JP2000510232A - センサ及びこのセンサ用の改質した膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的試料に面する表面上に遊離基を備えた膜によって覆われた又はこの膜を含む計測面を有する、試料中の検体を計測するためのセンサを提供する。表面は、親水性成分の鎖が表面上の遊離基に化学的に結合されるように親水性成分を表面上に固定することによって改質してある。かくして、表面には、その未改質状態に対して大きな親水性が賦与されている。

Description

【発明の詳細な説明】 センサ及びこのセンサ用の改質した膜 本発明は、生物学的試料中の検体を計測するため、膜によって覆われた又はこ の膜を含む計測面を有するセンサに係り、計測されるべき検体が計測面に向かっ て前記膜を透過し、この膜が試料に面する表面上に遊離基（free group）を有し ている、センサに関する。 全血について計測を行うために使用されるようになったセンサ用の膜を選択す る上での一つの問題点は、膜材料によっては、血液蛋白質及び赤血球細胞等の血 液の高分子要素を膜の表面に粘着させる傾向がある表面特性を持つということで ある。これにより計測面がコーティングされた場合、再現性のある計測結果を得 ることができないため、センサの計測の品質が低下する。表面がコーティングさ れる傾向は、膜表面が親水性であるか或いは疎水性であるのかによって左右され る。これは、疎水性表面の方がコーティングされる傾向が高いためである。 試料に面する膜即ち材料の外膜がコーティングされる傾向を最小にすることに よって問題点の解決が試みられてきた。グルコース計測用バイオセンサに適用さ れた様々な外膜の分析が、分析科学「Analytical Sciences」の１９９４年第１ ０号の第４２３頁乃至第４２８頁のマツスゼブスキ Ｗ、トロヤノビクス Ｍ、 レーベンスタン Ａ、モスサイスカ及びラング−モロツ Ｅによる「希釈してい ない全血分析用の電流滴定式グルコース用バイオセンサ」に開示されている。こ の文献には、例えばポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレ ート、ポリプロピレン、等を適用することが開示されている。 この文献によれば、セラネーゼ（Celanese）から得られるポリプロピレン（Ｐ Ｐ）製の外膜を使用することによって良好な結果が得られる。前記膜の表面特性 は、通常は疎水性であり、従って、外膜として全く適していない。上文中の説明 を参照されたい。しかしながら、膜を親水性成分／界面活性剤で濡らすと、親水 性の表面特性が提供され、良好な結果が得られる。上記文献には、様々な親水性 成分／界面活性剤による湿潤が開示されている。ＰＰ膜をトリトン（Triton）Ｘ −１００という表示の界面活性剤で湿潤することによって最良の結果が得られる 。 湿潤プロセスは、適正には、ＰＰ膜を界面活性剤溶液中に１０分間に亘って浸 漬し、膜を蒸留水で濯ぎ、次いで膜にワイピング（wiping）を施すことによって 行われる。 全血について多数の計測を行った後ですら、外膜は赤血球細胞を吸着した徴候 を示さない。更に、２週間の期間内に計測信号の有意な変化が現れない。計測間 で、外膜は４℃の燐酸緩衝液中に保持される。 しかしながら、上記文献に記載されたセンサには、デンマーク国コペンハーゲ ンのラジオメータ・メディカルＡ／Ｓから入手できるＡＢＬ６２０分析機等の自 動分析機に適していないという欠点がある。これは、分析機が自動的に実行する 繰り返し濯ぎ工程（更に詳細には、各計測時に機器の駆動により行われる濯ぎ工 程）に外膜の表面処理が耐えることができないためである。これらの工程は、特 別の濯ぎ液によって行われる。親水性成分／界面活性剤が洗い流され、外膜の親 水性が徐々に失われる。これによって、膜表面のコーティングの再現性を劣化さ せ、及び／又は計測信号を減少させる。上文中の説明を参照されたい。 従って、本発明の目的は、コーティングされる傾向がなく繰り返し濯ぎ工程に 耐える、試料に面した膜を備えたセンサを提供することである。 この目的は、親水性成分の鎖が表面上の遊離基に化学的に結合されるように親 水性成分を表面上に固定することによって表面を改質し、かくして表面の親水性 をその未改質状態に対して高めたことを特徴とする本発明によるセンサによって 達成される。 親水性成分が膜の表面上の遊離基に化学的に結合しているため、センサの濯ぎ 工程を繰り返し行った後でも、親水性成分と遊離基との結合は外れることがない 。更に、このセンサは、親水性成分が化学的に結合された膜が、親水性成分で湿 潤させただけの膜よりも安定しているため、計測間で特別の貯蔵施設を必要とし ない。 本発明によるセンサは、計測面が簡単な接触膜によって覆われた又は接触膜を 含む任意のセンサであるのがよい。多くの場合、計測のために生物学的試料に適 用された全てのセンサを本発明に従って有利に具体化できる。このようなセンサ の例は、酸素、二酸化炭素、及びアンモニアを計測するためのセンサ等のガスセ ンサ、リチウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニ ウム、重炭酸塩、及び塩素を計測するためのセンサ等の電解質センサ、グルコー ス、コレステロール、乳酸塩、クレアチニン、尿素、カルバミド、ピルビン酸塩 、アルコール、ビリルビン、アスコルベート、燐酸塩、蛋白質、トリグリセリド 、フェニルアナニン、チロシン、及びヒポキサンチンを計測するための酵素セン サ及び免疫センサ等のバイオセンサである。 本発明によるセンサは、任意の適当な計測技術に基付くことができるので、例 えば、電気化学的原理又は光学的原理に基付くようにしてもよい。 本発明によるセンサは、主に試料に面した膜層が多孔質の二層膜又は多層膜を 持つ電気化学的（電流滴定）酵素電極である。試料に面した膜層の多孔度は、主 に、例えばデンマーク特許第１７０１０３号の明細書に開示されているように、 膜層がいわゆる基質限定膜層であるように選択される。 この明細書では、生物学的試料は、全血、血清、血漿の試料、又は、そのまま か若しくは処理した状態の体液の試料である。 試料に面した膜層（外膜層）の材料は、センサに適した全ての材料のうちから 選択され、これは、多くの場合、ポリマー製の薄膜である。選択は、特定の薬剤 の透過性に関する必要条件、抵抗、強度、等に関する必要条件に鑑みてなされる 。必要とされることは、膜がその表面上に遊離基を有し、これらの遊離基に親水 性成分を結合できるということだけである。前記遊離基は、膜に通常の状態で存 在するか或いは例えば基本的加水分解又は血漿処理によって加えることができる 。 様々な濯ぎ条件が親水性成分の選択に影響を及ぼす。親水性成分は、膜の小孔 に入り込んだ例えば血液成分を計測間にこれらの小孔から十分に洗浄できるよう に適合していなければならない。更に、小孔を計測間に十分に洗浄するため、親 水性成分の分子量を分析機の様々な濯ぎ条件に適合させる必要がある。 膜又は膜の部分の遊離基、例えば適当なカップリング試薬を含むカルボン酸遊 離基に結合できる特に好ましい親水性成分は、適当な鎖長さ及び分子量を持つポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヘパリンである。他の適当な疎水性成分又 は表面改質剤は、ＰＥＧと同様の供給改質力を持つ親水性天然ポリマー、例えば ヒアルロン酸、燐脂質、アガロース、キトサン、サイクロデキストリン、アルギ ン酸塩、コラーゲン、リグニン、ペクチン、及び多糖類、及びセルロースをベー スとしたポリマー、例えばデキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、酢酸 セルロース、アルブミン、ゼラチン、寒天、カラゲーニン、及びスターチ；ＰＥ Ｇと同様の供給改質力を持つ親水性合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール ／ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリジン、ヒドロキシメチルメタクリレ ート、ヒドロキシエチルアクリレート、アクリル酸、アリルアルコール、及びア クリル酸ポリマー（ヒドロゲル）；血漿重合ポリマー（アクリル酸樹脂）のうち から選択できる。この他に、センサとの調和能力（reconcilability）が仮定さ れる。親水性成分の鎖は、これらの成分が剪断力により膜の表面から外れる程長 くないということが重要である。 更に、多孔質膜又は膜層に関し、親水性成分の鎖が小孔を塞ぎ、かくして検体 が膜又は膜層を通過するのを阻止する程は長くないということが重要である。 本明細書中では、膜の表面の未改質状態は、親水性成分による改質を行う前の 状態である。これは、必ずしも天然の状態でなくてもよく、膜によっては、上文 中に説明したように、表面上に遊離基を付けるため、基本的加水分解又は血漿処 理を加えることができる。この場合には、未改質状態は、遊離基を付けた後の状 態であるが、親水性成分による改質を行う前の状態である。 好ましい実施例では、膜又は膜層は多孔質であり、親水性成分の鎖は膜の小孔 内に入っており、小孔の表面の遊離基に結合している。この場合、親水性成分を 選択するとき、鎖が小孔の表面上に配置された場合に小孔の断面積を過度に減少 することによって小孔を塞いで小孔に入り込む程長くてはならないということが 更に重要である。 本発明を添付図面を参照して以下に詳細に説明する。 第１図は、本発明によるセンサの断面図であり、 第１ａ図は、第１図の円筒形で囲った部分の拡大断面図であり、 第２図は、表面改質を行う前の本発明によるセンサの外膜の概略断面図であり 、 第３図は、表面改質後の本発明によるセンサの外膜の概略断面図である。 第１図のセンサは、グルコースを計測するためのセンサである。このセンサの 計測技術は周知である。これは、グルコース及び酸素を酵素によって過酸化水素 （Ｈ₂Ｏ₂）及びグリコニック酸（glyconic acid）に変換することに基づいてい る。次いで、発生した過酸化水素を電流滴定電極によって検出する。センサ１は 、血液試料を計測するための分析機、例えば、デンマーク国コペンハーゲンのラ ジオメータ・メディカルＡ／Ｓ社から入手できる上文中に説明したＡＢＬ６２０ 分析機内に置かれるようになっている。 センサ１の主要構成要素は、膜リング３に取り付けられた電極２である。この 電極２は、プラチナ製陽極４を含み、この陽極は、マイクロプラグ６を介して銀 製陽極接点７に接続されたプラチナ製ワイヤ５に接続されている。プラチナ製陽 極４及びプラチナ製ワイヤ５の一部は、ガラス製部品８に接着されている。ガラ ス製部品８とマイクロプラグ６との間では、プラチナ製ワイヤ５は、熱収縮性チ ューブ９によって保護されている。銀製管状基準電極１０がガラス製部品８の上 部分を取り囲んでおり、固定装置１１及びエポキシ１２によって基準電極１０の 内側に固定された陽極接点７まで電極２の長さに亘って延在している。ガラス製 部品８の下部分は、電極支持体１３によって取り囲まれており、ここに膜リング ３が配置されている。基準電極１０の上部分は、電極２を分析機（図示せず）の 対応するプラグに取り付け、ジャケット１５を固定するのに役立つプラグ部品１ ４によって取り囲まれている。電極２とジャケット１５との間には、電極２の計 測面に配置された電解質がセンサ１から蒸発しないようにするガスケット１６及 び１７が配置されている。 ジャケット１５の一端に取り付けられた膜リング３は、リング２０を含む。膜 ２１は、リング２０の下開口部の上方で延伸状態に保持される。第１ａ図に更に 明瞭に示す前記膜２１は、酢酸セルロース（ＣＡ）製の約６μｍの多孔質膜層２ ２を含み、この膜層上には架橋させたグルコースオキシダーゼからなる約１μｍ の酵素層２３が（膜毎に５単位）付着させてあり、この酵素層上にはポリエチレ ンテレフタレート（ＰＥＴＰ）製の約１２μｍの多孔質膜層２４が更に付着させ てある。膜２１は、膜リング３を取り付けたときにＣＡ膜層２２が電極２のプラ チナ陽極４と対面するように配置される。 ＰＥＴＰ膜層２４は、拡散制限膜として役立つ。拡散制限膜は、試料から、酵 素変換が行われるグルコースオキシダーゼ層２３を透過するグルコースの量を、 変換を行う上で常に利用できる十分な酸素量よりも小さくする。ＰＥＴＰ膜層の 製造方法の一例を以下に説明する。 グルコースオキシダーゼ層２３での変換後、形成された過酸化水素はＣＡ膜層 ２２を透過してプラチナ製陽極４に至り、ここで酸化を行い、これによって検出 される。プラチナ製陽極４には、Ag/AgCl基準電極に関して＋６７５mVの極性が 与えられている。 ＣＡ膜層２２は、過酸化水素を透過させるが、存在した場合に計測結果に影響 を及ぼすパラセタモル（paracetamol）、ＨＥＰＥＳ、及びアスコルビン酸等の 酸化性薬剤を透過させない干渉排除膜として役立っ。 グルコースオキシダーゼ層２３を付着させたＣＡ膜層２２は、周知の方法で、 例えばイエロースプリングス・インストルメント社の米国特許第３，９７９，２ ７４号の明細書に記載された方法で形成されている。 第２図は、表面を改質する前のＰＥＴＰ膜層２４の断面の概略図を示す。断面 は膜層２４の一つの小孔２５のところで示してある。明瞭化を図るため、断面は 幾分変形させてある。この図からわかるように、膜層２４は、その表面上に−Ｃ ＯＯＨ遊離基２８及び−ＯＨ遊離基２９の夫々を備えている。これらの遊離基は 、膜層の外面２６、２７上並びに小孔２５の表面上に存在する。 第３図は、第２図と対応するが、表面改質後のＰＥＴＰ膜層２４を示す概略図 である。この図からわかるように、ポリエチレングリコール鎖３０が、膜層の− ＣＯＯＨ遊離基（第２図の２８）に固定されている。鎖３０は、センサ２の計測 面が血液試料と接触したときに鎖が水性環境中に「溶解」し、鎖の「アマモ（ee lgrass）」状の動きにより例えば血液蛋白質等の高分子が膜層２４の表面と接触 してこれをコーティングすることがないようにする長さを有する。 例１ グルコースセンサ用改質ＰＥＴＰ膜層の製造 ＰＥＴＰ膜層は、以下の仕様の二軸延伸したＰＥＴＰ薄膜（ベルギー国ルヴェ ンラニューブのホワットマンＳ．Ａ．から入手できるマイラーＡ）から製造され る。 厚さ ： １２μｍ±１μｍ 孔密度： １．６×１０⁶個／cm²（公称密度） 孔径 ： 約０．１μｍ （公称孔径） 空気流： ０．７バール（１０psi）で１．６ml／分／cm² ＰＥＴＰは、特に、良好な抵抗及び強度に対する必要条件に基づいて、膜材料 として選択された。以下の配合物の親水性成分の溶液によって、ＰＥＴＰ材料に 表面改質を施した。 ＰＥＧ−２００−（ＯＨ）₂ １０ｇ ＣＭＣ−ＭＴＳ ２ｇ トリトン ＣＦ−５４ ０．２ｇ ｄｅｍｉｎ．Ｈ₂Ｏ ４０００ml ｐｈ ６．０−６．５ ここで、 ＰＥＧ−２００−（ＯＨ）₂は、テトラエチレングリコールの最小含有量が２ ０％で、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、及びペンタエチ レングリコールの最小含有量が６０％の、平均分子量が２００g/molの、二つの 水酸基を持つポリエチレングリコールであり、 ＣＭＣ−ＭＴＳは、９５％の１−シクロヘキシル−３−（２モルフォリノエチ ル）カルボジイミド−メソ−ｐ−トルエンスルホネート（カップリング試薬）で ある。 ＰＥＴＰを切ってシートにし、各シートをフレームに固定する。ＰＥＴＰシー トを備えたフレームを、親水性成分を入れた反応浴中に室温で約１８時間に亘っ て浸漬する。次いで材料を室温で約１５分間に亘って攪拌しながら、脱イオン水 中で０．１％トリトンＸ−１００で洗浄し、脱イオン水中で攪拌しながら二度洗 浄する。これらの洗浄は夫々約１０分間に亘って行われる。最後に、材料をドラ フトチャンバ内で室温で少なくとも１６時間に亘って乾燥させる。この改質中、 ＰＥＧ−２００からなる鎖を、多孔質表面を持つＰＥＴＰ材料の表面に、この表 面上の−ＣＯＯＨ遊離基へのエステル結合によって固定する。 表面を改質したＰＥＴＰ材料を切断してウェーハ形状にし、これらを予め製造 したＣＡ膜層２２／グルコースオキシダーゼ膜層２３と一緒にする。これで、膜 ２１は、膜リング３に取り付ける準備ができる。 上述の方法で製造した膜は、特に良好な耐久性を示し、作動中の分析機に配置 した場合に少なくとも３０日間に亘って耐えることができる。 膜表面のＰＥＧ−２００鎖は、ヒドロゲルとして機能できるので表面を非粘着 質にすると同時に、極性があり且つ非反応性となるようにし、かくして、鎖がな い場合に血液蛋白質が表面上に付着物を形成する可能性をなくす。 例２ 親水性成分の選択 安定した計測について最良の改質膜を提供するＰＥＧを見つけるプロセスの間 、様々な種類のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（主に分子量が異なる）で、 且つ僅かに異なる方法で改質したＰＥＴＰ膜を製造する。全血試料について前記 膜の各々を使用した１０回の計測から得られた計測結果を、改質を施していない 膜及びＭｅＯＨ中で洗浄した膜から得られた計測結果と互いに比較する。結果を 以下の表１に示す。 この表からわかるように、上述の方法に従ってＰＥＧ−２００−（ＯＨ）₂で 改質したＰＥＴＰ膜が完全に最良の結果をもたらすことが明らかである。水酸基 を一つだけ有するＰＥＧ−２００−ＯＭｅが多くなればなる程、膜表面がコーテ ィングされる傾向が強くなる。更に、ＰＥＧの分子量が大きくなるに従って、計 測結果がより減少する傾向があるということがわかる。 分子量が２００g/mol乃至２０００g/molの範囲のＰＥＧについては実験を行わ なかったが、分子量が２００g/molを僅かに越える、おそらくは１０００g/molま でのＰＥＧがＰＥＴＰ膜の改質に適していると評定される。更に、分子量が２０ ０g/mol以下、例えば１００g/molのＰＥＧもまた適していると評定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリステンセン，イェスパー・スヴェニン グ デンマーク王国デーコー―2800 リュング ビュ，ウールリッケンボア・プラス ５, ２ テーホー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1． 生物学的試料中の検体を計測するためのセンサであって、膜（２１）によ って覆われた又はこの膜を含む計測面を有し、計測されるべき検体は前記計測 面に向かって前記膜を透過し、この膜（２１）は、前記試料に面する表面（２ ６）上に遊離基（２８、２９）を備えている、前記センサにおいて、 親水性成分の鎖（３０）が前記表面（２６）上の前記遊離基（２８）に化学 的に結合されるように前記親水性成分を前記表面（２６）上に固定することに よって前記表面（２６）を改質し、かくして前記表面（２６）の親水性をその 未改質状態に対して高めた、ことを特徴とするセンサ。 2． 前記膜（２１）は、一方の表面（２６）から他方の表面まで延在する小孔 （２５）を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のセンサ（１）。 3． 前記膜（２１）は二層又は多層の膜であり、前記試料に面した膜層（２４ ）は、層の一方の表面（２６）から層の反対側の表面（２７）まで延在する小 孔（２５）を有する、ことを特徴とする請求項２に記載のセンサ（１）。 4． 前記親水性成分の鎖は、前記膜（２４）の前記小孔（２５）に入り込んで おり、前記小孔（２５）の表面上の前記遊離基（２８）に結合されている、こ とを特徴とする請求項２又は３に記載のセンサ（１）。 5． 前記試料に面した前記膜層（２４）は、ポリエチレンテレフタレートを含 む、ことを特徴とする請求項１乃至４のうちのいずれか一項に記載のセンサ（ １）。 6． 前記親水性成分は、ポリエチレングリコールである、ことを特徴とする請 求項１乃至５のうちのいずれか一項に記載のセンサ（１）。 7． ポリエチレングリコールからなる鎖（３０）は、前記膜層（２４）の−Ｃ ＯＯＨ遊離基（２８）に結合されている、ことを特徴とする請求項６に記載の センサ（１）。 8． センサ（１）で使用するための、遊離基（２８、２９）を備えた表面（２ ６）を持つ膜（２１）において、 親水性成分の鎖（３０）が前記表面（２６）上の前記遊離基（２８）に化学 的に結合されるように前記親水性成分を前記表面（２６）上に固定することに よって前記表面（２６）を改質し、かくして前記表面（２６）の親水性をその 未改質状態に対して高めた、ことを特徴とするセンサ。 9． 前記膜（２１）は、一方の表面（２６）から他方の表面まで延在する小孔 （２５）を有する、ことを特徴とする請求項８に記載の膜（２１）。 10．前記膜（２１）は二層又は多層の膜であり、前記試料に面した膜層（２４） は、層の一方の表面（２６）から層の反対側の表面（２７）まで延在する小孔 （２５）を有する、ことを特徴とする請求項９に記載の膜（２１）。 11．前記親水性成分の鎖は、前記膜（２４）の前記小孔（２５）に入り込んでお り、前記小孔（２５）の表面上の前記遊離基（２８）に結合されている、こと を特徴とする請求項９又は１０に記載の膜（２１）。 12．前記試料に面した前記膜層（２４）は、ポリエチレンテレフタレートを含む 、ことを特徴とする請求項８乃至１１のうちのいずれか一項に記載の膜（２１ ）。 13．前記親水性成分は、ポリエチレングリコールである、ことを特徴とする請求 項８乃至１２のうちのいずれか一項に記載の膜（２１）。 14．ポリエチレングリコールからなる鎖（３０）は、前記膜層（２４）の−ＣＯ ＯＨ遊離基（２８）に結合されている、ことを特徴とする請求項１３に記載の 膜（２１）。 15．前記膜は、主に円形の膜リング（３）によって延伸状態に保持される、こと を特徴とする請求項８乃至１４のうちのいずれか一項に記載の膜（２１）。 16．前記膜リング（３）は、電極（２）に取り付けられるようになった手段 （１５）に連結されている、ことを特徴とする請求項１５に記載の膜（２１） 。