JP2000511531A - 虚血性障害を受けた組織を蘇生し、補償するための溶液及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、虚血により損傷を受けた器官の修復を、該器官の機能障害が反転し得る程度にまで誘導し、処理された器官または組織の循環系が回復する間の組織の更なる損傷を防止するするための方法を開示する。この方法は、本発明による蘇生溶液を用いて、約28℃〜約37℃の温和な温度で器官をフラッシュすることにより、血流喪失の間に蓄積した血液およびアシドーシス生成物除去することと；フラッシュされた器官または組織を蘇生溶液で潅流することとを具備し、前記溶液は、（i）器官または組織内の血管を拡張するため、（ii）栄養素の供給により器官または組織の機能を再確立するため、（iii）虚血により損傷を受けた器官または組織に細胞の完全性および機能を回復させるための成分、および（iv）前記虚血により損傷を受けた器官または組織（嫌気性呼吸により生存したもの）を、酸素添加された蘇生溶液に再適用することにより、酸化的代謝を再確立するための成分の新規な組み合わせを含有する。

Description

【発明の詳細な説明】 虚血性障害を受けた組織を蘇生し、補償するための溶液及び方法 発明の分野 本発明は、概括的には、組織及び臓器の保存、維持、及び修復に関する。より 具体的には、本発明は、本明細書に示した組成物を用いて、虚血性障害を受けた 臓器又は組織の完全性、機能、及び生存能力を復活させる方法を提供する。 発明の背景 移植用の臓器は、極度に不足し続けている。現在、臨床の臓器移植における主 要な制限因子は、臓器の継続的な不足である。例えば、腎臓移植の多くは、心停 止していない死体ドナーから回収した臓器を利用することに頼っている。さらに 、移植用臓器の大きな入手源は、心停止した死体であるが、これは未だ活用され ていない。心停止した死体は、負傷した場所で死んだ事故の犠牲者であり、外傷 を受けた後の生存時間が短い者である。このような場合に、このような臓器が使 用されない理由は、一旦心臓が停止して、循環血液の供給が不足すると（温虚血 （warm ischemia））、障害のカスケードが起こるからである。 温虚血によって機能を失わない限界まで損傷を受けた臓器は、低体温によって 引き起こされるさらなる損傷には耐えることができない。移植用の臓器を保存す るために利用される低体温状況下においては、脂質二重層は相変化を来して、ゲ ル状になり、著しく流動性が低下する。ほぼ凍結した細胞膜中の脂質は、高酸素 圧力下でさえも酸素を利用しない。その結果生じる代謝は解糖であり、これは無 酸素症の状態と類似する。18℃以下の低体温状態では、腎臓の尿細管活性が阻害 され、4℃では、酸素の利用は、正常体温の約5％であることが発表されている。 低体温での保存は、血管攣縮を生じせしめ、続いて臓器に浮腫を発生させ得る 。低体温で保存された臓器は、糸球体内皮細胞の膨潤及び尿細管の壊死を伴う血 管の完全性の喪失を来し得る（利用した低体温状態に起因する現象）。低体温状 態は、Na/K依存性ATPaseも阻害し、容積を調節する細胞の体積を喪失せしめ得る 。体積調節の喪失は、細胞の膨潤及び障害を引き起こす原因である。酸素を十 分に供給すると、該膨潤の程度を顕著に減少させることができる。十分な酸素供 給が存在しないと、無酸素症によって、潅流の数時間後に比較的微小な血管が崩 壊し得る。酸素が欠乏し、それに引き続いてＡＴＰの蓄積が枯渇するということ は、従来の保存状態下では、嫌気的な解糖が主要なエネルギー源であることを意 味している。酸化的リン酸化のための分子状酸素が欠乏すると（虚血で起こり得 る）、ミトコンドリア内にＮＡＤＨが蓄積し、ミトコンドリア内のＡＴＰの蓄積 が枯渇する。おそらく、その後のヌクレオシドの喪失は、温虚血になった組織が 機能停止に陥る上でのきわめて重要な因子であり、寒冷虚血（cold ischemia） の時間が長ければ、血液の供給が回復した後にＡＴＰが再生されるであろう。十 分な酸素を供給できないために、臓器保存は、通常低体温に依拠するようになっ た。 このように、虚血は（温虚血、冷虚血の何れであっても）、前致死的段階及び 致死的段階として特徴づけることができる一連の傷害カスケードである。前致死 的段階は、低酸素症、栄養不良、及び毒性代謝老廃物の除去不全という三通りの 悪影響をもたらす。循環血液が欠乏すると、分子状酸素が欠乏するようになる。 生じた低酸素血症は、ミトコンドリア中のＡＴＰ貯蔵の枯渇のようなエネルギー 貯蔵の枯渇をもたらす。ＡＴＰの枯渇は、浮腫、正常な細胞の完全性の喪失、及 び膜極性の喪失を含む細胞の変化を引き起こす。細胞の変化は、致死的段階の虚 血をもたらし、代謝性老廃物の蓄積、プロテアーゼの活性化、及び細胞死を生じ させる。 低体温臓器保存の分野での状況を代表し、低体温状況下での最適化な臓器保存 を供する現在の潅流溶液は、低体温によって引き起こされた組織の浮腫を防止す る成分；移植時の臓器機能を促進する代謝物；抗酸化剤；膜安定化物質；コロイ ド；イオン；及び塩を含有する（Southardら、1990、Transpl．49-251；及びSou thard，1989，Transpl．Proc．21:1195）。該潅流液の処方は、低体温が引き起 す代謝の低下によって臓器を保存するようにデザインされている。これは、低体 温保存の間に通常遭遇する浮腫及び血管攣縮を最少限にするが、十分に拡大した ドナープールの利用には向かない。 これは、温虚血によって機能を失わない限界まで損傷を受けた臓器又は組織は 、 低体温によって引き起こされるさらなる損傷には耐えることができないためであ る。僅か30分の虚血でさえも、移植後の臓器機能は危うくなる。例えば、心停止 していない死体から得た臓器を用いた場合、即時非機能率（immediate nonfunct ion rate）は25％程度であるが、30分以内の虚血では、即時非機能率は約60％に 増加する。このため、心停止した死体から得た腎臓の60％は、前致死的な虚血性 傷害のために即座に機能しなくなる。さらに、不可逆的な虚血性損傷及び傷害は 、僅か二時間以下、血流が途絶えた臓器に起こると考えられている（Klatzら、 米国特許第5,395,314号）。臓器の新規入手源を開発することができなければ、 移植処理の数は、変わらないであろう。さらに、温虚血によって損傷を受けた臓 器又は組織中の前致死的虚血性障害を修復するために利用できる方法／システム が存在しないので、ドナープールを実質的に拡大することは不可能である。 近年の努力は、血液の供給が中断された直後に、溶液で再潅流して蘇生するこ とによって、虚血性障害を防ぐことに焦点が当てられてきた。例えば、米国特許 第4,415,556号に開示されている保護溶液は、臓器への虚血性障害を防ぐために 、手術の間に、又は移植用の臓器に対して用いられている。該保護溶液は、臓器 の潅流中の好気的代謝を改善するための潅流液として用いられる。米国特許第5, 395,314号は、血液供給が中断した後に、臓器代謝、酸素供給、及びフリーラジ カルによる損傷を抑制するようにデザインされた低体温保存溶液（約8〜10℃） を、脳を通じて循環させることによって、脳を蘇生する方法を記載している。 このような方法及び保存溶液は、臓器の虚血性障害を防ぐ上では有用であるが 、これらの有利な効果は、実際的な制約及び機能的な制約によって相殺される。 第一に、このような虚血性障害を防ぐのに効果的な方法及び溶液は、血液供給が 途絶えた直後（数分以内）に適用しなければならない。例えば事故の犠牲者を臓 器ドナーとして用いる場合には、輸送上の制約（logistic restraint）によって 、このような溶液及び方法が実際に使用されるのは、病院に備え付けた場合のみ に著しく限定されるであろう。第二に、不可逆的な虚血性障害及び損傷は、血流 が途絶えた臓器に数分以内（例えば、脳）又は2〜3時間以内（心臓、腎臓）に起 こ ると考えられている。温虚血によって機能を失わない限界まで損傷を受けた臓器 又は組織は、移植前の低体温保存、又は移植時の血流の回復によってもたらされ るさらなる損傷に耐えられない。理由の一つは、虚血−再潅流後の循環の回復は 、逆にさらなる組織の損傷をもたらし得ることである（McCordら、1985,N Engl J Med 312:159-163）。循環が回復する結果、損傷を受けた組織の再酸素化が起 こる。虚血性の障害を受けた組織を再酸素化すると、酸素−フリーラジカルの形 成、フリラーラジカルスカベンジャーの枯渇、及び走化性因子の放出によって、 さらなる組織障害がもたらされ得る。 このように、単に前致死的段階の間の臓器又は組織中の虚血の影響を抑制する よりも、むしろこれを克服し、致死的虚血のきわめて初期の段階で、臓器又は組 織中の修復プロセスを補助する方法及び溶液が必要とされている。機能の損傷が 回復し得る程度まで、虚血性の障害を受けた臓器及び組織を修復せしめ、且つ循 環が回復する間のさらなる組織損傷を防止せしめる方法は、臓器ドナープールを 実質的に拡大させるであろう。 発明の概要 本発明は、本発明の時まで不可逆的な虚血性損傷及び傷害と考えられていた、 血流が途絶えた臓器又は組織に関するものである。該方法及び組成物は、虚血性 障害及び損傷後に、虚血性損傷を受けた臓器及び組織の修復を誘導し、循環の回 復期間中に組織がさらなる損傷を受けるのを防ぐために用いられる。このことは 、このような損傷の防止又は抑制を目的とする、本発明の方法及び組成物と現在 用いられている虚血性障害及び損傷の前に使用するための方法及び組成物を区別 するものである。本発明の方法は、本発明の蘇生溶液（resuscitation solution ）を用いて、少なくとも虚血の前致死的段階の間に、虚血性の障害を受けた臓器 又は組織の完全性及び機能を再生することができる方法である。さらに、本発明 の方法及び溶液は、血流が途絶えた臓器又は組織中の血液循環が回復する間に生 じ得るさらなる組織の障害を防止又は抑制することを目的としている。 本発明の方法は、移植及び／又は血液循環の回復に適した臓器を与えるために 、約28〜37℃の温和な温度で、動脈系を通じて本発明の蘇生溶液を使用して臓器 を洗浄し、血流が途絶している間に臓器又は組織に蓄積した血液及び酸性産物（ acidotic product）を除去することと、該洗浄された臓器又は組織を該蘇生溶液 で潅流して、(i)臓器又は組織中の血管、特に収縮した毛細血管を拡張すること 、(ii)栄養因子を供給することによって臓器又は組織の機能を再生すること、(i ii)虚血性障害を受けた臓器又は組織の細胞の完全性及び機能を回復させること 、(iv)嫌気的呼吸によって生き残っている虚血性障害を受けた臓器又は組織を酸 素化された蘇生溶液に再適応させることによって酸化的代謝を再確立することを 具備する。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の蘇生方法及び溶液によってもたらされた臓器のプロセスを示 すフローチャートである。 図２は、本発明の方法及び蘇生溶液を用いたイヌの同種移植における、移植後 の日数に対する臓器機能のパラメーター（血清クレアチニン）のグラフである。 図３は、本発明の方法及び蘇生溶液を用いたイヌの同種移植における、移植後 の日数に対する臓器機能のパラメーター（尿中クレアチニン）のグラフである。 図４は、本発明の方法及び蘇生溶液を用いたイヌの自己移植における、移植後 の日数に対する臓器機能のパラメーター（血清クレアチニン）のグラフである。 図５は、本発明の方法及び蘇生溶液を用いたイヌの自己移植における、移植後 の日数に対する臓器機能のパラメーター（尿中クレアチニン）のグラフである。 好適な実施態様の詳細な説明 定義 本明細書及び請求の範囲で用いる「血流が途絶えた」という語は、血液循環が 停止し、続いて温虚血が起こる任意の状況下における、臓器又は組織を通過する 血液循環の停止を意味する。これには、外科的処置のために、又は心臓発作等の 自然の原因によって心臓の拍動が停止することが含まれる。 本明細書及び請求の範囲で用いる「臓器又は組織」という語は、腎臓、心臓、 肝臓、肺、小腸、膵臓、脳、目、及び肌を含むが、これらに限定されない「臓 器」を意味する。 本明細書及び請求の範囲で用いる「蘇生溶液」とは、血流が途絶え、虚血性の 損傷及び傷害を受けた臓器の完全性及び機能を再生し、血液が途絶えた臓器の血 液循環が回復する間に生じ得るさらなる組織の障害を防止又は抑制する手段を与 える緩衝化された生理的溶液を意味する。 本発明の方法は、本発明の蘇生溶液を用いて、少なくとも虚血の前致死的段階 の間に、虚血性の損傷を受けた臓器の完全性及び機能を再生することができる方 法である。本発明の時点では、僅か2〜3時間程度、血流が途絶えた臓器に対する 虚血性損傷及び傷害は、不可逆的であると考えられていたので、本発明の方法及 び組成物を用いて、臓器の完全性及び機能を再生することは、予期し得ないこと であった。さらに、本発明の方法及び溶液は、血流の途絶えた臓器に、血液循環 が回復する間に生じ得るさらなる組織の損傷を防止又は抑制することを目的とす る。 本発明の方法及び溶液は、臓器の血流が途絶えている間に蓄積した血液及び酸 性産物を除去するための手段；細胞の完全性及び機能を再生することにより、臓 器機能を回復させる手段；及び臓器を酸素化された環境に再適応させるための手 段を提供する。(1)生きた血管内皮細胞と接触している間には血液は凝固せず、 それ故、虚血性障害を受けた臓器を再潅流するこのような内皮細胞を元通り生か した状態で、ことが可能である；(2)血管運動（vascular dynamics）の再生は、 組織を十分に潅流して酸素化し、正常な自己制御機構を与えるために、十分な上 皮細胞依存性血管拡張を与えることに依存する；(3)蘇生のためには、毛細血管 が十分拡張しなければならないが、細胞の完全性が回復するように、正常な透過 性は変化してはならない；(4)虚血中に失われた栄養因子が回復しなければなら ず、機能を取り戻すために細胞の極性が確立されねばならないという前提に基づ いて、虚血性障害及び損傷の後に臓器の機能を再生し得ることが見出された。 本発明の方法及び溶液は、臓器機能を回復させる目的で、及び該臓器を酸素化 された環境に再適応させるために協働して、虚血性障害を受けた臓器を蘇生する 。図１は、本発明の蘇生方法及び溶液によってもたらされる臓器のプロセスを示 すフローチャートである。 以下の実施例は、本発明を実施するための好適な実施態様を示している。本発 明を説明するために用いられる以下の実施態様においては、以下の概念を考慮す ることが重要である。ヒトの臓器移植に関する組成物及び方法を評価するために は、ウシのモデルとイヌのモデルが適当と認められた。何故なら、該モデルは生 理学的な基礎を反映することが示されているからである。このように、本発明の 組成物及び方法は、これらの実験モデルで有効であることが示されたが、該組成 物及び方法は、主としてヒトに使用されるべきものである。実験モデルからヒト へスケールアップするための生理学的基礎は、当業者に公知であり、臓器容量及 び臓器流速のような差異を考慮することが含まれる（例えば、Harrisonら、1977 ,J．Pharm Sci.66:1679-1683）。これらの実施例は説明のためのものであって、 限定することを意図したものでないことを理解しなければならない。 例１ − プロセス 本発明のプロセスには、実質的に細胞死が起こる前に、器官における血流遮断 のウインドウの間、介在することが含まれる。当業者は、本発明のプロセスを用 い得るウインドウが、処置されるべき器官タイプにより変化し得ることを理解し よう。例えば、本発明のプロセスを用いる心臓の処置のためのウインドウは、約 １時間未満である一方で、腎臓は、約４時間以内の期間の血流遮断で本発明のプ ロセスを用いて処置し得る。虚血性損傷カスケードが細胞死に至ることを、図１ に説明する様式で停止させるために、本発明のプロセスには、次の工程が含まれ る。 （１）動脈システムを通して、虚血的に損傷を受けた器官に、約２８℃ないし約 ３７℃の温暖な温度にある本発明の蘇生溶液で洗い流し、（ｉ）血流遮断の期間 中、器官中に蓄積したアシドース生成物および血液を除去し； （ii）細胞の環境を生理的ｐＨに回復させ； （iii）微細管を適切に拡張させ； （iv）高エネルギー化合物を提供し、並びにグルコース、ピルベート(pyruvate) およびウリジン５’−トリホスフェート（ＵＴＰ）が含まれ得るがこれらに限定 されるものではない補足基質により解糖を支持することにより、救済手段として 、 進行中の嫌気性代謝を支持し、 （ｖ）代謝基質を提供し、アデニン化合物プールを回復させ、クエン酸サイクル を支持し、および電子輸送鎖の結合を再構築することにより、嫌気性代謝から酸 化性代謝への転換を開始させ、これにより分子状酸素がゆっくりと導入される結 果、酸素毒性により仲介される再灌流障害を防止し； （vi）器官の浸透性を実質的に変化させることなく、きつく狭窄され、水腫状の 、虚血的に損傷した器官内の微細管の内皮細胞床を適切に血管拡張させるための メカニズムであって、血管拡張が、安定な灌流圧、安定な流量並びに一定の温度 、一定のｐＨおよび一定の酸素化(oxygenation)を提供する器官組織の適切な灌 流を可能にするメカニズムを提供し、 （vii）栄養因子を提供し、虚血的に損傷を受けた器官における機能を再構築さ せ、もって、細胞一体性および機能を回復させるための代謝生成物を提供し；並 びに ２）動脈システムを通して、虚血的に損傷を受けた器官に、約２８℃ないし約３ ７℃の温暖な温度にある本発明の蘇生溶液を灌流させ、 （ｉ）酸素化、温度およびｐＨを正常化し； （ii）器官の浸透性を実質的に変更することなく、器官の血管系を適切に拡張す るためのメカニズムを提供することを続け、これにより安定な灌流圧力および安 定な血管系流量を導き、並びに （iii）虚血的に損傷を受けた器官における機能を再構築するための栄養因子を 提供し続け、これにより細胞接合を堅くし、膜極性を再構築するような細胞一体 性および機能を回復させるための代謝生成物を提供する。 当業者には、全プロセス、即ちフラッシュ工程および潅流工程の両工程の間、 本発明の再生溶液を用い得るので、フラッシュ工程中に誘導される利点の１また はそれ以上が、灌流工程においても持続することが理解されるであろう。 説明のためであり、限定することを目的とするものではないが、灌流工程にお いて、十分量の蘇生溶液が、温浸法により、カニューレを経由して、その特定の 器官のための主要な動脈血液供給内へ、その流れが血液を含有しなくなるまでゆ っくりと導入される。この方法により、虚血性血液およびアシドーシス生成物で あって、器官が血流を遮断されている期間に血管系空間に蓄積したものが、血管 系空間から除去される。さらに、ｐＨが回復され、新鮮な基質が配達され、好気 的代謝および細胞の一体性および機能に必要な他の細胞通路が支持される。当業 者には、フラッシュ工程において使用するために十分な蘇生溶液の量は、具体的 な器官のタイプおよびフラッシュされるべきサイズに、さらには血流遮断の時間 の長さに依存し得ることが理解されよう。説明のためのものであり、限定するこ とを目的とするものではないが、２００ないし６００ｍＬの蘇生溶液が、１〜３ 時間の期間血流を遮断されてきた人の腎臓をフラッシュするために十分な量であ ろう。 説明のためのものであり、限定することを目的とするものではないが、灌流工 程において、蘇生されている虚血的に損傷を受けた器官のために好適な収縮期の 圧力において、当該特定の器官のタイプについて正常に近い流量に到達するまで 、十分量の蘇生溶液をゆっくりと灌流させる。説明のためのものであり、限定す ることを目的とするものではないが、１〜３時間の期間血流が遮断されてきた人 の腎臓は、＜８０ｍｍＨｇの収縮期圧力において、＞５０ｍＬ／分の流量に到達 するまで、ゆっくりと灌流させることができる。ｐＨは、酸素化剤(oxygenator) を経由して、または蘇生溶液中の成分である酸素輸送化合物を経由して、分子状 酸素をゆっくりと導入することにより、生理的範囲に正常化される。灌流中の器 官の酸素化、さらには温度およびｐＨの正常化は、おおむね、灌流の初めの１５ 〜３０分内に発生する。器官がゆっくりと血管拡張すると、灌流圧力および流量 は、安定化し、器官は迅速に酸化性代謝へスイッチする。当業者には、灌流のた めに必要な時間の長さは、特定の器官のタイプおよび灌流されるサイズ、さらに は血流遮断の時間の長さに依存することが理解されよう。しかしながら、虚血的 に損傷を受けた器官を本発明のプロセス（フラッシュ工程および灌流工程）によ り約２時間処置することは、ほとんどの器官（例えば、０．５ないし４時間の血 流の遮断）が蘇生し、器官機能が回復するために十分であろう。また、もし、腎 臓が尿を生成するように、器官が生成物を産生するならば、本発明のプロセスは 、器官機能の正常な生成物の生産をもたらし得る。 本発明のプロセスは、伝統的な低体温法（４°ないし１０℃）を用いることな く、イクス・ビボ(ex vivo)で虚血的に損傷を受けた器官を蘇生し、保存するた め に開発されてきた。本発明のプロセスは、必要な酸素の配達、代謝のための栄養 物、コロイド浸透圧、ｐＨ、灌流圧力および流量を提供し、最も頻繁には、それ ぞれのイン・ビボ(in vivo)における正常な範囲内またはその近辺でのイクス・ ビボにおける器官代謝を支持する。本明細書において、正常な代謝速度(rate)付 近とは、正常な代謝速度の範囲の約７０％〜９０％と定義する。更に、本発明の プロセスは、イクス・ビボでの代謝のレベルであって、十分な酸化性代謝を提供 し、当該器官の正常な機能的生成物をもたらすものを支持する。伝統的な低温法 を用いることなく、イクス・ビボで器官を支持するこのプロセスの開発により、 代謝速度を正常付近に支持し、および手術後または移植後の経過と関連し得る機 能的能力を構築する機会が与えられる。 本発明の更なる態様において、本発明のプロセスは、蘇生溶液を配達するため の層状または拍動性ポンピングシステムを具備し、灌流および灌流圧力を、提供 しおよび制御するための手段；温度制御のための手段；並びに呼吸気体の導入お よび排出を、提供しおよび制御するための手段を含む装置を用いて実施すること ができる。そのような装置は、本発明者らによる米国出願番号第08/246,801号に 記載されており、この記載は、引用により本明細書に取り込む。そのような装置 は、既に器官の中を循環してきた灌流物を試験および／または回収し、ｐＨ、各 種の圧力、流量、血管抵抗性、各種の化学成分、酸素化、二酸化炭素濃度および 酸素消費のような機能的特徴の１またはそれ以上をモニターしおよび測定するた めの装置手段も含み得る。更に、前記装置手段または前記手段と共同する第２の 装置手段を用いて、腎臓由来の尿のような、器官から発生する器官生成物を測定 および／または回収することができる。ここで、器官生成物のパラメータを引き 続いて測定することは、本発明のプロセス中またはその後の器官一体性および機 能に関連し得る。 例２ − 蘇生溶液 当技術分野において、器官保存および灌流溶液には、塩溶液または細胞培養様 の基礎培地のような緩衝された生理学的溶液からなるベース溶液に、各種の合成 サプリメント(defined supplements)が添加されたものが含まれることが知られ ている。好ましい態様において、本発明の蘇生溶液は、アミノ酸、イオン、生理 学的塩、不浸透物(impermeant)、血清蛋白および／または因子並びに糖を含有す るようなベース溶液も用いることができる。本発明の蘇生溶液は、ベース溶液の 成分に追加して、少なくとも３つの成分カテゴリーに分類し得るサプリメントの 新規な組合せを含有する。当業者は、各々のカテゴリーの成分は、機能的に均等 な化合物であって、同じ結果を達成するものと置換し得ることを理解するであろ う。従って、各々の成分カテゴリー内の成分として列記した次の種は、説明のた めのものであり、限定することを目的とするものではない。 第１の成分カテゴリーである血管拡張薬には、生理学的に有効な量の成分の組 合せであって、平滑筋細胞の弛緩により大きい管を適切に拡張させる手段、さら には微細管を適切に拡張させる手段を提供するものが含まれる。血管系の正常な 浸透性が維持されることを保証するために、血管拡張は、内皮細胞に依存する方 法で制御される。そのような成分の組合せには、次のものが含まれる：（ｉ）内 皮細胞仲介性血管拡張のための基質(substrate)、例えば、アセチルコリン、ド ーパミン、ブラジキニンおよびアルギニン；（ii）微細管血管拡張のための基質 、例えばプロスタサイクリン（および類似体、例えば、カルバサイクリン(carba cyclin)）並びにＭｇ⁺；並びに（iii）アデノシン（および類自体、例えば、シ クロヘキシルアデノシン）並びにカルシウムチャネル遮断により仲介される血管 拡張に対して組合わされた影響を有するベラパミル（他のカルシウムチャネル遮 断剤には、フルナリジン(flunarizine)、ニフェジピン(nifedipine)、ＳＮＸ− １１、クロルプロマジン(chlorpromazine)およびジルチアゼム(diltiazem)が含 まれる。）。そのような血管拡張薬の組合わせを用いる結果、血管系は十分に拡 張される一方で、同時に、その一体性および正常な障壁機能が維持される。これ らの血管拡張薬は、サプリメントの新規な組合わせの体積（Ｗ／Ｖ）の約１％な いし約５０％含まれ、これらは、本発明の蘇生溶液を形成する際に、ベース溶液 へ添加される。 第２の成分カテゴリーである化学エネルギー基質には、生理学的に有効な量の 成分の組合わせであって、血流遮断の期間中に喪失する酸化性代謝を再構築する ための手段を提供するものが含まれる。血流遮断中に、膜一体性が喪失する結果 、イオンのような細胞内成分、アデニン化合物プールの成分、クエン酸サイクル の 成分、および結合した電子輸送鎖の成分が喪失する。再生溶液に添加されるその ような化学エネルギー基質には、次のものが含まれる：ピルベート；グルコース ；ＡＴＰ；ＡＭＰ；補酵素Ａ；β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ ＡＤ⁺）；β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ⁺ ）；フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）；チアミンピロホスフェートク ロリド（コカルボキシラーゼ）；ウリジン５’トリホスフェート（ＵＴＰ）；塩 素；アデノシン；マグネシウム；およびこれらの混合物。もし、細胞の死が起こ る前に組織細胞においてエネルギー供給が再構築されるならば、血流遮断期間中 の細胞の変化を逆転させ、組織細胞体積を正常に戻し得る。化学エネルギー基質 は、サプリメントの新規な組合わせの体積の約．０１％ないし約９０％含有され 、これらは、本発明の蘇生溶液を形成する際に、ベース溶液へ添加される。 第３の成分カテゴリーである、栄養因子には、生理学的に有効な量の成分の組 合わせであって、細胞修復プロセスの１またはそれ以上を促進し、血流遮断中の 期間に喪失した細胞機能を再構築する手段を提供するものが含まれる。栄養因子 の組合わせは、蛋白合成を促進する手段を提供し、より堅い細胞接合の再構築お よび膜極性の再発生を導き、これにより細胞機能の回復がもたらされる。蘇生溶 液に添加されるそのような栄養因子には、高濃度アミノ酸およびマグネシウム（ 例えば、典型的な血漿濃度の２ないし６倍）、核酸誘導体およびリボヌクレオシ ド；並びに膜補強剤を伴う成長因子、例えば、酸性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ ）、塩基性ＦＧＦ、ヘパリンおよびコンドロイチンサルフェート並びにこれらの 混合物が含まれ得る。成長因子は、サプリメントの新規な組合わせの体積の約１ ％ないし約９０％含有され、これらは、本発明の蘇生溶液を形成する際に、ベー ス溶液へ添加され、それに溶解される。 当業者は、３つの成分カテゴリーのいずれもの１またはそれ以上の成分は、本 発明のプロセスのために望ましい追加の機能を有し得ることを理解するであろう 。例えば、マグネシウムイオン（マグネシウム運搬化合物の要素として導入され たもの）は、血管拡張剤および化学エネルギー基質の両者として作用し；グルコ ースは、栄養因子および化学エネルギー基質の両者として作用する。さらに、好 ま しい態様において、蘇生溶液中に含有されるアミノ酸には、シスチンおよびシス テインが含まれ、これらは、栄養因子として機能することの他に、抗酸化剤−優 先遊離ラジカル捕獲剤(antioxidants-preferred free radical scavenger)であ って、本発明のプロセスのフラッシュ工程および灌流工程中に毒性の遊離のラジ カルを捕獲するものとしても作用する量含まれる。グルタチオン、シクロデキス トリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、クロルプロマ ジンおよびプロスタサイクリンのような他の抗酸化剤が本発明の蘇生溶液中に含 有され得、または、機能的に均等な化合物として用いられ得る。そのような抗酸 化剤は、サプリメントの新規な組合わせの体積の約０．０００％ないし約１０％ 含有され、これらは、本発明の蘇生溶液を形成する際に、ベース溶液へ添加され 、それに溶解される。 本発明の他の態様において、本発明の蘇生溶液を用いて蘇生されるべき組織に は、神経系組織（例えば、脳）が含まれ、本発明の蘇生溶液には、ＮＭＤＡ受容 体遮断剤（ＮＭＤＡ受容体イオンチャネル遮断剤、例えば、アプティガネル(Apt iganel)およびセレスタット(Cerestat)；ＮＭＤＡ受容体グリシン部位遮断剤、 例えば、２Ｄ ９３７９およびＧＶ １５０−５６２Ａ）のような神経保護薬、 窒素酸化物（ＮＯ）蓄積遮断剤（例えば、ルベルゾール(lubeluzole)、並びにナ トリウムチャネル遮断剤であって、細胞内へナトリウムが入ることを阻害し、グ ルタメート(glutamate)放出を誘発し得るもの（例えば、ＢＷ６１９−Ｃ８９、 フォスフェニトイン(fosphenytoin)がさらに含まれる。 本発明の他の態様において、本発明のプロセスで酸化剤を経由して分子状酸素 を誘導するのではなく、酸素輸送化合物（「酸素運搬剤」）であって、虚血的に 損傷を受け、傷つけられた器官に対して酸化性代謝のための分子状酸素を提供す る機能を奏するものが１またはそれ以上、蘇生溶液に含まれる。そのような酸素 運搬剤は、当業者に既知であり、次のものが含まれるが、これらに限定されるも のではない：ヘモグロビン、安定化ヘモグロビン誘導体（ピリドキシル化(pyrid oxylated)ヘモグロビンのような溶血されたヒト赤血球から製造されるもの）、 ポリオキシエチレン複合体（ＰＨＰ）、組換えヘモグロビン生成物、ペルフルオ ロ薬品（ＰＦＣ）エマルジョンおよび／またはペルフルオロ薬品微細泡 （集合的に「ペルフルオロ薬品」という）。そのような酸素運搬剤は、サプリメ ントの新規な組合わせの体積の約０．０００％ないし約５０％含有され、これら は、本発明の蘇生溶液を形成する際に、ベース溶液へ添加され、それに溶解され るか、または全蘇生溶液の約０．０００％（Ｖ／Ｖ）ないし約２０％含有される 。 酸素運搬剤として有用であるといわれるＰＦＣエマルジョンは、例えば、米国 特許第5,403,575号；第4,868,318号；第4,866,096号；第4,865,836号：第4,686, 024号；第4,534,978号；第4,443,380号；第4,423,077号；第4,252,827号；第4,1 87,252号；第4,186,253号；第4,110,474号；および第3,962,439号に記載されて いる。そのような液体ＰＦＣエマルジョンには、次のものが含まれるが、これら に限定されるものではない：ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロオク チルジブロミド、ブロモフルオロカーボン、ペルフルオロエーテル、フルオソー ル(Fluosol)ＤＡ^TM、Ｆ−４４Ｅ、１，２−ビスペルフルオロブチル−エチレン 、Ｆ−４−メチルオクタヒドロキノリジン、９ないし１２炭素ペルフルオロアミ ン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロインダン、ペルフルオロトリメチルビ シクロ［３，３，１］ノナン、ペルフルオロメチルアダマンタン、ペルフルオロ ジメチルアダマンタン。酸素運搬剤として有用であり得るＰＦＣ微細泡は、例え ば、米国特許第5,409,688号および米国特許第5,393,524号に記載されている。そ のような微細泡を創製するために有用であるとして開示されるＰＦＣには次のも のが含まれるが、これらに限定されるものではない：ドデカフルオロペンタン（ ＤＤＦＰ）、六フッ化硫黄、ペンタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフル オロプロパン、ヘキサフルオロエタン、オクタフルオロ−２−ブチン、ヘキサフ ルオロブタ−１，３−ジエン、イソプレン、オクタフルオロシクロブタン、デカ フルオロブタン、ｃｉｓ−２−ペンテン、硫化ジメチル、エチルアルシン、ブロ モクロロフルオロメタン、トランス−２−ペンテン、２−クロロプロパン、ヘキ サフルオロジスルフィド、エチルメルカプタン、ジエチルエーテル、エチルビニ ルエーテル、バリレン、トリスフルオロアルシン、臭化フルフリル、塩化ｃｉｓ −プロペニル、フッ化ブチル、１，１−ジクロロエタン、イソプロピルメチルエ ーテル、イソプロピルアミン、ギ酸メチル、２−アセチル−フラン、フッ化エチ レン、１−ペンテン、イソプロピルアセチレ ン、ペルフルオロペンタン、イソペンタン、ビニルエーテル、２−ブチン、１， ４−ペンタジエン、テトラメチルシラン、ジメチルホスフィン、ジブロモジフル オロメタン、２−クロロープロペン、ジフルオロヨードメタン、アセトアルデヒ ド、トリメチルホウ素、３−メチル−２−ブテン、１，１−ジメチルシクロプロ パン、アミノエタン、ビニルブロミド、ジシラノメタン、トリクロロフルオロメ タン、ブロモフルオロメタン、トリフルオロジクロロ−エンタン、ペルフルオロ ペンテンおよび他のフッ素含有炭化水素（米国特許第5,409,688号）。 本発明の蘇生溶液を製造するプロセスにおいて、サプリメントの新規な組合せ であって、血管拡張剤、化学エネルギー基質および栄養因子を含む少なくとも３ つの成分のカテゴリーに分類され得るものをベース溶液へ添加し、そこへ溶解さ せる。本発明のプロセスとともに使用するための本発明の蘇生溶液の組成は、成 分が変化し得るものであり、成分は、先に説明したような範囲にわたるものであ るが、好ましい処方を下記表１に示す。しかしながら、これらは説明のためのも のであり、限定する目的に示されるものではない。（なお、少なくとも３つの成 分カテゴリーのうち、２以上のカテゴリーにおいて効果を奏し得る成分は、以下 の１つのカテゴリー内に示した。これは明確にする目的であることに注意された い。） 表１ ベース溶液へ添加されるサプリメント （量は、ベース溶液１リットル当たりのミリグラム数である） このようにして調製された蘇生溶液は、容量オスモル濃度＞３３０ｍＯｓｍで あるが、好ましくは６００ｍＯｓｍ未満を有するべきであり、約３５０ｍＯｓｍ ないし約４００ｍＯｓｍの範囲が好ましい。蘇生溶液のｐＨは、約６．５ないし 約７．５の範囲内のｐＨに調整されるべきであり、好ましくは７．３ないし７． ４５のｐＨ範囲にあるべきである。 すでに指摘したように、他の態様において、蘇生溶液は、次に示す追加の抗酸 化剤、および１種またはそれ以上の酸素運搬剤をさらに含有することができる（ ベース溶液の１リットル当たり）。 例３−血液途絶に対する効果 実験は、臓器の血流を約３０分間途絶することにより惹起した温虚血に対する 効果を明らかにするために行った。前述の温虚血は、迅速な細胞完全性の低下を 招く。虚血性障害カスケードは、浮腫を招くアデニン化合物プールの喪失と共に 開始される。該細胞完全性の喪失および浮腫の発症は、結果的に血管の完全性を 虚脱し、正常な透過性機能の喪失を招く。腎などの臓器においては、正確な３０ 分間の腎血流途絶により惹起された虚血障害により、重度の血管収縮が誘導され ると考えられている。その重度の血管収縮が、十分な腎灌流を行うための十分な 流量率を得られない原因となる。収縮した血管における高い抵抗は、更に二次的 に生じる無酸素による悪化を引き起こし、それにより機能的能力の喪失（即ち、 尿産生機能の喪失）が生じる。表２は、血流途絶なしの仔ウシ腎（「正常群」） と正確に３０分間血流を途絶した仔ウシ腎（「虚血群」）とを具備する実験動物 モデル系における灌流特性（圧；流量率；および血管抵抗）並びに臓器機能（尿 産生）の比較を示している。血管抵抗は、平均圧／平均流量率である。 例４−蘇生方法および溶液の効果 実験は、本発明に従う方法および蘇生溶液に関する能力、即ち、臓器における 温虚血の影響を克服する（阻害のみではない）能力と、治療方法を援助すること により臓器の機能的損傷を回復可能な程度にする能力とを明らかにするために行 った。腎は、安楽死した仔ウシから得た。血流途絶の３０分後または６０分後に 、切開中線から腎を摘出した。無処置群は、抗凝固剤も投与せずに、腎摘出を行 う前に得た。対照群の各腎に、３０分間の血流途絶を行い、その期間の虚血性障 害に罹患した。該対照群の腎は、摘出後、３２℃の温度で、１００ｃｃの細胞培 養用基礎培地を用いて洗浄し、それによって腎の各血管内に残留した血液を洗い 流した。試験群の各腎は、６０分間の血流途絶を行い、その期間の虚血性障害に 罹患した。該試験群の腎は、摘出後、３２℃の温度で１００ｃｃの本発明の蘇生 溶液を用いて洗浄した。洗浄後、夫々の腎について、改変ＭＯＸ−１００^TM輸送 用蘇生システムにおけるポンピングを行った。対照群の腎は、３２℃で、臓器を 保護するために開発された従来技術（温蘇生技術を用い、灌流液として細胞培養 用基礎培地を用いる）を使用してポンピングを行った。試験群の腎は、本発明の 方法および蘇生溶液を用いて、32℃で、ポンピングした。灌流特性（圧；流量率 ；および血管抵抗）および臓器機能（尿産生）について、対照群（３０分w/o発 明）と試験群（６０分w/発明）とを比較した結果を、表３に示した。 試験群の腎（１時間の虚血性損傷を罹患した後、続いて本発明に従った方法お よび蘇生溶液を用いて蘇生を行った）における灌流特性（圧；流量率；および血 管抵抗）並びに臓器機能（尿産生）は、正常腎の機能的範囲内にあったことが、 表２に示された。従って、本発明に従った方法および蘇生溶液に関する能力、即 ち、臓器における温虚血の影響を克服する（阻害ばかりではない）能力と、治療 方法を援助することにより臓器の機能的損傷を回復可能な程度にする能力とが明 らかになった。 例５−種々の虚血時間に対する有効性 実験は、１時間よりも長い期間に亘り血流が途絶された臓器における、本発明 に従う方法および蘇生溶液の効果を評価するために行った。６０分間、９０分間 、２時間または４時間を含む種々の血流途絶時間で安楽死した仔ウシから、仔ウ シ腎を摘出した。無処置群は、抗凝固剤も投与せずに、腎摘出を行う前に得た。 次に、各腎を、３２℃の温度で、１００ｃｃの本発明に従った蘇生溶液で洗浄し た。何れの腎にあっても、血管内での血液凝固が観察された症例はなかった。該 血液は、生存可能な血管内皮に接する限り、流体を維持できるようである。洗浄 後、夫々の腎を幾時間かに亘り、本発明に従った方法および蘇生溶液を用いて、 ３０℃でポンピングした。６０分間（60'）血流を途絶した腎、90分間（90'）血 流を途絶した腎、２時間（120'）血流を途絶した腎、４時間（240'）血流を途絶 した腎の灌流特性（圧；流量率；および血管抵抗）および臓器機能（尿中クレア チニン濃度−クレアチニンクリアランス；組織学的知見）を表４に示した。 結果は、本発明に従った方法および蘇生溶液は、少なくとも４時間までの血流 途絶期間の虚血により損傷された臓器を蘇生することが可能であることを示して いる。例えば、60分間の温虚血性障害に罹患された腎を、該方法と蘇生溶液を使 用して２時間ポンピングした場合、灌流特性は表１に列記した正常腎での値に等 しくなる。試験した組織切片において形態および完全性が良好に保存されている ことが観察されるように、組織学的評価は機能的データを裏付けしている。 ９０分間および１２０分間の血流途絶では、６０分間の血流途絶の腎に比較し 、それらの腎は、より広範囲な細胞損傷を受ける（即ち、拡張期圧の上昇と流量 率の減少）。しかしながら、前述の細胞損傷に関わらず、これらの腎は、それで も猶、尿を産生し；組織学的には良好に保存されているように見える。加えて、 壊死は、これらの腎においては検出されなかったのである。 ４時間に亘り血流を途絶された腎は、実質的に流量率が減少し、それに付随し て拡張期圧が上昇（微小血管床における収縮を含む）することが示された。しか しながら、重要なのは、これらの腎が、それでも猶、臓器機能を示したことに注 目することである。尿は、２３．５ｍｇ／ｄＬの尿中クレアチニン濃度で産生さ れた。組織学的には、これらの腎は、早期の局所的壊死の初期症状を呈していた 。有糸分裂を示す特徴が、局所的尿細管壊死の範囲に隣接して観察され、これに より、活発化された修復過程が誘導されたことが示される。従って、血流途絶の ４時間後であってさえも、本発明の方法および蘇生溶液に関する能力、即ち、臓 器における温虚血の影響を克服する（阻害ばかりではない）能力と、治療方法を 援助することにより臓器の機能的損傷を回復可能な程度にする能力とを明らかに することができた。 該方法および蘇生溶液の相対的な利点を決定するために、対照群の腎（本発明 に従った方法および蘇生溶液による処置を行ってない）についても、２または４ 時間の何れかの血流途絶後に組織学的な評価を行ったことに注目することが重要 である。２時間の温虚血に暴露した対照群の腎の組織学的評価は、早期広汎性尿 細管壊死を示していた。４時間の温虚血損傷では、対照群の腎は、広汎性の尿細 管細胞障害を示していた。対称的に、２時間の温虚血に暴露し、続いて本発明に 従った方法および蘇生溶液で処理した腎では、修復された細胞の完全性が観察さ れた。その上更に、４時間の温虚血に暴露し、続いて本発明に従った方法および 蘇生溶液で処理した腎では、対照群の腎では広範囲の尿細管損傷が見られたのに 対して、局所的な尿細管壊死が見られたのみであった。該組織学的評価は、更に 、血流途絶後の温虚血発症カスケードを回復することに関する、本発明の方法お よび蘇生溶液の実質的な効果の裏付けをするものである。 例６−インビボにおける蘇生臓器の機能 Ａ．同種移植 本発明の方法および蘇生溶液を用いて蘇生された臓器の蘇生後における、イン ビボでの機能を評価した。イヌを用いた同種移植を、死後６０分間の血流途絶の 期間を経ること、ドナーのイヌから腎を摘出すること；本発明の蘇生溶液を用い て該臓器を洗浄すること；および本発明の方法および蘇生溶液を使用し、３０か ら３２℃、２時間で、該臓器を灌流することにより処理して行った。該蘇生方法 に続き、レシピエントから左右の腎を切除すると同時に、該腎をレシピエントの イヌに同種移植した。それによりレシピエントである該イヌは、蘇生された腎臓 に依存して生存することとなった。レシピエントであるイヌの移植後の経過を図 ２および３に示した。 該腎を十分に再潅流すると、移植の２時間以内に尿が産生された。該腎は、移 植後の観察期間を通して尿産生を持続した。図２に示されるように、実験に供し たレシピエントにおける血清クレアチニンは、移植後２４時間で２ｍｇ／ｄｌ以 上のレベルにまで若干上昇した。該血清クレアチニンは、移植後48時間以内に正 常範囲に回復した。該血清の化学的性質は、移植後の１０日目まで正常値を維持 し、１０日目に急性の臓器拒絶反応が生じた（不十分な処方計画により免疫抑制 剤が該レシピエントのイヌに投与された）。図３に示されるように、該尿中クレ アチニン値は急速に上昇し、移植後４８時間以内で約７０ｍｇ／ｄｌの正常範囲 内に収まった。初期に生じた急性尿細管壊死（ＡＴＮ）の、この非常に軽度な発 現は、移植後４８時間以内に迅速に回復した。急性尿細管壊死の回復可能な性質 と、それに加えて、移植腎の援助により該レシピエントを持続的に生存させる 能力とにより、６０分間より長い温虚血で罹患された移植した臓器の生存能力と インビボでの機能が立証された。従って、本発明の方法および蘇生溶液を使用し て蘇生された臓器は、蘇生の後、インビボにおいて機能することが可能な臓器で ある。 Ｂ．自家移植 もう一つの態様では、本発明の方法および蘇生溶液を使用して蘇生した臓器に 関して、インビボにおける蘇生後の機能を評価した。２匹のイヌを使用し、イヌ における自家移植を、左腎を摘出すること、続いて２時間の３７℃食塩水中での 温虚血性に損傷することにより行った。温虚血期間に続いて、腎をカニュレーシ ョンし、本発明の蘇生溶液により洗浄し；本発明の方法および蘇生溶液を使用し て、３０から３２℃で２時間、灌流した。該蘇生方法に続き、該腎を、未処理の 反対側腎を摘出するのと同時に、自家移植した。それにより、各レシピエントの イヌは、自らの生存を蘇生された該腎に完全に依存することとなった。該レシピ エントのイヌの移植後の経過を図４および５に示す。 該腎を十分に再潅流すると、移植から数時間以内で尿が産生された。該腎は、 移植後の観察期間を通して、尿の産生を維持した。図４に示されるように、実験 に供した両イヌとも、ＡＴＮに伴なう血清クレアチニンの含有量が若干上昇した 。各症例における血清中クレアチニン値のピークは、移植後３日目で現れ、夫々 ３．５ｍｇ／ｄｌおよび２．８ｍｇ／ｄｌの値を示した。しかしながら、該血清 クレアチニンレベルは、移植後１０日以内で正常値にまで回復した。血清の化学 的性質は、移植後の観察期間の残余期間に亘って正常値を維持した。図５に示さ れるように、血中クレアチニン値は急速に上昇し、血清の化学的性質が正常化す る以前の幾日かで正常範囲に回復した。安楽死の時点における組織学的知見で、 本質的に正常な腎であることが示された。これらの知見は、尿細管上皮が再生し たことを示す。急性尿細管壊死の回復可能な性質と、それに加えて、移植腎の援 助により該レシピエントを持続的に生存させる能力とにより、２時間より長い温 虚血で罹患された移植した臓器の生存能力と、インビボでの機能が立証された。 従って、本発明の方法および蘇生溶液を使用して蘇生された臓器は、蘇生の後、 インビボにおいて機能することが可能な臓器である。 例７−公知の保存溶液との比較 臓器を、本発明の方法および蘇生溶液、または当該分野で公知の保存溶液（基 礎培地−ＲＳＭ−２１０^TM若しくはＶＩＡＳＰＡＮ^TMの何れか）の何れかを用い て蘇生を行い、次に機能的および組織学的な比較を行った。６０分間の血流途絶 から罹患した腎の各群を、各溶液を使用して３２℃で洗浄し、各溶液で２時間の 灌流を行った：４℃のＶＩＡＳＰＡＮ^TM；または３０−３２℃のＲＳＭ−２１０^TM 若しくは本発明の蘇生溶液を用い、同じ蘇生方法を使用した。平均した灌流特 性（圧；流量率；および血管抵抗）並びに臓器機能（尿中クレアチニン濃度；組 織学的知見）の比較を、６０分間に亘り血流を途絶し、各溶液で処理した腎につ いて行った結果を、表５に示した。 表５に示された結果により、本発明の蘇生溶液は、ＲＳＭ−２１０^TMおよびＶ ＩＡＳＰＡＮ^TMに比較して、虚血性損傷を受けた臓器における血管特性および機 能を修復することに関してより優れた能力を有していることが示された。例えば 、蘇生過程において、本発明の蘇生溶液を用いて洗浄され、灌流された腎は、Ｒ ＳＭ−２１０^TMまたはＶＩＡＳＯＡＮ^TMを用いた洗浄および灌流された腎に比較 して、血管収縮が減少されていることと、流量率がより高いものであることを示 した。同様に、本発明の蘇生溶液を使用して洗浄し、灌流した腎については、臓 器機能が修復され、結果としてクレアチニンの分泌に一致する尿の産生が 成される腎のみであった。組織学的に、本発明の蘇生溶液、またはＲＳＭ−２１ ０^TMを使用して洗浄し、潅流した腎のみが回復し、これは良好に保護された腎構 造により示されるように、十分に保護されたものであった。対称的に、ＶＩＡＳ ＰＡＮ^TM溶液により洗浄され、灌流した腎は、糸球体腫脹および尿細管壊死を含 む組織学的損傷が存在していることが明らかにされた。当該技術分野で公知の保 存溶液に対し、本発明の方法および蘇生溶液が有するより優れた能力、即ち、臓 器における温虚血の影響を克服する能力、および治療方法を援助して臓器の機能 的損傷を回復可能な程度にする能力が明らかになった。 例８−蘇生方法における酸素の運搬 上記、詳細に記載したとおり、本発明の一態様は、蘇生溶液の処方における構 成要素として、一種または数種の酸素運搬剤を含むことである。種々の酸素運搬 剤の蘇生溶液中の構成要素としての効果、およびこれら酸素運搬剤の分子状酸素 運搬の相対的役割；および本発明による方法および蘇生溶液の、進行中の酸化代 謝を援助する能力が評価された。酸素運搬剤を補充していない蘇生溶液（表６で 「ＲＳ」と記す）、精製赤血球を補充した蘇生溶液（表６で「ＲＳ−ＲＢＣ」と 記す；１５％ｖ／ｖ）、精製ヘモグロビンを補充した蘇生溶液（表６で「ＲＳ− Ｈｇｂ」と記す；商業用調製の６０ｃｃ／リットル）、およびペルフルオロケミ カルエマルジョンを補充した蘇生溶液（表６で「ＲＳ−Ｒｆ」と記す；２０％ｖ ／ｖ）を、６０分の温虚血を受けた腎臓を蘇生するためにそれぞれ使用した。６ ０分の血流剥奪を受けた各グループの腎臓を、３００℃から３２℃で各溶液を用 いてフラッシュし、次いで３０℃から３２℃で２時間、各溶液で蘇生と同一方法 を用いて灌流した。６０分間血流を剥奪され、各溶液で処理された腎臓の平均灌 流特性（圧力；流速；および血管抵抗）および器官機能（尿のクレアチニン濃度 ；組織学）の比較を表６に示す。 蘇生溶液中の構成要素としての有効な酸素運搬剤によって、分子状酸素の濃度 が蘇生溶液中で増加するにつれ、蘇生方法の結果として器官機能が回復すること を、表６に示す結果は実証している。例えば、ペリフルオロケミカルまたは精製 ヘモグロビンの有効な酸素運搬剤は、当該方法の間に運搬される分子状酸素の濃 度が高まるという結果に至った。これら運搬剤のいずれかを含む蘇生溶液で処理 した腎臓の機能は、酸素運搬剤の添加されていない蘇生溶液、または低効率の酸 素運搬剤を含む蘇生溶液で処理した腎臓の機能以上に回復した。例えば、本発明 による精製ヘモグロビンまたはペリフルオロケミカルを含む蘇生溶液を用いると 、尿の平均クレアチニン濃度は、それぞれ１８ｍｇ／ｄＬおよび４１．８ｍｇ／ ｄＬという結果であった。対照的に、酸素添加器が蘇生方法に使用されず、且つ 蘇生溶液が酸素運搬剤を含んでいないか、または低濃度の精製赤血球を含んでい ると、尿の平均クレアチニンは、それぞれ８．４ｍｇ／ｄＬおよび８．３ｍｇ／ ｄＬであった。当該蘇生溶液の別の態様が実証されており、その中で、蘇生溶液 中の構成要素として一種または数種の有効な酸素運搬剤を添加することにより、 回復した器官の機能が本発明の方法により処理された虚血性損傷の器官において 認められている。 例９ 本発明による方法および蘇生溶液は、血流の剥奪された肝臓における温虚血の 効果を克服するため、および肝臓機能の欠陥が復帰し得る程度まで回復方法を援 助するために使用することができる。灌流に必要な時間の長さは、血流剥奪の時 間の長さ次第であり得るが、本発明による方法（フラッシュおよび灌流）で約２ 時間、虚血性損傷の肝臓を処理することは、多くの肝臓（例えば、約０．５から ４時間、血流の剥奪された肝臓）の蘇生において器官機能の回復に充分であり得 る。全体の肝臓機能、並びに肝臓の個々の生理学的側面を、循環灌流液および肝 臓生成物（胆汁）中の構成要素の濃度を測定することにより決定することができ る。肝臓の機能的特性は、胆汁塩、コレステロール、塩基性フォスファターゼの 胆汁濃度；胆汁ｐＨ；および血管流速、酸素消費、およびグルコース利用（潅流 液から測定）などの、これらに限定されないパラメーターを測定することにより 評価することができる。このように、例１および２で説明した方法および溶液に 従って、虚血性損傷肝臓を処理することができ、次いで代謝機能を予測して評価 することができる。 例１０ 本発明による方法および蘇生溶液は、血流を剥奪された膵臓における温虚血の 効果を克服するため、および膵臓機能の欠陥が復帰し得る程度まで回復方法を援 助するために使用することができる。灌流に必要な時間の長さは、血流剥奪の時 間の長さ次第であり得るが、本発明による方法（フラッシュおよび灌流）で約２ 時間、虚血性損傷の膵臓を処理することは、多くの膵臓（例えば、約０．５から ４時間、血流の剥奪された膵臓）の蘇生において器官機能の回復に充分であり得 る。全体の膵臓機能、並びに膵臓の個々の生理学的側面を、循環灌流液および膵 臓中の構成要素の濃度を測定することにより決定することができる。膵臓の機能 的特性は、アミラーゼ、リパーゼなどの膵臓酵素の濃度；ホルモンインシュリン ；膵臓分泌液のｐＨ、ナトリウムおよびカリウム；および膵臓血管の流速、酸素 消費、およびグルコース利用（灌流液から測定）を含む。このように、例１およ び２で説明した方法および溶液に従って、虚血性損傷膵臓を処理することができ 、次いで代謝機能を予測して評価することができる。 例１１ 本発明による方法および蘇生溶液は、血流を剥奪された心臓における温虚血の 効果を克服するため、および心臓機能の欠陥が復帰し得る程度まで回復方法を援 助するために使用することができる。灌流に必要な時間の長さは、血流剥奪の時 間の長さ次第であり得るが、本発明による方法（フラッシュおよび灌流）で約２ 時間、虚血性損傷の心臓を処理することは、多くの心臓（例えば、約０．５から ４時間、血流の剥奪された心臓）の蘇生において器官機能の回復に充分であり得 る。全体の心臓機能、並びに心臓の個々の生理学的側面を、循環灌流液および心 臓中の構成要素の濃度を測定することにより決定することができる。心臓の機能 的特性は、機械的および電気的作用、心臓酵素、例えばトランスアミナーゼ（ア スパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ Ｄ）、フルクトース１，６−二リン酸アルドラーゼ（ＡＬＳ）、リンゴ酸デヒド ロゲナーゼ（ＭＤ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、クレアチンホスホキ ナーゼ（ＣＰＫ）、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＢＤ）；心臓血管の流 速、酸素消費、およびグルコース利用（灌流液から測定）などの、これらに限定 されないパラメーターを測定することにより評価することができる。このように 、例１および２で説明した方法および溶液に従って、虚血性損傷心臓を処理する ことができ、次いで代謝機能を予測して評価することができる。 例１２ 本発明による方法および蘇生溶液は、血流を剥奪された小腸における温虚血の 効果を克服するため、および小腸機能の欠陥が復帰し得る程度まで回復方法を援 助するために使用することができる。灌流に必要な時間の長さは、血流剥奪の時 間の長さ次第であり得るが、本発明による方法（フラッシュおよび灌流）で約２ 時間、虚血性損傷の小腸を処理することは、多くの小腸（例えば、約０．５から ４時間、血流の剥奪された小腸）の蘇生において器官機能の回復に充分であり得 る。全体の腸機能、並びに小腸の個々の生理学的側面を、循環潅流液および小腸 中の構成要素の濃度を測定することにより決定することができる。小腸の機能的 特性は、胃酸刺激テスト、およびトレーサー分子を用いた吸収アッセイのような 機能アッセイ；小腸血管の流速、酸素消費、およびグルコース利用（灌流液から 測定）などの、これらに限定されないパラメーターを測定することにより評価す ることができる。このように、例１および２で説明した方法および溶液に従って 、虚血性損傷小腸を処理することができ、次いで代謝機能を予測して評価するこ と ができる。 例１３ 本発明による方法および蘇生溶液は、血流を剥奪された肺における温虚血の効 果を克服するため、および肺機能の欠陥が復帰し得る程度まで回復方法を援助す るために使用することができる。再灌流直前に界面活性物質で肺の移植組織をま ず処理することが望ましいと思われる（参照、例えばErasmusら、1996、Am．J． Respir．Crit．Care Med．153：665−670)。灌流に必要な時間の長さは、血流 剥奪の時間の長さ次第であり得るが、本発明による方法（フラッシュおよび灌流 ）で約２時間、虚血性損傷のを処理することは、多くの肺（例えば、約０．５か ら４時間、血流の剥奪された肺）の蘇生において器官機能の回復に充分であり得 る。全体の肺機能、並びに肺の個々の生理学的側面を、循環灌流液中の構成要素 の濃度、例えば界面活性物質タンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）レベルを測定することに より決定することができる。肺の機能的特性は、ＦＶＣ（努力肺活量）、ＦＥＶ １（１秒における努力呼気量）、ＰＥＦＲ（最大呼気流速）、ＶＡ（平均肺胞体 積）、ＴＬＣ（全肺気量）、およびＤＬＣＯ（一酸化炭素のための移送）などの 、これらに限定されないパラメーターを測定することにより評価することができ る。このように、例１および２で説明した方法および溶液に従って、虚血性損傷 肺を処理することができ、次いで代謝機能を予測して評価することができる。 ここで記載した本発明の態様および例は、単に説明のみの目的であって、限定 するものではなく、前記記載および添付図面から当業者に明らかないかなる変更 および改変も、添付の請求の範囲およびその均等な範囲の中に含まれることを理 解しなければならない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．虚血により損傷を受けた器官の修復を、該器官の機能障害が反転し得る程 度にまで誘導するための方法であって： 前記器官を、生理的緩衝溶液を用いて約28℃〜約37℃の温度でフラッシュする ことにより、血液および血流喪失の間に前記器官に蓄積したアシドーシス生成物 を除去することと； 前記器官を、該器官内の血管を拡張するための手段、細胞の完全性および細胞 機能を再確立することにより器官の機能を修復するための手段、および前記器官 を酸素添加された環境に再適用する際に該器官内の酸化的代謝を再確立するため の手段を更に含む生理的緩衝溶液を用いて、約28℃〜約37℃の温度で潅流するこ ととを具備した方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、前記器官を潅流するための生理的緩衝用 液が、更に、前記器官に血液循環が再生される際の器官組織の損傷を防止する手 段を含んでいる方法。 ３．請求項１に記載の方法であって、前記酸化的代謝を再確立するための手段 が、酸素添加器および酸素輸送剤からなる群から選択されたモードにより分子状 酸素を導入することを含む方法。 ４．請求項１に記載の方法であって、前記潅流は、前記生理学的緩衝用液を供 給する層流ポンプシステムまたは脈動ポンプシステムを含む装置を用いて行われ 、該装置は更に、潅流および潅流圧を提供および制御するための手段と、温度制 御のための手段と、呼吸ガスの導入および換気を提供および制御するための手段 と、既に前記器官を通して潅流された生理的緩衝用液を試験して、ｐＨ、種々の 圧力、流速、血管抵抗性、化学的成分、酸素添加、二酸化炭素濃度および酸素消 費のような一以上の機能的特性をモニターおよび測定する試験または採取のため の手段とを具備する方法。 ５．請求項４に記載の方法であって、前記潅流は、前記第一の装置と組み合わ せて、前記器官から放出される器官生成物を試験するために試験または採取する 第二の装置を用いて行われ、その後の前記器官生成物のパラメータの測定は、器 官の完全性および機能に関連する方法。 ６．虚血性損傷を防止するため、および虚血により損傷を受けた器官の修復を 、該器官の機能障害が反転し得る程度にまで誘導するための方法であって： （ａ）前記器官を、血液および血流喪失の間に前記器官に蓄積したアシドーシ ス生成物を除去する生理的緩衝用液（これは更に、前記器官を生理的ｐＨに修復 するための手段、前記器官の微小血管を拡張するための手段、進行中の嫌気的代 謝を指示する手段、建機的代謝から酸化的代謝への反転を開始させるための手段 、細胞の完全性および細胞機能を回復させるための代謝物を含む）を用いてフラ ッシュすることと、 （ｂ）前記器官を、生理学的緩衝用液（これは更に、器官の酸素添加、器官の 温度、および器官のｐＨを正常化するための手段、器官の血管を拡張するための 手段、細胞の完全性および細胞機能を回復するための代謝物を含む）を用いて潅 流することとを具備した方法。 ７．請求項６に記載の方法であって、前記器官を潅流するための生理学的緩衝 溶液は、更に、前記器官への血液循環の回復の際に、器官の組織損傷を防止する ための手段を含有している方法。 ８．請求項６に記載の方法であって、前記酸化的代謝を再確立するための手段 が、酸素添加器または酸素輸送剤からなる群から選択されるモードにより分子状 酸素を導入することを含む方法。 ９．請求項６に記載の方法であって、前記潅流は、前記生理学的緩衝用液を供 給する層流ポンプシステムまたは脈動ポンプシステムを含む装置を用いて行われ 、該装置は更に、潅流および潅流圧を提供および制御するための手段と、温度制 御のための手段と、呼吸ガスの導入および換気を提供および制御するための手段 と、既に前記器官を通して潅流された生理的緩衝用液を試験して、ｐＨ、種々の 圧力、流速、血管抵抗性、化学的成分、酸素添加、二酸化炭素濃度および酸素消 費のような一以上の機能的特性をモニターおよび測定する試験または採取のため の手段とを具備する方法。 １０．請求項９に記載の方法であって、前記潅流は、前記第一の装置と動作的 に関連した、前記器官から放出される器官生成物を試験するために試験または採 取する第二の装置を用いて行われ、その後の前記器官生成物のパラメータの測定 は、器官の完全性および機能に関連する方法。 １１．虚血による損傷を阻止するため、および虚血により損傷を受けた器官の 修復を、該器官の機能障害が反転し得る程度にまで誘導するための蘇生溶液であ って：該蘇生溶液は更に、 前記器官の血管を拡張するための生理学的に有効な量の血管拡張剤と； 器官の血流喪失の間に失われた酸化的代謝を再確立するための、生理学的有効 量の化学エネルギー基質と； 器官の血流喪失の間に失われた細胞機能を再確立する一以上の細胞修復プロセ スを促進するための、生理学的有効量の栄養素とを含有する蘇生溶液。 １２．請求項１１に記載の蘇生溶液であって、前記血管拡張剤は、内皮細胞媒 介性血管拡張の基質、微小血管拡張の基質、およびカルシウムチャンネルブロッ カーからなる群から選ばれる成分の組み合わせを含む蘇生溶液。 １３．請求項１２に記載の蘇生溶液であって、前記内皮細胞媒介性血管拡張の 基質はアセチルコリンおよびアルギニンを含み、前記微小血管拡張のための基質 はプロスタサイクリン(prostacycline)およびＭｇ⁺を含み、また前記カルシウム チャンネルブロッカーはアデノシンおよびベラパミル(verapamil)を含む蘇生溶 液。 １４．請求項１１に記載の蘇生溶液であって、前記化学エネルギー基質は、ア デニン化合物プールの成分、クエン酸サイクルの成分、および結合電子輸送鎖の 成分からなる群から選ばれる成分の組み合わせを含む蘇生溶液。 １５．請求項１４に記載の蘇生溶液であって、前記化学エネルギー基質は、ピ ルビン酸塩、グルコース、ＡＴＰ、ＡＭＰ、補酵素Ａ、β-ニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチド（Ｎａｄ＋）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ） 、チアミン、塩化ピロリン酸塩（コカルボキシラーゼ）、ＵＴＰ、塩素陰イオン 、マグネシウム、およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる蘇生溶液。 １６．請求項１１に記載の蘇生溶液であって、前記栄養素は、アミノ酸、マグ ネシウム、核酸誘導体、リボヌクレオシド、産生繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ） 、塩基性ＦＧＦ、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、およびこれらの組み合わせか らなる群から選ばれる蘇生溶液。 １７．請求項１１に記載の蘇生溶液であって、該溶液は更に、生理学的有効量 の、抗酸化剤、酸素運搬剤およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる成 分を含有する蘇生溶液。 １８．請求項１１に記載の蘇生溶液であって、前記溶液は更に、薬学的有効量 の神経保護薬を含有する蘇生溶液。 １９．虚血により損傷を受けた器官の修復を、該器官の機能障害が反転し得る 程度にまで誘導するための方法であって： 該方法は約28℃〜約37℃の温度で行われ、前記器官をフラッシュすること、お よび請求項１１に記載の蘇生溶液を用いて前記器官を潅流することを具備した方 法。 ２０．虚血により損傷を受けた器官の修復を、該器官の機能障害が反転し得る 程度にまで誘導するための方法であって： 該方法は約28℃〜約37℃の温度で行われ、前記器官をフラッシュすること、お よび請求項１７に記載の蘇生溶液を用いて前記器官を潅流することを具備した方 法。 ２１．虚血性損傷を防止するため、および虚血により損傷を受けた器官の修復 を、該器官の機能障害が反転し得る程度にまで誘導するための方法であって： 該方法は約28℃〜約37℃の温度で行われ、前記器官をフラッシュすること、お よび請求項１１に記載の蘇生溶液を用いて前記器官を潅流することを具備した方 法。 ２２．虚血性損傷を防止するため、および虚血により損傷を受けた器官の修復 を、該器官の機能障害が反転し得る程度にまで誘導するための方法であって： 該方法は約28℃〜約37℃の温度で行われ、前記器官をフラッシュすること、お よび請求項１７に記載の蘇生溶液を用いて前記器官を潅流することを具備した方 法。 ２３．虚血性損傷を防止するため、および虚血により損傷を受けた器官の修復 を、該器官の機能障害が反転し得る程度にまで誘導するための溶液を調製する方 法であって：生理学的緩衝用液に添加剤を加えることを具備し、 該添加剤は、前記器官の血管を拡張するための生理学的有効量の血管拡張剤 と；器官の血流喪失の間に失われた酸化的代謝を再確立するための生理学的有効 量の化学エネルギー基質と；器官の血流喪失の間に失われた細胞機能を再確立す る一以上の細胞修復プロセスを促進するための、生理学的有効量の栄養素とを含 み、 前記溶液は、約6.5〜7.5の範囲のｐＨおよび330ｍＯｓｍを超える浸透圧を有 するように調節される方法。 ２４．請求項２３に記載の方法であって、前記血管拡張剤は、内皮細胞媒介性 血管拡張の基質、微小血管拡張の基質、およびカルシウムチャンネルブロッカー からなる群から選ばれる成分の組み合わせを含む方法。 ２５．請求項２４に記載の方法であって、前記内皮細胞媒介性血管拡張の基質 はアセチルコリンおよびアルギニンを含み、前記微小血管拡張のための基質はプ ロスタサイクリン(prostacycline)およびＭｇ⁺を含み、また前記カルシウムチャ ンネルブロッカーはアデノシンおよびベラパミル(verapamil)を含む方法。 ２６．請求項２３に記載の方法であって、前記化学エネルギー基質は、アデニ ン化合物プールの成分、クエン酸サイクルの成分、および結合電子輸送鎖の成分 からなる群から選ばれる成分の組み合わせを含む方法。 ２７．請求項２６に記載の方法であって、前記化学エネルギー基質は、ピルビ ン酸塩、グルコース、ＡＴＰ、ＡＭＰ、補酵素Ａ、β-ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチド（Ｎａｄ＋）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、チ アミン、塩化ピロリン酸塩（コカルボキシラーゼ）、ＵＴＰ、塩素陰イオン、マ グネシウム、およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる方法。 ２８．請求項２３に記載の方法であって、前記栄養素は、アミノ酸、マグネシ ウム、核酸誘導体、リボヌクレオシド、産生繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、塩 基性ＦＧＦ、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、およびこれらの組み合わせからな る群から選ばれる方法。 ２９．請求項２３に記載の方法であって、該溶液は更に、生理学的有効量の、 抗酸化剤、酸素運搬剤およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる成分を 含有する方法。 ３０．請求項２３に記載の方法であって、前記溶液は更に、薬学的有効量の神 経保護薬を含有する方法。