中に再構築した。プラスミドｐｃ’ｒ 　５４をＢｃｌ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消９ 化し、生ずるベクターＤＮＡをデル電気泳動で分げ、２つの合成オリゴヌクレオ チドＲ１６２およびＲ１６３およびプラスミドｐＡＴλ１−１５　よりの２つの フラグメント Ｒ１６２５’　ＧＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴ　３’Ｒ１６３５’　ＧＴ ＧＡＡＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＴＴ　３’とリゾ−ジョンさせた。これらのフラグ メントは、ｐＡＴλ１−１５をＦｏｋ　ＩおよびＨｉｎｄｎ工で消化し、５′３ ００塩基対ＦｏｋＩフラグメントおよび３’　６００塩基対ＦｏｋＩ　−Ｈｉｎ ｄＩｎフラグメントを電気泳動で分けた。生ずるリゾ−ジョン混合物で県１匹旦 株ＨＢ　１０１を形質転換してアン−シリン抵抗性とし、予知される正しい制限 酵素消化パターンを有するプラスミド含有細菌コロニーを分けた。挿入されたＤ ＮＡの５′末端の配列を決めたところｐｒｅ−λｃ　ＤＮＡの予期された配列を 有していた。このプラスミドをＨｉｎｄＩｎで消化し、生ずるＨｉｎｄｌＩ［切 断末端を　Ｔ４７］”　リメラーゼで平滑化しそしてＲ１０７リンカーとリゾ− ジョンさすことによりＢｃｌＩサイトに変えた。生ずるデラスミｒをＢｃｌＩで 消化し、ゲル電気泳動で、ＢｃｌＩフラグメント上でｐｒｅ−λｃＤＮＡを分け た。このＢｃｌＩフラグメントをＢｇｌ　Ｉ切断ｐＭＡ　９１にリゾ−ジョンし 、ｐｒｅ−λｃ　ＤＮＡの完全長を含有するｐＭＡ　９１ｆ′ラスミドを得た。

酵母における免疫グロブリンの発現 上記のように調製したｐｒｅ−λおよびｐｒｅ−μ含有された細胞によりｐｒｅ −λおよびｐｒｅ−μ遺伝子が発現された。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＤ　４６をｐＭＡ　９ １ｐｒｅ−λまたはｐＭＡ　９１　ｐｒｅ　−ｐで形質転換すると、Ｗｅｓｔｅ ｒｎプロットで検出されうる発現免疫反応性蛋白質を生ずるコロニーを力えた。

プラスミドｐＭＡ　９１ｐｒｅ−λを含有する酵母細胞は抗λ抗血清と反応し、 細菌により合成されたマチュア（ｍａ、ｔｕｒｅ　）λとポリアクリルアミドゲ ル上で同じに移動する蛋白質を生成した。同様に、ｐＭＡ　９１　ｐｒｅ−μを 含有する酵母細胞は、抗μ血清と反応しそして細菌により合成されたマチュアμ 蛋白質とポリアクリルアミドゲル上で同じに移動する蛋白質を生成した。これら の観察は、ｐｒｅ−λおよびｐｒｅ−μ共に、酵母宿主細胞の環境中で相当する マチュア蛋白質に加工されていることを示唆する。

さらにμ蛋白質生成物（しかし、λ蛋白質でない）はグリコジル化されることも 示された。１５μ２／−のツニカマイシンの存在または非存在で細胞をインキュ ベートした。この化合物は、蛋白質のＮ一連結グリコキシル化を特異的に阻止す る。ツニカマイシンなしでインキュベートされた細胞に由来する細胞抽出物は、 ５１ ｗｅｓｔｅｒｎプロッティングでみて、より高い分子量バンドを示した。ツニカ マイシンの存在でインキュベートした細胞からの抽出物は、そのような高分子量 バンドを示さなかった。

細胞をがラスピードで溶解し可溶性および不溶性分画をみたところ、μおよびλ 蛋白質は不溶分画に限られて存在していた（　Ｗｅｓｔｅｒｎプロッティングに よる）。

分　泌 インキュベーションしたあと酵母細胞を遠心して集め上清の１−を取り、ＢＳＡ 被覆０．２　／ｊ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通し、残存する細胞由来の ものを除いた。濾過上清についてμおよびλ蛋白質についてのＥＬＩＳＡ分析を した。ｐＭＡ　９１　ｐｒｅ−λを含む細胞よりの上清のみが、検出しうるレベ ルの免疫グロブリン蛋白質を示した。ミニマル培地中で細胞を０Ｄ６６ｏ−０， ２まで発育させ、ついで遠心しＹＰＡＢで再懸濁させ○Ｄ６６６＝　１．０から １．５で採取すると、上清中のλ蛋白質の検出量は増加した。それでλ蛋白質は 酸母細胞より分泌されるがμ蛋白質はそうでない。

細胞内の存在 インキュベーションのあと、ｐＭＡ　９１　ｐｒｅ−μを含有する細胞はスフェ ロプラストに変え５チ酢酸／９５チエタノール（Ｖ／Ｖ　）中で固定し、フルオ ルセイン複合ヒツジ抗マウスμとインキュベートした。固定細胞を螢光顕微鏡で 調べた。μ蛋白質はスフェロプラストの周縁そして特に空胞中に存在した。

同じ細胞中でのμおよびλ蛋白質の双方の発現同じ宿主細胞中に両方の遺伝子を 発現さすには、形質転換に用いろための許容されうるプラスミドを提供する必要 がある。ｐｒｅ−λ遺伝子を、ｐＭＡ　９１　ｐｒｅ−，１よりＨｉｎｄ：ｍ　 フラグメント上で切り出し、デラスミｒｐＬＧ　８９のＨｊｎｄＴＩＩサイトに 挿入した（　Ｇｒｉｔｉ　ＩＪ、。

ＤａｖｊｅｓＪ、　Ｇｅｎｅ、　２５．　１７９−１８８．　１９８３　’）。

このプラスミドはｕｒａろマーカーを含有し、形質転換された宿主細胞を選択す るのに用いられる。便宜なｕｒａ　３−宿主細胞はｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 株ｘ４００ろ一５Ｂである。Ｉ）ＭＡ　９１　ｐｒｅ　−ｐおよびｐＬＧ８９　 ｐｒｅ−λの両方でこの株を形質転換した。ｕｒａ　３およびｌｅｕ　２マーカ ーの両方をあわせて含有するコロニーを発育させた。形質転換された細胞をイン キュベーションしたあと、ＥＬＩＳＡ法で、Ｘ４００ろ一５Ｂの同じ培養物中に λおよびμ蛋白質の両方が検出された。発現の程度は、ＭＤ　４６細胞中でそれ ぞれの遺伝子としてｘ４００３−５Ｂでλ遺伝子のみで得られたのと同根をチェ ックするためにつぎの操作を用いた。

０Ｄ６６ｏ；１まで発育させたあと、形質転換されたＸ４００３−５Ｂ細胞を遠 心し、５　ｍＭ　のポウ酸塩緩衝液ｐＨ８，０またはリン酸塩緩衝１ｐＨ５，８ に再懸濁させた（洗浄剤だとへば０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　を加えるかまたは 加えない）。懸濁細胞は、上記緩衝液中でガラスぎ−ｒと共に回転かくはんし不 溶物は遠心除去した。遠心したあと、上清の１部をＮＩＰ結合性についてアッセ イした（組上げ旦、辿μおよびλ蛋白質について前記した通り）。上清に特異的 抗原結合活性が検出され、この活性は遊離ＮＩＰ　（特異的抗原）により特異的 に競合消失された。これらの結果はＸ４００３−５Ｂ細胞中にμおよびλ蛋白質 が発現され、±７　ｅｇ二で機能的免疫グロブリンに組上げられることを示す。

上記の実験で、形質転換された細胞をインキュベートするに用℃・た培地は、酵 母ミニマル培地（１リツトル中、６．７　Ｐ　ＤＩＦＣＯ酵母窒素塩基（アミノ 酸なし）、１０９グルコースおよびヒスチジン、トリプトファン、メチオニンお よびアデニンの各２００■含有）である。

λ蛋白質のみを発現さす時には、培地はさらに２００■／ｌのロイシンを含有し た。μ蛋白質のみを発現さす時には、培地はさらに２００■／ｌのウラシルを含 有した。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１ Ｈ＝Ｈｉｎｆｌ Ｈ３；Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ ＦＩＧ、　２ 、、？ＪＮＡジ可能な２シに構造 ｐＮＰ１４．　（１０１，２ｒｕｔ −品卯Ｃ１ＵＡＵＧＡＵＣＡ四＠ＡＡＣｉＵ［３ＣＡＡ〔ＵＧ［ＡＣｉＦＩＧ、 　４ ＮＩＰ　ｔＱｐ−Ｂ５Ａ　季吉６活・１１分画２も（△）、精製 系列希釈１：Ｉ ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、　１３ 手続補正書（睦） 昭和６０年　２月２２日 特許庁長官殿 １、事件の表示 ２・発明の名称　〜ヤ、、、イ、ホ、イブケトよえ、よ蛋白質およびそれらの製 造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和　年　月　日 ８、補正の内容　別紙のとおり 手続補正書（方式） 昭和６０年３月ユケ日 特許庁長官殿 ２、　発明ノ名称７１．今斗エインごりメツ１ｐ゛テちＩＪ届自毛質よ１）、そ し、らα翳昌慧方ジ（ ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ５６補正命令の日付 昭和６０年）　月：Ｌｌ）日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の翻訳文 図面のｌ！訳文の浄書　（内容に変更なし）国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）異質マルチチェインホリペデチＰ鎖のそれぞれをコードするＤＮＡ配列で 宿主細胞を形質転換しそして該形質転換宿主細胞中に該、ｆ　リペデチＰ鎖を発 現さすことを包含する、単−宿主細胞中に異質マルチチェイン、ｌ？　リペデチ ドまたは蛋白質を生成さす方法。 （２）各ＤＮＡ配列を個別にベクターに挿入し、個別のベクターで単一宿主細胞 を形質転換する上記（１）項記載の方法。 （３）　ＤＮＡ配列の少なくとも２つをひとつのベクターの別々のの部分に挿入 し、それを用いて単一宿主細胞を形質転換する上記（１）項記載の方法。 である、上記（２）または（３）項記載の方法。 （５）　フ０ラスミドがｃｏｌＥＩ、ｐｃＲＩ、ｐＢＲ３２２、ＲＰ　４または ファージＤＮＡである、上記（４）項記載の方法。 （６）　宿主細胞が細菌または酵母である、上記（１）から（５）項までのいず れかに記載の方法。 （７）　宿主細胞がＷ、　ｃｏｌｉ、旦、　５ｕｂｔｉｌｉｓまたは旦。 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　である上記（６）項記載の方法。 （８）　宿主細胞が旦９匹見菌株ＨＢ１０１、ｘ１７７６、Ｘ２８８７、ＰＳ　 ４１０、ＭＲＣ１、ＲＶろ０８、ＢまたはＥ１０３５である、上記（７）項記載 の方法。 （９）ポリペプチド鎖が宿主細胞により発現され分泌される上記（１）から（８ ）項までのいずれかに記載の方法。 ０Ｑ　宿主細胞により発現された？リペデチド鎖を、活性マルチチェインポリペ プチドまたは蛋白質の組上げを容易にする条件で可溶化する、上記（１）がら（ ８）項までのいずれかに記載の方法。 ０１）　少なくともＩｇＨおよびＬ鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列で 宿主細胞を形質転換する、１８分子または免疫学的機能を有する工、フラグメン トな生成さすための上記（１）から０１項までのいずれかに記載の方法。 （Ｊ２　ＤＮＡ配列が完全ＩｇＨおよびＬ鎖をコードする上記αυ項記載の方法 。 ０涛　不変ドメントの付着する可変ドメインと同じ材料に由来した不変ドメイン の少なくともひとつを有している、１ｇ分子またはフラグメントを製造するため の上記０刀または（６）項記載の方法。 α→　不変ドメインの付着する可変ドメインとは別の材料に由来した不変ドメイ ンの少なくともひとつを有している、１２分子またはフラグメントを生成さすた めの、上記α１）または＠項記載の方法。 αＱ　Ｉｇ分子をコードするＤＮＡまたはフラグメントが１種または１種より多 くのモノクローナル抗体生成バイブ・す１−マに由来する、上記Ｑｌ）から１４ ）項までのいずれかに記載の方法。 ０Ｑ　イニシエータＡＴ（）コドンの領域におけるベクク５６ −　ＤＮＡ配列を、ＲＮＡ　２次構造を実質的に欠くものに変えることを包含す る、形質転換された宿主細胞における蛋白質発現のレベルを増加さす方法。 αη　ＤＮＡ配列を、配列のΔＧ値の絶対値を最小になるように変える上記（ト ）項記載の方法。 （ト）単一宿主細胞より組換えＤＮＡ技術により生成された異質マルチチェイン ホリペデチドまたは蛋白質。 ０窃　単一宿主細胞より組換えＤＮＡ技術により生成されたＩｇ分子または免疫 学的に機能する１８フラグメント。 翰　不変域が付着する青変域と同じ材料に由来する少な（ともひとつの不変域を 包含する、上記６１項記載の１８分子またはフラグメント。 （財）　不変域が付着する可変域の由来した材料とは別の材料に由来する少なく ともひとつの不変域を包含する、上記（１９項記載の１８分子またはフラグメン ト。 （イ）　それぞれに可変ドメインに付着するひとつだけの不変ドメインを含有す る、上記翰または（２０項記載のＩｇフラグメント。 （イ）　それぞれの可変ドメインに付着して完全糖分子を生成するに十分の不変 ドメインを含有する上記（イ）または６２１）項記載の１８分子。 ＠　組換えＤＮＡ技術の生成物としての、完全な可変域を有するＩ、ＨまたはＬ 鎖またはそれのフラグメント。 （ハ）　上記（１）から６９項までのいずれかの方法で用いる詩表昭６Ｏ−５０ （１８９２（２） ためのベクター。 圀　上記（至）から（２）項までのいずれかに記載の分子を生成することを可能 とするように宿主細胞を形質転換するに用いるためのベクター。 勾　プラスミドである、上記（イ）または（イ）項記載のベクター。 翰　上記（ハ）から（イ）項までのいずれかによるベクターで形質転換された宿 主細胞。 翰　上記０８）から（ハ）項までのいずれかに記載の分子と薬剤として許容され うる担体とを含有する治療用組成物。 鉛　上記（至）から（ハ）項までのいずれかに記載の分子と薬剤として許容され うろ担体とを混合することを包含する、上記（イ）項記載の組成物の調製方法。 （３］）　クロマトグラフ媒体上に固定された上記θ８）から（ハ）項までのい ずれかに記載の分子を含有する、アフィニテイクロマトグラフ媒体。 （３ウ　抗原結合性１８分子またはフラグメントのひとつまたはそれぞれが、上 記θ１から０４項までのいずれかに記載の分子またはフラグメントである、免疫 学的アッセイ方法。 ０３工８分子またはフラグメントと共に細胞中で合成される細胞毒性、酵素性ま たは構造性ポリペプチド部分が付着している、上記０８）から（２）項までのい ずれかに準する工８分子またはフラグメント。 浄書（内容に変更なし）