JP2000509277A

JP2000509277A - ヒト造血幹細胞及び前駆細胞抗原並びにその使用方法

Info

Publication number: JP2000509277A
Application number: JP9539045A
Authority: JP
Inventors: ミラグリア，シェリー; ジー．ゴッドフライ，ウェイン; イン，アミー; バック，デビッド
Original assignee: アムセルコーポレイション
Priority date: 1996-04-26
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2000-07-25
Anticipated expiration: 2017-04-25
Also published as: ES2327691T3; US6455678B1; US8084033B2; JP3908279B2; JP2006149396A; AU720938B2; US20050214861A1; JP2006246898A; CA2251604A1; DK0953046T3; AU2682197A; US20090093052A1; EP0953046B1; ATE435282T1; WO1997041224A1; US20010051372A1; EP0953046A1; DE69739480D1; CA2251604C

Abstract

(57)【要約】造血前駆細胞及び試薬、特に前記抗原に対して特異的に結合する抗体が供給される。抗原の発現は、高い組織特異性である。それは、ヒト骨髄、胎児骨髄及び肝臓、臍帯血及び成人末梢血液に由来する造血前駆細胞のサブセットに基づいて単に検出される。AC133により認識される細胞のサブセットは、CD34^brightであり、そしてCD34⁺集団に存在するCFU-GM活性の実質的にすべてを含む。AC133のこの高い特異性分布は、ヒト造血前駆体及び幹細胞を単離し、そして特徴づけるための試薬としてそれをひじょうに有用にする。AC133抗原の発現のために選択される細胞は、他の造血幹細胞及び前駆細胞マーカーのための選択によりさらに精製され得る。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト造血幹細胞及び前駆細胞抗原並びにその使用方法技術分野本発明は、造血幹細胞及び前駆細胞(progenitor cell)により発現された抗原、及びそのような抗原を、特に細胞分離及び精製のために使用する方法に関する。背景哺乳類血液細胞の高い交代速度（turnover）は、他の血液細胞系統を生ぜしめることができる造血幹細胞の供給を必要とする。造血幹細胞の直子孫は、前駆細胞と呼ばれ、そして１又は複数の系統、すなわちエリスロイド、ミエロイド及びリンパ系統内の種々の細胞型を生ぜしめることができる。幹細胞及び前駆細胞集団は、骨髄、胎児肝臓、等における全細胞数の数％のみを構成する。それらの集団は、造血系をもとの集団にもどす（repapulate）それらの能力のために、非常に興味あるものである。造血幹細胞及び前駆細胞集団の精製又は富化のための多くの方法が、文献に記載されて来た。造血前駆細胞は多くの臨床的用途を有するので、それらの方法にかなりの商業的関心がよせられている。前駆細胞移植が、白血病、乳癌及び他の腫瘍の治療のために化学療法及び放射線と組合わせて現在使用されている。ときおり、移植片拒絶の危険性を回避するために自己由来の移植物が使用されているが、しかし移植細胞集団における腫瘍細胞の存在のために、病気再発の高い危険性が存在する。従って、より精製された前駆細胞源の移植が好ましい。遺伝子療法のためのビークルとしての造血前駆細胞の使用にも興味がもたれている。臨床的にはまだ証明されてはいないが、造血幹細胞の寿命、及び脈管構造におけるそれらの子孫(progeny)の散在性(disseminity)は所望の特徴である。多くのベクター、たとえば造血幹細胞をトランスフェクトすることができる、いくつかのレトロウィルス及びアデノウィルスに基く構造体が記載されて来た。造血幹細胞及び前駆細胞集団上に見出される、タンパク質及び他の細胞表面マーカーは、それらがそれらの集団の同定、分離及び単離のための試薬の調製、及びそれらの重要な細胞のさらなる特徴化において有用であるので、非常に興味あるものである。幹細胞の同定及び分離（陽性及び陰性）において使用され得るいくつかの抗原、たとえば幹細胞上に見出されるが、しかし成熟血液細胞上には見出されないCD34抗原が現在、知られているが、他の抗原、特に所望のクラス及びサブクラスの細胞、特に造血幹細胞及び前駆細胞の精製及び分離を単純にすることができる抗原の開発が常に必要とされている。背景文献アメリカ特許第5,061,620号は、実質的に均質なヒト造血幹細胞組成物及びそのような組成物を得る態様を記載する。ストロマ細胞関連の造血が、Paulなど．（1991）Blood 77：1723-1733により記載されている。ローダミン染色による幹細胞の表現型の同定が、Spangrnde and Johnson（1990）P.N.A.S ．87：7433-743 7に論じられている。造血における細胞表面抗原発現が、Straussなど．（1983）Blood 61：1222-1231及びSieffなど．（1982）Blood 60：703-713に論じられている。多能性造血細胞の記載が、McNieceなど．（1989）Blood 74：609-612及び Mooreなど．（1979）Blood Cells ５：297-311に見出される。幼若細胞−含有コロニーをインビトロで形成できるヒト造血前駆細胞の特徴化が、Gordonなど．（1987）J ．Cell．Physiol．130：1 50-156及びBrandtなど．（1988）J ．Clin．Invest．82：1017-1027に見出される。移植への前駆細胞の使用が、Toなど．Progenitor Threshold in Transplantat ion （ISBN 1-880854 17-1）pp.15-20に論じられている。前記方法を用いて得られる細胞組成物の利用性及び本発明の組成物が、中でもそれらの出版物に記載されている。ヒト造血前駆細胞の単離のための高いグラジエントの磁気分離の使用が、Thom as and Landsdorp（1992）Advances in Bone Merrow Purging pp.537-544；及び Kato and Radbrach（1993）Cytometry 14：384-392に記載されている。ヒト造血前駆細胞についての磁気選択の他の方法が、Bigasなど．（1992）Advances in B one Merrow Purging pp.545-551；Okuなど．（1992）Advances in Bone Merrow Purging pp.553-560；及びHardwickなど．（1992）Advances in Bone Merrow Pu rging pp.583-589に記載されている。高いグラジエントの磁気細胞分類が、Milt enyiなど．（1990）Cytometry 11：231-238に記載されている。Moldayのアメリカ特許第4,452,773号は、磁気性鉄−デキストラン微小球の分離を記載し、そして生物学的材料への結合のために適切な粒子の種々の調製手段を記載する要約を提供する。発明の要約ヒト造血前駆体及び幹細胞の富化及び特徴化のための方法及び組成物が提供される。幹細胞及び前駆細胞上に存在し、そして造血細胞の生物学的（又は他の）源に存在する莫大な数の細胞からのそれらの重要な細胞の同定及び／又は選択のために使用され得る、本明細書においてAC133抗原として言及される抗原が同定された。それら、たとえば抗体と反応する新規抗原組成物及び試薬が、本発明の方法への使用のために、並びに造血前駆体及び幹細胞生物学のさらなる研究のために供給される。たとえば、造血細胞は、種々の源、たとえば胎児及び成人骨髄、サイトカイン可動化(mob ilized)末梢血液細胞、及び胎児肝臓から得られ、そして本発明の試薬及び方法を用いて分離され得る。図面の簡単な説明本発明は今や、一般的に記載され、これは本明細書の一部を形成する図面と一緒に、特定態様の次の記載に関して、良好に理解されるであろう。図１は、胎児肝臓細胞の螢光活性化細胞分別(fluorescence activted cell so rting)（FACS）分析からのドット−プロットを示す。ｙ軸はフィコエリトリン（ PE）に接合されたAC133抗体による細胞染色を示す。細胞は、HPCA２−FITC（抗 −CD34）により対比染色された（counterstained）。数字は、枠内に含まれる合計細胞の％を表わす。図２は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)活性化Ｙ79.1細胞上でのAC1 33抗原発現のFACS分析を示すグラフである。図３は、PMA活性化Ｙ79.1細胞上でのAC133抗原及びCD34発現のFACS分析を示すグラフである。図４Ａ及び４Ｂは、胎児肝臓細胞上での抗体AC133，CD38及びHLA−DRの３色FA CS分析からのドット−プロットを示す。図４Ａ中のｘ軸は、HLA-DR-FITCを表わし、そしてｙ軸はAC133−PEによる細胞染色を示す。図４Ｂ中のｘ軸はCD38−FIT Cを表わし、そしてｙ軸はAC133−PEによる細胞染色を表わす。図５Ａ，５Ｂ，５Ｃ及び５Ｄは、胎児肝臓から精製されたAC133陽性細胞上での抗体CD38，HLA-DR，CD90及びCD117のFACS分析からのドット−プロットを示す。図５Ａにおいては、ｘ軸はCD38−FITC染色を示し、そしてｙ軸はHPCA２−PE染色を示す。図５Ｂ，５Ｃ及び５Ｄにおいては、ｘ軸はHPCA２−FITCによる染色を示す。図５Ｂ中のｙ軸は抗−HLA-DR−PEによる細胞染色を表わす。図５Ｃ中のｙ軸は抗−CD90−PEによる細胞染色を表わす。図５Ｄ中のｙ軸は抗−CD117−PEによる細胞染色を表わす。数字は、ボックスゲート内にある合計細胞の％を示す。図６は、AC133抗体並びに細胞系KG1a及びＹ79.1による免疫沈殿の結果を示すゲルである。レーンは次の通りである：１）分子量マーカー；２）未沈殿KG1a溶解物の１：５希釈物；３）未沈殿Ｙ79.1溶解物の１：50希釈溶液；４）AC101抗体（CD34）により沈殿したKG1a溶解物；５）AC101抗体により沈殿したＹ79.1溶解物；６）HPCA２抗体（CD34）により沈殿したKG1a溶解物；７）HPCA２抗体により沈殿したＹ79.1溶解物；８）16D11抗体（CD34）により沈殿したKG1a溶解物；９）16D11抗体により沈殿したＹ79.1溶解物；10）AC133抗体により沈殿したKG1a 溶解物；11）AC133抗体により沈殿したＹ79.1溶解物；12）AC133及びHPCA２抗体の混合物により沈殿した、KG1a及びＹ79.1の混合物の溶解物；13）8A3(抗−CD10 9)抗体により沈殿したKG1a溶解物；14）15G5(抗−CD109)抗体により沈殿されたK G1a溶解物。図７Ａ及び７Ｂは、PMA活性化された、ツニカマイシン処理された又は未処理のＹ79.1細胞上でのCD56（図７Ａ）及びAC133抗原（図７Ｂ）発現のFACS分析を示すグラフである。図８は、AC133磁気精製された胎児肝臓細胞のHPCA２−PE（ｙ軸）染色のFACS 分析を示すドット−プロットである。ｘ軸はグリコホリンＡ−FITC接合体による染色を示す。図９Ａ及び９Ｂは、AC133磁気分離の前及び後の、バフィーコート末梢血液単核細胞のHPCA２染色のFACS分析を示すドット−プロットである。ｙ軸は、HPCA２ −PEによる染色を示し、ｘ軸は抗−CD45及び抗−CD15−FITC接合抗体による染色を示す。図10は、クローン原性アッセイにおけるAC133及びAC101で精製された細胞のクローニング効率を示す棒グラフである。図11は、AC133で精製された細胞、及びAC133陰性，CD34陽性細胞のプート効率を示す棒グラフである。図12は、AC133抗原についてのDNA及びアミノ酸配列を示す化学式である。図13は、AC133抗原のトランスメンブラン領域及び他の領域の図解である。特定の態様の記載ヒト造血幹細胞及び／又は前駆細胞の富化及び／又は特徴決定に使用される方法及び組成物が提供される。本明細書においては“前駆”細胞と呼ばれる、造血幹細胞の直子孫(immediate progeny)は、１又は複数の系統(lineage)内に種々の細胞型を生じさせることができる。本発明においては、幹細胞及び／又は前駆細胞のサブセット（すなわち、短期移植(short ingraftment)のために必要とされるCFU−GM細胞）が、それらの細胞に対して高い特異性を有するAC133抗原（Ag）として本明細書で言及される新しく発見された抗原に特異的に結合する試薬の使用を通して同定され、又は選択され得る。AC133抗原発現の高い組織特異性は、高く精製された前駆細胞集団についての富化の間、特に好都合である。AC133− 陽性細胞集団は、前駆細胞活性、特にCFU−GM活性を測定するアッセイにおいて活性的である細胞について高度に富化される。AC133陰性であり、且つCD34 陽性である細胞サブセットは、BFU−Ｅ活性、すなわちエリトロイド−コミッテッド(committed)前駆細胞活性の測定のために富化される。 AC133抗原に対して特異的に結合する試薬は、生理学的リガンド、合成リガンド、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含する。AC133モノクローナル抗体は、ヒト骨髄、胎児骨髄及び肝臓、臍帯血及び成人末梢血液に由来する造血前駆細胞上に発現されるAC133細胞抗原と特異的に相互作用するいづれかのモノクローナル抗体である。AC133に対して向けられる抗体により認識される前駆細胞のサブセットは、CD34^brightであり、そしてCD34⁺サブセット（及び前駆細胞の収集において収集されるまだ幹細胞である細胞）に存在する実質的にすべてのCFU-GM活性を含む。移植のためには、CFU−GMにおいて活性な細胞は、それらが好中球の生成を提供するので、特に興味あるものである。AC133抗体の使用は、造血前駆細胞集団の陽性免疫選択、及びフローサイトメトリーを用いての前駆細胞集団の表現型分析を可能にする。特に、AC133に対する抗体は、短期移植及び敗血症からの保護のために必要とされるCFU−GM細胞のみならず、さらに、長期の移植のために必要である原始的な長期のもとの集団にもどる細胞(primiti ve long-term re-populuting cells)を認識する。次に、AC133抗原の発現について選択される細胞は、他の造血幹細胞及び前駆細胞マーカーについての選択によりさらに精製され、そして／又は選択され得る。下記に詳細に記載されるように、本発明の種々の方法における興味ある分子は、AC133抗原それ自体、AC133又はそのフラグメントに対して特異的に結合する試薬、AC133抗原をコードする核酸配列、及びAC133抗原又はそのいづれかのフラグメントを発現する細胞集団を包含する。AC133抗原は、天然源から単離され、又は組換えDNA技法を用いて製造され得る。核酸は、cDNA，RNA、ゲノム配列、又はコード配列を単独で、又は転写調節領域、及び発現及び／又はクローニングベクターに見出される他の配列と組合して含んで成る合成配列であり得る。AC133 Ag自体は、当業界において知られているアフィニティー結合法を用いてAC133抗体結合により陽性として同定され得る細胞からの単離により精製された形で得られる。陽性同定は、細胞膜タンパク質のタンパク質分解消化、及び図12に示されるAC133についてのタンパク質配列に対する配列の比較により入手できる。 mAb AC133は、明るい（bright）CD34⁺細胞上に発現される新規の細胞表面抗原に対する特異性を有する抗体である。前記抗原は、ヒト骨髄、胎児骨髄及び肝臓、臍帯血、及び成人末梢血液に由来する造血前駆細胞のサブセット上に発現される。mAb AC133は、可能性ある治療利点、及びフローサイトメトリーを用いての前駆細胞集団の表現型分析をもたらす、造血前駆細胞集団を免疫選択するために磁気ビーズシステムに使用され得る。この新規分子の性質をさらに特長づけるために、AC133抗原がイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。AC133抗原は、約120KDの減じられた分子量を有する一本鎖ポリペプチドから成り、そして約20KDaのＮ−グリコシド結合多糖類と共に糖タンパク質を含んで成る。還元されたAC133抗原はmAb AC133により認識され、これは線状エピトープ又は糖エピトープを示唆する。そのような分子は、類似性が同じ出発ペプチド構造体からの合成のために、AC 133分子の収集において、糖構造体間に確かに存在するが、ペプチド合成のために存在する鋳型（すなわち、メッセンジャ−RNA）なしに存在する正確に同一の糖構造体を、糖合成の酵素性質のために有することが予測されないことが、糖タンパク質の分野におけるそれらの実験により認識されるであろう。従って、“AC133抗原”は、グリコシル化部位に付加される糖構造と共に図12（下記で論ぜられる）に示されるペプチド構造を有するタンパク質を意味する。糖構造における天然の変動のために、グリコシル化された分子のための広範囲の分子量がまた、予測され、そして本発明の範囲内にある。AC133抗原の場合、他の既知のタンパク質に比較して、結合される糖残基の構造及び大きさにおいて比較的低い変動性が存在すると思われる。AC 133の分子量は典型的には、分子量を測定するために、使用される実験技法の詳細には無関係に、115〜127KDの範囲にあることが見出されている。精製されたAC133抗原は、リシルエンドペプチダーゼにより消化されてペプチドが生成され、これは逆相HPLCにより単離され、そしてEdman分解により配列決定された。それらのペプチドは、WERI−Rb−１cDNAライブラリー鋳型を用いてのポリメラーゼ連鎖反応に使用される縮重オリゴヌクレオチドを設計するために使用される。この技法は、次に、1.7KBの明白な配列を生成し、これは完全なcDNA クローンを単離するために使用された。このcDNAは、2598個のヌクレオチドの単一の読取り枠をコードし、そして解鎖を除去した抗原について見出される約90KD aの分子量に対応する、96.8KDaの分子量を有する865個のアミノ酸タンパク質を予測せしめる。疎水度及びトランスメンブランらせん度の分析は、２つの大きな細胞外ループをもたらす、５つのトランスメンブランドメインの存在を示唆する。Ｎ−結合されるグリコシル化の部位のための合計８個のコンセンサス配列が存在し、そのすべてが、２つの大きな細胞外ループ及び50個のアミノ酸のＣ−末端細胞質テイルを有する本発明者が提案した構造モデルを支持する２つの大きな(2 60及び290個のa.a.)ループ上にある。前記細胞質末端を失ったAC133抗原の末端切除されたものはまだ、mAb AC133により認識される。その生理学的リガンドとの受容体の相互作用に関与し得る、両細胞外ループにロイシンジッパーモチーフ（leucine zipper mot if）のためのコンセンサス配列が存在する。図13に示されるように、AC133抗原は、細胞外Ｎ−末端及び細胞質Ｃ−末端を有する５−トランスメンブランタンパク質（“５TMタンパク質”）として現われる。４MT（また、テトラスパンとも呼ばれる）、７TM及び11TMタンパク質のファミリーは、文献に特徴づけられている。テトラスパンファミリーの機能は知られていないが、７TMタンパク質は一般的に、走化性アゴニストを結合するＧ−タンパク質結合の受容体結合であると思われ、そして11TMはイオン−チャンネル受容体のファミリーを表わす。しかしながら、５TM分子はこれまで記載されておらず、そしてAC133抗原の構造は、分子量及び細胞外ループの大きさに関して、既知の７TM種類のメンバーと著しく異なる。さらに、AC133抗原は４TM又は７TMタンパク質と配列相同性を共有しないが、該TMメンバーは、特にトランスメンブランドメイン内でお互いと有意な相同性を共有する。 AC133遺伝子の短いフラグメントは、EST(発現された配列標識)、たとえば成人の網膜、ランゲルハンス島及び胎児の脳として、Genbankに存在する。しかしながら、AC133抗原の発現は、原始造血幹細胞及びいくつかの神経冠由来の組織に限定されると思われる。AC133抗原はまた、NT−２奇形癌細胞上に発現され；しかしながら、発現は、それらの細胞が最終的にニューロンに分化するにつれて失なわれる。AC133抗原（受容体）と生理学的リガンドとの相互作用は、細胞内シグナルを供給することができる。 AC133抗原に対する発見された元のモノクローナル抗体は、CD34 ^bright ヒト造血幹細胞及び前駆細胞上に選択的に発現される、約１20,000Mrの新規抗原を定義する抗体のパネルの１つである。CD34^bright細胞は長期のＢ細胞リンパ球産生及び骨髄造血をインビトロで支持し、そしてＴ，Ｂ、骨髄単球及び巨核球のもとの集団へのもどりをインビボで仲介する。CD34^dim細胞は、インビトロ又はインビボで、長期の造血活性を付与しなかった。CD34^bright集団は、すべての原始幹細胞活性を含み、そして従って、造血幹細胞移植及び遺伝子療法におけるさらなる研究のために選択される集団である。AC133抗体は、造血幹細胞及びコミッテット(committed)前駆細胞のサブセットの陽性選択及び表現型分析のための手段を提供する。最初の特異的抗体AC133、すなわちネズミIgG₁抗体は、精製されたCD34⁺ヒト前駆細胞により免疫化されたマウスから誘導された。AC133 陽性細胞の正確な抗原表現型を決定するために、AC133及びCD34二重陽性細胞が、３及び４色FACS分析を用いて、胎児肝臓、胎児及び成人骨髄、臍帯血及び末梢血液において試験された。すべての組織においてAC133抗体により認識されるサブセットは、CD34^bright、CD38^-/+，HLA−DR^+/-である。CD90⁺，CD117⁺及びCD10 9⁺幹細胞集団は、AC133陽性集団内に含まれる。典型的には、AC133はすべてのCD 34⁺細胞の20〜60％を染色し、その集団は系統に付されていない(non-lineage co mmitted)CD34⁺集団及び顆粒球／半球路に付された(committed)CD34⁺細胞のすべてを含む。AC133抗原の発現は、標準のFACS法により、末梢血液単核細胞、顆粒球、血小板又は臍帯静脈由来の内皮細胞上で示されない。50人のヒト細胞系のパネルに対するFACS分析は、わずか２種の網膜芽腫細胞系、すなわちＹ79.1及びWE RI−Rb−１が、NT−２奇形癌細胞と共にAC133抗原を発現することを示す。羊胎児へのAC133陽性細胞の移植は、選択された細胞の移植能力を示しており、そしてその胎児の羊骨髄に入ったヒト細胞が収穫され、そして二次受容体に移植することが示され、これは選択された細胞の長期のもとの集団へのもどりの能力を提供する。AC133遺伝子は、96.8KDaの予測されるサイズを有する、865個のaaから成るポリペプチドをコードする。このタンパク質は、膜を５回横切るユニークな構造を有する。従って、AC133抗原は、哺乳類５TM膜タンパク質の新しいクラスを定義する。それらのデータは一緒になって、AC133が造血幹細胞の同定及び分離のためのもう１つの抗原システムを提供することを示す。幹細胞及び／又は前駆細胞に選択的に結合する抗体は、特に興味あるものである。AC133 Agに対する抗体は、ヒト造血前駆細胞により異種移植免疫担当哺乳類宿主（たとえば、ネズミ、ゲッ歯動物、ウサギ、羊、ブタ又はウシ宿主）を免疫化することによって得られる。免疫化のための適切な前駆細胞集団は、サイトカイン−可動化末梢血液、骨髄、胎児肝臓、又は他の前駆細胞源からCD34⁺細胞を単離することによって得られる。細胞は、免疫原としてのそれらの使用の前、フィトヘマグルチニンと共にインキュベートされ得る。免疫化は従来の技法に従って行なわれ、ここで細胞は宿主中に、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内注射され得る。通常、約10⁶〜10⁸個の細胞が使用され、これは１回又はそれ以上の回数の注射〜通常、約８回を越えない回数の注射に分けられ、そして約１〜32週間の期間に及ぶ。この注射はアジュバントを伴って又はそれを伴わないで行なわれ得；アジュバントの例は完全又は不完全フロイントアジュバント、スペコール（specol）及びミョウバンを包含する。好ましい態様においては、対側性免疫化（contralateral immunization）が、下記例に記載のようにして使用される。この方法は、抗原刺激の部位に向かう免疫リンパ球の自由に往来する能力による。動物は、身体の片側、たとえば左支脚皿上の局部で、免疫優性であるが、しかし無関係な多くの抗原を発現する細胞により予備免疫化される。種々の造血細胞がこの目的のために使用され得る。注目の免疫原が、動物の反対側上の局部で注射される。無関係の抗原により予備免疫化され、そしてその抗原に対して応答するリンパ球が左側の流入リンパ節におびき寄せられ、そして注目の免疫原に応答するリンパ球が支脚皿注射のために、右側の流入リンパ節、たとえば膝窩リンパ節に存在するであろう。この膝窩リンパ節は、融合のために細胞源として使用され得る。免疫化スケジュールの完結の後、抗血清が、AC133 Agを包含する造血前駆細胞の表面膜タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗血清を供給するために、従来の技法に従って収穫され得る。次に、リンパ球が適切なリンパ組織、たとえば脾臓又は流出リンパ節から収穫され、そして適切な融合パートナー、通常、骨髄腫系により融合せしめられ、特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが生成される。興味ある抗原特異性についてのハイブリドーマのクローンのスクリーニングが、従来の方法に従って行なわれ得る。特に次のものが興味あるものである：下記例に記載される特異的モノクローナル抗体AC133；AC133抗原に結合する他の抗体（モノクローナル及びポリクローナルの両者）、特に交差反応性抗体（すなわち、同じエピトープに結合し、そして同時結合を実質的に阻害するもの）；その種類似体；その結合フラグメント；及びその接合体。AC133抗原に対する抗体を発現するネズミハイブリドーマ細胞系の寄託は、1997年４月23日、American Type Cultuce Collection，1230）Parkla wn Drivo，Rockville MD 20852で行なわれ、そしてATCC受託番号を与えられた。それらの抗体は、注目の造血細胞サブセットについて免疫選択することができる。抗体が通常のマルチ構造の代わりに一本鎖として生成され得ることは知られている。一本鎖抗体は、Jostなど．（1994）J.B.C ．269：26267-73、及び多くの他の文献に記載されている。Ｈ鎖の可変領域及びＬ鎖の可変領域をコードするDNA 配列は、グリシン及び／又はセリンを包含する、少なくとも約４個のアミノ酸の小さな中性アミノ酸をコードするスペーサーに連結される。この融合体によりコードされるタンパク質は、機能的可変領域のアセンブルを可能にし、そして元の抗体の特異性及び親和性を保持する。抗体をヒト化する方法もまた、当業界において知られている。ヒト化抗体は、トランスジェニックヒト免疫グロブリン−不変領域遺伝子を有する動物の生成物であり得る（たとえば、国際特許出願WO90/10077及びWO90/04036を参照のこと）。他方では、注目抗体は、CH１，CH２，CH３、ヒンジドメイン及び／又は骨格残基をその対応するヒト配列により置換する組換えDNA技法により構築され得る（W O92/02190を参照のこと）。キメラ免疫グロブリン遺伝子の構成へのIg cDNAの使用は、当業界において知られている（Liuなど．（1987）P.N.A.S ．84：3439及び（1987）J ．Immunol．15 9：3521）。それらの技法においては、mRNAが抗体を生成するハイブリドーマ又は他の細胞から単離され、そしてcDNAを生成するために使用される。注目のcDNA は、特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得る（アメリカ特許第4,683,195号及び第4,683,202号）。他方では、ライブラリーが製造され、そして注目配列を単離するためにスクリーンされ得る。次に、抗体の可変領域をコードするDNA配列が、ヒト不変領域配列に融合される。ヒト不変領域遺伝子の配列は、Kabatなど．（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest ，N.I.H.公開番号91−3242に見出され得る。ヒトＣ領域遺伝子は、既知のクローンから容易に入手できる。次に、ヒト化されたキメラ抗体が従来の方法により発現され得る。抗体フラグメント、たとえばFv，Ｆ(ab')₂及びFabフラグメントは、たとえばプロテアーゼ又は化学的分解により注目抗体の切断により調製され得る。あるいは、切断された遺伝が設計され得る。たとえば、Ｆ(ab')₂フラグメントの部分をコードするキメラ遺伝子は、切断された抗体フラグメントを生成するために、Ｈ鎖のCH１ドメイン及びヒンジ領域をコードするDNA配列、続いて、翻訳停止コドンを含む。 AC133抗原に対する抗体は、約120KDの見掛け分子量（市販の標準に基づいて、還元SDS−PAGEゲルからのウェスターンブロット条件下で）を有し、そして一般的には、約115〜127KDの範囲であるように見えるタンパク質に結合する。AC133 抗体がツニカマイシン−処理されたWERI−Rb−１細胞から免疫沈殿され得ないので、抗体は糖エピトープを認識すると思われる。AC133抗原は、CD34⁺細胞のサブセット上に発現されるが、しかし内皮細胞及び線維芽細胞上には不在である。HL A−DR⁺，CD90⁺及びCD117⁺前駆細胞は、AC133−陽性細胞の集団に包含される（CD 90⁺としてこれまで知られている抗原は現在、CD90⁺として知られており；DR陽性及び陰性、並びにCD38陽性及び陰性細胞はこの集団に包含される）。この集団は、造血細胞のCD34⁺サブセットに存在する実質的にすべての造血幹活性を含む。 AC133抗原に特異的に結合する試薬は、抗体に制限されない。１つの種の他の種への結合を検出する当業界において知られている多くの方法のいづれかが、AC 133抗原−結合試薬の存在についてアッセイするために使用され得る。１つの普遍的に適合できるアッセイは、放射性ラベルされた試験化合物、及び固相に結合されるAC133 抗原を用いて検出され得る、溶解相と固相との間の放射能の分布を包含する。AC 133抗原は、たとえばカラムにおける固相に結合され得、そして生理学的緩衝液におけるチタン−又は¹⁴Ｃ−ラベルされた試験化合物がそのカラムに通され得る。結合された放射能は、カラム上で直接的に、又は適用された放射能から、カラムを通して通過する溶解相における放射能を引き算することにより検出され得る。結合親和性は、結合のために十分な時間、平衡化を可能にした後、試験化合物の種々の濃度での結合された放射能のレベルを測定することによって検出され得る。AC133に対する結合の特異性は、AC133に結合する試験化合物が成熟血液細胞上に存在する抗原（又は予備選択されたアッセイ媒体における興味ある他の抗原）にまた結合するかどうかを決定することによって検出され得る。特に好ましいリガンドは、成熟血液細胞上に存在するいづれかの抗原と10％以下、好ましくは５％以下の交差反応性をもって、AC133に対して選択的であるものである。交差反応性は、いづれかの標準技法により測定され得、そして好ましくは、純粋なAC 133抗原、試験されるべきリガンド、及び予測される交差反応性抗原間での競争結合アッセイにより、一定濃度のAC133抗原及び試験リガンド（ここで、リガンドの半分がAC133に対する結合を飽和する）を用いて測定される。最とも好ましくは、交差反応性は、抗体が50ng/100μｌの濃度で存在する場合、その半分がモノクローナル抗体ATCC を飽和するAC133抗原の一定濃度で測定される。 AC133に特異的に結合する試薬が同定されると、その試薬（放射能ラベルされた形での、もう１つのラベルを含むように変性された非放射能形での、又はラベルされていない形での一定の使用での）は、AC133への試薬の結合を要する種々のアッセイ又は生物学的使用、たとえば螢光染色、細胞分離、又は細胞識別に、インビボ及びインビトロで使用され得る。たとえば、AC133に対する抗体による免疫選択は、造血前駆細胞及び造血幹細胞を精製する手段を提供する。抗体はまた、造血細胞を検出し又は数えるために診断に、CD34陽性集団を機能的に異るサブ集団に分割することに、前駆細胞の単離に、及び成熟血液細胞を生成する前駆体の調製にも使用される。生物学的サンプル（たとえば、血液又はその誘導体、生検、及び滑液）は、対象抗体により結合される表面分子を発現する細胞の存在についてアッセイされ得る。たとえば、アッセイは、細胞溶解物、損なわれていない細胞、又は凍結物に対して、異なった細胞型を区別するために実施され得る。 AC133に特異的に結合する対象の抗体及び他の試薬は、実質的に純粋なヒト造血前駆細胞及び造血幹細胞の調製のために有用である。前駆細胞のサブセットが AC133結合に基づいて他の造血細胞から分離され得、そして当業界において知られている他の表面マーカーに結合することによって、さらに相互に分離され得る。造血細胞源は、胎児又は成人骨髄；胎児肝臓；臍帯血；及び末梢血液、特にサイトカインで可動化された末梢血液を包含する（たとえば、Camposなど．（1993 ）Leukemia 7：1409-15及びGriggなど．（1993）Bone Marrow Transplant”，Su ppl 2：23-9を参照のこと）。ヒト幹細胞は、表現型CD34^bright；HLA-DR⁺；CD38^dim/negative；CD117(ｃ−k it)^dim；CD90(Thy-1)⁺を有し、そして種々の系統特異的マーカー、たとえばCD３，CD４，CD７，CD８，CD14，CD15及びCD19の発現を欠いていることが報告されている。Negativeの表示は、染色のレベルがイソタイプ−適合の陰性対照の明るさで又はそれ以下で存在することを示す。dimの表示は、染色のレベルが陰性染色のレベル近くで存在するが、しかしまた、イソタイプ適合の対照よりも明るいことを示す。分離のための方法は、抗体被覆された磁気ビーズを用いての磁気分離、及び固体マトリックス（たとえば相）に結合される抗体を用いてのアフィニティークロマトグラフィー又は“パンニング”を包含する。正確な分離を提供する技法は、種々の程度の洗練性を有する、たとえば複数のカラーチャンネル、低角度及び鈍感な光分散検出チャンネル、又はインピーダンスチャンネルを有する螢光活性化された細胞ソーターを包含する。死亡細胞は、死亡細胞に関連する色素（たとえばヨウ化プロピジウム、LDS）による選択により排除され得る。赤血球細胞は、傾瀉、溶血又はFicoll−Paqueグラジエントにより除去され得る。選択された細胞の生存性に対して過度に有害でないいづれかの技法が使用され得る。便利には、抗体は、多くの異なった目的のために次のラベルにより接合され得る：たとえば特定の細胞型の分離を容易にする磁気ビーズ；アビジン又はストレプタビジンに対して高い親和性で結合するビオチン；螢光活性化された細胞ソーターにより使用され得る螢光色素；ハプテン；及び同様のもの。多色分析がFACS と共に又は免疫磁気分離及び流動細胞計測を組合して使用され得る。多色分析は、次の複数の表面抗原に基づいての細胞の分離のために興味あるものである：たとえばAC133⁺，CD90⁺又はCD117⁺，AC113^-、又はCD34⁺。多色分析に使用される螢光色素は、フィコビリタンパク質、例えばフィコエリトリン及びアロフィコシアニン；フルオレセイン；及びテキサスレッドを包含する。本発明の１つの態様においては、抗−AC133抗体は、磁気試薬、たとえば超常磁性微小粒子（微小粒子）に直接的に又は間接的に接合される。磁気粒子への直接的な接合は、当業界において知られているような種々の化学的結合基の使用により達成される。たとえば、抗体は、側鎖アミノ又はスルフヒドリル基及び異種機能性架橋試薬を通して微小粒子に結合され得る。多数の異種機能化合物が存在物に対して結合するために利用できる。抗体上の反応性スルフヒドリル基及び磁気ビーズ上の反応性アミノ基との好ましい結合基は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（SPDP）又は４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（SMCC）である。他方では、抗−AC133抗体は、磁気粒子に間接的に結合される。その抗体はハプテンに直接的に結合され、そしてハプテン特異的な第２段階の抗体がその粒子に結合される。適切なハプテンは、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、FITC、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、及びビオチンを包含する。タンパク質へのハプテンの結合のための方法は当業界において知られており、そしてそのような結合のためのキットは市販されている。幹細胞又は前駆細胞の分離又は同定のためには、抗体が造血細胞サンプルに添加される。特定の細胞サブセットを結合するのに必要な抗−AC133抗体は、試験分離及び分析を行なうことによって実験的に決定される。細胞及び抗−AC133 Ab は、複合体が形成されるのに十分な時間、通常少なくとも約５分、より通常には少なくとも約10分、及び通常には、１時間以下、より通常には約30分以下の時間インキュベートされる。さらに、細胞は、造血前駆細胞又は造血幹細胞上に存在するか又は不在であることが知られている細胞表面マーカーに対して特異的な抗体又は結合分子と共にインキュベートされ得る。たとえば、CD90，CD117及びHLA-DRは、幹細胞の陽性選択において有用である。幹細胞上に不在であることが知られている種々のマーカー、たとえばCD３，CD４，CD８，CD14，CD15及びCD19は、陰性選択のために使用され得る。ラベルされた細胞は、特異的抗体調製法に従って分離される。螢光色素−ラベルされた抗体はFACS分離のために、そして磁気粒子は免疫磁気選択又は特に高いグラジエントの磁気選択（HGMS）のために有用である。典型的な磁気分離装置は、WO90/07380，PCT/US96/00953及びEP 438,520（それらは引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。精製された細胞集団は、いづれか適切な培地に集められ得る。種々の培地；たとえばダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）、ハンクスの基本塩溶液（HBSS）、ダルベッコのリン酸緩衝溶液（DPBS）、RPMI，Isoveの変性ダルベッコ培地（I MDM）、及び５mMのEDTAを含むリン酸緩衝液（それらはいづれも、ウシ胎児血清( FCS)、ウシ血清アルブミン(BSA)、又はヒト血清アルブミン(HSA)により補充され得る）は、市販されており、そして使用され得る。ヒト造血前駆細胞及び／又は造血幹細胞のために非常に富化された組成物（細胞源に依存する）は、この態様においては、単一の段階で達成される。所望の細胞は、細胞組成物中に約80％で又はそれ以上で存在し、そして好ましくは、細胞組成物中に約90％で又はそれ以上で存在する。注目の特定集団は、CD34^bright及びHLA−DR^+/-として特徴づけられるAC133⁺細胞を含む。この集団はさらに、CD90⁺ ，CD117⁺及び／又はCD38^dimであるそれらの細胞のために選択され得る。機能的に、それらの細胞は、CFU−GM活性のために及び長期のもとの集団にもどった細胞について高く富化される。興味あるもう１つの集団は、BFU−Ｅ活性について富化されたCD133^-及びCD34⁺である。AC133がより制限された細胞集団により発現されるので、精製への対象の抗体の使用はCD34の使用に比べて好都合であり、それにより、注目の特定の活性のためにより富化されたサブセットを可能にする。所望の細胞が単離されるとすぐに、それらは、基質細胞からのならし培地において増殖し、そのような基質細胞と共に同時培養し、又はそのような前駆細胞の増殖を支持する維持因子、たとえば幹細胞因子又はインターロイキンの組合せを含んで成る培地において増殖することによって成長せしめられ得る。細胞を培養するために使用される培地は、便利には、定義された富化培地、たとえばIMDM、又はIMDMとRPMI1640との混合物であり、そして一般的には、塩、アミノ酸、ビタミン、５×10^-5Ｍのβ−メルカプトエタノール、ストレプトマイシン／ペニシリン及び10％ウシ胎児血清から構成され、そして時間から時間に、一般的には週当たり少なくとも１〜２度、変えられ得る。対象の細胞組成物は種々の手段で使用される。それらは、照射された宿主及び／又は化学療法下にある宿主を再構成するために使用され得る。特定の異なった成長因子を通して１又は複数の選択された系統への成熟、増殖及び分化を付与することによって、前駆細胞は委託された系統に付された(committed)細胞源として使用され得る。エリトロポエチン、コロニー刺激因子(たとえば、GM−CSF，Ｇ −CSF、又はＭ−CSF)、インターロイキン（たとえば、IL−１，−２，−３，− ４，−５，−６，−７，−８，−９、又は−10）、又は同様のもののような因子又は基質細胞が、前駆細胞の増殖及び分化に影響を及ぼすために使用され得る。前記細胞はまた、造血細胞の分化及び成熟に関与する因子、たとえばAC133抗原に特異的に結合する試薬の単離及び評価にも使用され得る。従って、前記細胞は、培地、たとえばならし培地の活性を測定するために；成長因子活性又は関与について流体を評価するために；又は同様のことを行なうためにアッセイにおいて使用され得る。前記細胞は、遺伝的疾病の治療のために使用され得る。造血細胞に関連する遺伝的疾病は、遺伝的欠損を補正し、又は疾病、たとえばHIVに対しての保護のために治療するために自己由来の又は同種異系の幹細胞の遺伝的修飾により治療され得る。たとえば、疾病、たとえばβ−サラセミア、鎌状赤血球血症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、組換え酵素(recombinase)欠損症、又は組換え酵素調節遺伝子欠損症は、相同又はランダム組換えのいづれかにより、対象細胞中への野生型遺伝子の導入により補正され得る。他方では、正常な同種異系前駆細胞が移植され得る。造血細胞に関連する疾病以外の疾病もまた、その疾病が特定の分泌される生成物、たとえばホルモン、酵素、インターフェロン、因子又は同様のものの欠乏に関係している場合、治療され得る。前記細胞は液体窒素温度で凍結され、そしてそれらが融解され、そして再使用されるように、長期間、貯蔵され得る。細胞は通常、５％DMSO及び95％ウシ血清アルブミンにおいて貯蔵されるであろう。融解されるとすぐに、細胞は幹細胞増殖及び分化に関連する成長因子又は基質細胞の使用により拡張され得る。 AC133抗原は、天然源から又は組換え技法により実質的に純粋な形で得られる。天然源からは、抗原陽性細胞が溶解され、そして抗−AC133モノクローナル抗体のアフィニティーカラムに通される。造血前駆細胞が、従来の分離技法により天然源から単離され得、又は実験セクションに記載される細胞系が抗原源として使用され得る。アフィニティー精製されたタンパク質は、適切な塩溶液、又は通常、低い酸濃度、たとえば0.1〜１％のトリフルオロ酢酸の存在下で、水性／有機グラジエント、たとえばアセトニトリル又はエタノールにより、アフィニティーカラムから溶離される。次に、その溶離されたタンパク質は、従来の技法に従って、クロマトグラフィー、電気泳動、又は同様のものによりさらに精製される。下記例は、95％以上の純度のAC133抗原をもたらすアフィニティークロマトグラフィーによりAC133抗原を精製するためへのモノクローナル抗体の使用を記載する。そのような精製された調製物中のペプチドが配列分析のために調製され、そして単離され、その結果として、核酸プローブがAC133遺伝子配列の単離のために企画され得る。本明細書に示されるAC133の遺伝子配列（図12）は、組換え技法による抗原の獲得を可能にする。たとえば、全RNAが、標的化されたタンパク質を発現するよう抗体結合により示された細胞から単離される。残留DNAは、従来の技法に従って除去され、そしてポリアデニル化されたRNAは、たとえばオリゴ−dTセファロース上で又はゲルクロマトグラフィーによりさらに精製され得る。次に、cDNAが、逆転写酵素を用いて従来の技法に従って調製される（Sambro okなど.,前記及び下記例を参照のこと）。次に、前記cDNAが、cDNAが発現される適切なクローニングシステム、たとえばλgtll中に導入される。次に、ファージプラークが、対象の抗体を用いて、又はポリクローナル抗血清を用いることによってスクリーンされ得る。他方では、AC133抗原タンパク質配列に由来する核酸配列によるプローブを可能にするクローニングシステムが使用され得る。次に、そのcDNA挿入物は、所望により、他のベクター中にサブクローン化される。cDNA は、完全な転写体のためのcDNAライブラリーのさらなるプロービングのために使用され得る。他方では、そのcDNA配列は、対象のタンパク質をコードするゲノム遺伝子を同定するためのゲノムライブラリーをプローブするために使用され得る（たとえば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，J．Sambrook ，E.F．Fritsch，T．Maniatis，CSHL，Cold Spring Harbor，NY，1989を参照のこと）。本発明のDNAは、AC133タンパク質又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、及び前記遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の調節に関与する隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列を包含し、そして成熟mRNA又はゲノムDNAの長さをほぼ含むであろう。従って、本発明は、単離された核酸分子を供給し、ここで前記分子は、（１）図１に示されるようなAC133のためのアミノ酸コード領域を有する第１配列（配列番号１）；（２）前記第１配列のサブ配列であり、そして少なくとも14個、好ましくは少なくとも17又は20個、より好ましくは少なくとも25個の長さのヌクレオチドである第２配列；（３）前記第１又は第２配列の少なくとも１つのヌクレオチドが異なったヌクレオチドにより置換されている第３配列；又は（４）前記第１、第２又は第３配列のいづれかに対して相補的な第４配列を含んで成り、但し、（ｉ）前記分子がRNA分子である場合、Ｕが前記分子中の前記配列においてＴを置換し、（ii）前記第３配列が前記第１又は第２配列に対して少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％同一であり、そして（iii）前記第２配列が、配列番号１のヌクレオチド347−667，1564 −1696又は2110−2386でない。また、本発明のDNAとして、イントロンを包含するその対応するゲノム配列が包含される。それらの非コード配列は、ターミネーター及びポリアデニル化配列、調節タンパク質結合配列、転写配列、及び同様の配列を包含する。十分な長さのAC133cDNA配列を含む分子は、結果物の源として、又はAC133分子自体の調製のための出発材料として有用である。 “サブ配列(subsequence)”とはcDNA配列からの連続するヌクレオチドのグループである。それらの配列のいづれかが、AC133遺伝子の存在（又は不在）、又はAC133抗原をコードするmRNAの発現の同定に使用され得る。そのようなサブ配列は、出発ヌクレオチドからの化学的合成（自動遺伝子合成機におけるように）により、又は十分な長さの配列の生化学的操作（たとえば、フラグメントを調製するために制限エンドヌクレアーゼを用いて、任意には、続いて、（１）末端ヌクレオチドの切断及びエキソヌクレアーゼ及び／又は（２）所望する配列を選択するためにサイズソーティング及び／又は親和性捕獲による）により調製され得る。使用される条件下で存在する他の核酸間でユニークである十分な長さの配列番号１に記載されるAC133 配列のいづれかのサブ配列は、ゲノムAC133遺伝子のすべて又は一部のポリメラーゼ鎖反応(PCR)増幅に使用される２つのプライマーの１つとして有用である。所望の標的配列とユニークにハイブリダイズするのに必要なサブ配列の長さは、使用される特定の方法により変化し、そしてその長さの選択は遺伝子材料の日常の同定を行なう当業者の範囲内である。好ましいサブ配列は、少なくとも15の長さのnt、より好ましくは少なくとも18のnt、さらにより好ましくは少なくとも19 ，20，21，25又は30の長さのntから、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の全長さまで、好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブとして使用される場合、200nt以下の長さ、又はPCRプライマーとして使用される場合、50nt以下の長さである。配列番号１のコード領域内の３個のサブ配列は、機能未知のEST'sとしてGenba nkにこれまで記録されている。従って、それらのGenbankサブ配列、すなわちヌクレオチド347−667，1564−1696及び2010−2386は、本発明のサブ配列としては請求されていない。さらに、配列番号１の３’非翻訳領域からの、又は機能未知の、特にヌクレオチド2684−3332及び3408−3804の領域における多くのESTがGen bankに存在する。それらの２つの領域からのサブ配列は、本発明の一部として請求されていない。Genbank配列の１又は複数の配列を含む、配列番号１として示される完全な配列の長い方のサブ配列、及び１又は複数のGenbank配列の一部を含むが、しかし配列番号１に示される新しく同定されたヌクレオチドをも含むサブ配列は、本発明の一部として見なされる。本発明の核酸組成物は、対象タンパク質のすべて又は一部をコードするゲノム又はcDNA配列であり得る。従来の方法に従って、たとえば制限酵素消化又はPCR 増幅によりオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって、cDNA又はゲノム配列のフラグメントが得られる。多くの場合、フラグメントは、少なくとも12 個のnt、より通常には少なくとも18個のnt、又は上記の他の長さの１つのものであろう。好ましいフラグメントは、機能的エピトープを含むであろう。機能的エピトープを供給する配列は、前記配列の発現、及び従来のイムノアッセイによる特異的抗体とのその発現生成物の反応性についてのアッセイにより決定され得る。本発明の典型的なアミノ酸及びDNA配列は、下記配列番号１及び２に示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸についての標準の略語が本明細書において使用される。天然のAC133抗原に由来するポリペプチドは本発明の特に好ましい態様であるが、しかしそれらのポリペプチドの特定の配列に基づく変動もまた、本発明の一部である。その広い観点においては、本発明は（それはポリペプチド自体に関係する場合）、（１）配列番号２に示されるAC133の第１アミノ酸配列；（２）第１配列のサブ配列であり、そして少なくとも６個、好ましくは８個、より好ましくは10個の長さのアミノ酸である第２アミノ酸配列；又は（３）前記第１又は第２配列中の少なくとも１つのアミノ酸が異なったアミノ酸により置換されている第３配列から成る群から選択されたいづれかのポリペプチドを包含し、但し、ここで前記アミノ酸置換は他の残基と１つの酸性残基との、他の残基と１つの塩基性残基との、他の残基と１つの非極性残基との、他の残基と１つの荷電されていない極性残基との、又は他の残基との１つの芳香族残基との置換であり、そして前記第３配列は、前記第１又は第２配列に対して少なくとも 90％、好ましくは95％の同一性を有する。２種のアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的な又は完全な同一性が存在する場合、相同である。たとえば、85％の相同性とは、それらの２種の配列が最大の適合性をもって一直線に並べられる場合にアミノ酸の85％が同一であることを意味する。ギャップ（適合される２種の配列のいづれかにおける）は、最大の適合性で可能にされる。５又はそれ以下のギャップが好ましく、そして２又はそれ以下のギャップがより好ましい。あるいは、そして好ましくは、２種のタンパク質配列（又は少なくとも30個の長さのアミノ酸の配列に由来するポリペプチド配列）は、それらが、突然変異データマトリックスと共に整列プログラムを用いての５以上（標準偏差単位において）の一列整列評点(alignment score)、及び６又はそれ以上のギャップペナルティ(gap penalty)を有する場合、相同である(Du yhoff，M.O.，Atlas of Protein Sequence and Structure，1972，vol．5，Nati onal Biomedical Rosearch Foundation，pp.101-110、及び補足２，pp.1-10)。それらの２種の配列又はその一部は、より好ましくは、それらのアミノ酸が、整列プログラムを用いて最適に一列整列される場合、50％以上の又は50％の同一性を有する場合、相同である。配列番号２に示される天然のアミノ酸配列からのマイナーなアミノ酸の変動は予期され；特に保存性アミノ酸置換が予期される。ある種類のアミノ酸内で生じるそれらのアミノ酸の保存性置換は、それらの側鎖に関連している。遺伝子的にコードされたアミノ酸は一般的に、次の４種の種類に分けられる：（１）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性：リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）荷電されていない極性：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは時々、芳香族アミノ酸として分類される。たとえば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離された置換、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の類似する置換は、特にその置換が、AC133又はその誘導体とAC133に対して特異的に結合する試薬との相互作用に関連する結合部位としてアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合特性に対して主要な効果を有さないであろうことを予測することが道理に合っている。アミノ酸の変化が機能的ペプチドに影響をもたらすかどうかは、そのペプチド誘導体の特異的結合性質をアッセイすることによって容易に決定され得る。図13に示されるように、AC133のペプチド構造体に異なる機能を有する多くの領域が存在する。それらの領域は、細胞外Ｎ−末端、第１トランスメンブラン領域、第１細胞質ループ、第２トランスメンブラン領域、第１細胞外ループ、第３トランスメンブラン領域、第２細胞質ループ、第４トランスメンブラン領域、第２細胞外ループ、第５トランスメンブラン及び細胞質Ｃ−末端として（アミノ末端により開始して）記載され得る。前記領域のおおよそのサイズが図13に示されており、そして異なる領域に存在するアミノ酸の最良の見積りは次の通りである：細胞外Ｎ−末端、aa 20-107；第１トランスメンブラン領域、aa 107-126；第１細胞質ループ、aa 127-1 57；第２トランスメンブラン領域、aa 158-179；第１細胞外ループ、aa 180-435 ；第３トランスメンブラン領域、aa 436-454；第２細胞質ループ、aa 455-480；第４トランスメンブラン領域、aa 481-503；第２細胞外ループ、aa 504-792；第５トランスメンブラン、aa 793-816；及び細胞質Ｃ−末端、aa 817-865。コードされたペプチドのアミノ末端で切断可能なシグナル配列(aa 1-19)が存在するように思え、この配列は、図13に示される領域の一部としては含まれないが、しかし合成的に生成されたAC133ペプチドに存在するであろう。また、AC133抗原及びグリコシル化部位（結合の点で“Ｙ”により示される）の構造を確かめるために同定された短いペプチドセグメント（Ｐ１−Ｐ４）のおおよその位置が図13に示される。図12はまた、グリコシル化部位（アミノ酸配列がボックスで囲まれている）及びトランスメンブラン領域（下線が引かれている）を示す。２つのグリコシル化部位はオーバーラップ（NNTS、オーバーラップするNNT及びNTSから成る）し、そして点線により大きなボックスで示されており、これは個々のコンセンサスグリコシル化部位を示す。 DNA 配列は、実質的な純度で得られ、そして損なわれていない染色体の配列以外の単離された分子として得られる。通常、DNAは他の核酸化合物を実質的に含まないで得られ、一般的には、少なくとも約50％、通常少なくとも約90％の純度であり、そして典型的には、“組換え”であり、すなわち天然の染色体上で通常関連しない１又は複数のヌクレオチドを両端に有する。 DNA 配列は種々の手段で使用される。それらは同じか又は他の種における関連する表面タンパク質を同定するためのプローブとして使用され得る。DNAはまた、対象の遺伝子を発現する細胞又は器官を同定するためにも使用され得る。特定のヌクレオチド配列、特にDNA，mRNA又はcDNAの存在について細胞をプローブする技法は、文献において十分に確立されており、そして本明細書においては詳しく記載する必要はない。便利には、mRNA はDNAを有さないで単離され得、そして逆転写酵素及び特定のプライマーによるP CRを用いることによって、興味ある対象のDNAが拡張され、ゲル電気泳動上で分離され、そして次に、サザンブロット又は配列決定を用いてプローブされ得る。他の技法もまた、使用され得る。相同配列は、本発明内に含まれるAC133抗原配列に対して実質的な配列類似性を有するものであり、すなわち対象のDNA配列のヌクレオチド配列と少なくとも8 0％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。配列類似体は、大きな配列のサブセットである対照配列、たとえば保存されたモチーフ、コード領域又はフランキング領域に基づいて計算される。対照配列は通常、少なくとも約18個の長さのnt、より通常には少なくとも約30個の長さのntであり、そして比較される完全な配列に延長することができる。そのような相同核酸配列は、低い緊縮条件下で、たとえば50℃及び10×SSC（0.9ＭのNa Cl／0.09Ｍのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションにより検出され、そして１×SSCによる55℃での洗浄にゆだねられる場合、結合されたまま存続する。発現のためには、DNA配列が適切な発現ベクター中に挿入され、ここで生来の転写開始領域又は外来性転写開始領域が使用され得る。プロモーターは、インビトロ組換え法により、又は染色体中への配列の相同組込みの結果として導入され得る。広範囲の種類の転写開始領域が広範囲の種類の発現宿主のために知られており、ここで発現宿主は、原核生物又は真核生物、特にＥ．コリ(E．coll)、Ｂ．サブチリス(B．subtilis)、哺乳類細胞、たとえばCHO細胞、サル腎細胞、リンパ球、特にヒト細胞系、及び同様のものを包含する。一般的に、発現宿主において作動する選択マーカーが存在するであろう。プロモーター、翻訳可能なmRNA転写体を生成するために、興味ある遺伝子のコード配列に操作可能的に連結され得る。発現ベクターは、異種タンパク質をコードする核酸配列を挿入するためにプロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。適切な発現ベクターにおけるプロモーターは、構成的又は誘導的のいづれかであり得る。外来性融合タンパク質が追加の機能性、たとえば高められたタンパク質合成、安定性、定義された抗血清との反応性、又は酵素マーカー、たとえばβ−ガラクトシダーゼを供給する、融合タンパク質の生成のためのプロモーターが特に興味あるものである。内因性又は外因性エンハンサー配列を包含するエンハンサー配列を有するか又はそれを有さない、構成的又は誘導的であり得る転写開始領域、AC133遺伝子又はそのフラグメント、及びポリＡ配列の結合のためのシグナルを操作可能的に有する転写終結領域を含んで成る発現カセットが調製され得る。遺伝子は、生来のイントロンを包含するゲノム、又はcDNA遺伝子、又はその一部であり得る。機能的エピトープの発現を可能にする配列、通常少なくとも約24個の長さのヌクレオチド、より通常には少なくとも約48個の長さのヌクレオチド、及び前記遺伝子中の完全な読取り枠までの配列の使用が特に興味あるものである。 DNAの導入の後、前記構造物を含む細胞が選択マーカーにより選択され、前記細胞が拡張され、そして次に、発現のために使用され得る。分泌が所望される場合、シグナルペプチドが、対象のタンパク質をコードする配列又はそのフラグメントに連結され、それにより、前記タンパク質が発現され、細胞膜を通してトランスロケートされ、そしてシグナルペプチドを除くために加工される。発現カセットは種々のベクター中に導入され得、ここで前記ベクターは通常、発現ベクターを含んで成る細胞の選択を付与する能力により特徴づけられるであろう。ベクターは、特に、真核細胞における細菌又はウィルス中のプラスミドとして、染色体外維持を、又は特に哺乳類細胞における組込みを提供することができる。染色体外維持が所望される場合、元の配列は、低い−又は高い−コピーのプラスミドであり得るプラスミドの複製を提供するであろう。広範囲の種類のマーカー、特に毒素に対して、より特定には抗体に対して保護するマーカーが、選択のために利用できる。選択される特定のマーカーは、宿主の性質に従って選択され、ここで多くの場合、相補性が栄養要求宿主、たとえば酵母により使用され得る。DNA構造体の導入は、いづれか便利な手段、たとえばカルシウム−沈殿されたDNA、エレクトロポレーション、融合；トランスフェクション、又はウィルスベクターによる感染によるものであり得る。次の例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。例体側性免疫化（Contralateral Immunization）によりAC133モノクローナル抗体の合成５匹のNew Zealand Black（NZB）マウスを、フィトヘマグルチニン(植物凝集素)(PHA)（Gibco/BRL）によりプレインキュベートされた、精製されたCD34陽性ヒト前駆細胞により、足肉証経路を通して、20日間にわたって合計７回、接種した。マウスを、多くの免疫優性ではあるが無関係の抗原を発現する細胞により、左脚の肉跳に３日目に予備免疫化した。この場合、末梢血液単核細胞（PBMC）を、それらが多くの抗原、たとえばクラスIHLA抗原、HLA- DR，CD15，CD26，CD29，CD31，CD36，CD44，CD45，CD58、等（また、造血幹細胞上に発現される）を発現するように、無関係の細胞として使用した。０日目、PB MCを、左脚肉趾中に再注射し、そして精製された幹細胞を右脚肉趾中に注射した。PBMC及び精製された幹細胞を、PHAと共に10分間、プレインキュベートし、そして注射の前、PBSにより洗浄した。前駆細胞を、免疫磁気ビーズを用いて、サイトカイン可動化されたドナーの白血球搬出パックから単離した。この処置は、非特異的アジュバント効果を付与し、そして必要なアジュバント、たとえばフロイントアジュバントを不必要にする。マウスに、３日間隔で合計５〜８回、そのような注射を行なう。最後の注射の後の１日目、すなわち21日目、マウス右手膝窩リンパ節を除去した。リンパ球懸濁液を調製し、そして細胞を、Kohler and Milstein（1975）Nat ure 256：495-497により始めに記載された方法の変法を用いて、SP２／OAg14骨髄腫細胞に融合せしめた。細胞を、10^-4Ｍのヒポキサンチン及び２μｇ／mlのアザセリンと共に、DMEM及び20％ウシ胎児血清を含む96ウェルプレート上にプレートした(Buckなど．（1984）Monoclonal Antiboudies and Functional Cell Line s ，Kennetなど．eds.，Planum Press,New York pp.275-309)。10日目、確認できるハイブリドーマコロニーが明白であった。ハイブリドーマを含むウェルからの上清液（ｓ／ｎ）を、２色流動細胞計測アッセイを用いて、15％までのCD34⁺細胞を含む胎児細胞調製物に対する結合についてスクリーンした。試験細胞へのマウスIgを含むｓ／ｎの結合性を、フィコエリトリンに接合されるラット抗−マウス−Ig（IgPE）により追跡し、そして既知のマウス抗−CD34抗体(AC101)接合体により対比染色した。図１は、AC13 ３上清液を用いてのこの２色FACS分析からの結果を示す。AC133は、胎児肝臓調製物において明るいCD34陽性細胞のみを染色することが示される。AC133ハイブリドーマ細胞は、IgG1／カッパ抗体を分泌することが示された。前記細胞を培養において拡張し、そしてストックを液体窒素により凍結した。AC133細胞を制限希釈分析によりサブクローン化し、そして一連の陽性分泌サブクローンをまた、液体窒素により凍結した。抗体の精製及び接合 AC133細胞を、ヌードマウスにおいて腹水腫瘍として最初に増殖せしめ、そして抗体に富む腹水を集めた。つい最近、AC133細胞は、中空繊維培養装置(Cellma x QUAD artificial copillary system，Cellco Inc.，Germantown，MD)において、非常に高い密度に増殖されている。純粋なIgG抗体を、中空繊維培養物又は腹水からプロテインＡクロマトグラフィーにより調製した。純粋な抗体を0.01％アジ化ナトリウムを含む0.01Ｍのリン酸緩衝溶液(PBS)に４℃で貯蔵した。この純粋な抗体ストックを用いて、フルオレセインイソチオシアネート（FI TC）(Wofs yなど．（1980）Selected Methods in Cellular Immunology，Mishelland Shiig i eds.，W.H．Freeman and Co.，San Francisco．pp.294-295)、フィコクリトリン（PE）(Hardy（1986）Handbook of Experimental Immunology，Weirなど.,eds ．Blackwell Scientific Press，Oxford．p.31)、又は磁気ビーズ接合体を、標準方法に従って調製した。正常組織及び細胞系でのAC133発現標準的FACS染色法を用いては、末梢血液単核細胞、顆粒球又は血小板、又はヒト臍帯静脈内皮細胞に、AC133抗体により検出できる染色は存在しなかった。FAC S分析によるヒト細胞系のパネルの試験（データは表１に示される）は、試験された３種のみの細胞系、すなわち網膜芽腫細胞系Ｙ79.1及びWERI−Rb-１及び奇形癌細胞系NT−２が検出できるレベルのAC133抗原を発現することを示した。表１．ヒト細胞系上でのAC133発現 PMAによるＹ79.1細胞の活性化は、AC133抗原の発現を高めることが見出された（図２に示される）。しかしながら、いくつかの他の細胞系のPMA活性化、又はヒトPBMCのPHA活性化は、AC133抗原の発現を誘発できなかった（データは表２に示される）。AC133抗原の発現は、試験されたCD34⁺細胞系上では検出できなかった。Ｙ79.1細胞系上でのCD34発現の欠失（図３に示される）と共に、この発見は、AC133がCD34抗原に向けられる可能性を除外する。AC133抗原の発現は、内皮及び線維芽細胞上でまた発現されるCD34抗原とは異なって、初期幹及び前駆細胞に制限される（Krauseなど．（1996）Blood 87：1-13）。 AC133抗原は、胎児及び成人骨髄、胎児肝臓、臍帯血、白血球搬出（LP）パック、及びサイトカイン移動された血液からのLPパックから単離されたヒト前駆細胞系のCD34^bright集団上で発現される。典型的には、それはそれらの集団におけるすべてのCD34⁺細胞の30〜50％を染色する。表２．細胞系の活性化 AC133 陽性細胞の表現型決定 AC133及びCD34二重陽性細胞の表現型決定を、前駆細胞上に発現することが知られている細胞表面構造体に向けられる接合された抗体のパネルを用いる２及び３色FACS分析を用いて行なった。胎児肝臓、胎児及び成人骨髄、臍帯血及び末梢血液を用いて、AC133陽性細胞の正確な表現型を決定した。それらの組織のすべてに見出されるAC133細胞は、CD34^bright，CD38^-/+及びHLA−DR^-/+である。データは図４に示される。CD90(Thy1)⁺及びCD117(ｃ−kit)⁺幹細胞は、図５に示されるようにAC133陽性集団に包含される。AC13３免疫磁気精製胎児肝臓細胞により行なわれた一連の実験においては、CD38−FITC接合抗体は、AC133精製細胞の74. 5％を染色し、そして残りの24.8％はCD38陰性であった。予測されるように、HLA −DRは細胞の大部分を染色した(81.14％)。CD90は、27.4％を染色することが示され、そしてCD117は90％を染色した。初期（再集団化する）の造血幹細胞はCD34^bright，CD38^dim/+，HLA-DR⁺，CD117^dim及びCD90⁺の表現型を有すると一般的に思われる。従って、AC133抗体は、ヒト造血前駆細胞の表現型的に重要な集団を認識する。AC133 抗原の免疫沈殿免疫沈殿実験は、AC133抗原が120KDの分子量を有することを示した。ビオチン（Pierce）ラベルされた、活性化Ｙ79.1及びWeri−RB−１細胞を次の成分を含む溶解緩衝液により溶解した：2.5％のBrij(Sigma)、25mMのトリス−HCl，pH8.0， 125mMのNaCl，2.5mMのEDTA，2.2μｇ／mlのアプロチニン(Sigma)及び１mMのPMSF (Sigma)。前記溶解物をAC133及び対照抗体と共に、安全性を前もって保証した後にインキュベートした。免疫複合体をスタフィロコーカスアウレウス(Staphyloc occus aureus)細胞(Cal Biochem)に対して集め、そして１％の２−メルカプトエタノールを含むSDS−PAGEサンプル緩衝液において95℃で５分間、加熱した。免疫沈殿物をSDS−PAGEにより分離し、そしてニトロセルロース膜(Novex)に移した。ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)（Amersham）及びSupersignal(Ｌ−H RP基質システム（Pierce）に対して結合されるストレプタビジンを用いて可視化せしめた。CD49d，CD71及びCD98を対照として用い、そして133KD，92KD及び80／ 40KDのそれらの予測されるバンドをそれらの対応するバンドにおいて観察した。 AC133による免疫沈殿は、120KDの分子量に対応する明確なバンドを示した。このバンドは、抗−CD34、抗体AC101，HPCA１及びHPCA２により免疫沈殿されたサンプルにおいては不在であり、このことは、CD34がＹ79.1細胞系において発現されないことを示唆する。これはFACSデータと一致する。さらなる実験からのデータが図６に示されており、ここで、ビオチンによりラベルされたＹ79.1及びKG1a細胞が同じゲル上でCD34及びAC133沈殿物を比較することによってAC133分子量データを確めた。この実験においては、CD34及びＹ79. 1抗原は、隣接するレーンにおける、ビオチル化されたKG1a（CD34⁺）及びＹ79.1 溶解物から沈殿せしめられた。前記結果は、１）個々の抗体がそれ自体の明確な抗原を沈殿せしめ、２）それらの２種の抗原の分子量が明らかに異なっており、それぞれ110及び127KDであることを明白に示す。対照レーン６及び８においては、HPCA２及び16D11(抗−CD34)は、KG1a溶解物からの110KDのバンドを沈殿せしめるが、しかしＹ79.1溶解物からのいづれのバンドも沈殿せしめない（レーン７及び９）。AC133はＹ79.1溶解物からの120KDタンパク質を沈殿せしめるが（レーン 10）、しかしレーン11においてKG1aの溶解物からのいづれも沈殿せしめなかった。レーン12において、KG1a及びＹ79.1溶解物は混合され、そしてAC133 Ag及びCD 34は同時沈殿せしめられた。それらの結果は、２種の抗原が異なった分子量のものであることを示す。 AC133 磁気ビーズ接合精製されたAC133抗体を、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン− １−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（SMCC）についての標準のプロトコールを用いて磁気アミノ−デキストランビーズに接合せしめた。AC13 3抗体を、OD₄₅₀単位当たり５μｇで、SMCC活性化されたビーズに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。反応を、β−メルカプトエタノール及びNEM の添加により停止せしめた。接合体を、磁場の存在下で２つのカラム上で精製し、そして溶離した。濃度をOD₄₅₀＝10に調整し、そしてOPGを安定化のために添加した。PBS及び0.1％アジ化ナトリウムにおける接合体を0.2μｍのフィルターを通して濾過し、そして４℃で貯蔵した。 AC133 磁気ビーズ接合体によるヒト造血前駆細胞の分離 AC133直接的磁気ビーズ接合体を調製し、そして淡黄褐色被膜PBMC、胎児肝臓W C１、胎児骨髄及び成人骨髄に対して試験した。図８は、miniMACSを用いてAC133 ビーズ接合体により精製され、そしてグリコホリンＡ−FITC及びHCPA２−PEにより染色された胎児肝臓細胞のFACSドットプロットを示す。出発材料は7.4％のCD3 4⁺細胞を含み、AC133精製に続いて、90％以上のAC133精製細胞は明るいCD34⁺であった。図９は、AC133磁気接合体が、約26％のCD34⁺細胞を含む淡黄褐色被膜からのCD34⁺細胞の富化においても非常に効果的であったことを示す。最終の精製された集団は、HPCA２−PE染色により示されるように、CD34に対して64％の陽性であった。磁気精製システムにおける細胞の分離能力は、AC133の機能的及び表現型的性質のさらなる研究を可能にする。 AC133 陽性細胞のクローン原性能力白血球搬出パックから精製された、AC133磁気ビーズ選択の細胞を、市販のキット(Stem Cell Technologies，Vancouver，B.C.)を用いてクローン原性アッセイにより試験した。組換えヒト成長因子を用いて、調節された成長環境を提供することによって、この培養アッセイは、CD34陽性細胞集団内の主要コロニー形成単位(CFU)を同定する。それは、特定の系統特異的分子に向けられる細胞の相対的百分率に関して、前駆細胞集団の比較に基づく情報を提供する。典型的には、末梢血液由来のCD34⁺細胞集団においては、BFU-ｅ（バースト形成単位−エリトロイド）及びCFU−GM（コロニー形成単位−顆粒球マクロファージ）が、認識される有力なコロニーであり、３：１の比で存在する。図10は分離白血球搬出パックから得られたAC133及びCD34精製された細胞を比較する典型的なクローン原性実験からの結果を示す。分別されていない対照細胞により得られたコロニーは典型的には主としてBFU−Ｅ(29.34％)であり、そしてCFU−GMは少数である（5.14％）。CD34 精製された細胞は、23.3％BFU−Ｅ及び5.58％のCFU−GMの類似する分布を示す。対照的に、AC133精製された細胞は、13.1％のBFU−Ｅ及び10.2％のCFU−GMの異なったパターンを示す。計算は、58％のCFU−GMがAC133精製された画分から回収され、そしてわずか13％のBFUEがその画分から回収されたことを示す。図11は、AC133免疫磁気精製に続いて得られた類似するクロン原性アッセイからの結果を示す。この実験においては、AC133細胞を陽性選択し、そして次に、C D34陽性細胞を、AC133陰性の流れから陽性選択した。この企画は、AC133⁺細胞（同じドナーからのものは除く）とCD34⁺との直接的な比較を示した。それらの結果は、CFU−GM前駆体の93.8％がAC133陽性画分に回収され、残りの6.2％がCD34⁺ ／AC133^-画分から回収されたことを示した。逆に言えば、CD34⁺AC133^-画分はBFU −ｅ前駆体の78.0％を含み、そして残りの22.0％がAC133⁺画分に得られた。上記実験結果は、抗−AC133抗体がFc受容体に対する抗体であり、又は抗−AC1 33抗体が、Fc受容体摂取を通して幹細胞に結合する可能性を除外する。さらなる実験は、AC133抗体染色が遊離PEによる可能性を除外する。AC133抗体は、RTK、すなわち受容体チロシンキナーゼ、TIE、すなわち、免疫グロブリン様ドメイン及び成長因子相同ドメインを含み、そして血管内皮細胞及び造血細胞において発現されるチロシンキナーゼに対する抗体のように挙動しない。AC133抗体はまた、Ｐ−糖タンパク質、すなわち造血細胞においてまた発現される170KDの複数薬物耐性生成物に対する抗体のように挙動しない。本発明者は、AC133抗体が、骨髄、胎児肝臓及び末梢血液における明るいCD34⁺ 細胞上でのみ発現される抗原を認識することを示した。この抗体及びその抗原は、いづれか既知のCD抗原の分子量又は分布に適合しない。幹細胞は別として、AC 133抗体は、CD34発現のために陰性であるヒト網膜芽腫細胞と反応することが示された。さらに、AC133抗原は、多くのCD34⁺細胞系上で発現されない。本発明は、初期幹細胞及び造血前駆細胞のサブセット上に見出される新規の抗原、及び前記抗原に対して特異的に結合する抗体を供給することが上記結果から明らかである。抗原の発現は高い組織特異性である。それは造血前駆細胞のサブセット上に単に検出され、そしてCFU−GMアッセイにおいて活性的である実質的にすべての細胞上に存在する。AC133抗原のこの高い特異的な分布は、ヒト造血前駆体及び幹細胞を単離し、そして特徴づけるための試薬として例外的に有用にする。 AC133 抗原の精製及び特徴づけ AC133抗原の精製及び特徴づけ、並びにcDNAクローンの単離が本明細書に記載される。この分子のタンパク質及び核酸配列分析は、AC133抗原が、既知のＧ− タンパク質結合の７種のトランスメンブランメンバーに対して、もし存在したとしても、低い相同性を有する５種のトランスメンブランドメインを有する新しい種類のトランスメンブラン受容体の最初に記載されるメンバーであることを示す。抗体AC133を、上記のようにして調製し、そして精製し、そしてCNBrにより活性化されたセファロースに接合した。CNBr活性化されたセファロースは、Pharma cia（Alameda，CA）から購入し、そしてmAB AC133親和性樹脂を、25分間のリガンドカップリング反応を用いて、製造業者の方法により調製した。COS−７及びWERI−Rb−１網膜芽腫細胞系を、American Type Culture Collection(Rockville，MD)から入手した。特注プライマーは、Operon Technologies（Alameda，CA）により合成した。 AC133 抗原の精製 AC133抗原を、96時間、PMAにより活性化されたＹ79網膜芽腫細胞（例えば、AT CCから市販されている）から単離した。細胞（２×10⁹）を、PBSにより洗浄し、そして0.125ＭのNaCl，25mMのトリス、pH８，0.005％のNaN₃，2.5mMのEDTA及び1 .0mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）及び１mg当たり４：１のトリプシンインヒビター単位を含むアプロチニンの2.2mg／ml溶液の１／1000希釈溶液(Sigma)を含む2.5％のBrij 99/96（２：１）界面活性剤溶液により溶解した。細胞を室温で５分間、断続的に回転せしめ、そして次に20分間、氷上に放置した。細胞核及び残骸を、12,000×Ｇで10分間の遠心分離により除去した。溶解物上清液を、洗浄緩衝液(0.125ＭのNaCl，25mMのトリス、pH8.0，0.01％のNaN₃，2 .5mMのEDTA，0.1％Brij)により平衡化された0.5mlのmAb AC133親和性カラム上への負荷の前、0.2μＭのフィルターを通して濾過した。カラムを洗浄緩衝液により広範に洗浄し、そして抗原を、50mMのエタノールアミン、pH11.5，0.1％のBri j，0.01％のNaN₃溶液に溶離した。pHをすぐに、HClにより中性に調節した。洗浄緩衝液により平衡化された300μｌの層体積のDEAEカラム上への抗原溶離液の通過により、汚染性タンパク質の多くを除去し、そして上記のようなAC133抗体カラムを用いての第２のアフィニティークロマトグラフィー処理段階は、タンパク質加水分解及びタンパク質配列決定分析に使用できる95％以上の純度のAC133抗原をもたらした。AC133抗原の純度及び同一性を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）及びウェスターン分析により確かめた（ Towbin，H.,T．Staehelin，and J．Gordon（1979）PNAS 76，4350-4354；Towbin ，H．and J．Gordon（1984）J．Immunol．Meth．７：313-340）。精製されたAC133抗原のエンドグリコナーゼ処理１μｇのAC133抗原を水50ml及び0.1Ｍの２−メルカプトエタノール及び0.5％S DS溶液125μｌに再懸濁した。タンパク質を５分間100℃で変性した。変性された混合物（35μｌ）を、0.5Ｍのトリス（pH８）25μｌ、水10μｌ、10％のNP-40(1 0μｌ)と共に５本の管の個々に添加した。０〜0.１単位のPNGアーゼＦ（Sigma）を個々の管に添加し、そしてそれらの管を30℃で一晩インキュベートした。解糖化された抗原を、銀染色されたSDS−ポリアクリルアミドゲル上で可視化した。 AC133 抗原のリシルエンドペプチダーゼ消化及びペプチドの単離 AC133抗原を、10％までのTCAの添加により２μｇ／mlの親和性カラム溶出液1. 4mlから沈殿せしめた。その沈殿された乾燥タンパク質を25μｌの消化緩衝溶液( ８Ｍの尿素、400mMのトリス、pH7.8)に懸濁し、これに45ｍのDTT５μｌを添加し、そしてその混合物を50℃で15分間インキュベートした。室温に冷却した後、10 0mMのヨードアセトアミド５μｌを添加し、そしてその混合物をさらに15分間インキュベートした。蒸留水（70μｌ）を添加し、尿素を２Ｍに希釈し、そして２ｐモルのリシルエンドペプチダーゼ、すなわちLysC（Wako Chemicals，USAから入手できる）を添加した。消化を37℃で24時間、行なった。ペプチドを、0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）における４〜32％アセトニトリルグラジエントを有するVYDACの狭い内孔のＣ18逆相カラム上でのHPLC分離により単離した。 AC133 抗原ペプチドのタンパク質配列分析Ｎ−末端配列分析を、Applied Biosystems 477A又は473A液体パルスタンパク質配列決定機上で、Edman化学(Edman，P.，Begg，G．（1967）Eur．J．Biochem ．1，80-91；Huwick，R.M.，Hunkapillar，M.W.，Hood，L.E.，and Dreyer，W.J ．（1987）J．Biol．Chem．256，p．7990)を用いて決定した。PTH−アミノ酸を、Applied Biosystemsからの２〜４％のABI Premix Buffer濃縮物の緩衝液Ｂ（アセトニトリル）への添加、12〜36％の緩衝液Ｂ線状グラジエントでの18分間にわたって、続いて36％Ｂでの13分間のイソクラティク（isocratic）期間を伴って、緩衝液Ａ(3.5％のテトラヒドロフラン)において55℃でBrownlee C-18逆相カラム(2.1mm×22cm)上で分離した。 AC133 抗原の単離及びタンパク質配列決定 120kDのAC133抗原を、収穫する96時間前、PMA活性化された網膜芽腫細胞系、すなわちＹ79からイムノアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。連続的なアフィニティークロマトグラフィー及びDEAEクロマトグラフィーを用いて、SDS-PAGE及び銀染色により95％以上の純度のAC133抗原を生成し、そしてAC1 33抗原としてのその精製された分子の同一性をウェスターンブロットにより確かめた。Ｎ−末端糖を除去するためにPGNアーゼＦによる前記抗原の解糖は、約30k Dの分子量が糖化によるものであることを示す。AC133抗原のＮ−末端を配列決定するための反復された初期の試みは失敗しており、このことは、このタンパク質がアミノ末端ブロックされることを示唆する。しかしながら、リシルエンドペプチダーゼによる精製された抗原の消化、続く逆相HPLC処理は、12〜16個のアミノ酸の長さを有する４種のペプチド配列を生成した。前記ペプチド及び得られる変性オリゴヌクレオチド配列による主要タンパク質及び核酸データベスの研究は、 AC133抗原がいづれか記載される分子により同定され得なかったことを示した。（そのアミノ酸配列は、現在、cDNA クローニングから推定されており、そして図12に示される。） cDNA クローニング全RNAをWERI-Rb-1網膜芽腫細胞（American Type Culture Collection，Rockvi lle，MDから入手できる）から単離し、そしてポリA⁺RNAを、ポリA⁺Tract System （Promega Corp.，Madison，WI）を用いて調製した。cDNAを、スーパスクリプト逆転写酵素（GIBCO BRL.，Gaithersburg，MD）及びオリゴdTプライマーを用いて合成し(Guebler，U．and B.J．Hoffman（1983）Gene 25：263)。ブラント末端化されたcDNAを、非自己相補性Bst XIアダプターに連結し、そしてゲル精製し、連結されていないアダプター及び小さなフラグメントを除去した。次に、連鎖されたcDNAを、pcDNA-I発現ベクター中にエレクトロポレートした(Invitrogen，San Diego，CA)中に連結し、そしてＥ．コリ株MC1061／P3(Dower，W.J．（1990）Gen etic Engineering V.12 Edited by J.K．Seflow，Plenum Press，New York 275- 295．(細菌のエレクトロポレーション：遺伝子情報に対する一般的なアプローチ )；Ausubel，F.M.，R．Brent，R.E．Kingston，D.D．Moore，J.G．Seidman，J.A ．Smith and K．Strahl．1987-1994 Current Protocols in Molecular Biology ． John Wilest Surs；N.Y.)。WERI-Rb-1 ライブラリーcDNA(100ng／反応)を、４種のAC133抗原ペプチドのタンパク質配列から企画された100ｐモルの個々の変性センス及びアンチセンスプライマーと共に、PCR鋳型として使用した。PCR反応を、反応当たり５単位のTaq DNAポリメラーゼ(Promega Corp，Madison，WI)により緩衝液（50mMのKCl、10mMのトリス、pH９、0.1％のTriton X-100、1.5mMのMgCl 、0.2mMの（個々の）dNTP）において行なった。増幅を次の通りに、 MJ研究（データ）装置において行なった：92℃で１分間、55〜37℃で１分間、72 ℃で３分間、35サイクル。増幅の後、その反応混合物を１％アガロースゲル上で試験し、個々のプライマー対照に出現しないユニークなバンドをゲル精製し、そしてTA Cloning Kit(Invitrogen，San Diego，CA)を用いてpCR2.1中にクローン化した。その遺伝子の５’及び３’末端を、一群の組のAC133抗原遺伝子特異的プライマー及びライブラリー特異的プライマーを用いて、半−特異的PCRにより単離した。20サイクルの一本鎖PCRを、５単位のTaqポリメラーゼを含むPCR反応緩衝液（上記）における100ngのライブラリーcDNA及び10ｐモルの個々のプライマーと共に、50μｌの反応体積において個々の遺伝子特異的プライマーを用いて行なった。この反応混合物のアリコート（10μｌ）を除去し、そして遺伝子特異的プライマー及びライブラリー特異的プライマーの両者を用いて、第２の35サイクルPCR反応のために鋳型として使用した。次に、このPCR反応混合物のアリコート（５μｌ）を、一群のライブラリー及び遺伝子特異的プライマーを用いてのさらなる35サイクルの反応のために使用した。前記遺伝子の５’及び３’末端に対応するバンドをゲル精製し、そしてpCR2.1中にクローン化した。オーバーラップするcDNAクローンを、螢光色素ターミネーター及びABI配列決定機(Applied Bios ystems，Foster City，CA)を用いて、ジデオキシ鎖反応により配列決定した。 AC133 抗原のcDNAクローンの単離このタンパク質のためのcDNAを単離するために、cDNAライブラリーを、PMA活性化されたＹ79細胞よりも約10倍、よりAC133抗原を発現するWERI-Rb-1網膜芽腫細胞系から調製した。変性プライマーを、前記ライブラリーとの低い緊縮性、PC R反応に使用し、５’末端でペプチド３の正しい配列及び３’プライム端でペプチド４の正しい配列を含む1.7kbのフラグメントを生成した。さらに、ペプチド２の配列を、正しい読取り枠におけるフラグメント内に見出した。遺伝子特異的プライマー及びライブラリー特異的プライマーによる半−特異的PCRは、その遺伝子の５’ 及び３’末端に対応し、そして初期1.7KBのクローンとオーバーラップする追加の1.2KB及び２KBフラグメントを生成した。３種の部分的クローンの配列決定は、3.0KBの読取り枠を含み、そして遺伝子のポリＡ⁺部分と関係しているように見え、そして真核生物のコンセンサススプライス配列を含まない128bpのイントロンをまた含む４KBのcDNAを生成した。イントロンを有さない、損なわれていない幹細胞由来のクローンを単離するために、AC133⁺幹細胞を、mAb AC133の磁気接合体、及びMiltenyi磁気分離システム（M iltenyi Biotech，GMBH）を用いて、胎児肝臓から単離した。全RNAをそれらの細胞から単離し、そしてRT-PCR反応のための鋳型として使用した。イントロンを拡張するよう企画されたプライマーは、ポリＡ⁺由来のcDNA鋳型を有する582bpの一本鎖フラグメントを生成し、そしてAC133⁺細胞系における全RNAからのイントロンを有さない454bpの一本鎖フラグメントを生成し（図３）、この事は、スプライスされたmRNAが全RNAプール内の主要生成物であることを示唆する。RT-PCRを用いて、開始メチオニンの前で始まり、そして完全なcDNA配列を含むcDNAクローンを生成した。AC133抗原をコードする十分な長さのcDNAは、96.8kDの分子量を有する863個のアミノ酸のタンパク質を予測する（図４）。前記配列の疎水性の分析（図５）及びトランスメンプランヘリックスアルゴリズムは、タンパク質が、２種の大きな(255及び280個のアミノ酸)細胞外ループ及びＣ−末端細胞質末端の存在を示す細胞膜を合計５倍に拡張する（図６）ことを示す。タンパク質配列により提供される他の構造的特徴は、推定上の大きな細胞外ループ及びＮ−糖化のための６種のコンセンサス配列の両者におけるロイシンジッパーモチーフを包含する。トランスフェクトされたCOS-7細胞におけるAC133抗原の発現 AC133陽性細胞(１×10⁷)を、上記のようにして胎児肝臓から単離した。全RNA を、Chomczynski，P．and Sacchi，N．（1987）Anal ．Biochem．162，156に記載のようにして、RNAzol(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)を用いて単離した。RT-PC Rを、10ngの全RNA鋳型、及び開始メチオニンの前及び停止コドンの後に指図されたプライマーと共にPromega Access RT-PCRシステム(Promega Corp,Madison，WI )を用いて実施した。遺伝子のコード領域に対応する2.8kbのバンドを、CMVプロモーターを含むInvitrogen指図の真核TAクローニングベクター（pCR3.1）中にクローン化した。副集密的COS-7細胞（ATCC，Rockville，MDから入手できる）を、エレクトロポレーションを用いて、５μｇのクローン化されたDNAによりトランスフェクトし、そしてFASS分析の前、48時間インキュベートした。トランスフェクトされたCOS-7細胞を、50ng／100μｌの試験mAb AC133-PEにより染色し、そしてBecton Dickerson（San Jose，CA）FACS走査により分析した。 COS 細胞におけるAC133抗原の発現 AC133抗原遺伝子によりトランスフェクトされたCOS細胞を、mAb AC133-PEにより染色し、そしてFACSにより分析した（図７）。AC133抗原遺伝子によりトランスフェクトされたCOS細胞はmAB AC133-PEにより明るく染色されたが、しかしながら、トランスフェクトされていない細胞、空のベクターによりトランスフェクトされた細胞、又はCD-8のための遺伝子はこの抗体により染色されない。種々のリンパ及び非リンパ細胞系におけるAC133発現種々の細胞系におけるAC133抗原転写体の存在を、ノザン分析により評価した。ノザンブロット分析を、Clontech（Palo Alto，CA）複合組織ノザンブロットを用いることによって、及び１％アガロース−２Ｍのホルムアルデヒドゲル上に RNAサンプルを溶解し、そしてナイロン膜中に一晩、細管ブロットすることによって実施した。全RNAをTri試薬により単離し、そしてその15μｇをレーン当たりに負荷した。メチレンブルーによるブロットの染色を、RNA濃度をモニターするために使用した。cDNAの800bp EcoRＩフラグメントを、³²P-dGTPにより、ランダムプライミングを用いてラベルし、そしてプローブとして使用した。種々の細胞系におけるAC133抗原転写体の存在を、ノザン分析により評価した。4.4KBのmRNA転写体が、WERI-Rb-1細胞及びＹ79細胞、並びにMACS−単離された AC133⁺胎児肝臓細胞に検出できた。AC133抗原の発現はPMA活性化に基づいてＹ79 細胞において増強されるが、その対応するmRNAはダウンレギレーションされるように思える。正常な造血組織においては、AC133抗原メッセージは、胎児鍛造に検出でき、そしてそれらの組織におけるAC133⁺細胞が少数で存在する事実により予測されるように、成人骨髄においては、弱く検出できる。AC133抗原転写体がまた、非リンパ組織、特に膵臓、腎臓及び胎盤においても示された。弱いシグナルが肝臓、肺、脳及び心臓に観察された。すなわち、パラフィン組織断片の免疫組織化学染色に対比する場合、AC133抗原の発現が骨髄においてのみ検出できた。類似する態様において、AC133抗原に対して特異的である他の抗体が開発された。次の表は、抗体、免疫原、イソタイプ、及びそのような抗体パネルのための交差阻止を示す。本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。前述の発明は、より理解を明確にするために例示的及び例的にいくらか詳細に記載されて来たが、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは、当業者に明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年７月３１日（１９９８．７．３１）【補正内容】請求の範囲 1. 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するAC133抗原に対して特異的に結合する抗体。 2. 前記抗体が、ハイブリドーマ細胞系により生成されるモノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載の抗体。 3. 前記抗体が、対側性免疫化を通して誘導される請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 4. 造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、又は両者の富化のための方法であって、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、又は両者を含んで成るヒト細胞の混合された集団と、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するAC133抗原に対して特異的に結合する試薬とを組合せ；そして前記試薬と結合する細胞を選択することを含んで成り；ここで前記選択された細胞が、前記ヒト細胞の混合された集団がそれぞれ、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、又は両者を含むかどうかに依存して、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞活性又は両活性について富化されることを特徴とする方法。 5. 前記ヒト細胞の混合された集団と、細胞表面マーカーCD90，CD117及びHLA -DRの少なくとも１つを特異的に認識する試薬とを組合せ；そして前記細胞表面マーカーの少なくとも１つに対して陽性である細胞を選択する；ことをさらに含んで成る請求の範囲第４項記載の方法。 6. 前記試薬が抗体又は抗体混合物である請求の範囲第４項記載の方法。 7. 前記抗体の少なくとも１つが、螢光色素接合される請求の範囲第６項記載の方法。 8. 前記螢光色素接合された抗体による前記選択がフローサイトメトリーによる請求の範囲第７項記載の方法。 9. 前記抗体の少なくとも１つが、磁気粒子に接合される請求の範囲第６項記載の方法。 10．前記磁気粒子接合された抗体による前記選択が高いグラジエントの磁気選択による請求の範囲第９項記載の方法。 11．配列番号２に示すアミノ酸配列を有するAC133抗原に対して特異的に結合する試薬に対して結合される実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 12．前記試薬がモノクローナル抗体である請求の範囲第11項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 13．前記前駆細胞がヒト胎児肝臓から得られる請求の範囲第11項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 14．前記前駆細胞がヒト末梢血液から得られる請求の範囲第11項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 15．前記前駆細胞がヒト骨髄から得られる請求の範囲第11項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 16．前記骨髄が成人の骨髄である請求の範囲第15項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 17．前記骨髄が胎児の骨髄である請求の範囲第15項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 18．配列番号１に示されるAC133のためのアミノ酸コード領域を有する配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る分子であって、但し前記分子がRNA 分子である場合、前記分子の配列においてＵがＴを置換している分子。 19．配列番号１に示されるAC133のためのアミノ酸コード領域に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る分子であって、但し前記分子がRNA分子である場合、前記分子の配列においてＵがＴを置換している分子。 20．配列番号１に示されるAC133のためのアミノ酸コード領域のサブ配列であり、そして少なくとも14個の長さのヌクレオチドである配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る分子であって、但し、（ｉ）前記分子がRNA分子である場合、前記分子の配列においてＵがＴを置換しており、そして（ii）前記配列が配列番号１のヌクレオチド347-667，1564-1696又は2010-2386でない分子。 21．請求の範囲第18〜20のいづれか１項記載の分子の配列に対して相補的な配列を含んで成る単離された核酸分子。 22．配列番号２に示されるAC133のアミノ酸分子をコードするDNAから実質的に成る単離された核酸分子。 23．請求の範囲第18項記載の核酸配列を含んで成る発現ベクター。 24．請求の範囲第23項記載の分子によりトランスフェクトされた細胞。 25．単離されたポリペプチドであって；（１）配列番号２に示されるAC133の第１アミノ酸配列；（２）前記第１配列のサブ配列であり、そして少なくとも６個のアミノ酸から成る長さを有する第２アミノ酸配列；又は（３）前記第１又は第２配列中の少なくとも１つのアミノ酸が異なったアミノ酸により置換されている第３配列を含んで成り；但し、前記アミノ酸置換が１つの酸性残基ともう１つの残基、１つの塩基性残基ともう１つの残基、１つの非極性残基ともう１つの残基、１つの荷電されていない極性残基ともう１つの残基：又は１つの芳香族残基ともう１つの残基との置換であり、そして前記第３配列が前記第１又は第２配列に対して少なくとも90％の同一性を有することを特徴とするポリペプチド。 26．前記ポリペプチドが前記第１配列を含んで成る請求の範囲第25項記載の単離されたポリペプチド。 27．前記ポリペプチドが前記第２配列を含んで成る請求の範囲第25項記載の単離されたポリペプチド。 28．前記ポリペプチドが前記第３配列を含んで成る請求の範囲第25項記載の単離されたポリペプチド。 29．リガンドに対して複合体化される請求の範囲第25項記載のポリペプチド。 30．前記リガンドが抗体である請求の範囲第29項記載のポリペプチド複合体。 31．単離されたポリペプチドであって、配列番号２の細胞外Ｎ−末端、aa 20- 107；第１トランスメンブラン領域、aa 107-126；第１細胞質ループ、aa 127-15 7；第２トランスメンブラン領域、aa 158-179；第１細胞外ループ、aa 180-435 ；第３トランスメンブラン領域、aa 436-454；第２細胞質ループ、aa 455-480；第４トランスメンブラン領域、aa 481-503；第２細胞外ループ、aa 504-792；第５トランスメンブラン領域、aa 793-816；又は細胞質Ｃ−末端aa 817-865のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。 32．ヒト造血幹細胞に対して結合するリガンドを同定するための方法であって、請求の範囲第25項記載のポリペプチドにより前記リガンドの結合性を検出することを含んで成る方法。 33．請求の範囲第25項記載のポリペプチドに対して特異的に結合する試薬。 34．前記試薬が、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体から成る群から選択される請求の範囲第33項記載の試薬。 35．前記試薬が、生理学的リガンド又は合成リガンドである請求の範囲第33項記載の試薬。 36．前記ポリペプチドがグリコシル化されてない請求の範囲第25項記載のポリペプチド。 37．前記ポリペプチドがグリコシル化されてる請求の範囲第25項記載のポリペプチド。 38．造血幹細胞上の抗原性マーカーに対するリガンドの選択的結合による幹細胞の同定に基づく細胞分離技法を用いて、前記幹細胞を単離するための方法であって；前記抗原性マーカーとして、そのアミノ酸配列が配列番号２に示されているAC 133抗原を用いることを特徴とする方法。 39．前記リガンドが抗体である請求の範囲第38項記載の方法。 40．前記リガンドが、前記AC133抗原の細胞外領域に結合する請求の範囲第38 項記載の方法。 41．前記細胞外領域が、配列番号２の細胞外Ｎ−末端、aa 20-107；第１細胞外ループ、aa 180-435；又は第２細胞外ループ、aa 504-792から選択されたアミノ酸を含んで成る請求の範囲第38項記載の方法。 42．前記リガンドが、試験化合物群中の化合物が前記AC133抗原に結合するかどうかを決定し、そして成熟血液細胞上に存在するいづれかの抗原と10％以下の交差反応性を有する、前記AC133抗原に対して特異的に結合する化合物間から前記リガンドを選択することによって同定される請求の範囲第38項記載の方法。 43．前記交差反応性が、前記リガンドがAC133への結合性を半−飽和する、AC1 33抗原及び前記リガンドの濃度を用いて、純粋なAC133抗原、前記リガンド、及び前記推定される交差反応性抗原の間の競争結合アッセイにより測定される請求の範囲第38項記載の方法。 44．請求の範囲第32項記載の方法により同定されるAC133のためのリガンド。 45．成熟血液細胞上に存在するいづれかの抗原と５％以下の交差反応性を有する、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するAC133抗原に対して特異的に結合する試薬。 46．前記試薬が、表面又は検出できるラベルに結合される請求の範囲第45項記載の試薬。 47．前記ラベルが螢光ラベルである請求の範囲第45項記載の試薬。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者イン，アミーアメリカ合衆国，カリフォルニア 95117, サンジョーズ，バンディアベニュ 397 (72)発明者バック，デビッドアメリカ合衆国，カリフォルニア 95054, サンタクララ，アトランティックコート 4246

Claims

【特許請求の範囲】 1. AC133抗原に対して特異的に結合する抗体。 2. 前記抗体が、ハイブリドーマ細胞系により生成されるモノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載の抗体。 3. 前記抗体が、ハイブリドーマ細胞系ATCC により生成される抗体による前記抗原に対しての同時結合を阻止する請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体。 4. 前記抗体が対側性免疫化を通して誘発される請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 5. ハイブリドーマ細胞系により生成される請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 6. 造血幹もしくは前駆細胞、又は両者の富化のための方法であって、造血幹もしくは前駆細胞、又は両者を含んで成るヒト細胞の混合された集団と、ハイブリドーマ細胞系ATCC により生成される抗体により認識される造血前駆細胞抗原に対して特異的に結合する試薬とを組合わせ；そして前記試薬を結合する細胞を選択することを含んで成り；ここで前記選択された細胞が、前記ヒト細胞の混合された集団がそれぞれ、造血幹もしくは前駆細胞、又は両者を含むかどうかに依存して、造血幹もしくは前駆細胞活性又は両活性において富化されることを特徴とする方法。 7. 前記ヒト細胞の混合された集団と、細胞表面マーカーCD90，CD117及びHLA -DRの少なくとも１つを特異的に認識する試薬とを組合わせ；そして前記細胞表面マーカーの少なくとも１つに対して陽性であるそれらの細胞を選択することをさらに含んで成る請求の範囲第６項記載の方法。 8. 前記試薬が抗体又は抗体混合物である請求の範囲第６項記載の方法。 9. 前記抗体の少なくとも１つが、螢光色素接合される請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記螢光色素接合された抗体による前記選択がフローサイトメトリーによる請求の範囲第９項記載の方法。 11．前記抗体の少なくとも１つが、磁気粒子に接合される請求の範囲第８項記載の方法。 12．前記磁気粒子接合された抗体による前記選択が高いグラジエントの磁気選択による請求の範囲第11項記載の方法。 13．ハイブリドーマ細胞系ATCC により生成される抗体により認識される造血前駆細胞抗原に対して特異的に結合する試薬に対して結合される実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 14．前記試薬がモノクローナル抗体である請求の範囲第13項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 15．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系ATCC により生成される請求の範囲第14項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 16．前記前駆細胞がヒト胎児肝臓から得られる請求の範囲第15項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 17．前記前駆細胞がヒト末梢血液から得られる請求の範囲第15項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 18．前記前駆細胞がヒト骨髄から得られる請求の範囲第15項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 19．前記骨髄が成人の骨髄である請求の範囲第18項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 20．前記骨髄が胎児の骨髄である請求の範囲第18項記載の実質的に純粋な造血前駆細胞集団。 21．単離された核酸分子であって；（１）図12（配列番号１）に示されるようなAC133のためのアミノ酸コード領域を有する第１配列；（２）前記第１配列の結果物であり、そして少なくとも14個の長さのヌクレオチドである第２配列；（３）前記第１又は第２配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが異なったヌクレオチドにより置換されている第３配列；又は（４）前記第１、第２、又は第３配列のいづれかに対して相補的な第４配列を含んで成り；但し、（ｉ）前記分子がRNA分子である場合、前記分子の配列においてＵがＴを置換し、（ii）前記第３配列が前記第１又は第２配列に対して少なくとも90％同一であり、そして（iii）前記第２配列が配列番号１のヌクレオチド347-667， 1564-1696又は2010-2386ではないことを特徴とする単離された分子。 22．前記分子が前記第１配列を含んで成る請求の範囲第21項記載の単離された分子。 23．前記分子が前記第２配列を含んで成る請求の範囲第21項記載の単離された分子。 24．前記分子が前記第３配列を含んで成る請求の範囲第21項記載の単離された分子。 25．前記分子が、AC133のアミノ酸配列をコードするDNAから実質的に成る請求の範囲第21項記載の単離された分子。 26．請求の範囲第21項記載の核酸配列を含んで成る発現ベクター。 27．請求の範囲第26項記載の分子によりトランスフェクトされた細胞。 28．単離されたポリペプチドであって；（１）配列番号２に示されるようなAC133の第１アミノ酸配列；（２）前記第１配列の結果物であり、そして少なくとも６個の長さのアミノ酸である第２アミノ酸配列；又は（３）前記第１又は第２配列中の少なくとも１つのアミノ酸が異なったアミノ酸により置換されている第３配列を含んで成り；但し、前記アミノ酸置換が１つの酸性残基ともう１つの残基、１つの塩基性残基ともう１つの残基、１つの非極性残基ともう１つの残基、１つの荷電されていない極性残基ともう１つの残基：又は１つの芳香族残基ともう１つの残基との置換であり、そして前記第３配列が前記第１又は第２配列に対して少なくとも90％の同一性を有することを特徴とするポリペプチド。 29．前記ポリペプチドが前記第１配列を含んで成る請求の範囲第28項記載の単離されたポリペプチド。 30．前記ポリペプチドが前記第２配列を含んで成る請求の範囲第28項記載の単離されたポリペプチド。 31．前記ポリペプチドが前記第３配列を含んで成る請求の範囲第28項記載の単離されたポリペプチド。 32．リガンドに対して複合体化される請求の範囲第29項記載のポリペプチド。 33．前記リガンドが抗体である請求の範囲第32項記載のポリペプチド複合体。 34．単離されたポリペプチドであって、配列番号２の細胞外Ｎ−末端、aa 20- 107；第１トランスメンブラン領域、aa 107-126；第１細胞質ループ、aa 127-15 7；第２トランスメンブラン領域、aa 1 58-179；第１細胞外ループ、aa 180-435；第３トランスメンブラン領域、aa 436 -454；第２細胞質ループ、aa 455-480；第４トランスメンブラン領域、aa 481-5 03；第２細胞外ループ、aa 504-792；第５トランスメンブラン領域、aa 793-816 ；又は細胞質Ｃ−末端aa 817-865のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。 35．ヒト造血幹細胞に対して結合するリガンドを同定するための方法であって、請求の範囲第８項記載のポリペプチドにより前記リガンドの結合性を検出することを含んで成る方法。 36．請求の範囲第28項記載のポリペプチドに対して特異的に結合する試薬。 37．前記試薬が、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体から成る群から選択される請求の範囲第36項記載の試薬。 38．前記試薬が、生理学的又は合成リガンドである請求の範囲第36項記載の試薬。 39．前記ポリペプチドが糖化されない請求の範囲第28項記載のポリペプチド。 40．前記ポリペプチドが糖化される請求の範囲第28項記載のポリペプチド。 41．造血幹細胞上の抗原性マーカーに対するリガンドの選択的結合による幹細胞の同定に基づく細胞分離技法を用いて、前記幹細胞を単離するための方法であって；前記抗原性マーカ１ーとしてAC133抗原を用いることを特徴とする方法。 42．前記リガンドが抗体である請求の範囲第41項記載の方法。 43．前記リガンドが、前記AC133抗原の細胞外領域に結合する請求の範囲第41 項記載の方法。 44．前記細胞外領域が、配列番号２の細胞外Ｎ−末端、aa 20-10 7；第１細胞外ループ、aa 180-435；又は第２細胞外ループ、aa 504-792から選択されたアミノ酸を含んで成る請求の範囲第41項記載の方法。 45．前記リガンドが、試験化合物群中の化合物が前記AC133抗原に結合するかどうかを決定し、そして成熟血液細胞上に存在するいづれかの抗原と10％以下の交差反応性を有する、前記AC133抗原に対して特異的に結合する化合物間から前記リガンドを選択することによって同定される請求の範囲第41項記載の方法。 46．前記交差反応性が、前記リガンドがAC133への結合性を半−飽和する、AC1 33抗原及び前記リガンドの濃度を用いて、純粋なAC133抗原、前記リガンド、及び前記推定される交差反応性抗原の間の競争結合アッセイにより測定される請求の範囲第41項記載の方法。 47．前記交差反応性が、モノクローナル抗体ATCC が50ng／100μｌの濃度で存在する場合、前記抗体を半飽和するAC133抗原の濃度で測定される請求の範囲第41項記載の方法。 48．請求の範囲第36項記載の方法により同定されるAC133のためのリガンド。 49．成熟血液細胞上に存在するいづれかの抗原と５％以下の交差反応性を有する、AC133抗原に対して特異的に結合する試薬。 50．前記試薬が、表面又は検出できるラベルに結合される請求の範囲第49項記載の試薬。 51．前記ラベルが螢光ラベルである請求の範囲第49項記載の試薬。