JP2000511432A

JP2000511432A - ｐＩｇＲ茎部および結合リガンドの細胞内在化

Info

Publication number: JP2000511432A
Application number: JP10500584A
Authority: JP
Inventors: イーモストヴ、キース; リッチマン―アイゼンスタット、ジャニース
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1997-05-14
Publication date: 2000-09-05
Also published as: US6340743B1; AU3063297A; EP0934338A4; EP0934338A1; CN1221428A; IL127238A; ATE338065T1; WO1997046588A1; EP0934338B1; IL127238A0; RU2191781C2; US6042833A; CA2256304A1; AU728587B2; DE69736602D1

Abstract

(57)【要約】生理的条件下でリガンドは重合体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の分泌性部分とは実質的に結合しないということを条件に、細胞のｐＩｇＲの茎部と特異的に結合する組成物および茎部に特異的に結合させる方法。リガンドは細胞を標的とするか、細胞内または細胞を通過して標的に向かい、さらに生物学的に活性な成分を含む。

Description

【発明の詳細な説明】ｐＩｇＲ茎部および結合リガンドの細胞内在化発明の分野本発明は一般に、細胞内への内在化または細胞を貫通する輸送のために重合体免疫グロブリンの茎部領域にリガンドを特異的に結合させることができる組成物および方法に関する。発明の背景製薬および生物医薬工業が直面している最も興昧深い問題の１つは、体内の種々の半透膜を通過して治療薬を体内輸送することである。特に巨大分子の場合、費用効率の障害または便利な治療に対する障害は、しばしば適切な薬物送達システム（drug delivery system）が欠如することによる。結局、この問題は薬剤の製造が経済上実現可能であるか否かを決定する。したがって、代わりの送達システムを探索することは、しばしば新薬それ自体の探索に匹敵する。遺伝子伝達の手法は、巨大分子薬物送達の典型例と考えることができる。これらの方法は３つのカテゴリー、物理的（例えば電気穿孔(electroporation)、直接遺伝子伝達および粒子衝撃）、化学的（例えばプロテイノイド類、マイクロエマルジョンおよびリポソーム）および生物学的（例えばウイルス由来ベクターおよびレセプター仲介取り込み）方法に分類できる。生物学的伝達方法のうち、レセプター仲介取り込みが特に将来有望なアプローチである。リガンドをエンドサイトーシスによつて取り込まれたレセプターに標的化することは、該リガンドを細胞内に輸送する手段としての機能をもつ。しかしながら、レセプター仲介システムの欠点の１つは、そのようなシステムは一般的に静脈内投与に依存するということであり、そのことはそれらシステムの利用を極めて制限する。粘膜上皮細胞は容易に近づくことができる組織に存在し、例えば上気道および胃消化管に見出される。これらの細胞の接近容易性によって、該細胞は薬物送達のための有用な標的になる（例えば、Ferkolら、J．Clin．Invest．92:2394-240 O(1993);Ferkolら、J．Clin．Invest．95:493-502(1995)を参照のこと）。管腔内表面の上皮細胞から基底外側表面の上皮細胞に抗体を逆方向輸送することが、非常に低レベルではあるが報告されている。Breitfeldら、J．Cell Biology，10 9:475-486(1989)。この研究では、細胞を通過する移動は、重合体免疫グロブリンレセプター(polymeric immunoglobulin receptor，pIgR)の分泌性成分に抗体を結合させることによってもたらされた。基底外側から先端部への輸送レベルについて、Breitfeldらは、輸送物の５％未満だけが逆方向性であることを報告している。逆輸送のレベルがこのように極めて低いため、分泌性成分を生物学的に活性な組成物を細胞内に送達する手段としての有用性は最小限のものになる。さらにまた、管腔内に切断ｐＩｇＲが豊富であるために、細胞表面の完全なｐＩｇＲよりむしろ切断ｐＩｇＲにリガンドが結合し、それによって薬物送達機構としてのｐＩｇＲの逆輸送の有用性が低下するであろう。したがって、当業界で必要とされているものは、高効率でリガンドを細胞表面へ又は細胞表面を通過して輸送する手段である。より具体的には、当業界で必要とされているものは、胃消化管または気道に並ぶ細胞へ又は該細胞を通過して巨大分子を送達する手段である。発明の要旨ある面として、本発明は、細胞の重合体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の茎部と特異的に結合するリガンドに関する。但し、該リガンドは生理的条件下でｐＩｇＲの分泌性成分と実質的に結合しないということを条件とする。典型的には、該抗体は該茎部とのみ特異的に結合する。ある態様として、該リガンドは、抗体、好ましくはヒトに適応させた抗体である。他の態様として、該リガンドは、抗体の組換え一本鎖可変領域フラグメントである。また他の態様として、該リガンドは、該レセプターの切断部位に近接する細胞膜である細胞外エピトープと最初の33個のアミノ酸内で結合する。リガンドは、茎部と結合するための結合成分と、生物学的に活性な成分、例えば核酸、タンパク質、脂質および炭水化物とを含んでいるのがよい。生物学的に活性な成分は、抗炎症物質、抗感染性物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗生物質および抗感染性物質を含む。ある態様として、生物学的に活性な成分は、野生型嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス調節因子をコードする核酸である。好ましい態様として、細胞は上皮細胞で、最も好ましくはホ乳類の上皮細胞であるのがよい。他の面として、本発明は、生理的条件下ではリガンドが実質的に重合体免疫グロブリンレセプターの分泌性成分とは結合しないということを条件に、該重合体免疫グロブリンレセプターの茎部に該リガンドを固着させることによってｐＩｇＲを発現する細胞に該リガンドを導入する方法に関する。ある態様では、リガンドは細胞の先端表面で該茎部に固着し、さらに別の態様では、リガンドはトランスサイトーシスによって細胞の基底部外側表面に運ばれ、基底部外側で茎部から遊離される。さらに他の面として、本発明は、重合体免疫グロブリンレセプターを発現する細胞にリガンドを固着させる方法に関する。該方法は、生理的条件下ではリガンドは実質的にｐＩｇＲの分泌性成分とは結合しないということを条件に、レセプターの茎部にリガンドを結合させる工程を含む。ある態様では、リガンドは結合後細胞に導入される。本発明の他の態様は、本発明の種々の面を参考にして誘導されるであろう。インビボおよびインビトロでの種々の用途の中でとりわけ、本発明を用いて、治療用または診断用組成物を粘膜上皮細胞内に又は該細胞を通過して輸送することができる。したがって、本発明は、核酸またはタンパク質を上皮細胞内に運搬する、高効率で便利な手段を提供する。好ましい実施態様の説明本発明は、細胞の重合体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の茎部と特異的に結合するリガンドに関する。但し、該リガンドは、生理的条件下でｐＩｇＲの分泌性成分と実質的に結合しないことを条件とする。とりわけ、本発明は、ｐＩｇＲ発現細胞にリガンドを固着させる方法および該細胞にリガンドを導入する方法を提供する。上皮細胞の先端表面に輸送された後、ｐＩｇＲの大半は切断され分泌性成分が遊離される。驚くべきことであり、かつ予想に反して、完全なｐＩｇＲが管腔内で切断されることによってｐＩｇＲの残留細胞外領域（すなわち“茎部”）は完全なままで残され、さらに、管腔内環境に典型的に存在する豊富なプロテアーゼにもかかわらず、該茎部は結合に利用できる状態にあることが見出された。ｐＩｇＲ茎部にリガンドを結合させる能力、ｐＩｇＲ茎部に結合したリガンドをエンドサイトーシスによって取り込む能力およびトランスサイトーシスによって輸送する能力は、部分的に、本明細書に開示し且つ請求の範囲に記載した発明の一部分を提供する。本発明は、ｐＩｇＲを発現する細胞内へ（エンドサイトーシス）または当該細胞を通過して（トランスサイトーシス）治療用組成物または診断用組成物を輸送する手段としての用途を有する。したがって、本発明を用いて、生物学的に活性な組成物（例えばタンパク質、核酸または検出可能標識）をｐＩｇＲ発現細胞に特異的に輸送することができる。本発明はまた、病理学的研究において、混合細胞集団から上皮細胞を標識し且つ区別する手段を提供する。さらに、ｐＩｇＲ発現は正常な上皮と比較して癌腫で減少するので、ｐＩｇＲの標識は、内視鏡または放射線利用方法において診断補助としての利用性を有する。さらにまた、ｐＩｇＲに治療用リガンドを結合させることによって、管腔内におけるそれらリガンドの存続時間が種々の輸送方法において延長され、それらの有効性を高める上で有用性を有する。定義本明細書で特記しない限り、使用される全ての技術用語および科学用語は、当技術分野に属する通常の技術を有する者が一般に理解する意昧と同じ意昧を有する。Singletonら、”Dictionary of Microbiology and Molecular Biology”第２版(1994)、John Wiley and Sons(ニューヨーク)およびHale & Marham，”Harp er Collins Dictionary of Biology”(1991)、Haper Perennial(ニューヨーク) は、本発明で用いる用語に関して一般的な辞典として有用であろう。アミノ酸は、本明細書では一般的に知られている３文字記号で表されるか、またはIUPAC-IU B生化学命名審議会が推奨する１文字記号で表される。同様に、ヌクレオチドは一般的に許容されている１文字コードで表される。本発明の目的のために、以下の用語は下記のように定義する。 “リガンド”または“リガンド結合部分”は、重合体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）と特異的に結合することができる全ての分子を意味する。リガンドには抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質および炭水化物が含まれるが、これらに限定されるものではない。 “生物学的に活性な成分”とは、細胞の転写、翻訳、レセプター結合、能動的もしくは受動的輸送、細胞シグナル発生、シグナル誘導、細胞分裂、細胞分化、細胞死、細胞粘着、細胞運動、細胞形態、代謝、酵素活性、アポプトシス、タンパク分解、タンパク移動（例えば分泌）、タンパク安定性またはリン酸化における増加または減少をインビボで直接惹起しまたは抑制する化合物を指す。生物学的に活性な成分はまた、前述の事象を評価することができる診断組成物を含む。 “特異的に結合する”または“固着する”とは、リガンドが特定の標的分子をもつ細胞または組織と、全体的または部分的に、優先的に結びつき、そのような標的分子を欠く細胞または組織とは結びつかないことを意昧する。もちろん、ある程度の非特異的相互作用が、分子と非標的細胞または組織との間でも生じることは理解されるところである。にもかかわらず、特異的な結合は、標的分子の特異的認識によって仲介されるものとして区別することができる。典型的には、特異的結合は、送達された分子と標的分子をもつ細胞との間で、そのような標的分子を欠く細胞との結合よりもはるかに強い結びつきを生じる。特異的な結合は、標的分子またはマーカーを欠く細胞または組織の場合と比較して、当該標的をもつ細胞または組織と結合するリガンドの量（単位時間当たり）で典型的には２倍、好ましくは５倍、より好ましくは10倍、最も好ましくは100倍の増加をもたらす。 “茎部(stalk)”とは、重合体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の細胞外成分を指し、これは、分泌性成分を構成するｐＩｇＲのセグメントが切断された後、細胞と結合するｐＩｇＲの領域と一致する。茎部は、分泌性成分に対応するｐＩｇＲのセグメントが切断されるか否かにかかわらず存在する。 “ｐＩｇＲ”または“重合体免疫グロブリンレセプター”とは、粘膜上皮細胞、即ち気道上皮細胞、粘膜下腺細胞、消化管細胞、鼻上皮、乳房、口腔粘膜、尿管および生殖管上皮並びに結膜組織を含む粘膜上皮細胞で発現され、二量体免疫グロブリンＡ（ｄＩｇＡ）および／または五量体ＩｇＭの基底外側から先端部へのトランスサイトーシスによる輸送に関係するレセプターを指す。 “実質的に結合しない”とは、標的分子に特異的に結合するリガンドの15％以下が特定の非標的分子と結合する場合をいう。より好ましくは、10％以下が非標的分子と結合し、より好ましくは５％未満が、さらに最も好ましくは１％未満が非標的分子と結合する場合をいう。 “分泌性成分”とは、基底外側から先端部へのトランスサイトーシスの後に一般に切断されるｐＩｇＲの細胞外部分を意昧する。典型的には、分泌性成分は、ｐＩｇＲの二量体ＩｇＡ（ｄＩｇＡ）結合部分を含む。分泌性成分は典型的には、該分泌性成分と結合したｄＩｇＡと共にまたはそれを伴わないで管腔内に遊離される。 “生理学的条件”とは、対象の細胞の維持または成長を可能にする条件（例えば温度、ｐＨ、および浸透圧）を有する細胞外環境を意味する。 “抗体”とは、体液反応のインビトロまたはインビボでの発生によって得られる免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。一般にこの用語はまた、例えばキメラ抗体（例えばヒトに適応させたネズミ抗体）、異種結合抗体（例えば二特異性抗体）および組換え一本鎖Ｆｖフラグメント（scFV）のような遺伝子工学によって得られる形態を含む。“抗体 ”の語はまた、抗体の抗原結合形態（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）₂）を含む。 “セトに適応させた抗体”とは、非ヒトアミノ酸配列を含むが、その定常領域がヒトでの免疫原性を減じるように改変された抗体を指す。 “野生型嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス調節因子”とは、嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）の機能型を指す。Riordanら、Science ，245:1066-1073(1989)。 “先端表面”とは、完全なｐＩｇＲがエンドサイトーシスの後で基底外側表面からトランスサイトーシスによって運ばれる細胞表面を指す。一般に、細胞の先端表面は管腔に隣接し、そこで完全なｐＩｇＲは切断され分泌性成分が遊離される。 “基底外側表面”とは、小胞内で合成され、ゴルジ複合体を通過した後、完全なｐＩｇＲが体内に送り出される細胞の表面を指す。 “茎部の表面”とは該茎部の細胞外領域を指す。 “遊離される”とは、リガンドとその標的分子との全体的または部分的な固有の結びつきにおける干渉を指す。 “トランスサイトーシスを受ける”または“トランスサイトーシス”とは、細胞のある形質膜から別の形質膜へ細胞内ルートを経て輸送されることを指す。典型的には、トランスサイトーシスは、細胞の基底外側から先端形質膜へまたは先端から基底外側形質膜へと発生する “細胞膜近接”とは、細胞膜に隣接しているかまたは近いこと指す。 “細胞外”とは、細胞を取り囲む脂質二重層から外側に広がる領域を指す。ｐＩｇＲの同定重合体免疫グロブリンレセプターの核酸配列およびアミノ酸配列が、分類学的に多様な種で同定されている。Piskurichら、Journal of Immunology 154:1735- 1747(1995)を参照のこと。他の種のｐＩｇＲの同定も当技術分野で周知のいずれの方法を用いても達成できる。例えば、公表されたｐＩｇＲの配列を用いてｐＩｇＲに対する核酸プローブを構築できる。このプローブは、典型的にはｐＩｇＲの保存領域から誘導されなければならない。プローブとゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーションを用いて未知の種のｐＩｇＲを同定することができる。ｐＩｇＲプローブの核酸配列は、一般に調べられている種に最も近縁の種の配列でなければならないということは当業者には理解されよう。核酸のハイブリダイゼーションについて詳しい解説は、Tijssen(1993)，「生化学と分子生物学の実験室手技：核酸プローブとのハイブリダイゼーション(Lab oratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes)」第一部、第二章“ハイブリダイゼーションの原理の概観と核酸プローブのアッセイ方法（Overview of principles of hybridizat ion and the strategy of nucleic acid probe assays)”、Elsevier刊、ニューヨークに見出される。また別のアプローチでは、ｐＩｇＲまたはそのペプチドフラグメント（例えば分泌性成分）を用いて抗体を作製し、発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。Ferkolら、J．Clin．Invest.，95:493-502(1995)を参照のこと。これらの方法および当業者に周知の他の方法は、例えばBerger & Kimmel，「分子クローニング技術(Guide to Molecular Cloning Techniques)」、Methods in En zymology，152巻、Academic Press，Inc.，刊、サンデイエゴ、カリフォルニア( Berger);Sambrookら、(1989)「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」第２版、１−３巻；および「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、F.M．Ausubelら篇、Current Protocols，Green Publishing Associates，Inc.およびJohnWiley＆S ons，Inc.,との共同事業(1994付録)(Ausubel)で見出されるであろう。核酸またはタンパク質がｐＩｇＲをコードすることを確認するために、ｐＩｇＲタンパク質と推定されるタンパク質に対する抗体を作製し、ｐＩｇＲの特性（例えば上皮細胞の表面に存在する、二量体ＩｇＡまたは五量体ＩｇＭと結合する、など）を有するタンパク質とこれらの抗体が結合できることを確認してもよい。茎部の同定茎部は当業者に周知の多様な技術によって同定できる。ｐＩｇＲの切断部位を同定し、それによって該茎部のアミノ末端の範囲を明らかにする推定ヘプタペプチドコンセンサス配列が同定されている。Phe-Ala-Xaa-Gluなる配列(配列番号：１)(ここでＸａａは極性アミノ酸または荷電アミノ酸)がこの推定切断部位の直前にあるものとして同定された。Piskurichら、Journal of Immunology 154:173 5-1747(1995)。このコンセンサス部位での切断によって分泌性成分が遊離され、そのカルボキシ末端が明らかにされる。分泌性成分のカルボキシ末端は二次的切断事象（例えばエキソペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼ活性）によって変化し、第二のカルボキシ末端を生じるであろう（上掲書）。しかしながら、該茎部のアミノ末端および分泌性成分のカルボキシ末端の範囲を最初に限定するアミド結合は、配列アラインメントおよび該切断コンセンサス配列の同定によって同定することができる。比較のための配列アラインメントを実施する方法は当技術分野では周知である。比較のために最適な配列アラインメントは、Smith & Waterman，Adv．Appl．Mat h.，2:482(1981)の局所相同アルゴリスム；Needleman & Wunsch，J．Mol．Biol. ，48:443(1970)の相同アラインメントアルゴリスム：Pearson & Lipman，Proc． Natl．Acad．Sci．USA，85:2444(1988)の類似性探索法；これらアルゴリスムのコンピュータによる実行(PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics，マウンテンビュー、カリフォルニア）、ウィスコンシン・ジネティクス・ソフトウェア・パッケージのGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA(Genetics Computer Group( GCG)，575 Science Dr.，マジソン、ウィスコンシン、アメリカ)を含むが、これらに限定されるものではない)によって実施できる。CLUSTALプログラムがHiggin s & Sharp，Gene，73:237-244(1988)；Higgins & Sharp，CABIOS，5:151-153(19 89)；Corpetら、Nucleic Acids Research，16:10881-90(1988)；Huangら、Compu ter Applications in the Biosciences 8:155-65(1992);Pearsonら、Methods in Molecular Biology，24:307-31(1994)に詳しく記載されている。アラインメントはまたしばしば精査と人力による並べ替えによって実施される。また別のアプローチでは、分泌性成分は先端管腔内の液体（例えば乳汁または胆汁）から単離し、当技術分野で周知の方法（例えばエドマン分解または質量分光測定法）を用いてアミノ酸の配列決定によって配列を決定できる。Elffertら、Hoppe-Seyer's Z．Physiol．Chem.，365:1489-1495(1984)。二次的切断事象によって限定された種々の二次的カルボキシ末端の中で、とりわけ該切断部位に隣接するカルボキシ末端のアミノ酸を同定できる。選択種のｐＩｇＲ茎部に対応するペプチドは以下を含む。マウス：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala- Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys(配列番号２)、ラット：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala- Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(配列番号３) 、ヒト：Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Se r-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-G1n-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg(配列番号：４) 、ウシ：Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gl y- Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(配列番号５)、ウサギ：Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp- Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly- Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys(配列番号６)。ｐＩｇＲを発現する細胞本発明は広く真核細胞に関連する。本発明のｐＩｇＲ発現細胞は好ましくはホ乳類細胞で、より好ましくは、通常ＩｇＡを分泌するホ乳類の上皮細胞である。１つ以上の所望の種から単離するか、合成するかまたは他の方法によって誘導したｐＩｇＲをコードする核酸をホ乳類細胞にトランスフェクトさせることができる。ホ乳類細胞にトランスフェクトし、遺伝子を発現させる方法は、当技術分野において既知である。ウイルスベクターによる細胞の形質導入は、例えば、感染を惹起するのに必要な条件および濃度でウイルスの宿主範囲内の細胞とウイルスをインキュベートすることが必要である。Methods in Enzymology，185巻、（D. V．Goddel編）、Academic Press，Inc.，刊、サンディエゴ、カリフォルニア(19 90);M．Krieger，「遺伝子伝達と発現：実験室マニュアル(Gene Transfer and E xpression--A Laboratory Manual)、StocktonPress刊、ニューヨーク、ニューヨーク(1990)およびこの中で引用された文献を参照のこと。本発明で用いることができる細胞培養には、細胞株および当技術分野で周知の組織または血液サンプルから得られる培養細胞が含まれる。フレッシュニー（Fr eshney）の「動物細胞の培養：基礎技術マニュアル（Culture of Animal Cells ，a Manual of Basic Technique）」、第３版、Wiley-Liss刊、ニューヨーク(19 94)）及びこの中で引用された文献は、細胞の培養について一般的な手引を提供するであろう。所望の種から得られるｐＩｇＲをコードする核酸配列は、イーストを含む種々の真核ホスト細胞、並びにＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞系およびミエローマ細胞系の他にＭＤＣＫおよびヒト大腸癌由来細胞(例えばCaco2) で発現させることができる。組換えタンパク遺伝子は、各々のホストのために適切な発現制御配列に機能的に連結される。真核細胞のためには、この制御配列はプロモータおよび好ましくはエンハンサー（例えば免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどに由来する）、ポリアデニル化配列を含み、さらにスプライスドナーおよびアクセプター配列を含むことができる。リガンドの茎部への結合個々の茎部結合リガンドは本発明にとって重要ではなく、種々のリガンドを用いることができる。リガンド、例えば核酸、タンパク質もしくはペプチド（ひとまとめにして“ペプチド”）、または抗体、または所望の特異的な結合特性をもつ小型の有機物もしくは無機物（例えば米国特許第5,143,854号明細書；WO90/15 070号；WO92/10092号；WO96/11878号）は、当技術分野で周知である。好ましくは、本発明のリガンドは、生理的条件下で、ｐＩｇＲの分泌性成分と実質的に結合することなく該茎部に結合するであろう。より好ましくは、本発明のリガンドは、生理的条件下で茎部にのみ特異的に結合する。典型的な生理学的条件は組織間で変動するであろう。しかしながら、代表的な生理的条件はホ乳動物（ヒトが含まれるが、ただしヒトに限定されない）の胃消化管または気道で認められるものである。リガンドは、茎部の膜近接アミノ酸の最初の６、９、12、15、18、21 、24、27、30または33内に含まれる細胞外リガンド結合部位（“エピトープ”）と結合するように選択される。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は組換え一本鎖Ｆｖ抗体を含む抗体は、本発明のリガンドとして用いるのに構築できる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である。例えば、Coliga n，「免疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)」(Wiley/Gre ene刊、ニューヨーク(1991)); Harlow & Lane，「抗体：実験室マニュアル(Anti bodies:A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Press刊、ニューヨーク( 1989);Sitesら編、「免疫学の基礎と臨床(Basic and Clinical Immunology)」（第４版、Lange Medical Publications刊、ロサンゼルス、カリフォルニア）およびその中に引用されている文献;Goding，「モノクローナル抗体：原理と実際(Mo noclonal Antibodies:Principles and Practice)」(第２版、Academic Press刊、ニューヨーク、ニューヨーク(1986));およびKohler & Milstein，Nature，256 :495-497(1975)を参照のこと;Huseら、Science，246:1275-1281(1989));及びWar dら、Nature，341:544-546(1989)を参照のこと。Birch & Lennox，「モノクローナル抗体：原理と応用（Monoclonal Antibodies:Principles and Applications）」（Wiley-Liss刊、ニューヨーク、ニューヨーク(1995)）。抗体またはペプチドリガンド調製のための他の適切な技術には、ファージまたは同様なベクターの組換え抗体／ペプチドのライブラリーの選択が含まれる。ファージ・ディスプレー法を用いてファージ表面に組換え一本鎖Ｆｖ（csFv）フラグメントまたはペプチドリガンドを発現するることによって、茎部に対して高い親和性を有する抗体およびペプチドを迅速に単離することができる。簡単に記せば、ファージの表面タンパク質をコードする遺伝子を改変し、抗体またはペプチド遺伝子の挿入を可能にする。これら挿入抗体またはペプチド遺伝子は、該遺伝子を含むファージの表面に融合タンパク質として発現される。所望の抗体またはペプチドリガンドを発現するファージを選択的に富裕化させ、該茎部に対するその親和性／結合活性を利用して単離できる。該リガンドをコードするＤＮＡは同じファージにパッケージされ、これによってリガンドをコードする遺伝子の単離が可能になる。そのような種々の方法は文献で十分に考察され、さらに当業者には周知である。例えば、Winterら、Annu．Rev．Immunol.，12:433-455(1994)；M arksら、J．Mol．Biol.，222:581-597(1991);Vaughanら、Nature Biotechnology ，14:309-314(1996);米国特許第4,642,334号；同4,816,397号；同4,816,567号；同4,704,692号；WO86/01533号；WO88/09344号；WO89/00999号；WO90/02809号；W O90/04036号；EP 0 324 162号；EP 0 239400号を参照のこと。ペプチド化学合成では、“分割、連結および再結合”（ＤＣＲ）と称される工程を用いて、組み合わせ式ペプチドライブラリーを製造している。Furkaら、Int ．J．Pept．Protein Res．37:487-493(1991)及びHoughtenら、Nature，354:84-8 6(1991)を参照のこと。またＤＣＲの代替として、モノマー混合物の直接連結によってペプチド混合物が製造されている。Rutterら、来国特許第5,010,175号を参照のこと。他の直線状ポリマーの混合物、例えば“ペプトイド”を製造するためにそのような方法を使用することが提唱されている。Simonら、Proc．Natl．A cad．Scl．USA，89:9367-9371(1992)を参照のこと。オリゴヌクレオチド合成では、オリゴヌクレオチド生成物の“縮退”または“ゆらぎ（wobble）”混合物は、例えば合成時の特定の工程でオリゴヌクレオチドポリマーに等モルのモノマー混合物を供給することによって製造できる。Atkinson & Smith，「オリゴヌクレオチド合成、実際的アプローチ(Oligonucleotide Synthesis．A Practical Ap proach)」（M．Gait編、pp35-81，IRL Press刊、オックスフォード）を参照のこと。ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを合成するこれらの方法は、活性がある場合には容易に同定することができる、多くの試験用化合物を提供する。好ましくは、リガンドは、例えばリガンドに存在する自己配列の数を最大限にすることによって、ホストにおける免疫原性を最小にするように構築されるであろう。したがつて、非外因性可変領域を有するキメラ抗体が好ましい。特に好ましいのは、外因性部分が除去されるか、またはヒトに適応させた抗体の場合のように本質的に相補性決定領域に限定された抗体を使用するものである。リガンドの結合と試験ｐＩｇＲの茎部へのリガンドの結合（すなわち固着）は、分泌性成分の切断前または切断に続いて発生し、該リガンドは基底外側表面または先端表面に固着される。したがって、リガンドは基底外側からもしくは先端からエンドサイトーシスによって取り込まれるか、またはトランスサイトーシスによって先端から基底外側へもしくは基底外側から先端へと運搬される。リガンドまたはその一切の成分の運命は、したがってその物理化学的性状にしたがって変動するであろう。したがって、細胞表面で、エンドソーム内で、またはトランスサイトーシス後に所望の機能を果たすようにリガンドの特性を選択またはデザインすることができる。例えば、タンパク分解性または還元性環境に対するリガンドの感受性を変化させて、細胞に結合したリガンド、細胞内に内在化したリガンドまたは細胞を通過して運搬されたリガンドの分布を決定するのに用いてもよい。所望の場合には、リガンドは、固着後もしくはトランスサイトーシス後、また別には細胞外環境に遊離された後に細胞に特異的に結合したままであるようにデザインしてもよい。したがつて、リガンドの種々の成分（結合成分、生物学的活性成分またはリンカーを含む）のいずれかの特性は、様々な程度の親和性、安定性または種々の細胞内区画もしくは種々の細胞表面における活性を望ましいものにするためにデザインまたは選択することができる。Ａ．リガンド結合の生体外試験茎部へのリガンドのインビトロ結合は、ホ乳類上皮細胞で結合リガンドのエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスを測定することによって簡便に評価することができる。一般に“エンドサイトーシス”とは、例えば食作用または飲作用によって物質を取り入れる細胞現象を指す。レセプター仲介エンドサイトーシスは、細胞表面レセプターと結合する物質を細胞に取り込ませる有効な手段を提供する。Wu & Wu，J．Biol．Chem.，262:4429-4432;Wagnerら、Proc．Natl．A cad．Sci．USA，87:3410-3414；及びEP-Al 0388 758号を参照のこと。エンドサイトーシスをアッセイする周知のいずれの方法も結合の評価に用いることができる。例えば結合、トランスサイトーシスおよび内在化アッセイは、Breiftfeldら、J．Cell Biol.，109:475-486(1989)に詳細に記載されている。先端エンドサイトーシスは、Ｆａｂフラグメントのようなリガンドを茎部とMa din-Darbyネコ腎（ＭＤＣＫ）細胞の先端表面で４℃で結合し、短時間（０〜10 分間）、37℃に温め、さらに再び４℃に細胞を冷却することによって、簡便に測定することができる。ＭＤＣＫ細胞でのｐＩｇＲの発現方法は、当技術分野では周知である。Breiftfeldら、Methods in Cell Biology，32:329-337(1989)。表面に残留するＦａｂは、ｐＨ2.3で剥離させて除去する。細胞内Ｆａｂは剥離後に細胞に結合したままのものである一方、表面結合Ｆａｂは酸洗浄によって除去されたものである。非特異的粘着のためのコントロールには、免疫前Ｆａｂおよび／またはｐＩｇＲをトランスフェクトしていないＭＤＣＫ細胞の使用が含まれる。トランスサイトーシスは、ＭＤＣＫ細胞をＦａｂとその先端表面で４℃で結合させ、０〜240分間、37℃に温め、その後基底外側の培養液中に輸送供給されるＦａｂ量を測定することによって、容易に評価することができる。基底外側から輸送供給されるＦａｂを、細胞と結合したままのＦａｂ（細胞内または酸剥離）および先端の培養液中に遊離されたＦａｂの合計と比較する。または、トランスサイトーシスは、細胞を先端培養液中でＦａｂに持続的に暴露し、基底外側培養液中でのＦａｂの蓄積を測定することによって、評価することができる。この方法は細胞の冷却を回避するが、リガンドの一群の輸送速度諭を提供しない。双方の方法において、Ｆａｂの分解は、トランスサイトーシスによって輸送されたＦａｂの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、抗ニワトリ抗体でウエスタンを調べることによって、評価することができる。非特異的輸送（例えば液相エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシス、または細胞間での隣接細胞漏出による）を、ｐＩｇＲをトランスフェクトされていないＭＤＣＫ細胞および／または免疫前Ｆａｂを用いることによって、コントロールすることができる。Ｂ．リガンド結合のインビボ試験インビボでのトランスサイトーシスは、病原体を持たない実験動物、例えばスプラーク・ドーリー（Spraque-Dawley）ラットを用いて簡便に評価できる。標識リガンド（例えば放射性ヨウ素付加抗体）を鼻道に投与することができる。当業者には理解されるように、“標識”は分光計によるか、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁気的、放射能化学的、または化学的手段（例えば蛍光、化学蛍光、または化学ルミネセンス）に検出できる組成物である。先端から基底外側へのトランスサイトーシスは、標識の存在によって測定されるように、血液循環中へのリガンドの輸送供給を測定することによって容易に求めることができる。血液循環から回収されたリガンドの完全性は、該リガンドをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析することによって調べることができる。生物学的に活性な成分リガンドの生物学的に活性な成分は、共有結合によりまたは非共有結合によリリガンドに結合させることができる。例えば、種々の放射性同位元素と結合させるためにキレート化剤（chelator）を用いてもよいし、または水素結合を介して核酸をリガンドに結合させてもよい。生物学的に活性な成分はまた、エマルジョン、プロテイノイド類またはリポソーム内に包含させてもよい。当業者には理解されるように、そのような構造物は、誘導極性ヘッド基または膜組み込みタンパク質を介してリガンドに共有結合によって連結できる。リガンドの結合成分はまた生物学的に活性な成分を含むことができる。生物学的に活性な成分は、例えば抗炎症性物質、サイトカイン類、抗感染性物質、酵素活性化剤もしくは抑制剤、立体構造改変剤、または抗生物質として当技術分野で既知の化合物のいずれも含むことができる。したがって、生物学的に活性な成分には、例えば核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸もしくは誘導体、糖タンパク質、放射性同位元素、脂質、炭水化物、または組換えウイルスのような化合物が含まれる。“核酸”という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー（一本鎖または二本鎖形のいずれか）を指し、特に限定されなければ天然のヌクレオチドの既知類似体を包含する。核酸には、アンチセンス核酸、単鎖もしくは二重鎖ＤＮＡと共有結合により架橋するための誘導オリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、またはタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸が含まれる。核酸にはまた、遺伝子治療用組成物、例えば野生型嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス調節因子をコードするものが含まれる。生物学的活性組成物のリガンドへの固着生物学的に活性な成分をリガンドに固着させる方法は、当該成分の化学構造にしたがって変動するであろう。一般に、リガンドは種々の官能基を含み、これらを生物学的に活性な分子の適切な官能基との反応に利用して、これら活性な薬剤をリガンドに結合させることができる。または、リガンドおよび／または生物学的活性成分を誘導して、新たな反応性官能基に暴露するか、またはこれと結合させることができる。該誘導は、ピアスケミカル社(Pierce Chemical Company)、ロックフォード、イリノイから購入可能なリンカー分子のような多数のリンカー分子のいずれかの結合を必要とする。本明細書で用いられる “リンカー”とは、共有結合または非共有結合によってリガンドと生物学的に活性な成分を結合させるために用いられる分子を指す。適切なリンカーは当業者には周知であり、直鎖もしくは分岐鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカーまたはペプチドリンカーが含まれる。Birch & Lennox，「モノクローナル抗体：原理と応用（Monoclonal A ntibodies:Principles and Applications）」４章、Wiley-Liss刊、ニューヨーク、ニューヨーク(1995)；米国特許第5,218,112号、同5,090,914号；Hermanson ，「生物物質結合技術(Bioconjugate Techniques)」、Academic Press刊、サンディエゴ、カリフォルニア(1996)を参照のこと。両分子がポリペプチドの場合、リンカーはそれらの側鎖基を介して構成アミノ酸と結合できる（例えばシステインとのジスルフィド結合を介して）。特定の生物学的活性成分上の基と反応する１つの官能基と、リガンドと反応する別の基とを有する二官能基性リンカーを用いて、所望の共役物を生成することができる。または、誘導は成分の化学的処理を伴ってもよい。例えば、過ヨウ素酸塩による糖タンパク抗体の糖部分のグリコール切断によって遊離アルデヒド基が生じる。抗体上のこの遊離アルデヒド基は、薬剤上の遊離アミン基またはヒドラジン基と反応し該抗体に薬剤を結合させることができる（米国特許第4,671,958号を参照のこと）。抗体または抗体フラグメント上の遊離スルフヒドリル基の生成方法もまた既知である（米国特許第4,659,839号を参照のこと）。放射性核種金属キレート、毒素および薬剤を含む種々の化合物をタンパク質（例えば抗体）に結合させる多くの方法およびリンカーが知られている。例えば、欧州特許出願第188,25 6号；米国特許第4,671,958号、同4,659,839号、同4,414,148号、同4,699,784号、同4,680,338号、同4,569,789号および同4,589,071号；並びにBorlinghausら、 Cancer Res．47:4071-4075(1987)を参照のこと。時には共役分子が標的部位に到達したとき、該分子を遊離することが所望される。したがって、標的部位の近傍で切断できる結合を含む共役物質を用いるのがよい。抗体から生物学的活性成分を遊離させるための結合の切断は、酵素活性または該共役物が標的細胞内または標的部位の近傍のいずれかで受ける状態によって促進することができる。標的部位が腫瘍の場合、腫瘍部位に存在する条件下（例えば腫瘍付随酵素または酸性ｐＨに曝される場合）で切断できるリンカーを用いることができる。cis-アコニット酸スペーサーの使用は、エンドソーム内で生物学的に活性な成分を遊離させるために有用である。同様に、ジスルフィド結合は、エンドソームの還元性環境で切断できる。切断可能な多数の異なるリンカーが当業者には知られている。米国特許第4,61 8,492号、同4,542,225号および同4,625,014号を参照のこと。これらリンカー群から薬剤を遊離させるメカニズムには、例えば光感受性結合の照射および酸触媒加水分解が含まれる。米国特許第5,141,648号は、特定の化学構造をもつリンカーを含む免疫共役物を開示する。この場合、該結合はインビボで切断され、それによって結合化合物（放射性治療薬、薬剤、毒素など）を遊離させる。該リンカーは弱酸性ｐＨで切断に感受性を示し、標的細胞の細胞質内に輸送されている間に切断され、それによって標的細胞内で生物学的活性化合物を遊離させると考えられている。米国特許第4,671,958号は、患者の補体系のタンパク分解酵素によってインビボで標的部位で切断されるリンカーを含む免疫共役物を記載している。多様な放射性診断化合物、放射性治療用化合物、薬剤、毒素および他の成分をリガンドと結合するために報告された多数の方法を概観して、当業者はある成分を本発明のリガンドに結合させる適切な方法を決定することができる。エンドソームからリガンドの放出当業者に周知の多くの方法を用いて、リガンドまたはそのいずれかの部分をエンドソームの外へ輸送することができる。茎部に特異的に結合するリガンドに結合させたポリ-L-リジン／核酸複合体は、効率的なトランスフェクションに用いることができる。Ferkolら、J．Clin．I nvest.，92:2394-2400(1993);及びFerkolら、J．Clin．Invest.，95:493-502(19 95)）。別のアプローチでは、ポリ−L-リジンは、ｐＩｇＲの茎部と特異的に結合するリガンドと、例えば遺伝子融合または化学的リンカーによって、連結することができる。次に、この複合体は不完全なアデノウイルスに連結することができる。クーリエルと共同研究者らは、不完全アデノウイルス変異体に連結したポリ−L- リジンまたはポリ−L-リジン−トランスフェリンに静電気力によって結合させた裸のプラスミドＤＮＡが、90％に達するトランスフェクション効率で細胞に供給できることを示した。アデノウイルス−ポリ−L-リジン−ＤＮＡ共役物は正常なアデノウイルスレセプターに結合し、続いてレセプター仲介エンドサイトーシスによって内在化される。このアプローチを用いて、遺伝子治療べクターの発現において1000倍もの増加が得られた。ヘルペスウイルスも同様な特性を有する。Cu rielら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:8850-8854(1991);Cottenら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA，89:6094-6098(1992);Curielら、Hum．Gene Ther.，3:147 -154(1992);Wagnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:6099-6103(1992); Michaelら、J．Biol．Chem.，268:6866-6869(1993);Curielら、Am．J．Respir． Cell．Mol．Biol.，6:247-252(1992);Harrisら、Am．J．Respir．Cell．Mol．Bi ol.，9:441-447(1993);Gaoら、Hum．Gene Ther.，4:17-24(1993);Curielら、米国特許出願第07/768,039号。インフルエンザウイルスを用いるまた別のアプローチでは、赤血球凝集素の疎水性ペプチドが低ｐＨで融合ペプチドとして機能してエンドソームの膜とウイルスの融合をもたらし、ウイルスを細胞質内に送り込む。このペプチドは、トランスフェリンレセプターを用いる遺伝子伝達のためのトランスフェリン／ペプチド／ポリ−L-リジン／ＤＮＡ複合体で用いられ、実質的に発現効率を改善した。Wa gnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:7934-7938(1992)。このペプチドを技術的に操作してリガンドまたはその一部をエンドソームから輸送するためのリガンドにすることかできる。さらに別のアプローチではリシンＡを用いることができる。リシンＡ鎖はエンドソームを突き抜けて細胞質ゾルに進入することができる。Beaumellら、J．Bio l．Chem.，268:23661-23669(1993)。本発明のリガンドは、例えば遺伝子融合または化学的リンカーによってリシンＡに連結できる。本発明は、理解を容易にするために例示及び実施例によってある程度詳細に記載してきたが、ある種の変更および改良が添付の請求の範囲内で実施できることは明白であろう。実施例１実施例１では、ウサギのｐＩｇＲ茎部領域に特異的に結合するニワトリの抗体およびＦａｂフラグメントを製造する方法およびアッセイする方法を述べる。ウサギｐＩｇＲの膜スパンニングセグメントは、630位のバリン残基で始まる。膜スパンニングセグメントに先行するウサギｐＩｇＲの24個の細胞外残基の配列は以下のとおりであった。 607-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ala-Ser-Ser-Ala-Ser-Gly- Gln-Ser-Gly-Ser-Ala-Lys-629(配列番号：７)。ｐＩｇＲの細胞外、膜近接部16個および23個のアミノ酸を表す２つのペプチドが合成された(Immuno-Dynamics，Inc.，ラホイヤ、カリフォルニア)。共役のためにＣ末端システインを付加した。ペプチド配列は以下の通りであった（一文字コードで表示）：DPA SGS RAS VDA SSA SGQ SGS AKC(配列番号８)(一次ペプチド )およびASV DAS SAS GQS GSA KC（配列番号９）(サブ配列ペプチド)。ペプチドの各量の半分をカサガイ（Keyhole limpet）ヘモシアニン(KLH)(Immuno-Dynamic s，Inc.製)と共役させた。ＫＬＨ−共役ペプチドを、ニワトリ抗体の製造（各ペプチドにつき２羽のニワトリ）のために、ランパイヤ・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Lampire Biol ogical Laboratories，Pipersville，ペンシルバニア）に送った。ランパイヤ社のニワトリ免疫用標準プロトコルは以下のとおりであった。免疫前鶏卵採取および免疫前試験採血；プロジェクト開始時にフロイント（Freund）の完全懸濁液でペプチド２ｍｇの筋肉内注射；第１週にフロイントの不完全懸濁液でペプチド０ .５ｍｇの筋肉内注射；第２週にフロイントの不完全懸濁液でペプチド0.25ｍｇの筋肉内注射；第３週は休養；第４週にフロイントの不完全懸濁液でペプチド0. 25ｍｇの筋肉内注射；第５週は休養；第６週に試験採血。６週頃から毎日採卵を実施し、さらに毎月試験採血した。鶏卵は毎月配達された。鶏卵の到着時に、卵黄を卵白から注意深く分離し、ニワトリ抗体（”ＩｇＹ” ）を抽出処理まで卵黄１個につき基礎緩衝液（0.01Ｍリン酸ナトリウム(ｐＨ7.5 )、0.1ＭＮａＣｌ、0.01％アジ化物）50〜80ｍｌ中で保存した。ポルソン（Po lson）ら、Immunol．Commun.，9:475(1980)の方法にしたがって、一連のＰＥＧ沈澱とそれに続く一連の硫化アンモニウム沈澱によって保存卵黄バッチからＩｇＹを抽出した。簡単に記せば、基礎緩衝液中の卵黄に固体ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量8000）を加えて、希釈卵黄の容積に対してＰＥＧの濃度を3. 5重量％とし、溶解するまで室温で攪拌した。溶液を20℃で10分間14,0OOｇで遠心分離し、吸収綿ガーゼを粗く詰めたロートを通して別の容器に静かに注いだ。さらにＰＥＧをこの清澄な濾液に加え、最終ＰＥＧ濃度が12％となるようにしてＩｇＹを沈澱させた。20℃で10分間14,000ｇで遠心分離して沈殿物を沈澱させた後、卵黄１個につき基礎緩衝液60ｍｌ中にこの沈殿物を溶解させ、さらに24％ＰＥＧの基礎緩衝溶液を等容積加えて沈殿物を再形成させた。この沈殿物をさらに２回20℃で10分間14,000ｇで遠心分離して全ての残留ＰＥＧ溶液を除去した。ペレットを卵黄１個につき基礎緩衝液30ｍｌに溶解し、等容積の飽和（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄をゆっくりと添加し、さらに４℃で一晩攪拌することによって、50％飽和（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄中でタンパク質を沈澱させた。沈殿物を４℃で10分間14,000ｇで遠心分離し、ペレットを等容積の50％冷（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄中で洗浄した。沈殿物を再び４℃で10分間14,000ｇで遠心分離し、カルシウムまたはマグネシウムを含まないＰＢＳ(ｐＨ7.5)中で溶解させ、ＰＢＳ中で十分に透析して全ての（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄を除去した。ＩｇＹ調製物の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し（約90〜 95％）、ＩｇＹの定量は、吸光係数1.3を用い280ｎｍでの吸収によって概算した。配列番号８の一次ペプチドを注射したニワトリのＩｇＹのアフィニティー精製は、スルフヒドリル基（例えばこのペプチドのＣ末端システイン上に存在するもの）と特異的に結合することを可能にするSULFOLINKカップリングゲル(Pierce C hemical Company)にこのペプチドをまず共有結合させることによって実施した。製造元の指示にしたがって、ペプチド３ｍｇを用いて３ｍｌカラムを作製した。簡単に記せば、50ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ(ｐＨ8.5)の６カラム容積を用いて３ｍｌカラムを平衡させ、続いて一次ペプチド配列番号８３ｍｇの50ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ(ｐＨ8.5)溶液３ｍｌをカラムに加え、室温で15分間攪拌した。カラムゲルとペプチドをさらに30分間攪拌せずにインキュベートした。ペプチド緩衝液をゲルから除去し、後の試験のため保存した。この試験では、スルフヒドリル基を検出するエルマン試薬（Ellman's reagent(DTNB(5',5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸))、Pierce Chemical Company)を用いてカップリング効率を確認した。一次ペプチド配列番号８は芳香族アミノ酸基を一切含まず、分光測定法または標準的なタンパク質アッセイ技術（例えばブラッドフォード分析）では検出されなかった。ゲルに結合させる前後のペプチド溶液の一部について比較のために製造元の指示にしたがってエルマンの試薬を用いたところ、100％の結合効率を確認した。ゲルカラムを３カラム容積の50ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ(ｐＨ8.5)で洗浄してから、50ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ(ｐＨ8.5)中のシステイン溶液３ｍｌで室温で15分間攪拌し、続いて攪拌せずに30分間静置して非特異的結合部位をブロックした。カラムから水を抜き、16カラム容積の１ＭＮａＣｌで洗浄し、続いて脱気した16カラム容積の0.05％アジ化ナトリウムで洗浄した。ローゼル(Rosol)ら、Veterinary Immunology and Immunopathology，35:321-3 37(1993)の改変版にしたがって、このペプチド結合SULFOLINKゲルでＩｇＹをアフィニティー精製した。室温で１回、10カラム容積のＰＢＳでカラムを洗浄した。ＩｇＹを２時間カラムに再循環させた。続いてカラムを10カラム容積のＰＢＳで、さらに0.5ＭＮａＣｌを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の10カラム容積で洗浄した。ペプチド特異的ＩｇＹを500ｍＭグリシン(ｐＨ2.5)で溶出させ、１Ｍトリス(ｐＨ9.5)で中和した。ＵＶ分光光度計及びグラフ作製装置を用いて洗浄とカラムからのタンパク質の溶出に追跡した。ＯＤ 280ｎｍでのシグナルを有するサンプルをセントリプレップ30（Amicon）で500〜600μｌの容積に濃縮した。製造元の指示およびアキタとナカイ(Akita & Nakai)，J．Immunol．Methods， 162:155-164(1993)の方法の改良版にしたがって、固定ペプシン(Pierce Chemica l Company)とともにインキュベートしたアフィニティー精製ＩｇＹからＦａｂ（Ｙａｂ）フラグメントを作製した。ペプシンスラリーを16倍の容積の50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐH4.2)で２回洗浄し、２倍の容積の酢酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した。アフィニティー精製ＩｇＹを３７＝ＢＯＣで固定ペプシンとインキュベートし、５時間混合した。トリス−ＨＣｌ(pH8.0)１モルを加え、最終ｐＨを7.5にした。ペプシン混合物を1000ｇで５分間遠心分離し、フラグメントを含む上清をCENTRICON-10フィルター(Amicon)に加えて小さなＦｃフラグメントを除去した。完全な切断はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。一連の試験採血から得たニワトリ血清及び一つにまとめた卵黄バッチから抽出したＩｇＹをＥＬＩＳＡで調べ、ペプチドの認識について確認した。アフィニティー精製ＩｇＹおよびＦａｂ’フラグメント（“Ｙａｂ”）を完全なｐＩｇＲを認識する能力についてウエスタンブロットによって調べた。細胞溶解物をMadin- Darbyネコ腎細胞（ＭＤＣＫ）細胞から作製し、さらにプロテアーゼ・インヒビター１μｇ／ｍｌおよびフェニルメチルスルフォニルフロリド（PMSF）を含む10 ％ＮＰ40溶解緩衝液を用いるBreitfeldら(Methods in Cell Biology，32:329-33 7(1989))の方法にしたがって、ＭＤＣＫ細胞にウサギｐＩｇＲをトランスフェクトした（“ｐＷｅ”）。細胞溶解物を還元状態で10％ゲルで泳動し、ＰＶＤＦ（ポリビニルジフルオリド）膜(Millipore，ベッドフォード、マサチューセッツ) に移した。ｐＩｇＲの細胞質部分に対するマウスのモノクローナル抗体、ＳＣ１６６（Solariら、Cell，36:61-71(1984)）を陽性コントロール抗体として用い、免疫前の卵黄から単離したＩｇＹを陰性コントロールとして用いた。ＨＲＰ共役ウサギ抗ニワトリＩｇＹ(Jackson Immunochemicals)及びＨＲＰ共役ウサギ抗マウス抗体（Biorad）を二次抗体として用いた。一次ペプチドを注射したニワトリのＩｇＹおよびサブ配列ペプチドを注射したニワトリのＩｇＹは完全なｐＩｇＲを認識したが、サブ配列抗体を注射したニワトリの１羽から得たＩｇＹはこれを認識しなかった。ＭＤＣＫ細胞およびｐＷｅ細胞をカバースリップ上で増殖させ、４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらにサポニンで浸透性を付与したものを用いたＩｇＹおよびＹａｂフラグメント（一次ペプチドを注射したニワトリから得た）の免疫蛍光実験では、ｐＩｇＲをトランスフェクトされた細胞でより特異的な染色が示された(FITC-共役ウサギ抗ニワトリおよび抗マウス抗体はジャクソン・ィムノケミカル社(Jackson Immunochemicals)から入手した)。固定および浸透性付与細胞での細胞ＥＬＩＳＡ（ハーンらの方法(M．Hahneら、J．Cell Bio l.，121:655-64(1993))を改変）によって、ＭＤＣＫ細胞よりもｐＷｅ細胞で５倍強いＹａｂフラグメントの染色が示された。これらのデータは、ウサギｐＩｇＲの茎部ペプチドに対するポリクローナル抗体の製造が成功であったこと、およびそれら抗体が完全なｐＩｇＲを認識することを示している。実施例２実施例２では、ヒト組換え一本鎖可変領域フラグメント（scFv）抗体のファージディスプレーによる選別について述べる。ファージディスプレーによるｓｃＦｖの選別は可溶性ビオチン付加抗原または固形支持体に固定された抗原を必要とする。ファージディスプレーによって選別されたｓｃＦｖは低いアフィニティーバインダーとしての傾向を有し、さらに可溶性抗原はより高いアフィニティーをもつｓｃＦｖの選別を可能にする(R．Schi erら、J．Mol．Biol.，255:28-43(1996))ようであるので、可溶性抗原による選別方法を選択した。製造元の指示に記載された方法に基づいてビオチン−ＢＭＣＣ((1-ビオチンアミド-4-(4'[マレイミドメチル]シクロヘキサン−カルボキサミド)ブタン)(Pierce Chemical Company，ロックフォード、イリノイ)を用いて、ウサギｐＩｇＲの膜近接、細胞外部分の23個のアミノ酸に対応する、ｐＩｇＲ茎部の一次ペプチド（実施例１に記載）をシステイン残基のスルフヒドリル基を介してビオチンと共役させた。スルフヒドリル基を介してペプチドが二量体化されていないことを確認するために、先ずペプチドを１％水素化ホウ素ナトリウムの 0.1Ｍトリス、５ｍＭＥＤＴＡ(ｐＨ8.0)溶液で還元した。１ＮＨＣｌを添加して溶液のｐＨをｐＨ５に下げた。溶液の発泡が終わったとき、１Ｍトリスを添加してｐＨを7.0にした。ＤＭＳＯにビオチン付加用試薬を溶解させて8.5ｍＭビオチン−ＢＭＣＣ溶液を調製した。５倍モル過剰のビオチン−ＢＭＣＣを還元ペプチドに添加し、４℃で一晩インキュベートした。10〜50％の範囲のＣＨ₃ＣＮ濃度勾配を用いてC18カラムのＨＰＬＣ（30分）および215ｎｍでのＵＶ検出によって、ビオチン付加ペプチドを遊離ビオチンから分離した。電子スプレーによる質量分光測定およびＬＳＩＭＳ（液体二次イオン質量分光測定、liquid seconda ry ion mass spectrometry）によって、ビオチン付加ペプチドに対応する正確なピークを同定した。極めて多数の異なるヒトｓｃＦｖ（約10¹⁰）をコードするファージライブラリーとともにビオチン付加一次ペプチドをインキュベートした。このファージライブラリーは、以前に報告されたように調製した(J.D．Marksら、J．Mol．Biol.， 222:581-97(1991)；J.D．Marksら、Bio/Technology，10:779-783(1992);J.D．Ma rksら、Bio/Technology，11:1145-1149(1993)；A.D．Griffithsら、EMBOJ.，12: 725-734(1993))。総計４巡りの選別、ファージミド（phagemid）回収および大腸菌（Escherichia coli）サプレッサー株ＴＧ−１における拡張を以下の改変を加えながらMarksら(J．Mol．Biol.，222:581-97(1991))に記載されたように実施した。用いられたファージライブラリーは幾つかのストレプトアビジンバインダーを含むことが知られているので、最初の３巡りの選別には、ファージとストレプトアビジンアガロース(Sigma)との30分間インキュベーションを２回実施して予備浄化工程を実施した。続いてファージをビオチン付加一次ペプチド５μ ｇと１時間インキュベートした。ビオチン付加ペプチドを該固着ファージと結合させるために、ペプチド−ファージ溶液をアビジン磁性ビーズとともに第１巡目および第３巡目でそれぞれ15分間および５分間インキュベートし、さらにストレプトアビジン磁性ビーズとともに第２巡目および第４巡目でそれぞれ10分間および５分間インキュベートした。第４巡目の選別から回収したファージを大腸菌の非サプレッサー株ＨＢ２１５１に感染させ、可溶性ｓｃＦｖフラグメントを産生させるために、Marksら(J．Mol．Biol.，222:581-97(1191))の記載にしたがってＩＰＴＧを用いて個々のファージミドクローンを誘発した。ドットブロットアッセイで可溶性ｓｃＦｖフラグメントの発現について、及びＥＬＩＳＡアッセイでビオチン付加一次ペプチドへの結合について、個々のクローン由来の細菌上清を解析した(Finnernら、Clin．Exp．Immunol.，102:566-574 (1995))。しかしながら、ＥＬＩＳＡアッセイは以下のように改変した。96ウェルのマイクロウェルプレート(Immulon-4)をアビジン（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で10μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩被覆し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％乳汁でブロックしてからビオチン付加一次ペプチド（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ）と結合させた。ＴＭＢ（3,3',5,5-テトラメチルベンジジン）溶液（Kirkega ard and Perry）を基質として用い(100μｌ／ウェル)、反応を0.18ＭＨ₂ＳＯ₄ で停止させた。その後ＥＬＩＳＡ読み取り装置で波長450ｎｍでカラー反応を読み取った。ドットブロット分析によって、第４巡目の選別から回収したファージで感染させたＨＢ２１５１の96個の選別コロニーのうち66％がｓｃＦｖを産生することがわかった。ＥＬＩＳＡアッセイは、96個のコロニーのうち43個が該ペプチドと結合するｓｃＦｖを産生することを示した。全陽性コロニーの多様性をＰＣＲスクリーニングによって決定した。重鎖および軽鎖のｓｃＦｖ挿入物を先ずプライマーＬＭＢ３およびｆｄ−Ｓｅｑｌ(Marks ら、J．Mol．Biol.，222:581-97(1991))で増幅し、続いて制限酵素ＢｓｔＮ１で消化した。異なるＤＮＡフィンガープリントパターンをもつクローンについて、セキサーム・ロングリードサイクルシークェンシングキット(SequiTherm Long- Read cycle sequencing kit)(Epicentre Technologies)およびリカーマシーン(L icor machine)を用いて配列決定した。５種の固有配列を特定した。更なる性状決定と使用に向けて大量の精製ｓｃＦｖを得るために、５種の固有のｓｃＦｖを発現ベクターpUC119 Sfi-NotmycHisでサブクローニングした。この発現ベクターによってｓｃＦｖのＣ末端にヘキサ−ヒスチジンタグが付加される（Schierら、J．Mol．Biol.，225:28-43(1996)）。実施例３実施例３では、Fercolら、J．Clin．Invest.，92:2394-2400(1993)；及びFerc olら、J．Clin．Invest.，95:493-502(1995)（これら双方の文献は参照により本明細書に含まれる）に開示された種々の方法を用いて、ｐＩｇＲ発現ホ乳類細胞への野生型嚢胞性線維症トランスコンダクタンス調節因子（CFTR）遺伝子の向標的について述べる。ｐＩｇＲの茎部領域と反応するＦａｂフラグメントを作製し、実施例１で述べたような技術を用いて精製する。ファーコルら（Ferkolら、(1993)）の方法にしたがい異種二官能基性架橋剤N-スクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）を用いて、このＦａｂをポリ（L-リジン）（分子量20,000ダルトン）に連結した。ＣＦＴＲ遺伝子を含むプラスミドをサイトメガロウイルス初期プロモーターに連結し、ベクターｐＣＢ６に挿入した。Thomasら、J．Biol．Chem.，268:3313-3 320(1993)。プラスミドＤＮＡをＦａｂ−ポリリジンと３ＭＮａＣｌ中で結合させることによって、Ｆａｂ−ポリリジン−ＤＮＡの複合体を作製する。この複合体をリン酸緩衝食塩水0.1ｍｌに溶解し、メトファン吸入麻酔で軽く麻酔した病原体をもたないスプラーク・ドーリーラット(250〜300グラム）の鼻道に入れることによって、該複合体を導入する。仰臥位に手で拘束したラットの鼻道に直接、プラスミド100μｌのＰＢＳ溶液を適用するためにはマイクロピペットが用いられるであろう。溶液が吸入されるまでラットをこの体位で保持する。この方法は鼻粘膜上にサンプルを効果的に適用できることを示した。Shahinら、Infection and Immunity，60:1482-1488(1992);Gizurarsonら、Vaccine，10:1 0 1-106(1992))。トランスフェクトされた遺伝子の転写はＣＦＴＲタンパク質の産生について免疫蛍光アッセイによつて調べる。実施例４実施例４は、ｐＩｇＲを発現する細胞にインビボで外因性タンパク質を送り込む手段について述べる。エンドソームからタンパク質を放出させる効果的な方法として、アデノウイルスにカップリングさせたタンパク質−Ｆａｂ複合体が用いられる。この方法は多数のレセプター系で用いられ、1000倍の発現増加が得られた。Curielら、J．Res pir．Cell Mol．Biol.，6:247-252(1992);Curielら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，88:8850-8854(1991);Gaoら、Hum．Gene Ther.，4:17-24(1993)(これらの文献は参照により本明細書に含まれる)。カップリングは、アデノウイルスおよびＦａｂ／ポリリジンのビオチン付加とそれに続くアビジンによる架橋によって実施される。得られた複合体を実施例３のように投与する。実施例５実施例５は、茎部に特異的に結合する抗体が、ｐＩｇＲを含むＭＤＣＫ（Madi n-Darbyネコ腎）細胞の先端膜から基底外側膜へとトランスサイトーシスによって輸送されることについて述べる。ｐＩｇＲと反応するＹａｂフラグメントを実施例１で述べたように作製した。抗ｐＩｇＲ茎部Ｙａｂフラグメントにゴールドセインらの一塩化ヨウ素法（Gold seinら、Meth．Enzymol.，96:241-249(1983)）によって放射性ヨウ素を付加した。放射性ヨウ素付加ＩｇＡをコントロールリガンドとして用いた。直径12ｍｍ、 0.4μｍの孔径の細胞培養インサート(Transwell，Costar)上で４日間、中心部集中態様で増殖させたＭＤＣＫおよびｐＷｅ細胞の先端表面に放射性ヨウ素付加ＹａｂフラグメントまたはＩｇＡ(100μｌ／ウェルに10⁷ｃｐｍ)を添加した。Brei tfeldら、Methods in Cell Biology，32:329-337(1989)。放射能標識Ｙａｂフラグメントは、プロテアーゼインヒビター、ロイペプチン50μｌ／ｍｌと２時間予備インキュベートした細胞、または予備インキュベートしない細胞に添加された。37℃で20分間の先端取り込み後、未結合放射能標識リガンドをＭＥＭ（最小必須培養液）／ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で３回迅速に（５分間洗浄１回、より迅速な洗浄２回）洗浄した。ガンマカウンター(Beckman Instruments，パロアルト、カリフォルニア)での定量のために７、15、30、60および120分の時点で先端培養液および基底外側培養液を採集、交換した。細胞培養インサートは、ガンマカウンターでの定量のために120分で切り出し、放射能活性の最初の総取込み量を算出した。ＭＤＣＫ細胞のバックグラウンド取込みをｐＷｅ細胞による取込みから差し引き、放射能標識リガンドの特異的な再循環およびトランスサイトーシスを算出した。結果は、ＩｇＡの５〜６％と比較して、Ｙａｂフラグメントの13〜18％が、ロイペプチンで前処理した細胞の先端表面から基底外側表面へとトランスサイトーシスによって輸送されたことを示している。本明細書で引用した全ての刊行物および特許は、それら個々の刊行物または特許が具体的にかつ個々に参照により本明細書に取り込まれたかのように、参照により本明細書に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＢＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者リッチマン―アイゼンスタット、ジャニースアメリカ合衆国 94132 カリフォルニア州サンフランシスコディアズアヴェニュー５

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞の重合体免疫グロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の茎部に特異的に結合するリガンドであって、ｐＩｇＲの分泌性成分とは生理的条件下で実質的に結合しないリガンド。２．該リガンドが抗体である請求項１記載のリガンド。３．該リガンドがヒトに適応させた抗体である請求項１記載のリガンド。４．該リガンドが、抗体の組換え一本鎖可変領域フラグメントである請求項１記載のリガンド。５．該レセプターの切断部位に隣接する細胞膜である細胞外エピトープと最初の 33個のアミノ酸内で結合する請求項１記載のリガンド。６．以下の群から選ばれるペプチドと結合する請求項１記載のリガンド：マウス：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg- Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser- Ser-Ser-Lys(配列番号：２）、ラット：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg- Ala-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser- Lys(配列番号：３)、ヒト：Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala- Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg(配列番号：４)、ウシ：Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro- Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(配列番号：５)、ウサギ：Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly- Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser- Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys(配列番号：６)。７．さらに、該レセプター茎部に選択的に結合する結合成分、並びに核酸、タンパク質、放射性同位元素、脂質および炭水化物から成る群から選ばれる生物学的に活性な成分を有すると定義される請求項１記載のリガンド。８．該核酸が、野生型嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス調節因子をコードする請求項７記載のリガンド。９．重合体免疫グロブリンレセプターを発現する細胞の該重合体免疫グロブリンレセプター茎部にリガンドを結合させることによって、重合体免疫グロブリンレセプター発現細胞にリガンドを導入する方法であって、生理的条件下ではｐＩｇＲの分泌性成分とは実質的にリガンドが結合しないことを条件とする、上記方法。 10．該リガンドが抗体である請求項９記載の方法。 11．該リガンドがヒトに適応させた抗体である請求項９記載の方法。 12．該リガンドが、抗体の組換え一本鎖可変領域フラグメントである請求項10記載の方法。 13．該リガンドが、該レセプターの切断部位に隣接する細胞膜である細胞外エピトープと最初の33個のアミノ酸内で結合する請求項９記載の方法。 14．該リガンドが以下の群から選ばれるペプチドと結合する請求項９記載の方法：マウス：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg- Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser- Ser-Ser-Lys(配列番号：２)、ラット：Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg- Ala-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser- Lys(配列番号：３)、ヒト：Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala- Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg(配列番号：４)、ウシ：Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro- Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(配列番号：５)、ウサギ：Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly- Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser- Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys(配列番号：６)。 15．さらに、該リガンドが、該レセプター茎部に選択的に結合する結合成分、並びに核酸、タンパク質、放射性同位元素、脂質および炭水化物から成る群から選ばれる生物学的に活性な成分を有すると定義される請求項９記載の方法。 16．該核酸が、野生型嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス調節因子をコードする請求項15記載の方法。 17．さらに、該レセプター茎部に選択的に結合する結合成分、並びに抗炎症性物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗生物質および抗感染性物質から成る群から選ばれる生物学的に活性な成分を有すると定義される請求項１記載のリガンド。 18．該細胞がホ乳類細胞である請求項９記載の方法。 19．該細胞が上皮細胞である請求項18記載の方法。 20．該リガンドが該細胞の先端表面で該茎部と結合する請求項９記載の方法。 21．該リガンドが該細胞の基底外側側にトランスサイトーシスによって運ばれる請求項20記載の方法。 22．該リガンドが、該細胞の基底外側表面で該茎部から遊離される請求項21記載の方法。 23．該リガンドが、該細胞の基底外側表面で該茎部に結合される請求項９記載の方法。 24．該リガンドが該茎部にのみ特異的に結合する請求項９記載の方法。 25．該リガンドが該茎部にのみ特異的に結合する請求項１記載のリガンド。 26．重合体免疫グロブリンレセプターを発現する細胞にリガンドを結合させる方法であって、該リガンドが重合体免疫グロブリンレセプターの分泌性成分とは生理的条件下では実質的に結合しないということを条件に、該レセプターの茎部にリガンドを結合させる工程を含む、上記方法。 27．該リガンドが、結合後に該細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれる請求項26記載の方法。 28．以下の配列を有するペプチドと結合する請求項１記載のリガンド： Ala-Asp-Ala-Ala-Pro-Asp-Glu-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Phe-Arg-Glu-Ile- Glu-Asn-Lys-Ala-Ile-Gln-Asp-Pro-Arg-Leu-Phe-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala-Val- Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly- Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg(配列番号：１０)。 29．該リガンドが以下の配列を有するペプチドと結合する請求項９記載のリガンド： Ala-Asp-Ala-Ala-Pro-Asp-Glu-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Phe-Arg-Glu-Ile- Glu-Asn-Lys-Ala-Ile-Gln-Asp-Pro-Arg-Leu-Phe-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala-Val- Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly- Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg(配列番号：１１)。