JP2000511775A

JP2000511775A - Ｃｄ４とケモカイン受容体領域の複合体に対する抗体、及びｈｉｖ感染に対するそれらの利用

Info

Publication number: JP2000511775A
Application number: JP10500752A
Authority: JP
Inventors: ワン，チャン・イー
Original assignee: ユナイテッド・バイオメディカル，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-06-03
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2000-09-12
Also published as: ES2270461T3; BR9709524A; EP0910659A2; CA2256306C; BRPI9709524B8; EP0910659B1; BRPI9709524B1; WO1997046697A2; WO1997046697A3; DE69736474T2; CN1227610A; DK0910659T3; ATE335835T1; DE69736474D1; CA2256306A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、記載のプロトコールおよびスクリーニング手順に従って、末梢血単核Ｔ細胞、胸腺細胞、脾細胞、およびＨＰＢ−ＡＬＬやＳＵＰ−Ｔなどのような白血病またはリンパ腫由来のＴ細胞株細胞など、ＣＤ４発現Ｔリンパ球を免疫原として使用することによって製造されたモノクローナル抗体に関する。本発明のモノクローナル抗体は、生体外および生体内においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の一次分離ウイルスおよび関連の免疫不全ウイルスを中和する能力を特徴とする。この抗体は、ケモカイン受容体のドメイン関連のＣＤ４タンパクを含む宿主細胞抗原複合体に対するものであり、ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）の全てのクレードからの一次分離ウイルスおよびＨＩＶ２型（ＨＩＶ−２）およびシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の一次分離ウイルスに対して広い中和活性を有する。本発明はこのような抗体、このような抗体を分泌するハイブリドーマ、このような抗体を含む医薬組成物を選択して製造する方法、および主要標的がＣＤ４発現リンパ球であるこのような抗体によって、ヒトをはじめとする霊長類における免疫不全ウイルス接触前後の感染予防方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 CD4とケモカイン受容体領域の複合体に対する抗体、及びHIV感染に対するそれらの利用発明の概要本発明は、説明されているプロトコルおよびスクリーニング手順に従って、末梢血単核T細胞と、胸腺細胞と、脾細胞と、HPB-ALL又はSUP-T等の白血病またはリンパ腫由来T細胞系細胞等のCD4発現Tリンパ球を免疫原として用いることによるモノクローナル抗体に関する。本発明のモノクローナル抗体は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)と関連免疫不全ウイルスの一次分離株を生体外（in vitro）および生体内（in vivo）中和能力によって特徴づけられる。この抗体は、ケモカイン受容体領域と共にCD4蛋白質を含む宿主細胞抗原複合体に対するもので、全クレードのHIVI型(HIV-1)の一次分離株とHIV2型(HIV-2)およびサル免疫不全ウイルス(SIV)の一次分離株に対して広い中和活性を有する。本発明は、この様な抗体と、この様な抗体を分泌するハイブリドーマと、この様な抗体を含む医薬組成物の選択と生産方法、および一次標的がCD4発現リンパ細胞である抗体によるヒトを含む霊長類における免疫不全ウイルス接触前後の感染予防方法にも関する。発明の背景後天性免疫不全症候群(エイズ)ウイルスとしてHIVが最初に発見されて以来12 年間、エイズの分子クローニングおよびエイズウイルスの特徴付けから10年間にわたるワクチンの徹底的な研究にもかかわらず、HIVワクチンと免疫療法の発展には未だ大きな障害が横たわっている。これらの障害には、HIV-１の多様性、ウイルス伝染の経路/様式が複数であること、およびHIV感染の予防に必要な免疫応答が理解されていないことが挙げられる。1995年7月28日(Cell 82:175-176)に発表された論文の中で、David Baltimoreはこの分野の全科学者達に、米国国立衛生研究所(NIH)の予算の10％が割り当てられているこのウイルス感染が、なぜこれほど解明されていないのか、一歩後退して、熟考することを提案した。幾つかの臨床試験から得られたワクチン血清がHIV-1の実験分離株を生体外で中和できるとすれば、有効な組み換えHIV-1エンベロープサブユニットワクチン( 例えば、gp120およびgp160ワクチン生成物)が得られるものと楽観視されていた( Belshe et al.，JAMA，1994，272:475;Keefer et al.，AIDS Res Hum Retroviru ses ，1994，10:1713)。この楽観的考えは、ワクチン血清がHIV-1の一次患者分離株の中和に関して極めて無効であることが発見された時点でぐらついた(Hanson ，AIDS Res Hum Retroviruses，1994，10:645;Mascola et al.，J Infect Dis， 1996，173:340)。NIHは1994年6月に、これらの期待外れの発見により、HIVサブユニットワクチンに基づく幾つかの組み換えエンベロープ蛋白質の高価な大規模有効性試験の延期を決定した。 HIV-1の一次分離株は、患者の末梢血単核細胞(PBMCs)または未感染PBMCsを含む血漿の限界培養により得られる。これらは、この分野においてヒトの感染に関与するHIV株に近似している(Sawyer et al.，J Virol，1994，68:1342;(Corneli ssen et al.，J Virol)，1995，69:1810)。一次分離株は、ヒトTリンパ系細胞系において長期間にわたり継代培養され、これらのT細胞系で成長するように十分に改変された、一般に使用されているIIIb/LAI、SF2、MN等の実験用に改変されたT細胞向性ウイルスと容易に識別される。第一に、大部分の一次分離株は、一次T細胞も感染できるが、M向性であり、培養されたT細胞系において成長しにくく、単核細胞またはマクロファージ向性である(Cheng-Mayer et al.，Science， 1988，240:80)。第二に、一次分離株は、ウイルス受容体蛋白質CD4(rsCD4)の組み換え可溶型による生体外中和に高度に抵抗性を有し、実験株の200-2700倍に相当する中和を要する(Daar et al.，PNAS USA，1990，87:6574-6578)。第三に、一次分離株は、gp120ワクチンの使用により誘発される抗体の中和にも抵抗性を有する(Mascola et al.)。一次分離株は、PBMC培養においてシンシチウム形成を誘導するシンシチウム誘導分離株(SI)と、非シンシチウム誘導(NSI)分離株の両者を含む。SI−次分離株の内、大部分は特にHIVに感受性を有するT細胞系MT2において複製するが、実験用に改変した分離株の培養に通常使用される、CEMまたはH9等の複製可能性の小さい形質転換T細胞系において複製できるのはわずかである。非シンシチウム誘導(NSI)一次分離株は、末梢血からの一次T細胞においてのみ培養できる。エイズワクチンに対する初期の楽観的観測は、サル免疫不全ウイルス(SIV)の不活化ウイルス製剤に関する研究からも生じた。HIV-1とSIVの形態と、遺伝子構成と、感染および疾病の経過とが類似している事から、アカゲザルにおけるSIV 感染は、異なるエイズワクチン戦略を探索するための優れたモデルとなった。このモデルにおける初期の研究から、ヒトT細胞系で成長させ、アジュバント中に処方されたSIVの不活化製剤により、ヒト細胞で成長させたSIVの感染性が高い、病原性変種を実験的に接種したマカークザルを感染から防御できることが明らかとなった(Desrosiers et al.，PNAS USA，1989，86:6353-6357;Murphey-Corb et al.，Science，1989，246:1293)。予想に反して、同種のサル細胞で成長させた SIV母株を免疫感作動物の抗原投与に使用すると、この防御作用は失われた。後に、サル細胞で成長させたSIVと未感染ヒト細胞を用いる免疫感作実験から、これら初期のSIV研究における感染の防御作用は、ウイルスをエンコードされた抗原に対してではなく、異種ヒト宿主細胞蛋白質に対する免疫応答の刺激によって恐らく生じたことが明らかにされた(Stott，Nature，1991，353:393)。SIV に関する受動免疫感作実験は、幾つかの抗細胞抗体が、細胞性免疫がない場合、 SIV感染に対する防御作用に寄与することを示唆する証拠を提供している(Gardne r et al.，AIDS Res Hum Retroviruses，1995，11:843-854)。抗細胞抗体により提供されるSIV接種に対する防御免疫の機序は明らかにされていない。提唱されている一機序は、SIV感染からの抗細胞性防御はウイルス関連細胞蛋白質が関与している可能性があるとしている。HIVおよびSIVの様な免疫不全ウイルスは、宿主細胞膜からウイルスの芽として恐らく宿主細胞から得られる細胞蛋白質を組み入れることが知られている。主要組織適合遺伝子複合体(MHC )関連細胞蛋白質、β₂-ミクログロブリン、HLA-DR、HLAクラスI分子の幾っかに対する抗体は、SIVおよびHIVの実験株の生体外での中和に関与していた(Arthur et al.，Science，1991，258:1935)。MHC関連表面蛋白質の他に、Monteferiori et al.(Virology，1994，205:82;AIDS Res Hum Retroviruses，1995，11:1429) は最近、ヒト細胞で成長させたSIVおよびHIV-1表面に3つの補体制御蛋白質、CD4 6、CD55およびCD59を同定し、これによって、これらの宿主細胞分子も補体によるウイルス溶解を回避するための機序として、ウイルスにより利用されている可能性が高くなった。別の提唱されている機序は、抗細胞抗体による防御が、これまで認識されていない方法で、免疫系細胞に対する免疫不全ウイルスの活性をブロックすることにより仲介される可能性があるとしている。宿主T細胞の表面にC D4と共に宿主細胞抗原複合体が存在しており、ウイルスの結合と侵入を促進し、防御抗細胞抗体の標的として作用するものと思われる。本発明に関する研究の進行中に、HIVを結合するための宿主抗原複合体のCD4受容体の他に、HIVの複製、侵入または融合に影響をその他の要素またはHIV補助受容体が最近報告された。これらには、CD8⁺T細胞により産生される3種類のケモカインが含まれ(Cocchi et al.，Science，1995，270:1811-1815)、これらはHIV抑制性であると報告されており、以下の通りである、T向性であるが、M向性ではないHIV-１融合および侵入のためのCD4発現細胞に存在する補助受容体CXC-CKR4(fu sinまたはLESTRとも呼ばれる)(Feng et al.，Science，1996，272:873)、M向性であるが、T向性HIV-1の補助受容体として3種類の抑制ケモカインを結合するβ −ケモカイン受容体 CC-CKR5(Doranz et al.，Cell，1996， 85:1149;Dragic et al.，Nature，1996，381:667;Choe et al．Cell，1996，85: 1135;Deng et al.，Nature，1996，381:661;Alkhatib et al.，Science，1996， 272:1955)、およびM向性および二重向性HIVの補助受容体としてのその他のβ-ケモカイン受容体(Dranz et al.，Cell，1996，85:1149)。これらの補助受容体は、過去に報告されている7つの貫膜断片を持つG蛋白質に結合された受容体であることが明らかにされている(Loetscher et al.，J Biol Chem，1994，264:232; S amson et al.，Biochemistry，1996，35:3362)。防御反応の機序を刺激していると想定される細胞蛋白質をより正確に同定するために、また抗細胞抗体によって仲介される防御の機序をより明確に特徴づけるために、本発明者により、生体外ミクロプラーク中和分析においてHIV−次分離株を中和できる抗体を同定するために、複数の細胞抗原:β₂-ミクログロブリン、MHCクラスI HLA A、B、C、MHCクラスII HLA-DR蛋白質、およびその他のT細胞系に関連するT細胞抗原に対する一群のモノクローナル抗体のそれぞれに関してH IV中和活性の特徴が明らかにされた。実験は、その様な活性を有することが明らかにされている抗体に関して、もしもあるならばその様な中和活性の範囲を決定するために、また適切な動物モデルにおいてこの様な生体外活性を生体内有効性に変換できるかどうか明らかにするために実施された。これらの実験結果から、CD4を含む宿主細胞抗原複合体に対する抗体を除いて、CD4のみに特異性を有する抗体を含め、その他の抗細胞抗体は全て中和分析においてHIV-1一次分離株を有効に中和できないことが実証された。結果から、ケモカイン受容体の領域と共にCD4を含む宿主細胞抗原複合体に対する抗体が、rsC D4との結合を強化することも明らかにされた。更に、所望の特性を有する抗体が同定され、サルにおいて生体内SIV感染を防止し、マウスにおいて再構成されたヒト免疫系の生体内HIV-1感染を防止することが可能である。発明の簡単な説明本発明は、(1)CD4発現細胞へのHIVの結合を遮断する、(2)CD4発現細胞間のHIV により誘導されるシンシチウム形成を遮断する、(3)全クレードのHIV1型の一次分離株およびHIV2型およびSIVの多様な一次分離株によるCD4陽性細胞の生体外感染を有効に中和する、(4)HIV-1の一次分離株によるCD4陽性細胞の生体外感染を、これらのウイルスの曝露前および曝露後に有効に中和する、(5)これらの抗体を非経口投与により、すなわち静脈内投与または腹腔内投与により投与した場合に、HIVおよびSIVの一次分離株によるアカゲザルとヒトを含む霊長類の感染を予防する、(6)HIV-1の一次分離株によりヒト末梢血リンパ球を再構成されたSCID(h u-PBL-SCID)マウスの感染を曝露前および曝露後に予防することが可能な抗体およびその相同物を初めて供給する。従って、本発明は、HIVの一次分離株、すなわち末梢血単核細胞(PBMC)においてのみ3-5回以上継代培養されていない患者の分離株を中和する能力を有するヒトCD4発現細胞表面に存在する、CD4を含むヒト宿主細胞抗原複合体に結合するモノクローナル抗体に関する。より具体的には、全クレードのHIV1型の一次分離株およびHIV2型およびSIVの多様な一次分離株に対する広範かつ有効な中和活性を有する、CC-CKR5の様なケモカイン受容体の領域と共にCD4蛋白質を含む表面に露出した宿主細胞抗原複合体に存在する抗原決定基に対する抗体に関する。本発明は、静脈内投与および/または腹腔内投与により、PBSまたは完全フロイントアジュバントの様なアジュバントにおいて洗浄および再懸濁された5-10x10⁶個のCD4 発現細胞、好ましくは、急性Tリンパ芽球性白血病患者からのHPB-ALL、またはT 細胞非ホジキンリンパ腫患者からのSUP-Tの様な、ヒトT細胞白血病またはリンパ腫由来の細胞系を用いて、ヒト以外の哺乳動物を免疫感作し、続いて、アジュバントを含まないPBSに再懸濁された5-10x10⁶個の洗浄細胞を2回以上静脈内投与または腹腔内投与する事による、抗体を産生する方法にも関する。免疫感作された動物によって産生される抗体は、それらの血清抗体が以下に結合する能力によって認識され、１． rsCD4、２．増強された反応性を有するケモカイン受容体の領域を伴うrsCD4、３．高分解能蛍光顕微鏡で示されるように、“cap”方式でHPB-ALLまたは SUP-T細胞を含むCD4発現細胞の表面、４．ペプチド:rsCD4由来のAA₁-AA₂₀、AA₈₁-AA₉₂、AA₇₉-AA₈₈、AA₆₀-AA₁₀₉、 AA₁₁₈-AA₁₆₅、AA₂₃₅-AA₂₅₁、AA₂₉₇-AA₃₅₁またはAA₃₆₁-AA₃₇₅、そして、５． HIVの一次分離株を中和できる。本発明の抗体は更に、HIVまたはSIVの一次分離株による感染に対し、霊長類またはhu-PBL/SCIDマウスに50mg/kg未満のED₅₀で、受動免疫を供給することにより特徴づけられる。本発明には、これらの特徴を有する抗体を分泌するハイブリドーマが含まれる。一次標的がCD4発現リンパ球である感染物質によって引き起こされる、細胞ヒトを含む霊長類における免疫不全ウイルス感染の曝露前および曝露後の予防用組成物も企図されている。本発明の抗体およびその相同物は、CD4発現細胞に存在するCC-CKR5の様なその他のケモカイン受容体の領域を伴う場合には特に、CD4分子を含む宿主細胞抗原複合体の“不連続に分散する形態の”抗原決定基を認識する。抗体は、ペプチド:CD4のAA₁-AA₂₀、AA₈₁-AA₉₂、AA₇₉-AA₈₈、AA₆₀-AA₁₀₉、AA₁₁₈ -AA₁₆₅、AA₂₃₅-AA₂₅₁、AA₂₉₇-AA₃₅₁およびAA₃₆₁-AA₃₇₅を含むヒトCD4(表1;SE Q ID NO:1)の細胞外領域のいずれか由来の合成疑似物質に結合する。本発明は、抗体相同物にも関する。これらには、モノクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体領域に有望されたある種の動物の抗体領域を含む組み換えキメラ抗体、およびヒト化された抗体が含まれる。本発明の抗体相同物は、好ましくは、重鎖と軽鎖を持つ無傷の免疫グロブリン分子である。更に、本発明のCD4反応性抗体相同物は、上記の結合特性を持つFab断片、Fab'断片、F(ab')₂断片、F( v)断片またはその他の免疫グロブリン断片である。好ましい抗体または抗体相同物として、本発明によりB4またはM2またはB13と名付けられたマウスモノクローナル抗体が提供される。本発明の抗体相同物を産生するハイブリドーマ、これらの細胞を培養することによる抗体相同物の選択および産生方法、および本発明のハイブリドーマ産生方法も提供される。図の簡単な説明図1は、核酸配列から推定される宿主抗原複合体の一部、ヒトCD4のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)を示す。アミノ酸は下記の様に一文字の略号で表示されている。 Littman et al．(Cell，1988，55:541)の補正されたナンバリング方式を用いて、AA₁-AA₁₁₀、AA₁₁₁-AA₁₈₁、AA₁₈₂-AA₂₈₇、AA₂₈₈-AA₃₇₅、AA₃₇₆-AA₃₉₃、AA₃₉₄-A A₄₃₃はそれぞれCD4の第一、第二、第三、第四細胞外領域、貫膜領域、細胞質領域を表す。図2は、理論的に可能な抗原決定基の形態図である。抗体の代表として簡単なＦｖフラグメントのスケッチで表している。黒四角は、抗原決定基のアミノ酸と接触する抗体の部分を示している。抗原決定基のアミノ酸は小さな丸で示されている。抗原決定基のアミノ酸が、1つの連続するペプチド配列を形成する場合には、この抗原決定基は“線形”であると見なされる(例えば、モノクローナル抗体E31およびE6);折り畳まれた立体配座のために空間的に隣接する2つまたは数本のペプチドにアミノ酸が分散している場合には、抗原決定基は“不連続”と呼ばれる(例えば、モノクローナル抗体J33、H5、D5、E2、I26)。最も極端な場合は、 “不連続分散”と呼ばれ、複合体の中の1つまたはそれ以上の分子に由来する多くの不連続部位が、折り畳まれた立体配座により結合し、延長された抗原決定基を形成する(例えば、モノクローナル抗体B4およびM2の抗原決定基)(Meloen et a l.，Ann Biol Clin，1991，49:231から修飾)。図3は、6種類の真正CD4抗体、ケモカイン受容体と共にCD4を含む宿主細胞抗原複合体を認識する2種類の抗体、およびモルモットαrsCD4血清に観察される、 CD4発現HPB-ALL細胞への3種類の結合:キャップ、パッチ、クラスターの図である。免疫蛍光分析において、HPB-ALL細胞へのB4またはM2の結合は、高分解能蛍光顕微鏡下に、細胞に“キャップ”(A)の形状の蛍光スポットとして現れる。HPB-A LL細胞への抗CD4抗体またはモルモットαrsCD4のそれぞれの結合は、“パッチ” (B)の形状の蛍光スポットとして現れる。HPB-ALL細胞へのFITC標識HIV-1gp120蛋白質の結合は、“クラスター”形状の蛍光スポットとして現れる。図4は、用量依存性試験によるケモカイン受容体CC-CKR5領域３ペプチド(p2047 a)によって発揮される、種々のモノクローナル抗体に関するrsCD4結合活性の増強率(％)を示す。図5は、rsCD4/ケモカイン受容体CC-CKR5領域3ペプチド混合物とrsCD4に関するモノクローナル抗体B4の親和性増強量(IC₅₀ rsCD4)を示す。発明の詳細な説明ここに使用されている“ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)の一次分離株”は、患者の末梢血単核細胞(PBMCs)または未感染PBMCsを含む血漿の5回までの継代培養の限界培養により得られる。一次分離株は、ヒトTリンパ系細胞系において長期間にわたり継代培養され、これらのT細胞系で成長するように十分に改変された、一般に使用されているIIIb/LAI、SF2、MN等の実験的に改変されたT細胞向性ウイルスと容易に識別される。第一に、大部分の一次分離株は、T細胞系において成長しにくい。例えば、PBMC培地においてシンシチウム形成を誘導する多くの一次分離株(SI分離株)は特にHIVに感受性を持つMT2 T細胞系において複製するが、CEMまたはH9等のより透過性の低いT細胞系においてはわずかしか複製しない。非シンシチウム誘導(NSI)一次分離株は、一次T細胞においてのみ複製する。第二に、一次分離株は、ウイルス受容体蛋白質CD4の組み換え可溶型(rsCD4)による生体外中和に対する感受性に関して、実験株とは異なっている(Daar et al.，PNAS USA，1990，87:6574-6578)。第三に、実験用に改変された株は、ウイルスエンベロープに特異性を有する抗体による中和に対して感受性を有するが、一次分離株は抵抗性を示す(Sawyer et al.，J Virol，1994，68:1342;Mascola et al.，J I nfect Dis，1996，173:340)。実施例1、表2に示すように、HIV-1 MNの様な実験株は抗V3抗体による中和にかなり感受性が高いが、2種類の一次分離株は一次分離株は、HIV-1 MNに対する中和力価が1:203,080である抗V3製剤に対してさえも抵抗性を示す。しかし、抗細胞抗体によるHIV実験株と一次分離株の中和は、抗エンベロープ抗体とは異なる傾向を辿る。実施例2表3において、β₂-ミクログロブリン、MHC クラスI HLA A、B、CおよびMHCクラスII HLA-DR、およびその他の十分特徴が明らかにされたT細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体は、実験細胞系由来のH IV-1 MN株による感染も、HIV-1 Bクレード一次分離株による感染も抑制しなかったが、rsCD4蛋白質に対する中等度の反応性とHPB-ALL細胞およびCC-CKR5の様なケモカイン受容体領域を伴うrsCD4蛋白質への強い結合力を有するHPB-ALLに対して産生されるモノクローナル抗体(モノクローナル抗体B4)は、HIV-1の一次分離株の中和に関して極めて有効であるが(表3、7、13)、実験細胞系由来のHIV-1MN 株の中和に関しては効果が少ないことが明らかにされた(表13)。B4は、10μｇ/m L未満の濃度で(表3、7、13)生体外ミクロプラークアッセイにおいて、CD4のみに特異性を有する抗体よりも遥かに有効にHIV−次分離株を中和することが明らかにされた(表7)。従って、一次分離株は、抗CD4含有宿主細胞抗原複合体抗体に選択的に感受性を有する様に見える。モノクローナル抗体B4の中和活性は、HIVおよびSIVの交差中和を含む程度まで達している(表14)。これらの結果(表7、13)は、HIVに関連する細胞蛋白質の中に、CD4と、交差中和する抗体の標的である、ケモカイン受容体CC-CCKR5の様な補助受容体を含む宿主細胞抗原複合体が存在することを強く示唆している。補助受容体は、HIV融合、侵入または抑制因子の補助受容体として表されている。抗CD4含有抗原複合体抗体の広範な中和活性の機序は不明である。CD4含有宿主細胞抗原複合体は、HIV感染と病因を仲介する2つの役割を果たしている:HIV結合のためのT細胞表面受容体とHIVによる細胞融合と侵入またはHIV抑制因子のための受容体の両者の役割を果たしている。本明細書に使用されている様に、CD4を含む宿主細胞抗原複合体”とは、HIV結合のための受容体とHIV抑制因子またはHI Vによる細胞融合および侵入のためのCC-CCKR5の様な関連する補助受容体を含む複合体を示す。この分子複合体は、CD4発現細胞の表面にのみ発現される。血清学および機能的に、これは組み換えにより発現される可溶性CD4蛋白質分子とは異なる。本明細書に使用されている様に、“CD4”は自然界に存在するCD4遺伝子によりエンコードされるCD4蛋白質全てを意味する。本明細書に使用されている様に、“CD4発現細胞またはCD4+細胞”はその表面にCD4糖蛋白質を示す細胞である。この様な細胞には、末梢血T細胞、胸腺細胞、牌細胞等のCD4発現Tリンパ球およびHPB-ALLまたはSUP-T等の白血病またはリンパ腫由来T細胞系細胞が含まれる。本明細書に使用されている様に、“組み換え可溶性CD4”または“rsCD4”は、ヒトCD4のAA₁-AA₃₇₅から成るポリペプチドである(図1、SEQ ID NO:1)。本明細書に使用されている様に、“CD4を含む宿主細胞抗原複合体”または“ 細胞表面CD4抗原複合体”とは、ケモカイン受容体の領域の様なその他の関与する宿主細胞蛋白質と複合体を形成する、４つの細胞外領域、貫膜領域、細胞質領域から成る50KD糖蛋白質を含む膜構造(図1、SEQ ID NO:1)を意味する。 CD4は最初、Tヘルパーリンパ球の細胞表面マーカーとして説明された。その後、CD4は単核細胞、ランゲルハンス島、小膠細胞、B-細胞の一部にまばらに発現されることが見いだされた。CD4分子は、MHCクラスII分子の受容体としてのその機能により、抗原特異性Tヘルパー細胞の活性化に直接的に関与していることも見いだされた。1984年に、ヒトCD4がHIVの受容体であることが見いだされた(Dalgl eish et al.，Nature，1984，312:763)。HIVエンベロープ糖蛋白質、gp120のCD4 への結合は、標的細胞へのウイルス侵入の初期段階を表す。 CD4分子は、一連のCD4に特異的なモノクローナル抗体を用いる研究により、またCD4構造の修飾、例えば、アミノ酸の置換、削除、挿入とその結果CD4に生じる機能的変化との相関関係の様なネガティブな推定により大規模にマッピングされている(Sattentau et al.，Science,1986，245:1120;Peterson and Seed，Cell ，1988，54:65;Jameson et al.，Science，1988，240:1335;Sattentau et al，J Exp Med，1989，170:1319;Hasunuma et al.，J Immunol，1992，148:1841;Burk ly et al.，J Immunol，1992，149:1779;Davis et al.，Nature，1992，358:76) 。これらのマッピング研究により、この分子の構造-機能マップの作製が可能となった。CD4に特異的なモノクローナル抗体の多くは、HIVの実験株に対して中和活性を有することが認められている。HIV中和活性を持つことが知られている抗体の内、一次分離株による感染を生体内で曝露前または曝露後に抑制できることを評価されているものは全くない。これらの抗体の内、特にケモカイン受容体の領域を伴う時、CD4を含む宿主細胞抗原複合体と反応性を示すことが報告されているものは全くない。 CD4の第一の細胞外領域は、免疫グロブリン鎖のそれと類似の3つの相補性決定領域(CDRs)において免疫グロブリンと相同である。CD4分子の細胞外領域の領域1 と領域2の両者は、クラスIIMHC分子の結合部位に寄与しており、領域1は単独でH IV結合とシンシチウム形成に関与していることが見いだされた。HIVエンベロープ糖蛋白質gp120の結合部位は、領域1のCDR2様ループに位置することが見いだされた(Peterson and Seed，Cell，1988，54:65; Landau et al.，Nature，1988， 334:159;Clayton et al.，Nature，1988，335:363; Arthos et al.，Cell，1989 ，57:469;Satentau et al.，J Exp Med，1989，170:1319)。領域1のCDR3領域と重なる別の部分はシンシチウム形成に関与していることが見いだされた(Kalyanara man et al.，J Immunol，1990，145:4072;Camerini and Seed，Cell，1990，60: 747;Corbeau et al.，J Immunol，1993，150:290)。これらの参考文献から、CD4に特異的な抗体は恐らく下記の幾つかの方法で免疫系と相互作用しているものと結論づけることができる：第一に、CD4発現T細胞およびその他の活性化されたT細胞、B細胞または単核細胞の間のCD4−クラスII 相互作用を遮断する;第二に、T細胞にシグナルを送り、正常のCD4 T細胞性免疫制御機能を阻害する;第三に、T細胞受容体分子の同時連動により引き金を引かれると、アポプトシスによりCD4発現細胞の細胞死が引き起こされる;第四に、CD4 とHIVの相互作用を遮断し、HIVにより仲介される演鐸疾患を阻害する。これらの結論に基づき、CD4に対する抗体は、エイズを含むHIV感染とHIV関連疾患を予防し、治療する優れた候補物質である。また、より一般的なレベルで、CD4に対する抗体は、移植片拒絶反応のような望ましくない免疫応答を予防し、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、または乾癖等の自己免疫疾患を治療するために有用と思われる。抗CD4抗体は多くの研究対象となっている。CD4へのHIV gp1 20の結合を遮断する抗体がシンシチウム形成を予防し、HIV感染を予防するものと予想された。 2つの十分に特徴が明らかにされた抗CD4抗体、Leu3AとOKT4Aが、HIVにより誘導されるシンシチウム形成を有効に遮断することが明らかにされた。Chiba、米国特許No.5,171,838により、モノクローナル抗体Leu3Aにより認識される抗原決定基は、HIV-1 gp120結合部位のCDR2領域と重なる15個のアミノ酸AA₄₉-AA₆₃の範囲に正確にマッピングされている。モノクローナル抗体OKT4Aにより認識される抗原決定基は、HIV-1 gp120結合部位と重なるAA₁₆からAA₄₉の間のCD4部位に正確にマッピングされている(Jameson et ao.，Science，1988，240:1336。注:James onの報告に開示されているCD4と本発明のSEQ ID NO:1、図1の間には9個のアミノ酸フレームシフトが存在する。しかし、どちらの抗体も、既にHIVgp120 に結合しているCD4分子には結合または作用できないため、HIV感染の治療への適用には限度があることが明らかにされている(Burkly et al.，WO 92/09305)。gp 120結合部位への抗原決定基付近に立体障害が生じるものと思われる。 HIVにより誘導されるシンシチウム形成に何らかの影響を及ぼすことが報告されている抗体には、MT151、MT413、13B8-2、OKT4E、VIT4、MT321がある(Dalgeli sh et al.，Nature，1984，312:763;Sattentau et al.，Science，1986，234:11 20;Davis et al.，Nature，1992，358:76;Corbeau et al.，J Immunol，1993，1 50:290)。これらの抗体は、OKT4AおよびLeu3Aにより結合される抗原決定基とは異なる第一の領域CDR3領域付近の抗原決定基に結合すると報告されている。しかし、OKT4AおよびLeu3Aと同様に、これらの抗体も既にHIVgp120に結合しているCD 4分子には結合または作用できないため、それらの有用性には限界がある(Burkly et al.，WO 92/09305)。 Burkly et al.，同書により報告されているように、モノクローナル抗体5A8を含む別のグループのモノクローナル抗CD4抗体も、HIVにより仲介されるシンシチウム形成を阻害することが明らかにされている。モノクローナル抗体5A8の特徴を明らかにするための抗原決定基マッピング研究の結果(p。81-82、WO 92/09305 )から、モノクローナル抗体5A8がCD4の第一および第二領域から成る配座抗原決定基を認識していることが見いだされ、両領域が5A8の結合に必要かつ“十分” であることが見いだされた。第一および第二領域に接続する棹状β鎖のAA₈₃-AA₁ ₀₅ が影響を及ぼし、第二領域のAA₁₀₅-AA₁₃₁がCD4への5A8の結合に絶対的に必要であることも見いだされた。CD4の第三および第四領域およびその他の複合体を形成する細胞表面抗原は関与していないように思われる。偶発的曝露による感染を予防するための、また感染母株から子孫への垂直伝染を中断するための受動免疫予防薬として、CD4陽性細胞へのHIV結合を阻害すること、および/またはHIVにより誘導されるシンシチウム形成を阻害することが明らかにされているCD4反応性モノクローナル抗体を使用することが従来示唆されていた(Rieber et al.，Lancet，1990，336:1007; Rieter et al.，PNAS，1992，8 9:10792; およびAttanasio et al.，J Infect Dis，1993，168:515)。しかし、これらのCD4抗体の殆どが、HIVの実験株に対する生体外中和活性に関して評価されており、曝露前後の適用により、一次分離株による感染の阻害能を評価されたものはない。この様な生体外ウイルス中和の成績をHIVに対する生体内の有効性に置き換えることはできないことは今では公知である。強力な生体外中和能にもかかわらず、HIV-1感染患者において抗ウイルス活性を発揮できない(Daar et al.，PNAS US A，1990，87:6574-6578)ことは特に公知である。本発明以前に、CD4の４つの領域全てに結合または近接でき、その結果HIV gp1 20のヒトCD4への最初の結合を遮断できると同時に、HIV1および2型とSIVの広範にわたる一次分離株の感染性も有効に中和でき、かつ後から結合する事による抗ウイルス機序により同様に作用する能力を持つ抗CD4抗体は報告されていない。本発明により、CD4の4つの領域全てに結合または接触し、ケモカイン受容体と結合した場合には、更に結合が増強される抗体が提供される。これらの抗体は、 HIV gp120のヒトCD4への最初の結合を遮断できると同時に、全クレードのHIV-1 一次分離株とHIV-2およびSIVの感染性も有効に中和することが可能で、後から結合することによる抗ウイルス機序により同様に作用することができる。本発明のモノクローナル抗体とその相同物は、霊長類において、またhuPBL/SCIDマウスモデルの再構成されたヒト免疫系において、免疫不全ウイルスの一次分離株による感染に対する抗体の生体内有効性を初めて証明した(実施例17および18)。モノクローナル抗体B4の様なこれらの特性を持つ抗体は、HIV感染およびエイズの様なHIV関連病態の治療に明らかに利点を提供する。既知の抗CD4抗体と異なり、B4またはその相同物は、CD4を含む細胞表面抗原複合体にHIVが結合する前と後に、妨害するために利用でき、交差クレード防御を含む、基準から外れた一次分離株による感染から有効な防御作用を発揮する。本発明のモノクローナル抗体は、霊長類モデルと再構成されたヒト免疫系において免疫不全ウイルスの一次分離株を中和するのに有効なことが明らかにされた初めてのモノクローナル抗体である。実施例2-18に示されているように、本発明の抗体の生体外および生体内中和の結果は、本明細書に記載されている特性の極めて望ましい組み合わせと共に、偶発的曝露前および曝露後のHIV1型および2型の世界中の株によるヒトのHIV感染の予防に有用であることを示している。本発明に有用な抗体の特性を、実施例2-16および19-20において得られた結果に基づいてここに要約する： 1. ELISA分析においてrsCD4に結合する； 2. 免疫蛍光分析においてCD4発現細胞に結合し、この場合結合パターンは高分解能蛍光顕微鏡下に“キャップ”形態を呈する。 3. HIV gp120のCD4発現細胞への結合を遮断する; 4. 既にHIV gp120が結合しているCD4発現細胞に結合する;および 5. 生体内ミクロプラークアッセイにおいて10μｇ/mL未満の濃度で、好ましくは50％中和の場合には0.01-10μｇ/mLの範囲で、90％中和の場合には 0.1-35μｇ/mLの範囲でHIV一次分離株を中和する。好ましくは、本発明の抗体は以下の能力も発揮する。 6. rsCD4をケモカイン受容体領域ペプチドと共にプレインキュベーションすると、ELISA分析においてrsCD4への結合が増強される; 7. ペプチドにより表されるCD4の4つの領域のいずれとも結合する;CD4の AA₁-AA₂₀、AA₈₁-AA₉₂、AA₇₉-AA₈₈、AA₆₀-AA₁₀₉、A₁₁₈-AA₁₆₅、AA₂₃₅-AA₂₅ ₁、AA₂₉₇-AA₃₅₁およびAA₃₆₁-AA₃₇₅; これらの特徴を有する抗体は、一次標的がCD4陽性細胞である感染性物質により引き起こされるヒトにおける疾患の予防と治療に特に有用である。従って、本発明は、全ての段階のエイズを含むHIV関連疾患の様な、一次標的がCD4陽性細胞である感染性物質によって引き起こされるヒトの疾患において、予防と治療に特に有用な抗体またはその相同物から成る予防および治療組成物と、これらの抗体組成物を用いる方法を提供する。本明細書に使用されている様に、“抗体相同物”は、上記の結合および中和特性を有する、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、その抗原結合断片から選択される1つ以上のポリペプチドをから成る蛋白質である。抗体相同物には無傷の免疫グロブリン、IgA、IgG、IgE、IgM型(そのサブタイプも含まれる)とカッパまたはラムダ鎖が含まれる。上記の特徴を有する抗体またはその相同物、例えば、Fab断片、Fab'断片、F(ab')₂断片、F(v)断片、重鎖モノマーまたはダイマー等は、本発明の範囲に含まれる。抗体相同物は、ヒト化組み換え抗体と組み換え抗体も含む。本明細書全体を通して、“本発明の抗体”およびその同等物という言葉にはそれらの相同物も含まれる。本明細書に使用されている様に、“CD4陽性細胞表面抗原複合体”または“CD4 を含む細胞表面抗原複合体”は本発明の抗体の結合部位である。複合体は、CC-C CKR5のような、ケモカイン受容体の領域と結合したCD4を含んでよい。本明細書に使用されている様に、“ヒト化組み換え抗体”は、ヒト以外の哺乳動物からまず抗体を入手し、その中で組み換え技術を用いて、CD4発現細胞のCD4 細胞表面複合体への結合に用いられないアミノ酸の一部または全てを、ヒト免疫グロブリンの軽鎖または重鎖と置換した抗体。本明細書に使用されている様に、“キメラ組み換え抗体”は、ヒト以外の哺乳動物からまず抗体を入手し、その中で組み換えDNA技術を用いて、軽鎖のヒンジおよび定常領域、重鎖またあその両者の全てまたは一部を、異なる種の哺乳動物、好ましくは、ヒトの免疫グロブリン軽鎖または重鎖の対応する領域と置換した抗体である。本明細書に使用されている様に、“Leu3A”は抗CD4ネズミモノクローナル抗体で、FITC結合体としてBecton Dickinson Immunocytometry Systems,サンノゼ、カリフォルニア州から発売されている。カタログ番号は340113。本明細書に使用されている様に、“OKT4A”は抗CD4マウスモノクローナル抗体で、FITC結合体としてOrtho Diagnostic Systems,ラリタン、ニュージャージー州から発売されている。カタログ番号はOK704010。本明細書に使用されている様に、5A8は、PCT WO 92/09305に記載されている抗 CD4マウスモノクローナル抗体である。本明細書に使用されている様に、“B4疑似物質は、ヒト組み換え可溶性CD4(rs CD4)またはCD4発現細胞のヒト細胞表面CD4抗原複合体へのモノクローナル抗体B4 の結合を、少なくとも30％減少させる化合物である。本発明の抗体本発明の抗体またはその相同物は、CD4を含む宿主細胞抗原複合体に特異的に結合する。複合体は、CC-CCKR5のようなケモカイン受容体の領域と結合したCD4 を含んでよい。これは、高分解能蛍光顕微鏡により観察される様に、間接的免疫蛍光分析において特徴的な“キャップ”パターンとして、CD4発現細胞にそれらが結合することにより示される。本発明の抗体は、CD4を含む宿主細胞抗原複合体の分散した不連続な抗原決定基に特異的に結合する。複合体は、CC-CCKR5のようなケモカイン受容体の領域と結合したCD4を含んでよく、CD4発現細胞へのHIV gp120の結合を遮断し、既にHIV gp120が結合しているCD4を含む宿主細胞抗原複合体に後から結合する。表面CD4へのHIV gp120の結合を遮断し、ウイルス結合の前後に、HIV1型および 2型の一次分離株全てによるCD4細胞の感染を阻害する抗体が好ましい。本発明の最も好ましい抗体は、下記に説明されている B4(IgG 2a)、M2(IgG1) 、B13(IgG2a)と名付けられたマウスモノクローナル抗体を含む。本発明の抗体およびその相同物は、HIV gp120がCD4陽性リンパ表面に存在する CD4を含む宿主細胞抗原複合体に結合する前と後に宿主細胞の複製による感染を防止するため、HIV感染と全段階のエイズの予防および治療薬であり、従って、H IVを防止し、ウイルスが未感染細胞に広がるのを遅延させる。本発明の抗体および抗体相同物は、HIVがCD4発現細胞が結合後に感染を阻害できるため、極めて有用である。本発明の抗体のスクリーニング分析通常の技術者は、本発明の抗体またはその相同物を同定するために、特定の抗体またはその相同物が上記の特徴を有するかどうかを、公知の方法を用いて容易に決定できる。特定の抗体がヒトCD4に結合するかどうかを決定するために、固相抗原としてr sCD4蛋白質を使用する従来の結合分析のいずれを用いてもよい。有用なrsCD4結合分析は、好都合には、抗体相同物が得られた種の免疫グロブリンに特異的な酵素標識二次抗体を用いる事により、ELISA法により達成できる。ヒトCD4発現細胞上のCD4を含む宿主細胞抗原複合体への抗体またはその相同物の結合は、検討される抗体またはその相同物が得られた同じ種の免疫グロブリンに特異的な蛍光標識二次抗体により染色するか、あるいは例えば、ケモカイン受容体のペプチド2047の様なペプチドを組み合わせたrsCD4蛋白質を用いるELISA法により検出できる。蛍光活性化細胞選別機(“FACS”)または高分解能蛍光顕微鏡が、抗体反応性細胞のパーセンテージをの測定と強度測定に使用される。細胞への抗体結合は、高分解能蛍光顕微鏡により観察することが可能で、特徴的な“キャップ”型を示す。この目的に有用なCD4発現細胞は、CD4発現Tリンパ球であり、例えば、末梢血Ｔ細胞、胸腺細胞、脾細胞等のCD4発現Tリンパ球およびHPB-AL LまたはSUP-T等の白血病またはリンパ腫由来T細胞系細胞である。細胞は公知の方法により分離できる。例えば、正常Tリンパ球は、Ficoll-Hypaque遠心分離により、悪性T細胞は遠心分離により分離できる。特定の抗体がヒトCD4へのHIV gp120の結合を遮断するかどうかを決定するために、適切な競合分析のいずれを用いてもよい。有用な分析には、例えば、ELISA の様な間接的免疫蛍光分析等が挙げられる。好ましくは、予め細胞を抗体とインキュベーションする事により、標識されたHIV gp120のCD4発現細胞上CD4の結合能力が測定される。 HIV gp120のCD4発現細胞へのCD4反応性モノクローナル抗体の結合遮断能は、H IV gp120をCD4発現細胞と共にプレインキュベーションすることにより評価され、先に結合していたHIV gp120が、抗体が細胞に結合するのを阻害する程度を定量した。CD4発現細胞への抗体の結合は、検討される抗体が得られた種に対して特異的な蛍光標識二次抗体を用いて、FACS分析または高分解能蛍光顕微鏡により定量される。上記の分析に使用されるHIV gp120は、HIVに感染した細胞、HIVそのもの、HIV gp120の遺伝子により形質転換された宿主細胞、gp120を発現する組み換えウイルスに感染した宿主細胞、または分離されたgp120により供給される。組み換えにより作製されたHIV gp120が好ましい。この様な生成物は、精製組み換えHIV g p120として市販されている(American Biotechnologies，Inc.,ケンブリッジ、マサチューセッツ州)。特定の抗体がCD4発現細胞の間でHIVにより誘導されるシンシチウム形成を遮断する能力を評価するために、公知のシンシチウム分析のいずれでも利用できる。好ましくは、一次分離株またはHIV感染CD4発現組織培養細胞(例えば、H9)をMT-2 細胞の培養物に加える。次に、種々の量の抗体を加える。ネガティブコントロールは、HIVの存在下に通常の培養培地、あるいは無関係な抗体を補給する。巨大シンシチウム誘導株を含むポジティブコントロールも使用していよい。インキュベーション後、巨大シンシチウム誘導株の場合には、全ての培養を、シンシチウムまたはプラーク形成を視覚による定量により評価する。この方法で、抗体がシンシチウム形成を遮断する能力、あるいは培養に形成されるプラーク数を減少させる能力を評価することができる。特定の抗体が、HIVによるCD4発現細胞の感染を阻害するかどうかを決定するために、HIV感染の指標であればどれを監視してもよい。HIV感染の生体外の指標として有用なのは、例えば、HIVコア抗原p24の分泌である。好ましくは、HIV感染の阻害は、HIV感染CD4発現細胞培養に抗原が存在する場合としない場合のHIV p2 4濃度を比較することにより決定される。特定の抗原がCD4発現細胞のHIV感染を遮断する能力を評価するために、p24抗原定量分析を利用できる。好ましいのは、添加されたウイルスに対する表示された希釈率における抗原の中和活性を測定する、p24ウイルス抗原中和分析である( Wrinetal.，J Virol，1995，69:39-48)。このp24HIVウイルス分析において、ウイルスの感染性と中和が、p24ELISAにより、PBMC培養により蓄積されたP24抗原を測定することにより定量される(Coulter Immunology，ハイアレア、フロリダ州)。特定の抗体が、rsCD4分子に対する結合よりも、CD4を含む宿主細胞抗原複合体に対する結合が強いかどうかを決定するために、ELISAまたはその同等物が有用である。この様な分析において、CD4を含む抗原複合体に対する抗体の結合能は、CD4に結合していると考えられる受容体の領域から得られるペプチドと共にプレインキュベーション。されたrsCD4を用いて、抗原が得られた種の免疫グロブリンに特異的な標識二次抗体を使用することにより検出できる。ペプチドは、IL8Rα (P2047a)、CC-CKR2bの領域2および3(p2087a、p2088a)、CC-CKR5(p2047a)の領域1 および4(p2079aおよびp2082a)およびCC-CKR5の領域3(p2047a)由来のペプチドから選択される。特定の抗体がヒトCD4から得られたペプチドに結合するかどうかを決定するために、ELISAまたはその同等物が有用である。この様な分析において、抗体がこれらのペプチドに結合する能力は、抗原が得られた種の免疫グロブリンに特異的な標識二次抗体を使用することにより検出できる。特定の抗体がヒトケモカイン受容体から得られたペプチドに結合するかどうかを決定するために、ELISAまたはその同等物が有用である。この様な分析において、抗体がこれらのペプチドに結合する能力は、抗原が得られた種の免疫グロブリンに特異的な標識二次抗体を使用することにより検出できる。好ましくは、抗体のペプチドへの結合は、rsCD4 ELISAにおける阻害試験により測定される。これは、まずrsCD4反応性抗体を、上記あるいは表1に一覧されているCD4ペプチドと共にインキュベーションし、次に抗体ペプチド複合体を、rsC D4でコーティングされた、あるいはrsCD4/ケモカイン受容体ペプチドでコーティングされたミクロウェルと共に2回目のインキュベーションを行うことにより実施される。本発明の抗体相同物の種類とその作製本発明の抗体には、上記および実施例2-18に説明されている手順によって特徴づけられる、上記に説明されている、B4の新しい特性の組み合わせを示す、抗体および抗体相同物が含まれる。本発明の抗体は、B4、M2およびB13の結合および中和特性を示す、無傷モノクローナル抗体、無傷組み換え抗体、無傷キメラ組み換え抗体、無傷ヒト化組み換え抗体またはその抗原結合部分である。 A. モノクローナル抗体本発明の最も好ましい抗体の種類は、本発明のハイブリドーマにより作製される無傷モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体作製技術は公知である( 一般的には、Kennett et al.，“Methods for Production and Characterizatio n og Monoclonal Antibodies”，in Monoclonal Antibodies ，Hybridomas: A ne w Dimension inBiological Anayses ，Plenum Press，pp 363-419，1980を参照) 。本発明の抗原の誘導に有用なCD4を含む宿主細胞抗原複合体には、ヒトCD4発現細胞が含まれ、これは例えば、CD4発現末梢血T細胞、胸腺細胞、CD4発現ヒトT細胞系細胞の細胞である。これは、Kung et al.,米国特許No.4,381,295の報告と対照的である。この報告では、以下の様に述べられている:“事実、本出願者は、抗原としてT細胞悪性細胞系を用いて、所望の(T4)抗体を産生しないハイブリドーマの形成を引き起こした。”(4列、54-56行)。事実、Kung et al.は、急性リンパ性白血病(14列、45行 )およびT細胞系の殆ど(51行目)の8例中8例にOKT4の反応性が観察されないことを報告し、従って、悪性T細胞系は望ましくない免疫原であると結論づけた。本発明の抗体を産生するための免疫原は、信頼性の高いCD4発現細胞供給源、好ましくは、急性Tリンパ芽球性白血病(T-ALL)患者からのHPB-ALL、またはT細胞非ホジキンリンパ腫(T-NHL)患者からのSUP-T1の様なＴ細胞系から得られる。理論に束縛されることは望まないが、分離CD4またはCD4の組み換え可溶型（例えば、rsCD4)よりも寧ろ、HPB-ALL、SUP-T1細胞またはMT-2の様なCD4発現細胞を免疫原として使用する方が、本発明の抗体産生を誘発すると考えられている。CD 4発現細胞の使用により、CD4を含む宿主細胞抗原複合体の細胞表面の形態をより望ましい形態にすることができる。これは、CD4分子単独では不可能である。免疫感作は標準手順を用いて達成できる。単位投与量と免疫感作法は、免疫感作される哺乳動物の種、その免疫状態、哺乳動物の体重、投与される製剤中のCD 4を含む宿主細胞抗原複合体の量によって異なる。好ましい実施例において、マウスの免疫感作に使用されるCD4発現細胞製剤の各投与量は、少なくとも約5-10x10⁶個の細胞を含む。典型的には、PBSにおいて培養培地の蛋白質を全く含まない様に十分に洗浄され、アジュバントを含む、あるいは含まないCD4発現細胞を腹腔内投与することにより、０日目で免疫感作される。次に、初回免疫感作後14日目から6ヶ月目に、好ましくは、初回免疫感作後15から30日目に、PBSにおいて洗浄および再懸濁されたCD4発現T細胞をアジュバントを加えずに、マウスに腹腔内投与により初回ブーストする。更なるブーストが可能である。アジュバントを含まない反復投与による超免疫感作が好ましい。融合3日前、最終ブースト(アジュバントを含まないPBS中のCD4発現細胞)が腹腔内投与により実施する。免疫感作された哺乳動物の血清を、上記の方法により、更に具体的には表12により、本発明の抗体の存在に関してスクリーニングする。血清がrsCD4と反応性を示す免疫感作哺乳動物から脾細胞を分離する。脾細胞と不死の細胞の融合に有用な多くの公知のプロトコールのいずれかが、本発明のハイブリドーマ産生の目的に使用される。典型的には、不死細胞系(例えば、骨髄腫細胞系)および脾細胞は、同じ哺乳動物から得られる。有用な哺乳動物には、マウス、ラット、アカゲザルがある。好ましくは、脾細胞はBALB/c系の同系交配マウスまたはCD1系の異系交配マウスから得られる(Jackson Labs，バーハーバー、メイン州)。好ましい不死細胞系はヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地(“ハット培地”) に感受性を有するマウス骨髄腫細胞系である。最も好ましいマウス骨髄腫細胞系は、P3x63-AG8.653(ATCC、ロックビル、メリーランド州、カタログ番号CRL1580) である。典型的には、ハット培地に鋭敏なマウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール(“PEG”)を用いて、マウス脾細胞に融合される。融合していない骨髄腫細胞と増殖しない融合した骨髄腫細胞を死滅させる、ハット培地を用いて、融合から生じたハイブリドーマ細胞が選択され、融合していない脾細胞は数日後に自然に死滅する。本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、上記のスクリーニング分析を用いて、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。好ましくは、一次スクリーニングにより、rsCD4単独よりも、ケモカイン受容体C C-CKR5の第三の外部領域から得られるペプチド(例えば、p2047)とプレインキュベーションしたrsCD4に、“優先的に”結合する活性を有する抗体を選択する。結合活性の増強は、対応するrsCD4/p2047複合体とrsCD4により得られるELISAの結果を比較することにより検出される。この単純な二重一次スクリーニング(rsC D4/p2047対rsCD4)により、CD4を含む表面抗原以外に反応性を有する抗体の大多数(>90％)が除去される。rsCD4よりも、CC-CKR5の第三外部領域と結合したrsCD4 に優先的に反応する事により選択された抗体を、HPB-ALLまたはSUP-T細胞の様な CD4発現細胞への結合の特徴付けにより、CD4を含む細胞表面抗原複合体への結合に関して二次スクリーニングを行う。この様な結合は、抗体が得られた種の免疫グロブリンに対して特異的な蛍光標識二次抗体により検出され、FACS分析により定量され、または蛍光顕微鏡により観察される。CD4発現細胞に対し結合反応性を有する抗体は更に、シンシチウム形成阻害を測定するのためのMT-2ミクロプラーク中和分析あるいはウイルス複製阻害を測定するためのp24抗原中和分析により、23135の様なHIV-1の一次分離株の中和能を更に検討される。間接免疫蛍光分析によりCD4発現細胞を明るく染色する、ELISAによりrsCD4/p2 047への優先的な結合および/またはrsCD4への結合活性を示し、かつ10μｇ/mL未満の濃度でHIV-1の一次分離株に対して中和活性を示す抗体を分泌する抗原が、最終クローニングとサブクローニングのために選択される。無傷のモノクローナル抗体である本発明の抗体を作製するために、上記のスクリーニング分析において陽性の検討されたハイブリドーマを、公知の条件と、ハイブリドーマ細胞が培養培地の中にモノクローナル抗体を分泌するのに十分な時間、栄養培地において培養する。ハイブリドーマ細胞に適した組織培養技術と培養培地は公知である(例えば、上記Kennett et al.，Monoclonal Antibodiesを参照)。所望の抗体を含む条件ハイブリドーマ培養上清を収集する。あるいは、選択されたハイブリドーマ細胞を免疫感作されていないマウスの腹腔内に注射する。ハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖し、抗体を分泌する。これは腹水として蓄積する(上記Kennett et al.，Monoclonal Antibodies)。シリンジを用いて腹腔から腹水を回収することにより、抗体を収集する。本発明のモノクローナル抗体が、条件ハイブリドーマ培養上清または腹水から容易に精製できることは、通常の技術者にとって明らかである。 B. 組み換え抗体およびそれらをエンコードするDNA 本発明の抗体相同物は、本発明の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をエンコードするDNAにより形質転換宿主細胞により産生される組み換えモノクローナル抗体が可能である。組み換え抗体は、公知の遺伝子工学技術により作製される。例えば、組み換え抗体は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマから得られる所望の抗体の免疫グロブリンの軽鎖と重鎖をエンコードするcDNAまたはゲノムDNAをクローニングすることにより作製できる。次に、これらのポリペプチドをエンコードするcDNAまたはゲノムDNAを組み換え発現ベクターに挿入すると、転写および翻訳を調節するために、2つの遺伝子はそれ自身の調節配列に機能的に結合される。発現ベクターと発現調節のための調節配列は、選択された宿主細胞に適合するように選択される。典型的には、重鎖および軽鎖遺伝子は共に同じ発現ベクターに挿入されるため、両者の発現は機能的に結合される。発現宿主として、原核細胞または真核細胞を使用できる。真核宿主細胞における発現が好ましい。なぜならば、この様な細胞は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体を組立、分泌する可能性が高いからである。上記の方法に関する変更は、本発明の範囲内であることは明らかである。宿主細胞が、軽鎖二量体または重鎖二量体のような無傷抗体の一部を産生することが可能であり、これらも本発明の抗体相同物である。例えば、本発明の抗体の軽鎖または重鎖(しかし、両方共ではない)をエンコードするDNAにより宿主細胞を形質転換することが望ましい場合があろう。例えば、Fab'断片をエンコードするDNAの様な、CD4結合に不必要な軽鎖および重鎖のどちらか一方、あるいは両方をエンコードするDNAの一部または全てを除去するためにも、組み換えDNA技術を用いることができる。この様な先端を切断されたDNA分子から発現される分子は、本発明の抗体相同物である。 C. キメラおよびヒト化組み換え抗体およびそれらをエンコードするDNA 上記の組み換え抗体をエンコードするDNAを、キメラまたはヒト化組み換え抗体を産生するための起点として使用することができる。キメラ組み換え抗体は、重鎖および/または軽鎖のヒンジおよび定常領域が、異なる種の免疫グロブリン軽鎖または重鎖の対応する領域のDNAによって置換されている、所望の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をエンコードするDNAを含む、適切な発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより作製される。元の組み換え抗体がヒト以外のものである場合には、ヒンジおよび定常領域をエンコードするヒトの配列により置換するのが好ましい。キメラ組抗体の一例は、マウス可変領域とヒトヒンジおよび定常領域を有する。一般的には、米国特許No.4,816,397およびMorrison e t al.，“Chimeric Human Antibody Molecules: Mouse Antigen-Binding Domain s With Human Constant Region Domains”、Proc Nat'l Acad Sci USA，1984，8 1:6851-55を参照。ヒト化組み換え抗体は、相補性決定領域(CDRs)の間に散在するフレームワーク配列を含む、CD4抗体複合体結合に関与していないアミノ酸をエンコードするDNA の全てまたは一部が所望のヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖の対応する領域の DNAにより置換されている、所望のヒト以外の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をエンコードする適切な発現ベクターを用いて、宿主細胞を形質転換することにより作製される。一般的には、P.T．Jones et al．“Replacing The Compleme ntarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ”,Nature，1986,321:522-25を参照。最も好ましい本発明のヒト化組み換え抗体は、ヒトフレームワーク配列の間に散在するB4“CDRs”を有する。 D. 形質転換哺乳動物において産生される本発明の抗体相同物不活化された内因性免疫グロブリン遺伝子座に関して同型接合で、ヒト配列重鎖およびヒト配列軽鎖をエンコードする導入遺伝子配列を含むマウス由来のハイブリドーマは、ヒト配列重鎖とヒト配列軽鎖を含む抗体相同物を分泌する。これらの形質転換抗体相同物は、それぞれのELISAにより、組み換え可溶性CD4分子と CC-CKR5ケモカイン受容体の第三外部領域から得られるペプチド(例えば、P2047) と結合したrsCD4により優先的に結合し、またCD4発現細胞の間接的免疫蛍光染色により、CD4蛋白質を含むヒト宿主細胞抗原複合体に結合し、全クレードのHIV-1 由来の一次分離株と、HIV-2およびSIVの種々の一次分離株に対して中和活性を有し、モノクローナル抗体B4の一次分離株に対して同様の抗体結合特性を有するが、これらは、A章、副題モノクローナル抗体に説明されている様な免疫感作およびスクリーニング法により作製することができる。より具体的には、機能的に破壊されたJH遺伝子座に関して同型接合で、ヒト配列重鎖をエンコードするために再配列可能な導入遺伝子と、ヒト配列軽鎖をエンコードするために再配列可能な導入遺伝子を有する、Smith et al.，WO 93/1222 7に説明されているように、HC1またはHC2遺伝子型のいずれかを有することを特徴とする形質転換マウスは、正常BALB/cまたはCD1マウスの代わりに免役感作するための種々のとして使用される。 E. 無傷抗体ではない、本発明の抗体相同物相同物には、本発明の抗体の断片も含まれる。この様な断片は、上記の無傷の抗体の全てから得ることができる。例えば、上記抗体から得られる宿主細胞抗原複合体に結合する断片および全長のモノマーまたはダイマーポリペプチドは、それ自体が本発明の抗体相同物である。有用なこの種の抗体相同物には、Fab断片、Fab'断片、F(ab')₂断片、F(v)断片、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、1本の重鎖および1本の軽鎖から成るダイマー、およびその同等物が含まれる。前記断片は一般に、本発明の有用な抗体相同物である。抗体相同物は、化学的方法、例えば、ペプシンまたはパパインの様な蛋白質分解酵素を用いて、かつ任意で切断生成物を還元剤で処理することにより、無傷抗体を切断することにより作製できる。あるいは、有用な断片を、先端を切断された重鎖および/または軽鎖遺伝子を用いて形質転換された宿主細胞を用いることにより、あるいは先端を切断された重鎖および/または軽鎖遺伝子の融合物を用いることにより作製できる。重鎖および形質転換モノマーは、無傷抗体をチジオトレイトールの様な還元剤で処理し、続いて精製により鎖を分離することにより作製できる。重鎖および軽鎖モノマーは、所望の重鎖または軽鎖をエンコードするが、両方はエンコードしないDNAにより形質転換された宿主細胞によっても作製できる(Sastry et al.，Proc Nat'l Acad Sci USA，1989，86:5728-32)。本発明の抗体を産生する細胞本発明は、本発明の抗体を産生する細胞および細胞培養も提供する。この様な細胞には、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが含まれる。更に、本発明は抗体を産生する細胞を培養する事による本発明の抗体を産生する方法も提供する。この様な細胞を培養し、産生された抗体を分離する方法は公知である。これらの方法には、細胞培養技術と腹水の産生方法が含まれる。 CD4発現細胞によりヒト以外の哺乳動物を免疫感作する段階を含む、本発明のハイブリドーマ産生方法も提供される。本工程の免疫原として使用される細胞は、CD4発現細胞の信頼性の高い供給源由来の細胞で、例えば、急性Tリンパ芽球性白血病患者からのHPB-ALL、またはT 細胞非ホジキンリンパ腫患者からのSUP-Tの様な、ヒトT細胞白血病またはリンパ腫由来の細胞系であり、これを初回免疫感作のためにPBSまたは完全フロイントアジュバントに含めて腹腔内投与し、その後のブーストのためにアジュバントを含めずに静脈内投与または腹腔内投与する。本発明の医薬組成物および方法本発明の抗体およびその相同物は、一次標的がCD4発現リンパ細胞である感染性物質により引き起こされる疾患を防止するための予防および治療組成物として有用である。この様な疾患には、HIV感染およびエイズを含む関連疾患が含まれる。ヒトに投与するための本発明の好ましい医薬組成物には、マウスモノクローナル抗体B4またはM2またはB13およびその相同物の1つ以上の様な、またマウス/ヒトキメラ組み換え抗体、ヒト化組み換え抗体またはこれらの抗体の抗原結合部分の様な、本発明の抗体が含まれる。B4またはM2またはB13によって示されるのと類似の結合特性を有するマウス/ヒトキメラ組み換え抗体またはB4またはM2またはB13によって示されるのと類似の結合特性を有するヒト化組み換え抗体を含む医薬組成物が最も好ましい。本発明の医薬組成物は更に、HIV感染予防用のその他の治療薬を含んでよい。例えば、本発明の抗体相同物は、AZTの様な逆転写酵素を阻害する抗ウイルス薬またはHIV蛋白質分解酵素を阻害する薬物と組み合わせて使用できる。更に、本発明の医薬組成物はインターフェロンの様な抗ウイルス薬、またはシクロスポリンのような免疫抑制剤を含んでよい。更に、1種類以上の抗体相同物を、2種類以上の前記治療薬と併用して使用できる。この様な併用療法は、有利には治療薬の投与量を少なくすることができ、従って、種々の単独療法に関連する毒性または副作用の可能性を回避することができる。本発明の医薬組成物は、免疫療法有効量の本発明の1種類以上の抗体相同物、またはその誘導体、および好ましくは薬剤学的に許容可能な担体を含む。“免疫療法有効量”とは、HIV感染またはエイズの、あるいは一次標的がCD4発現細胞である感染性物質の免疫無防備状態を防止できる量を意味する。“薬剤学的に許容可能な担体”とは、それを投与された患者において、アレルギー反応またはその他の副作用を引き起こさない担体を意味する。適切な薬剤学的に許容可能な担体には、例えば、水、食塩水、燐酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、その同等物の1種類以上、およびそれらの組み合わせが含まれる。薬剤学的に許容可能な担体には更に少量の補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、防腐剤または緩衝液が含まれ、これらは抗体相同物の保存期間または有効性を増強する。本発明の組成物は、種々の形態が可能である。これらには、例えば、錠剤、丸剤、粉末、液体溶液、分散剤または懸濁剤、リポソーム、座薬、注入可能な溶液等の固体、半固体、液体投与形態が含まれる。好ましい形態は、投与および予防または治療適用の目的によって異なる。好ましい組成は、注入可能な溶液の形態である。本発明の好ましい医薬組成物は、その他の抗体により受動免役感作に使用されるものと類似している。好ましい投与方法は非経口投与である。本技術に精通する者にとって、本発明の抗体相同物の免疫療法有効量は、投与スケジュール、投与される抗体相同物の単位投与量、抗体相同物が他の治療薬と組み合わせて投与されるかどうか、患者の免疫状態および健康状態、および投与される特定の抗体相同物の免疫活性によって異なることは明らかである。 HIV感染予防のための免疫療法、すなわち無傷抗体である抗体相同物の単位投与量あたりの免疫療法有効量は、約1から100mg/kg(患者の体重)、好ましくは5mg /kgから50mg/kg、最も好ましい5mg/kgである。単位投与量は、2週間おきに1回投与、針刺しの様な不慮の接触直後に1回投与すべきである。抗ウイルス効果は、ウイルス負荷を含む種々の方法により測定できる。しかし、それより少ない、あるいは多い投与量、および他の投与スケジュールも使用できることは明らかである。無傷抗体ではない抗体相同物に関する治療法は、それらの大きさおよび薬剤学的特性に応じて異なる場合がある。本発明を更に理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、説明のみを目的としており、如何なる方法によっても本発明の範囲を制限することを目的とはしていない。実施例1 HIV gp120に対する抗体による生体外中和への実験株と一次HIV-1分離株の感受性の比較抗体によるウイルス中和定量法の明細な手順細胞。ヒトT細胞系MT-2(No.237，NIHエイズ研究および標準試薬プログラムカタログ)を、以前に報告されている(Hanson et al.，J Clin Microbiol，1990，2 8:2030-2034)15％ウシ血清を補足したダルベッコの改変イーグル培地において維持した。HIV-1セロネガティブドナーの末梢血単核細胞(PBMCs)をFucoll-Hypaque 勾配分離(Organon Teknika Corp.，ダラム、ノースカロライナ州)により新鮮バフィーコートから分離した。得られたPBMCsを0.5％PHA-P(Difco Laboratories, デトロイト、ミシガン州により刺激した。3-4日後、PHA-Pを含む培地を除去し、細胞を15％ウシ胎児血清、900μｇ/mLグルタミン、抗生物質、および5％インターロイキン-2を捕捉したRPMI(Cellular Products，Inc.,バッファロー、ニューヨーク州)において維持した。ウイルス。HIV-1 MNは、国立衛生研究所、バサナダ、メリーランド州から得られた持続的に感染させたH9細胞培養(NIHエイズ研究および標準試薬プログラムカタログNo.402)として利用可能であり、かつ維持された実験用に改変された株であり、これから細胞を含まない濃縮親株が調製された。HIV-1の一次分離株は、P BMC共存培養により患者のPBMCsから調製された。一次分離株の保存培養は、PBMC sによる3-5回以上の継代培養を行わずに調製され、遠心分離により不純物を除去された(Sawyer et al.，J Virol，1994，68:1342-1349)。これらは、カリフォルニア公共医療部のCarl Hansonにより供給された。 MT-2 ミクロプラーク中和分析。HIV中和抗体力価の測定は、連続希釈血清または抗体と一定量のHIVをプレインキュベーションし、それからHIVに感受性を有するMT-2細胞の感染と、HIVにより誘発されるミクロプラークを示す細胞単層の形成が起こる。結果は、ミクロプラークの定量により評価される。この分析は、実験用改変株でも一次分離株でも、SI分離株のみに適している。なぜならば、ミクロプラークは、HIV感染細胞の病巣と融合するMT-2細胞により形成される巨大シンシチウムを表しているからであり;また、この分析は、シンシチウム形成の阻害がHIV粒子またはHIV感染細胞に対する抗体の作用により引き起こされるため、すなわちこの分析はウイルスから細胞へのHIVにより誘導される融合または細胞から細胞へのHIVにより誘導される融合の阻害の両者を測定するため、ウイルスから細胞への伝染と細胞から細胞への伝染の両者の阻害を評価するのに適切であるからである。次に、1週間後に、propidium iodideで染色されたプラークの数を数えることにより観察される様に、プラークミクロプラークの還元により中和が観察される(Hanson et al.，J Clin Microbiol，1990，28:2030-2034)。この分析において、ウイルスおよび血清または抗体は共に、非特異的増強または阻害作用を打ち消すために、50％のプールされた脱線維素正常ヒト血漿の中に希釈される。血清および抗体。GP抗gp120N末端V3 MNは、HIV-1 MNの超可変B3領域のN-末端部分（抗N末端V3 MN)に対応する合成ペプチド抗原により超免疫感作されたモルモットのプールされた血清である(Wang et al.，Science，1991，254:285-288) 。GP抗gp120N末端V3ライブラリ血清は、約1x10¹ ³個の可能なHIV-1 N末端V3配列のライブラリ(抗Ｎ末端V3ライブラリ)を表すペプチドの複合混合物により超免疫感作された3匹のモルモットからプールされた抗血清である。モルモットの免疫感作に使用されるN末端V3 MNおよびN末端V3ライブラリ免疫原は、Walfield et a l.(Koff et al.編、AIDS Research Reviews，Chapter18，Marcel Dekker:ニューヨーク,1993)において説明されているように、HIV-1の幾つかの実験株に対する中和活性を持つポリクローナル抗体の産生に使用できる多分岐N-末端V3合成ペプチド免疫原であった。別の抗gp120抗体は、CD4に対するgp120結合部位に特異性を有する、gp120結合部位IgG1 b12と名付けられた組み換えヒトモノクローナル抗体(MAb)である（抗gp120 CD4BS)(Burton et al.，Science，1994,266:1024-10 27)。IgG1 b12は、長期無症候性HIV-1セロポジティブドナーの骨髄から調製された抗体-ファージディスプレイライブラリのFab断片として作製され、組み換えDN AIgG1発現ベクターの中にクローニングすることにより、丸ごとヒト抗体に変換された。これは、多様なHIV−次分離株を中和するための最高の標準品である(Bu rton et al.,上記)。結果: 抗N末端V3 MNモルモット抗血清、抗N末端V3ライブラリモルモット抗血清、およびIgG1 b12(抗gp120 CD4-BS)のHIV中和活性の比較を表2に示す。2つの抗N末端 V3血清の中和活性は、HIV-1 MN実験株と、2つのHIV-1一次分離株(23135およびBR 014)に関して測定された。抗gp120 CD4結合部位抗体の中和活性は、2つの一次分離株、23135とBT014に関して測定された。中和活性は、MT-2ミクロプラーク中和分析により測定され、表2に表示された終点(50％と90％)でポリクローナル血清抗体の希釈力価として、またモノクローナル抗体の濃度(μｇ/mL)として表されている。 T細胞系H9で成長させた実験用に改変された株、HIV-1 MNは、両抗N末端V3抗血清による中和に極めて高い感受性を有し、抗N末端V3 MNは、株に対する特異性が低い抗N末端V3ライブラリ抗血清よりも約4培倍高かった。PBMCで成長させた一次分離株は、どちらの抗N末端V3血清による中和にも抵抗した。しかし、一次分離株の少なくとも一方は、抗gp120 CD4結合部位、IgG1 b12による中等度の中和が可能であった。これらの結果は、中和に対する感受性における実験用に改変されたHIV-1と一次分離株の差を反映している。これらの結果は、実験用に改変されたHIV-1株の、株に特異的な抗gp120N末端V3抗体に対する感受性、この様な抗体に対する一次分離株の抵抗性、宿主細胞CD4受容体へのgp120の結合に対する抗体による中和に対するある種の一次分離株の感受性を示している。実施例２一次HIV-1分離株に対する抗宿主細胞抗体の生体外中和活性の特性モノクローナル抗体を腹水から精製し、モルモットポリクローナル抗gp120N末端V3抗体を蛋白質Aアフィニティークロマトグラフィーにより血清から精製した。抗体を燐酸緩衝食塩水(PBS)の中に1mg/mLの濃度で滅菌溶液として再構成し、H IV-1中和分析用にPBSの連続希釈液として調製した。抗体は別々に分析し、異なる特異性の抗体間の相乗作用とその欠失を明らかにするために7-15群の混合物にそれらを合わせた。HIV-1に対する中和活性は、2種類の一次分離株に関してMT-2 ミクロプラーク中和分析により測定し、表示された終点(50％と90％)で抗体濃度 (μｇ/mL)として表した。結果: 表3の結果は、種々の細胞表面抗原に対する特異性を有するネズミモノクローナル抗体(1および2群、HLA DRに対するモノクローナル抗体ID1および80A;3群、H LA A,B,C重鎖に対するモノクローナル抗体A1.4;4群、β₂-ミクログロブリンに対するモノクローナル抗体H28;および5群、CD4蛋白質を含む宿主細胞抗原複合体に対するB4)、HIV-1 MNのgp120のN-末端V3領域から得られる合成ペプチドにより免疫感作されたモルモットからのポリクローナル抗gp120 N末端V3MN抗体製剤(6群)、これらの抗体の混合物(7-15群)、十分特徴が明らかにされたT細胞抗原に対する5 つの更なるモノクローナル抗体(16群、Eロゼット受容体に対するモノクローナル抗体;17群、T3抗原に対するモノクローナル抗体;18群、Leu1に対するモノクローナル抗体;19群、T8抗原に対するモノクローナル抗体;20群、T細胞抗原受容体に対するモノクローナル抗体C37)(Wang et al.，Hybridoma 1986，5:179-190)を含む抗体集合物の、2つのクレードB HIV-1一次フィールド分離株(23135およびBR01 4)に対する中和活性を示している。表3の実験において検討された11の個々の抗体の内、CD4を含む宿主細胞受容体抗原複合体へのユニークな結合活性を有する本発明の好ましい実施例である、T 細胞系HPB-ALLにより免疫感作されたマウスから得られたモノクローナル抗体、B 4だけが一次分離株の強力な中和活性を示した。7-15群の抗体混合物は、B4を含んでいる場合に限り、中和活性を示した。7-10群と15群の結果と11-14群の結果を比較せよ。更に、5群、9、10、15群、7、8群の中和活性を比較すると、混合物の中和活性にはB4のみが寄与していることは明らかである。その他の抗体は、B4 の中和活性を希釈する作用しか果たしておらず、本発明のCD4を含む宿主細胞抗原複合体に対する抗体(モノクローナル抗体B4)とその他の抗細胞抗体または抗gp 120 N末端V3抗体の間の相乗効果を示す証拠は全くない。HPB-ALL細胞に発現されることが公知である、その他のT細胞抗原に対するモノクローナル抗体の中で、検出可能なレベルでHIV-1一次分離株を中和したものは全くなかった。実施例３ HPB-ALL細胞によるBALB/cマウスの免疫感作により作製された、CD4を含む宿主細胞抗原複合体に対するモノクローナル抗体 rsCD4とCD4発現細胞とのモノクローナル抗体の反応性を測定するための明細な手順rsCD4。精製された組み換え可溶性CD4(rsCD4)は、発売元(American Bio-Techn ologies，Inc．ケンブリッジ、マサチューセッツ州)およびNIH(米国)エイズ研究および標準試薬プログラムから入手した。 rsCD4 ELISA による抗CD4反応性の測定。rsCD4 ELISAは、96ウェルミクロタイタープレートを、10mM NaHCO₃緩衝液、pH9.5に含めた0.25μｇ/mLのrsCD4をウェルあたり100μＬ用いて共に4℃で一晩インキュベーションし、コーティングすることにより実施した。rsCD4でコーティングしたウェルを、PBSに含めた3重量％のゼラチン250μＬと共にインキュベーションし、0.05容量％のTWEEN20を含むPB Sで３回洗浄してから、乾燥させた。試験試料(モノクローナル抗体またはモルモット抗rsCD4血清)を20容量％正常ヤギ血清、1重量％ゼラチン、および0.05容量％TWEEN20を含むPBSで、他に表示されていない限り、1:20の容量比の希釈率で希釈した。100μＬの希釈された試料を各ウェルに加え、次いで37℃で1時間反応させた。次にウェルをPBSに含めた0.05容量％TWEEN20で6回洗浄し、未結合標識抗体を除去した。1容量％正常ヤギ血清、0.05容量％TWEEN20を含むPBSの中に、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウスIgGまたはヤギ抗モルモットIgGが希釈率1:1000で含まれる溶液100μＬを各ウェルに加え、37℃で15 分間インキュベーションした。ウェルを0.05容量％のTWEEN20を含むPBSで6回洗浄し、未結合標識抗体コンジュゲートを除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液、pH 5.0に含まれる0.04重量％オルトフェニレンジアミン(OPD)と0.12容量％過酸化水素を含む基質混合物100μＬと15分間反応させた。反応は100μＬの1.0M H₂SO₄ を添加して停止させ、492nm(A₄₉₂)で吸光度を測定した。間接的免疫蛍光染色によるCD4発現細胞に対する反応性の測定。ウェルあたり0 .5x10⁶個のCD4発現細胞(例えば、HPB-ALLまたはSUP-T1細胞系細胞)を、指定されたモノクローナル抗体またはモルモット抗rsCD4血清と室温で45分間インキュベーションする前に、1％BSAを含むPBSにおいて2回洗浄した。第一の染色抗原と共に細胞をインキュベーション後、細胞を同じ洗浄緩衝液において更に2回洗浄し、希釈率1:500の第二のフルオレセインイソシアナート(FITC)を結合されたヤギ抗マウスIgGまたは(FITC)を結合されたヤギ抗モルモットIgG試薬(Cappel，マルバーン、ペンシルバニア州)と共に室温で更に45分間インキュベーションした。染色された細胞を同じ洗浄緩衝液中で再度洗浄し、染色された細胞のパーセンテージ、染色強度、より好ましくは、それぞれの抗原による抗原染色パターンを測定するために、細胞を細胞蛍光光度法および/または免疫蛍光顕微鏡による蛍光分析用に処理した。結果: HPB-ALL細胞系は、間接的免疫蛍光染色により示される以下の膜表現型急性リンパ芽球性白血病患者から得られる悪性ヒトT細胞系である:CD5+(T1/Leu1+)、CD 4発現(T4/Leu3A+)、CD8+(T8/Leu2/C8+)、CD3+(T3/Leu4+)、CD6+(T6/Leu6+)、CD2 +(T11/Leu5/D9+)、CD25+(Tac+)、HLA-A,B,Cおよびβ₂ミクログロブリン+、HLA-D R-(Wang et al.，1986，上記)。BALB/cマウスを、初回免疫感作のために完全フロイントアジュバントに含めた5-10x10⁶個のPBSで洗浄された指数関数的に増殖するHPB-ALL細胞を腹腔内投与することにより免疫感作し、続いてアジュバントを含まないPBSに懸濁された5-10x10⁶個のPBSで洗浄された指数関数的に増殖する細胞を週に1回から2回腹腔内合計3ヶ月間ブーストした。5x10⁶個のPBSで洗浄されたHPB-ALL細胞を最後に静脈内投与により免疫感作してから3日後に、脾臓摘出を実施し、単核細胞懸濁液を調製した。単核脾細胞を骨髄腫細胞への融合と体細胞雑種形成のためにポリエチレングリコール(PEG)で処理した。融合細胞を96ウェルミクロタイタープレートの中に分配士、インキュベーションし、上記のrsCD4 ELISAにより検出される、rsCD4に特異的な抗体を含むウェルを選択した。rsCD4に反応性を示すハイブリドーマを収集し、支持細胞の存在下に96ウェルの底の平らな組織培養プレートにおいて、単細胞クローニングを行った。その後、これらのサブクローニングされたハイブリドーマをまずrsCD4-ELISAによりrsC D4との反応性に関して再スクリーニングし、次にrsCD4に反応性を示すクローンを、更にHPB-ALL細胞によるそれらの抗体の染色活性に関してスクリーニングした。中等度のrsCD4反応性とHPB-ALL細胞を明るく染色するB4およびM2と名付けられた2つのクローンだけが、その後の再クローニングのために選択され、プリスタンを投与されたnu/nuマウスに1x107個の細胞を腹腔内投与することにより腹水として維持された。実施例4-13に示すように、その他のCD4反応性モノクローナル抗体と共に、これら2つのクローンにより分泌される抗体の結合および中和特性を明らかにした。実施例４ BALB/cマウスのrsCD4による免疫感作により作製される真正CD4特異モノクローナル抗体結果: BALB/cマウスを、完全フロイントアジュバント(CFA)に含めた10μｇのrsCD4の腹腔内投与により0日目に免疫感作し、不完全フロイントアジュバント(ICFA)に含めた10μｇ rsCD4を21、42および137日目にブーストし、145日目にPBSに含めた10μｇ rsCD4を静脈内投与し最終ブーストを行った。脾臓摘出と融合を最終ブーストの3日後に実施した。rsCD4に反応する抗体を含むウェルをrsCD4-ELISAにより選択した。E6、E31、H5およびJ33と名付けられた4つのハイブリドーマを採取し、単細胞クローニングを行った。これらのハイブリドーマをその後再クローニングし、腹水発育のために維持した。対照として、1匹のモルモットを完全フロイントアジュバントに含めた100μｇのrsCD4により0日目に免疫感作し、不完全フロイントアジュバントに含めた100μｇ rsCD4を14、28日目に免疫感作した。この動物の血清を28日目と42日目に入手し、抗rsCD4のポジティブコントロールとした。実施例6-10に示すように、これらの4つのハイブリドーマとその抗体の結合および中和特性が明らかにされ、モノクローナル抗体B4およびM2と比較された。実施例５ BALB/cマウスのHPB-ALL細胞による免疫感作と、その後のgp120-rsCD4腹腔内によるブーストにより作製される真正CD4特異モノクローナル抗体結果: BALB/cマウスを、CFAに含めた5x10⁶個のHPB-ALL細胞の腹腔内投与により0日目に免疫感作し、ICFAに含めた5x10⁶個のHPB-ALL細胞を28日目にブーストし、続いてICFAに含めたHIV-1 gp120-rsCD4複合体を56日目から開始して、週に3回ブーストした(1回10μｇ)。脾臓摘出と融合を最終ブーストの3日後に実施した。rsCD4 に反応する抗体を含むウェルを同定した。D5、E2、I26と名付けられた3種類のハイブリドーマを選択し、クローニングし、再クローニングし、腹水発育のための維持した。実施例6-10に示すように、これらの3種類のハイブリドーマとそれらの抗体の結合および中和極性が明らかにされ、モノクローナル抗体B4およびM2と比較された。実施例６個々の結合活性およびHIV一次分離株中和活性に関する、CD4反応性モノクローナルおよびポリクローナル抗体の特性 rsCD4、CC-CKR5表面分子から得られたペプチドと結合したrsCD4、合成CD4ペプチド、CD4発現細胞とのモノクローナル抗体の反応性を測定するための明細な手順抗体によるウイルス中和の測定手順は実施例１に説明されており、rsCD4、CD4 発現細胞の細胞表面への抗体結合の測定手順は実施例3に説明されている。合成C D4ペプチドとの抗体反応性の明細な手順と、抗原決定基マッピングの結果を確認するためのELISA阻害分析のみが、本実施例に示されている。合成CD4ペプチド。表1に記載されているペプチドは、Fmoc化学を用いるApplie d Biosystems自動ペプチド合成器(モデル430、431、433A)で、Merrifield固相合成技術により合成された。所望のペプチドを完全に組み立てた後、トリフルオロ酢酸を用いる標準法に従って処理し、樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖の保護基のブロックを解除した。環状ペプチドに関しては、切断されたペプチドを15％DMSO水溶液に48時間溶解し、システイン間の分子内ジスルフィド結合形成を促進した。★で印を付けられた表1のペプチドは、この様にして環状化された。来のT細胞ヘルパー抗原決定基を含む。切断、抽出、洗浄されたペプチドは、HPL Cにより精製され、質量分析法と逆相クロマトグラフィーにより特徴を明らかにされた。合成CD4ペプチドに基づくELISAs。合成CD4ペプチドに基づくELISAsは、抗原コーティング工程を除き、本明細書上記に説明されているrsCD4 ELISAと本質的に同様に実施された。rsCD4は0.25μｇ/mL、4℃にてミクロタイターウェルをコーティングしたが、指定されたCD4ペプチドでは5μｇ/mL、37℃にて1時間でコーティングした。 ELISA 阻害分析。rsCD4ELISAにおけるペプチドにより引き起こされる抗体結合の阻害は、1.67mg/mLから16.7mg/mLの範囲の表示された濃度の競合ペプチドと共に、終点rsCD4結合希釈率で希釈試料を37℃で1時間プレインキュベーションする事により、測定された。プレインキュベーションされた試料とペプチド混合物は、上記に説明されているrsCD4 ELISA法において直接使用された。阻害率(パーセント)は、ペプチドが存在しない条件でプレインキュベーションされた、同様に希釈された適切なモノクローナル抗体と比較して計算された。rsCD4 ELISAにおけるrsCD4により引き起こされる抗体結合の阻害は、終点rsCD4結合希釈率で、希釈された試料を、表示された濃度の競合rsCD4と共にプレインキュベーションすることにより、同様に測定された。間接免疫蛍光阻害分析。間接免疫蛍光染色法を用いる競合阻害分析のために、種々の阻害試薬を指定された工程でインキュベーションし、2回のインキュベーションの間に必ず同じ洗浄緩衝液において2回洗浄した。結果: 実施例3、4、5に説明されている上記の3つの融合実験から選択された9種類のC D4に反応するモノクローナル抗体の特徴を、以下に関して更に明らかにした:(1) 間接免疫蛍光分析によるCD4発現細胞とのそれらの反応パターン、(2)直接結合および表1に示す注意深くデザインされた合成CD4ペプチドを固相抗原として使用するELISAsの間接的阻害により決定される、CD4におけるそれらの抗原決定基、(3) MT-2ミクロプラーク中和分析によるHIVの一次分離株を中和するそれらの能力。抗体の特徴。ネズミハイブリドーマサブイソタイピングキット(Calbiochem,サンディエゴ、カリフォルニア州、カタログNo.386445)により決定された様に、γ 2a,κ型のネズミ免疫グロブリンであるモノクローナル抗体B4を例外として、他のモノクローナル抗体は全てγ１,κ型である(表7)。選択された9種類のモノクローナルCD4反応性抗体の内、rsCD4 ELISAにより証明された様に、全てがrsCD4 単核細胞と免疫反応性を示し(表4)、モノクローナル抗体J33、H5、E6、E2および I26は比較的強い結合反応性を示し、D5は比較的弱い結合反応性を、モノクローナル抗体B4、M2、E31は中等度の結合反応性を示した。過去に完全および不完全アジュバントの含めた100μｇのrsCD4により2回免疫感作された動物の2 8日目の採血により得られたモルモット抗rsCD4血清rsCD4 ELISAによりrsCD4と極めて高い反応性を示すことが見いだされ、終点力価は105以上であった。この血清は、rsCD4の複数の領域と反応性を有することが明らかにされ、従って、この後の抗体の特徴を明らかにする実験において、真正抗CD4ボジティブコントロールとして使用されている。表4、7、8を参照。各モノクローナル抗体の抗原決定基の同定。モノクローナル抗体のそれぞれによって認識されるCD4分子上の抗原決定基の同定は、表1に示す合成CD4ペプチドの収集物を用いる直接結合試験により試みられた。これらのペプチドは、ヒトCD 4の第一の2つの領域の利用可能な三次元(3-D)構造(Wang et al.,Nature，1990， 348:411)とラットCD4の利用可能な立体構造の相同性分析から予想される、この分子の第三および第四領域の構造(Brady et al.，Science，1993,260:979)に従ってデザインされた。これは、合成CD4と天然CD4の間の血清学的交差反応性を最大限にするためである。断片との結合をrsCD4との結合と比較する。各抗体の結合は、表示されたペプチドまたはrsCD4を固相抗原として利用し、結合されたネズミ抗体を検出するために50μｇ/mLの抗体濃度で開始する連続希釈液において酵素イムノアッセイにより測定された。結合結果は、ペプチドとrsCD4に基づくE LISAsにおける吸光度として表されている。パターン認識を簡単にするために、最大50μｇ/mLの反応性シグナルまで上昇を示す一連の希釈液における最高抗体濃度にて得られた結果のみを、各抗体に関して提示した。A492が0.150より大きい試料は反応性ありと見なされる。ポジティブ結合は、表4に下線で示されている。この徹底的なマッピングの努力により、全てのモノクローナル抗体に関して、CD4一次配列を参考に、それらの抗原決定基のペプチド結合部位と位置が同定された(表4)。表4に示されるペプチド反応性パターンにより9種類の抗体は3群に分けられた。第一群の抗体は、線状抗原決定基を認識し、E6およびE31と名付けられた2つのモノクローナル抗体が含まれた。これらは、一合成ペプチドにより提供される線状抗原決定基を認識することが見いだされた(表4)。より具体的には、モノクローナル抗体E6は、CDR2 HIV gp120結合領域に重なる第一の領域の少数の15個のアミノ酸(AA41-AA55)により提示される領域のみに位置する抗原決定基を認識することが見いだされ、E31はより大きな環状ペプチドAA118-AA165と反応した。第二群の抗体は、5つのモノクローナル抗体、H5、J33、E2、D5、I26から成り、CD4の2つの領域由来の線状ペプチドと反応することが見いだされ、しばしば優先的に一方と反応する(表4)。従って、これらの抗体は不連続形態抗原決定基を認識するものと見なされる。より具体的には、H5はCD4分子の第一の領域のCDR3 領域(AA₇ ₉-AA₉ ₆)と主に反応し、2つの環状ペプチドAA_{1 3 3}-AA_{1 5 1}およびAA₁ _{1 8} -AA_{1 6 5}によって特徴づけられるCD4の第二の領域との反応性は僅かであることが見いだされた;J33は、環状ペプチドAA_{1 3 3}-AA_{1 5 1}によって特徴付けられるCD4第二の領域の中心と主に反応し、共に領域内ジスルフィド結合の形成に寄与し、それぞれCDR1およびCDR3領域由来のペプチド(AA₁-AA_{2 0})と(AA_{6 8}-AA₉ ₂ )(P1852、表4)の人工的ダイマーによって特徴付けられる第一の領域との反応性は僅かであることが見いだされた;D5は、環状ペプチドAA₁-AA_{2 0}とAA_{2 3 5}-AA₂ _{5 1} によってそれぞれ特徴付けられる第一および第三領域の両者由来の2つのアミノ酸の範囲を認識した;E2は主に環状ペプチド、AA235-AA251によって特徴付けられる第三領域のアミノの範囲を主に認識し、ハイブリッドペプチド1858により特徴付けられるCD4分子のN-末端部分(AA₁-AA_{2 0})との反応性は僅かであった;I26は、環状ペプチドAA_{2 3 5}-AA_{2 5 1}によって特徴付けられる第三領域との優先的反応性のため、D5と大きく重なる領域を認識した。精製されたrsCD4または十分定義されたrsCD4-gp120複合体により免疫感作されたマウスから得られた最初の２群の抗体は、天然rsCD4と強い反応性を示し、CD4 分子の種々の領域と明らかな反応性を示し、真正抗CD4抗体と見なされる。そして最後に、第三群のモノクローナル抗体B4およびM2は、rsCD4 ELISAによって示されるように、飽和濃度(50μｇ/mL)でも天然CD4と中等度の反応性を示したが、CD4の幾つかの領域AA₁-AA_{2 0}、AA_{7 9}-AA_{9 6}、AA_{1 1 8}−AA_{1 6 5}、AA_{2 1 3} -AA_{2 2 6}、AA_{2 3 5}-AA_{2 5 1}、AA_{2 9 7}-AA_{3 5 1}およびAA_{3 6 1} -AA_{3 7 5}のペプチドと弱い反応性しか示さないことが見いだされた。興味深いことに、十分公知の抗CD4抗体Leu3Aと0KT4Aが結合すると報告されている、領域1の CDR2領域に対するB4の反応性は、その他のペプチドとのその反応性と比較すると顕著に低かった。第三群の2つの抗体は、不連続分散配座抗原決定基を認識するものと見なされる。 B4-rsCD4 およびM2-rsCD4相互作用を干渉する疑似ペプチドの同定。B4とM2の両者のCD4分子上の接触部位と考えられる部位を更に明らかにするために、B4-rsCD 4またはM2-rsCD4結合に関与していることが明らかにされている付近の領域のペプチドを(表4)、B4-rsCD4またはM2-rsCD4相互作用の阻害能をELISAで検討した。表5に、rsCD4 ELISAにおいて得られた阻害率(パーセント)の結果を示す。この場合、固相に結合されたrsCD4にB4を結合させる前に、デザインされたCD4ペプチドを連続希釈し、10μｇ/mLのB4 0.1mLと共に個々にインキュベーションした。ペプチドは、1.67mg/mL、167μｇ/mL、16.7μｇ/mLの濃度(それぞれ、濃度1、濃度2、濃度3)で競合的阻害のために使用された。B4-rsCD4相互作用の強い阻害または増強を示したペプチドの結果だけを比較のために示す。増強は、阻害に関してマイナスの値によって示されてる。表6に、rsCD4 ELISAにおいて得られた阻害率(パーセント)の結果を示す。この場合、固相に結合されたrsCD4にM2を結合させる前に、デザインされたCD4ペプチドを表5の様に連続希釈し、20μｇ/mLのB4 0.1mLと共に個々にインキュベーションした。M2-rsCD4相互作用の強い阻害または増強を示したペプチドの結果だけを比較のために示す。表5に示すように、rsCD4へのB4の結合は、AA₁-AA_{2 0}、AA₆-AA_{2 0}、AA_{8 1}-AA₉ ₂ 、AA_{7 9}-AA_{8 8}、AA_{1 5 4}-AA_{1 6 5}、AA_{2 9 7}-AA_{3 5 1}の領域のCD4ペプチドにより強力に阻害されることが見いだされ、CD4関連配座抗原決定基の形成にこれらの領域が関与していることを示している。モノクローナル抗体Le u3Aに関するY.Chiba、上記およびOKT4Aに関するJameson et al.，上記による報告と対照的に、B4-rsCD4結合の有意な増強が、AA_{3 6}-AA_{4 7}の領域のペプチドに観察されたことから、B4の結合へのAA_{3 0}-AA_{4 7}の直接的関与ではなく、空間的な近接性が示唆される。阻害部位は、しばしば分子内ジスルフィド結合周辺に位置している(表5)。種々のCD4ペプチドによる阻害と増強は類似パターンを示すが、M2に関しては僅かに過ぎないが差が認められた(表6)。実施例７ CD4発現細胞の細胞表面に対するモノクローナル抗体の結合特性 HPB-ALL細胞のそれらの抗原決定基の表面発現を検出するために、またHIVgp12 0結合と種々のCD4反応性抗体により認識されるCD4抗原決定基の空間的関係を決定するために、9種類のCD4反応性モノクローナル抗体とモルモット抗rsCD4血清を、種々の間接免疫蛍光分析において使用した。結果: 表7に、以下に関する3つの融合実験から生じたネズミモノクローナル抗体に関して得られた結果が要約されている。(1)それらのイソタイプ;(2)rsCD4ELISAによるrsCD4とのそれらの反応性;(3)それらの細胞反応性の割合(パーセント)を示す間接免疫蛍光分析による表面CD4との反応性;(4)先に結合していたHIVgp120が、CD4を含む宿主細胞抗原複合体に抗体が結合するのを障害する能力;(5)先に結合していた抗体が、CD4を含む宿主細胞抗原複合体にHIV gp120が結合するのを障害する能力;(6)抗体の23135の様なHIV-1一次分離株を中和する能力。細胞膜に結合されたCD4のHIV gp120結合部位と、種々のCD4反応性モノクローナル抗体によって認識されるCD4抗原決定基の空間的関係は、特に(3)、(4)、(5) の項目によって明らかにされる。CD4への結合パターンは、フルオレセインイソシアナート(FITC)標識抗マウスIgG、FFTC標識抗モルモットIgG、またはFITC標識 gp120を用いるHPB-ALL細胞の間接免疫蛍光染色により示される。パターンは、gp 120が存在しない場合の抗CD4ネズミモノクローナル抗体の結合(3)、先に結合されたモノクローナル抗体が存在する場合のFITC標識gp120の結合(5)先に結合されたgp120が存在する場合のモノクローナル抗体の結合(4)に関して示されている。 B4およびM2の結合部位とは異なる結合部位を有するが、場合によってはB4付近に存在する7種類のその他のCD4モノクローナル抗体の中和活性と比較して、モノクローナル抗体B4およびM2の中和活性のユニークな点は(5)および(6)項目において言及されている。 CD4gp120結合部位のCDR2領域に重なる第一領域(AA_{4 1}-AA_{5 5})由来の線状抗原決定基を認識するモノクローナル抗体E6(Wang et al.，Nature，1990，348:411 and Ryu et al.，Nature，1990，348:419)は、rsCD4蛋白質とHPB-ALL細胞の両者と強力に反応することが見いだされ、このHIV結合部位部位のより露出した表面の性質を示している。しかし、rsCD4 ELISAの結果により証明される、真正抗CD4モノクローナル抗体 J33、H5およびE2によって示されるrsCD4分子への比較的強力な反応にも関わらず、僅かに中等度のHPB-ALL細胞の染色しか観察されなかった。これらのモノクローナル抗体に関する1+の評点は、細胞表面CD4抗体複合体上のそれらの抗原決定基が極めて露出されていない状態であることを示していた。更に、rsCD4と共に領域1、2、4の免疫優勢抗原決定基を高度に認識することを以前に特徴付けされているモルモット抗rsCD4血清(実施例6)は、間接免疫分析によりHPB-ALL細胞が僅かしか染色しかしないことを示し、再度CD4陽性細胞表面上のCD4分子に関して全体的な露出の程度が低いことを示している。これに反して、モノクローナル抗体B4およびM2は共にrsCD4との比較的中等度の反応性にも関わらず、細胞を強く染色したことから、CD4以外の補助受容体の部位との接触が関与しており、補助受容体は、CD4と共に、CD4を含む宿主細胞抗原複合体を形成している。これは、幾つかのCD4由来ペプチドによるB4-rsCD4相互作用の阻害によっても実証され(表 5)、細胞表面のCD4蛋白質を含むより大きな抗原複合体と、rsCD4とCD4を含む細胞表面抗原複合体の総合的構造差を示している。モノクローナル抗体によるgp120のCD4細胞への結合阻害。予め細胞を個々のモノクローナル抗体(50μｇ/mLの飽和濃度で100μＬ)またはネガティブコントロールとしてPBSと共にインキュベーションし、続いて細胞を100μＬのFITC-標識HIV gp120と共に1:200の希釈率でインキュベーションする条件で、CD4発現HPB-ALL細胞へのHIVの結合を阻害する能力に関して、これらのモノクローナル抗体の結合特性を更に評価した(表7(5))。インキュベーションの間に一次および標識された二次抗体により、細胞を２回洗浄した。最初にPBSと共にインキュベーションされ、続いてFITC-gp120と共にインキュベーションされた細胞の場合、明るさスコア1+の小さなクラスターの特徴的な染色パターンが得られた(表7および図3)。この様な特徴的なFITC-gp120-HPB-ALL染色パターンは、最初にモノクローナル抗体H5、E31、J33、D5、E2またはI26と共にインキュベーションされ、続いてFITC-gp120染色を行った細胞に関しても得られた事から、これらの抗原によるFITC-gp120結合阻害がないことが証明され、gp 120結合部位とこれらの抗CD4抗体の結合部位の間に関係がないことを示唆している。しかし、予めモノクローナル抗体B4、M2、またはE6により染色すると、FITC -gp120の特徴的な染色パターンが完全に阻止された事から、CD4-gp120結合に対するこれらの抗体の強力な阻害性質を示し、gp120結合部位とB4、M2、E6の結合部位の間の関係を示唆している。E6抗体と異なり、B4およびM2はCD4のHIV結合部位(すなわちCDR2領域)を認識しないので、このB4またはM2の阻害活性は、立体障害として説明された。 gp120 によるモノクローナル抗体のCD4発現細胞への結合阻害。細胞のCD4発現細胞にgp120を予め結合させ、続いてこれらのCD4反応性モノクローナル抗体により結合させることによる効果も評価された。 10x10⁶個のHPB-ALL細胞をまずHIV-1 IIIB株(American Biotechnologies,Inc. ，ケンブリッジ、マサチューセッツ州)過量のgp120、10μｇと共に37℃で45分間インキュベーションした。gp120で処理したHPB-ALL細胞を洗浄緩衝液にて2回洗浄し、次いで本明細書上記の間接免疫蛍光染色法により明記されたモノクローナル抗体と共にインキュベーションした。 E6のCD4発現細胞への結合のみが、先にgp120を結合させることにより完全に阻害されることが見いだされた(表7、(4))。E6により認識される抗原決定基(4)は、 OKT4AとLeu3Aにより認識される抗原決定基(表4)付近にマッピングされた。モノクローナル抗体B4とM2のCD4発現細胞への結合は、CD4発現細胞にgp120を予め結合することにより有意に影響を受けなかった事から、これら２つの抗体がHIV-1 結合後にCD4発現細胞に結合できることを示している。この観察結果から、実施例16(表16および17)に示されるウイルス結合後の段階における抗体B4の生体外中和能と、hu-PBL-SCIDマウスモデルにおいて証明された様にHIV-1感染の接触後防止におけるB4の生体内有効性(実施例18、表20参照)の可能な機序が提供される。実施例８モノクローナル抗体によるHIV一次分離株の中和結果: 本明細書(実施例1)に説明されているMT-2ミクロプラーク分析により、9種類の CD4反応性モノクローナル抗体とモルモット抗rsCD4血清を、それらのHIV-1一次分離株23135を中和する能力に関して試験すると、B4とM2のみが強力な阻害活性を示し、それぞれ0.21および0.38μｇ/mLの濃度で50％阻害まで上昇した(表7、( 6))。HIV gp120結合部位付近の部位を同定し、LKT4AとLeu3Aにより認識される部位に近い抗体E6、および主にCD4第一領域のCDR3領域に位置する部位を認識するH 5は共に、それぞれ59および45.5μｇ/mLの50％終点濃度で僅かしか中和しなかった。モノクローナル抗体B4およびM2と異なり、その他の真正CD4モノクローナル抗体は、ミクロプラーク形成の阻害によって測定される(すなわち、一次HIV-1分離株による細胞融合と感染の阻害)有意な一次分離株中和活性を示さない。モルモット抗rsCD4血清のrsCD4との強力な反応性にもかかわらず、血清希釈率1:10未満の抗rsCD4濃度でも、この血清はHIVにより引き起こされる細胞融合と感染を、阻害しなかった。実施例９ハイブリドーマ選択のための至適免疫感作およびスクリーニング法表７から得られる情報に基づき、本実施例と表12において、新たに洗浄されたアジュバントを含まないCD4発現細胞を用いるマウスのの超免疫感作により、CD4 を含む宿主細胞抗原複合体に高度に反応するハイブリドーマ分泌抗体が良好に産生される。CD4発現細胞に反応するハイブリドーマクローンの産生頻度を高めるために、まずHPB-ALLまたはSUPTI細胞を、HLA A-B、C、CD3、T細胞受容体、CD8 、CD6、CD2、CD5抗原に対する抗体を含むT細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体混合物と共にインキュベーションし、CD4を含む抗原複合体以外のHPB-ALL表面抗原を宿主の免疫系に接触させない様にマスクする。この様にして、HIV-1の受容体と補助受容体の両者を含む細胞表面CD4含有抗原複合体に対する宿主の免疫反応を優先的に標的とする。まずELISAにより、rsCD4に陽性反応を示す、および/またはケモカイン受容体CC-CKR5の第三外部領域由来のペプチド、p2047とプレインキュベーションしたrsCD4に優先的反応性を示す、それよりもrsCD4に反応性を示すハイブリドーマを選択し;続いてrsCD4/p2047およびrsCD4反応性クローンの中から、間接的免疫蛍光分析によりHPB-ALLまたはSUP-T1細胞の様なCD4発現細胞と強力な反応性を示すクローンを選択し、続いて表面のCD4に反応するハイブリドーマの中から、標準MT2ミクロプラーク還元分析により試験されるHIV-1一次分離株に中和活性を有する抗体を分泌するハイブリドーマを選択する段階を含む、簡単な３段階のスクリーニング法が有用である。実施例１０ B4の結合特性と類似の結合特性を有するCD4反応性モノクローナル抗体の選択 B4の結合特性と類似の結合特性を有するモノクローナル抗体は、(1)HRPに結合されたrsCD4 ELISA系において下記のように調製されたモノクローナル抗体B4陽性B4シグナル、または(2)間接的免疫蛍光分析系においてHPB-ALL細胞のFITC-アビジン染色を伴う下記の様に調製されたビオチニル化B4のどちらかを検出する、競合的阻害免疫蛍光分析を比較法として使用することにより、CD4反応性抗原の中から簡単に同定できる。モノクローナル抗体B4のビオチニル化または酵素結合の明細な手順。スクシンイミドエステルを用いるモノクローナル抗体B4のビオチニル化。モノクローナル抗体B4を、蛋白質A-アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、PBSの中に入れ1mg/mLに調整した。0.71mgのN-ヒドロキシスクシンイミドビオチン（Biot in-X-NHS、Boehringer Mannheim Biochemicals，インディアナポリス、インディアナ州、カタログNo.1008960）を0.31mLのDMSO(Boehringer Mannheim Biochemic als，カタログNo.1418165)に溶解し、続いて5mL PBSに含めた5mg B4を加え、ビオチンとB4のモル比を50対1にした。混合物を室温で2時間撹拌し、続いてPBSに対して2-8℃で大規模な透析を行い、最終濃度0.71mg/mLのB4を得た。ビオチニル化B4を、種々のモノクローナル抗体による“B4-CD4-発現細胞”相互作用阻害の競合的免疫蛍光染色分析において、トレーサーとして使用した。過ヨウ素酸塩法によるモノクローナル抗体B4へのホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)の結合。酵素-抗体複合法を、本質的にWilson and Nakane(Knapp et al.，編、1978 Elsevier/North-Holland Biomedical Press,Immunofluoresce nce and Related Staining Techniques ，p215)により説明されている方法で、酵素対抗体モル比0.48対1で実施した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP) -B4複合体を複合体形成後にPBsにおいて大規模に透析し、抗体濃度0.18mg/mLを得た。この複合体を、種々の抗CD4モノクローナル抗体による“B4-rsCD4”相互作用阻害の競合的ELISAにおいて50μｇ/mLで使用した。検出および競合的阻害。表８に、９種類の抗CD4モノクローナル抗体(モノクローナル抗体B4、M2、E6、H5、J33、E31、D5、E2、I26)およびモルモット抗CD4血清による“ビオチニル化B4-表面CD4を含む複合体”の相互作用の競合的阻害に関する試験から得られた結果を示す。競合的阻害試験は、間接的免疫蛍光分析により実施し、この場合、0.5x10⁶個のCD4発現HPB-ALL細胞をテストあたり100μＬで 10μｇ/mLの飽和濃度で個々の抗体と共に、あるいはやはりテストあたり100μｇで1:50の希釈率でモルモット血清と共にインキュベーションし、十分洗浄し、続いて100μＬのビオチニル化B4(0.71mg B4/mLの原液から1:1000の希釈率で)を用いて2回目の染色を行い、十分洗浄し、続いてPBS(pH8.2)に1:250に希釈した100 μＬのFITC-アビジントレーサー(Pierce Chemical Co．ロックフォード、イリノイ州、カタログNo.21221)により３回目の染色を行った。表9に、9種類の抗CD4モノクローナル抗体(モノクローナル抗体B4、M2、E6、H5 、J33、E31、D5、E2、I26)による“HRP B4-rsCD4”の相互作用の競合的阻害に関する試験から得られた結果を示す。競合的阻害試験は、直接的rsCD4 ELISAにより実施例し、この場合、B4シグナルを増強するために、rsCD4をコーティングした固相ウェルをCD4ペプチド1624aで予め処理した。rsCD4をコーティングしたウェルを、120μＬでHRP-結合モノクローナル抗体B4 50μｇ/mLの存在下に、30μ Ｌの個々の抗体（ウェルあたり100μＬで50μｇ/mL）と共にインキュベーションした。結果: 表8に示すように、試験された全てのモノクローナル抗体とモルモット抗rsCD4 血清の中で、B4とM2だけが、間接的免疫蛍光分析系において、HPB-ALL細胞のビオチン-B4(希釈率１:1000)およびFITC-アビジン(Pierce Chemical Co.，希釈率1 :250)染色を有効に阻害した。表9と同様に、試験された全てのモノクローナル抗体の内、モノクローナル抗体B4とM2だけが、rsCD4 ELISAにおいてHRP-B4のrsCD4 分子への結合を45％以上阻害した。従って、HIVの一次分離株に対するその中和活性を含む、B4の結合特性と類似の結合特性を有する抗体を分泌するハイブリドーマの有効な選択は、標準MT-2ミクロプラーク中和分析の様な生体外の機能分析による選択よりも遥かに簡単な選択方法である、HRP-結合またはビオチニル化B4 をトレーサーとして使用する競合的免疫分析により達成できる。より重要な事は、7種類の真正抗CD4モノクローナル抗体(すなわち、モノクローナル抗体E6、H5、J33、E31、D5、E2、I26)の内、rsCD4および表面CD4受容体複合体結合部位との反応性に関してB4と有効に競合できるものが全くなかった点である (表8および9)。実施例１１ｒｓＣＤ４による「Ｂ４−表面ＣＤ４含有複合体」相互作用ではなく、「Ｂ４− ｒｓＣＤ４」相互作用の阻害：MAbはＣＤ４を含む宿主細胞抗原複合体と反応性である。結果：表１０は、固相抗原としてのｒｓＣＤ４（０．２５μｇ/mL、０．１mL/ウェル、４℃、一晩被覆）と、０．２５μｇ/mL、０．１mL/ウェルの精製Ｂ４を使用した間接ｒｓＣＤ４ＥＬＩＳＡシステムで、「Ｂ４−ｒｓＣＤ４」相互作用の競合阻害を含む試験から得られた結果を示し、Ａ４９２nmの読みは０．６７９であった。固相ｒｓＣＤ４とインキュベートする前に、０．００８μｇ/mLから２５μ ｇ/mLまで上昇するｒｓＣＤ４濃度で精製B4と室温で１時間予備インキュベートした。表１０からわかるように、１μｇ/mLのｒｓＣＤ４と２μｇ/mLとのＢ４のプレミックスは、Ｂ４と固相ｒｓＣＤ４との間の相互作用の５０％を阻害する。表１１は、標的細胞としてのＨＰＢ−ＡＬＬ（０．１mLでの試験当たり０．２〜０．５×１０⁶細胞）および０．７１μｇ/mL、０．１mL／試験のビオチニル化Ｂ４を使用した間接免疫蛍光検査分析で、「ビオチニル化Ｂ４−表面ＣＤ４含有複合体」相互作用の競合阻害を含む試験から得られた結果を示し、染色強度３＋で陽性率９５％細胞であった。ＣＤ４−発現ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞とインキュベートする前に、０．００５μｇ/mLから５０μｇ/mLまで上昇するｒｓＣＤ４濃度でビオチニル化Ｂ４と室温で１時間予備インキュベートした。表１１からわかるように、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞のＢ４染色では、ｒｓＣＤ４ＥＬＩＳＡシステムと違って、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞のＢ４染色では、ｒｓＣＤ４を５０μｇ/mLの濃度まで加えても阻害は全くみられなかった。この反応性は、真正抗ＣＤ４抗体の非複合ＣＤ４部位に照らして、ＣＤ４を含む細胞表面抗原複合体Ｂ４の新規認識部位を示す。この結果を、ｒｓＣＤ４による予備吸収によって完全に除去された真正抗ＣＤ４モノクローナル抗体によって、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の免疫蛍光染色で確認した。（データ示さず）。ＣＤ４反応性モノクローナル抗体とｒｓＣＤ４、ＣＤ４由来の合成ペプチド、およびＣＤ４−発現ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞との結合反応性に関する観察結果は全て、以下の４つの主要結果にまとめることができる。（１）表４からわかるように、ＭＡｂＢ４およびＭＡｂＭ２は、分子との部分的反応性と同様にｒｓＣＤ４と適度に反応したが、７種の真正抗ＣＤ４モノクローナル抗体のうち５種（すなわち、Ｅ６、Ｈ５、Ｊ３３，Ｅ２およびＩ２６）およびモルモット抗ｒｓＣＤ４血清はｒｓＣＤ４ＥＬＩＳＡでｒｓＣＤ４と一層強く反応し、（２）表７からわかるように、全ての真正抗ＣＤ４モノクローナル抗体およびモルモット抗ＣＤ４血清は、ＭａｂＢ４およびＭａｂＭ２の「キャップ」パターン（パターンＡ）と異なる、特徴のある「パッチ」結合パターン（パターンＢ）でＨＰＢ−ＡＬＬ細胞と弱く反応し、（３）表８からわかるように、ＣＤ４発現ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を、飽和濃度である２０μｇ/mlの真正抗ＣＤ４モノクローナル抗体または飽和希釈度である１：５０のモルモット抗ｒｓＣＤ血清と予備インキュベートしても、その後、ビオチニル化Ｂ４がＨＰＢ−ＡＬＬに結合するのを阻害しなかったが、ＭａｂＢ４およびＭ２は阻害し、（ｄ）表１０および１１からわかるように、ｒｓＣＤ４濃度１μｇ/mL、２μｇ/mLのＢ４で「Ｂ４−ｒｓＣＤ４」相互作用の５０％阻害が達成されたが、ｒｓＣＤ４濃度５０μｇ/mLでも、０．７１μｇ/mLのビオチニル化Ｂ４で「Ｂ４−ＣＤ含有宿主細胞抗原複合体」相互作用の阻害は全く観察されなかった。上記４つの結果に基づいて、ＭａｂＢ４およびＭａｂＭ２の結合特異性は、ＣＤ４を含む宿主細胞表面抗原複合体を含み、ＣＤ４がその宿主細胞抗原複合体の一部のみを構成するように、ＣＤ４タンパクのみの部位を超えて伸びる部位を包含することによって、真正抗ＣＤ４抗体と容易に区別されると結論づけられた。実施例１２ＣＤ４発現ヒトＴ細胞株由来の細胞で免疫化したＨＣ１および／またはＨＣ２トランスジェニックマウスから誘導されたヒトＩｇモノクローナル抗体の生成この実施例では、不活性化内因性イムノグロブリン座に関して同型接合であり、且つヒト重鎖およびヒト軽鎖をコード化している導入遺伝子ヒト配列を含有するマウスからのヒトハイブリドーマの生成について記載する。。実施例３に記載の免疫化計画に従ってＣＤ４−発現ヒトＴ細胞株で免疫化した、このトランスジェニックマウスから生成したハイブリドーマは、ヒト配列重鎖およびヒト配列軽鎖を含むモノクローナル抗体を分泌する。表１２に記載のアルゴリズムに従って、これらのハイブリドーマの中から、全てのクレードからのＨＩＶ−１の一次分離ウイルスおよびＨＩＶ−２およびＳＩＶの様々な一次分離ウイルスに対して広い交差中和活性を有し、モノクローナル抗体Ｂ４の抗体結合特性に類似した抗体結合特性を有する、ＣＤ４タンパクを含むヒト宿主細胞抗原複合体に結合する抗体を分泌するクローンを選択する。さらに詳細には、smithら、第WO 93/12227号に記載されているような、機能的に崩壊したＪ_H遺伝子座に関して同型接合であり、且つヒト配列重鎖をコード化するように再編成することができる導入遺伝子およびヒト配列軽鎖をコード化するように再編成することができる導入遺伝子を収容しているＨＣ１遺伝子型またはＨＣ２遺伝子型のいずれかを有すると見なされるトランスジェニックマウスを、ＣＤ４発現ヒト白血病Ｔ細胞株、ＨＰＢ−ＡＬＬ由来の細胞で免疫化する。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）１００μｌ中の細胞約５〜１０×１０⁶を、腹腔内注射によって、さらに好ましくは静脈内注射または両者によって、第０日にマウスに導入する。この免疫化を隔週に、最小限４回繰り返し、最後の免疫化を融合の３週間前に実施する。牌臓を摘出し、Kohler and Milstein，Nature，1975，256 :495-97に従って、標準法（ＰＥＧ融合）で、約１５０×１０6個の牌細胞を、約３×１０⁶個の融合パートナー細胞（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞株、ＡＴＣＣ）に融合する。その後の週に、各々、後続の隔週および／または毎月の追加抗原刺激後および最後の静脈内追加抗原刺激の３日後に、多回融合を実施してもよい。ハイブリドーマを成長させ、実施例３に記載の通りに、ｒｓＣＤ４への結合について上清をＥＬＩＳＡで試験する。ヒトイムノグロブリンに対するペルオキシダーゼ複合二次抗体でヒト抗体を検出する。一次ハイブリドーマは閾値濃度でクローニングした単細胞であり、これをｒｓＣＤ４と反応性であるヒトモノクローナル抗体の分泌についてして評価する。このモノクローナル抗体も、ＣＤ４タンパクを含む宿主細胞抗原複合体を認識するかどうかを決定するために、ｒｓＣＤ４反応性クローンの上清を、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株またはＳＵＰ−Ｔ細胞に由来する細胞とのＢ４の反応性に似た反応性について、間接免疫蛍光染色で試験する。良好な成長および高レベルのモノクローナル抗体産生も、開発用クローナルハイブリドーマ細胞株を選択する上で重要な因子である。ｒｓＣＤ４とＣＤ４発現細胞の両者に反応性である抗体を分泌し、且つ十分に成長して高レベルの抗体を分泌するクローンの中から、ＨＩＶの一次分離ウイルスに対する中和活性について、クローン上清をさらに試験する。さらに詳細には、５０％または９０％のエンドポイント希釈について先に説明した通りに、たとえば、ＨＩＶ−１クレードＢ一次分離ウイルス２３１３５に対して、１：２希釈で開始して、既述のＭＴ２ミクロプラーク中和アッセイで試験する。さらにサブクローニングするために、強力なＨＩＶ−１中和活性を示すもののみを選択する。選択したハイブリドーマは、ＨＩＶおよびＳＩＶの一次分離ウイルスに対して強力な中和活性を有する、ＣＤ４を含む宿主細胞抗原複合体上の不連続な点在する立体配座エピトープに特異的な結合活性を有するヒトイムノグロブリンを分泌する。これらのヒトモノクローナル抗体は曝露前ＨＩＶ感染予防用および曝露後ＨＩＶ感染予防用の抗体候補である。実施例１３ＣＤ４を含む宿主細胞抗原複合体に対する広い交差クレードＨＩＶ−１中和活性の証明結果: 実験用菌株ＭＮおよびＨＩＶ−１クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，およびＥを代表する指示された一次分離ウイルスについて、抗体の中和活性を比較した。実施例１に記載の通り、上記一次分離ウイルスはＰＢＭＣで成長させ、ＨＩＶ−１ＭＮはＨ９細胞で成長させた。中和アッセイは、ＭＴ−２ミクロプラーク法（実施例１）で行い、その結果を表１３に示す。表１３では、実施例４（表３）の５群、９群、および１５群、実施例１（表２）に記載のαｇｐ１２０ＣＤ４−ＢＳモノクローナル抗体ＩｇＧ１ｂ１２、実施例２（表３）の６群ポリクローナル抗ｇｐ１２０Ｎ−末端Ｖ３抗体、および大抵のＨＩＶクレードＢ菌株のＮ−末端Ｖ３配列特異性を有する市販のネズミモノクローナル抗ｇｐ１２０Ｎ−末端Ｖ３抗体、ＭＡｂ５０．１のモノクローナル抗体交差クレードＨＩＶ−１の中和活性を比較する。ＭＡｂ５０．１（ Repliqen Corporation，Cambridge MA）は、ＨＩＶ−１ＭＮのgｐ１２０Ｎ末端Ｖ３ループ先端由来の合成ペプチド免疫原に対して生成した。このＭＡｂが認識するエピトープはLys-Arg-Ile-X-Ile-Gly-Proであることが明らかにされている（wrin et al.，J Virol，1995，69：39-48）。ユニーク抗体Ｂ４（５群）はＨＩＶ−１クレードＡ〜Ｅの一次分離ウイルスを強力に中和したが、実験用菌株ＭＮに対する中和力はそれより弱かった。Ｂ４と他の抗細胞抗体および抗−Ｎ−末端Ｖ３を組み合せると、一次分離ウイルス（９群および１５群）に対するＢ４中和活性を弱めただけであった。ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合する一次抗体に有効な他の抗体ＩｇＧ１ｂ１２は、クレードＡ、Ｂ、およびＤの一次分離ウイルスに対して比較的弱い中和活性を示すＢ４（「ＩｇＧ１Ｂ１２」群）よりも弱い交差クレード中和パターンを一次分離ウイルスに対して示した。ＩｇＧ１ｂ１２は、２種のクレードＢ一次分離ウイルスの一方のみを中和した。対照的に、抗Ｎ−末端Ｖ３抗体は、ＭＡｂ５０．１もポリクローナル抗Ｎ−末端Ｖ３ＭＮ（６群および「ＭＡｂ５０．１」）も、実験用菌株を強力に中和したが、ホモタイプクレードＢ一次分離ウイルスを含め、一次分離ウイルスをほとんど中和しなかった。ユニーク抗体Ｂ４と抗Ｎ−末端Ｖ３抗体（１５群）との組み合わせのみが、実験用菌株も一次分離ウイルスも強力に中和した。結論として、抗ｇｐ１２０Ｎ−末端Ｖ３抗体は実験用菌株に対して優先的な中和を示したが、本発明のユニーク抗体Ｂ４はクレードＡ〜Ｅの一次分離ウイルスに対して優先的中和を示した。また、あるＨＩＶ−１一次分離ウイルスに対する交差クレード中和活性を有することが既に証明されている抗体の１つである、α ｇｐ１２０ＣＤ４−ＢＳ抗体と比較して、本発明の抗体はＨＩＶ−１クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥを代表する一次分離ウイルスの全てに対して強力な中和活性を示した唯一の抗体であった。実施例１４ユニーク抗体のＨＩＶ−２中和活性およびＳＩＶ中和活性の証明抗体によるウイルス中和を決定するための具体的な手順ｐ２７抗原中和アッセイ。力価測定したウイルスのストックを抗体の階段希釈と混合し、これを使用して、分裂促進因子で刺激したヒトＰＢＭＣを感染させ、感染した細胞を５日間培養する（Gardner et al.，AIDS Res Hum Retroviruses, 1995，11：843-854）。ＰＢＭＣ培養で蓄積したＳＩＶｐ２７抗原をｐ２７ＥＬＩＳＡで決定することによって最大ウイルス感染性および中和を測量する（Coul ter SIV p27 EIA，Coulter Immunoqlogy，Hialeah，FL）。未処理（最大）培養中のｐ２７濃度と比較して、指示された率のｐ２７蓄積減少をもたらした抗体濃度として中和活性を表わす。感染性低下アッセイ（ＩＲＡ）。ＩＲＡを実施した（White-Scharf et al.,vi rology ，1993，192：197-206）。ＩＲＡ中和測定は、抗体が一定量、この場合は１０μｇ/mL、存在する条件下で、ＰＢＭＣを感染させるのに使用するウイルス負荷を変えることによって行われる。ＩＲＡの結果を、10μｇ/mLの抗体で＞９５％不活性化された感染単位として表す。ウイルス。ＨＩＶ−２_RODはＨ９細胞で成長させたクローン化菌株である（NIH AIDS Research and Reference Reagent Proqram Cataloq no．207）。一次分離ウイルスであるＨＩＶ−２₂₈₇は、実験的に感染させたサルの血漿から採取し、ＳＩＶ₂₅₁、ＳＩＶ₂₃₉、およびＨＩＶ−１／ＳＩＶリコンビナントＳＨＩＶ_IIIB 、およびＳＨＩＶ_89.6はヒトＴ細胞株で継代した実験用菌株であり、David Mont efiori（Duke University，Durham，NC）により提供された。ＳＩＶ₂₅₁のストックは、霊長類ＰＢＭＣで継代したものであった。リコンビナントＳＨＩＶ_IIIB、およびＳＨＩＶ_89.6は、指示されたＨＩＶ−１のクレードＢ菌株由来のＨＩＶ− １エンベロープを有するＳＩＶである。結果: 表１４に示した実験は、Ｂ４（実施例４、表３の５群）とＨＩＶ−２、ＳＩＶ、およびリコンビナントＳＨＩＶの様々な単離ウイルスに対するポリクローナル抗Ｎ−末端Ｖ３ _MN（表３の６群）との比較である。単離ウイルスの名称は、表に示す通りである。ＨＩＶ−２₂₈₇の中和測定は、感染性低下アッセイ（ＩＲＡ）で行った（White-Scharf et al.，virology，1993，192：197−206）。ＩＲＡの結果を、１０μｇ/mLの抗体で＞９５％不活性化された不活性化感染単位として表す。ＨＩＶ−２_RODの中和活性は、実施例１に記載のＭＴ−２アッセイで測定した。ＳＩＶ₂₅₁、ＳＩＶ₂₃₉、およびＨＩＶ−１／ＳＩＶリコンビナントＳＨＩＶ_IIIB、およびＳＨＩＶ_89.6は、８０％エンドポイントまで実施したＰＢＭＣ成長ＳＩＶ₂₅₁のＢ４の一組の中和測定を除き、感染ＰＢＭＣ培養のｐ２７抗原中和アッセイで５０％エンドポイントまで測定した（Gardner et al.，AIDS Res H um Retroviruses ，1995，11：843-854）。５０％エンドポイントおよび８０％エンドポイントは、未処理培養と比較した抗体処理培養中の検出可能なｐ２７分画である。Ｂ４は、表１４に示したＨＩＶ−２、ＳＩＶ、およびＳＨＩＶ菌株全てに対して、中和を示した。比較すると、実験用ＨＩＶ−１ＭＮに効果的であることが予め証明されている抗Ｎ−末端Ｖ３ＭＮ抗体による中和（実施例１および実施例１３、表２および表１３）は、これらのリコンビナント菌株が実験に適合した状態であったにも拘わらず、ＳＨＩＶリコビナントに関しては明白ではなかった。それ故、実験用単離ウイルスにせよ一次分離ウイルスにせよ、Ｔ細胞株で成長させたにせよＰＢＭＣで成長させたにせよ、独特で且つ強力に中和する抗体の交差中和活性は本発明の明確な特性である。この観察結果から、抗体の防護効果を試験するために、ＳＩＶアカゲザル感染モデル、ＳＩＶブタオザル感染モデルおよびＨＩＶ−２ブタオザル感染モデルで、本発明の抗体を有効に試験できることがわかる。実施例１５チンパンジー適合ＨＩＶ−１に対するユニーク抗体の中和活性の証明結果: チンパンジーＰＢＬで成長させたクレードＢ、ＨＩＶ−１ＤＨ−１２およびＨＩＶ−１主要保存単離ウイルスに対する、Ｂ４および先に特性化されたＩｇＧ１ｂ１２（抗ｇｐ１２０ＣＤ４結合部位）の中和活性を比較し、その結果を表１５に示す。Ｂ４の場合はＭＴ−２法とＩＲＡ法の両者で、ＩｇＧ１ｂ１２の場合はＩＲＡ法のみで中和を決定した。ＩＲＡの結果は、Ｂ４の場合は１０μｇ/mLの抗体で＞９５％不活性化された不活性化感染単位として表し、ＩｇＧ１ｂ１２の場合は２５μｇ/mLの抗体で＞９５％不活性化された不活性化感染単位として表わす。このＭＴ−２アッセイ成績と、表３および表１３（５群）の結果を比較すると、ユニークＣＤ４反応性抗体Ｂ４は、ヒトＰＢＭＣ成長主要ウイルスに関して、チンパンジー適合ＨＩＶ−１に匹敵する中和活性を示したことがわかる。ＩＲＡ成績の比較から、Ｂ４は抗ｇｐ１２０ＣＤ４結合部位抗体ＩｇＧ１ｂ１２よりも一桁以上強い中和活性をチンパンジー適合ＨＩＶ−１に対して示すことが示唆される。したがって、本発明の抗体は、チンパンジー適合ＨＩＶ−１に対して、一次分離ウイルス中和活性を有する既知のモノクローナル抗体の最高のものより明らかに活性である。以上の結果から、本発明の抗体は、ＨＩＶ−１感染用チンパンジー生体内モデルでで有効に試験して、防護効果を試験できることがわかる。＊感染低下アッセイによる＃ MT-2ミクロプラークアッセイによる実施例１６ＨＩＶ−１−次分離ウイルスのＢ４による中和速度論結果：表１６および表１７は、クレードＢ主要野生単離ウイルスであるＨＩＶ−１２３１３５に対するＢ４による中和速度論を示す。表１６は、ウイルスの添加後０〜２４時間の間隔中に添加した２種のＢ４濃度、２μｇ/mLおよび２０μｇ/mLに関する、ＭＴ−２ミクロプラークアッセイを使用した速度論を示す。中和は、指示されたウイルス希釈液の生存率（％）として表す。表１７は、ウイルスを細胞に加えた後０〜９６時間の時間経過中に添加された、２０μｇ/mLのＢ４によるＨＩＶ−１２３１３５の中和速度論を表す。延長時間経過には、指示された希釈のインプットウイルスに対する中和活性を決定するために、ｐ２４抗原中和アサアセイを使用することが必要であった（Wrin et al.，Ｊ Virol，1995，69：3 9-48）。このｐ２４アッセイでは、力価測定したウイルスの階段希釈を使用してＰＢＭＣを感染させ、感染した細胞を４日間培養する。指示された時刻に、指示された濃度まで抗体を加える。ＰＢＭＣ培養で蓄積したｐ２４抗原をｐ２４ＥＬＩＳＡ測定することによってウイルス感染性および中和を測量する（Coulter Im munology，Hialeah，FL）。未処理培養中のｐ２４濃度と比較した、抗体処理した培養中の検出可能なｐ２４の比率（％）として中和活性を表す。すなわち、結果は、ミクロプラークカウントによるウイルス生存率と同じであるが、ｐ２４検出はバックグラウンドによって、より多くの影響を受ける。表１６から、Ｂ４は濃度２μｇ/mLで感染後１時間までインプットウイルスを完全に中和することがわかる。濃度２０μｇ/mLでは、抗体は２４時間以上有効である。表１７は、時間経過を９６時間に延長したときの結果を示し、２０μｇ /mLのＢ４抗体インプットで感染後４８時間まで効果的に中和することがわかる。以上の結果から、ユニーク抗体は、細胞がウイルスに曝露された後でも生体外感染の確立を防止することがわかり、このような抗体はＨＩＶ曝露後の予防的治療に有効であることが示唆される。実施例１７ＳＩＶ_mac251感染に対するアカゲザルの受動免疫化ＳＩＶ感染防護を決定するための具体的手順。本発明の抗体の中和活性に関する上記研究で、ＨＩＶ−２およびＳＩＶの一次分離ウイルスならびにＨＩＶ−１の全てのクレードからの一次分離ウイルスを中和するためのＢ４の濃度、速度論、および拡大幅を特性化する。生体外特性化および霊長類ＣＤ４配列間の高度保存から、３種全ての免疫不全ウイルスによる感染に対するＢ４実施態様は、生体内の防護効果が非常に類似していると考えられる。そこで、ヒトＡＩＤＳの優れた動物モデルである、アカゲザルの実験的ＳＩＶ感染に対するＢ４の投与試験によって、本発明の防護効果を評価した。ウイルスストックおよび生体内ＳＩＶ投与。投与に使用したウイルスストックは、R．Desrosiers （New England Reional Primate Research Center, Sout hborough MA）から入手した原型ＳＩＶ_mac251菌株であった。投与は全て、アカゲザルＰＢＭＣで産生された非クローン化ＳＩＶ_mac251単離ウイルス約１０ＡＩＤ₅₀の静脈内接種であった（Desrosiers et al.，ONAS USA ，1989，86：6353-63 57）。単一免疫化されたコントロール群のサルに、このウイルスストック同量を静脈内投与し、持続的に感染していることを確認した。投与後、動物から定期的に採血し、ウイルス抗原血症血清試験、血清変換試験、およびウイルス検出のためのＰＢＭＣおよび血漿の培養で感染の確立をモニタリングした。ＳＩＶ血清学アッセイ。ＳＩＶ感染の結果としての血清変換を、ＳＩＶに対して交差反応性であり、且つＳＩＶ貫膜タンパク（ｇｐ３６）の免疫優性アミノ末端領域（アミノ酸５８８−６０３）に対する血漿抗体のエンドポイント滴定に使用できるＨＩＶ−２ペプチド抗原に基づく酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）（ＨＩＶ−１，２ＥＩＡ、United Biomedica，Inc.，Hauppauqe NY）で検出した。ＳＩＶｐ２７抗原アッセイ。特異的モノクローナル抗体に基づく抗原捕捉ＥＩＡ（Coulter Immunology，Hialeah，FL）を使用して、生体外および生体内での生産性ウイルス感染を検出した。非希釈血漿の場合、生体内の陽性成績は＞０．０５nq/mLの値で表示された。ＳＩＶ単離アッセイおよびエンドポイント希釈アッセイ。 Ficoll-Hypaque勾配で、アカゲザルＰＢＭＣを全血から分離した。非希釈清澄血漿または分離したＰＢＭＣ 2mlを、分裂促進因子で刺激したヒトＰＢＭＣに加えた。２０U/mLのIL-2および２００U／mLの抗インターフェロンα（両者ともCol laborative Research，Waltham，MA）、２．５×１０^-2mMの２−メルカプトエタノールおよび２μｇ/mLのポリブレン（両者ともにsigma）を加え、３７℃、５％ CO2に保った、１０％ウシ胎児血清（Sigma，St．Louis MO）を含有するＲＰＭ１ −１６４０清澄培地で培養を維持した。ｐ２７抗原の存在について培養上清を毎週２回、４〜６週間まで検査した。上清試料が３日連続でｐ２７抗原陽性であった場合、培養を陽性であると決定した（Coulter SIV p27 EIA，Coulter Immunol oqy，Hialeah，FL）。サルＰＢＭＣにおける感染性ＳＩＶの測量では、ＰＢＭＣを階段希釈し、ヒトＰＢＭＣで同様に培養した。エンドポイントアッセイのための培養は第１４日に終わらせ、ｐ２７抗原を検査する。デザインおよび方法。下記の試験に使用したサル６匹は、TSI Primate Center Mason Laboratories（Worcester MA）でコロニー繁殖した成体および若成体アカゲザルであった。このサルはＳＩＶ、ＳＲＶ−１、ＳＲＶ−２、ＳＲＶ−５およびＳＴＬＶ−１に対する抗体に関して血清反応陰性であった。American Assoc iation for Accredition of Laboratory Animal Care Standard（アメリカ実験用動物認可協会ケア基準）に従って、このサルを室内に収容し、研究者はthe In stitue of Laboratory Resouces，NRC，Washington D.C.のCommittee on Care a nd Use of Labiratory Animals（実験用動物のケアおよび使用に関する委員会）が作成したGuid for the Care and Use of Labiratory Animals（実験用動物のケアおよび使用に関するガイドライン）を厳守した。体重によって、動物をコントロール群と投与群に無作為化した。ＳＩＶ_mac251 １０ＡＩＤ₅₀による静脈内ウイルス投与の１時間前に、ＰＢＳを１群のサル２匹に投与し、タンパクＡアフィニティカラムクロマトグラフィーで精製したMAb Ｂ４ 4mg/kgを２群のサル４匹に静脈内注入で投与した。結果：投与前、ウイルス投与前、ウイルス投与後１時間、１、３、１５、２２、２９および３６日後に血液を採取した。全ての試料をｒｓＣＤ４酵素イムノアッセイで測定した４抗ＣＤ４／ケモカイン受容体抗体の血清レベルは、注入の１日後に最大値の半分に減少していたが、これは末梢血中およびリンパ組織中のサルＣＤ４発現Ｔ細胞による浸透および飽和結合に起因する公算が高い。第１５日、２２日および２９日に、全てのサルから血漿試料を採取し、ＳＩＶｐ２７抗原アッセイでｐ２７抗原を試験した。第１５日に、コントロール群のサル（１群のNo．170およびNo．170）は２匹とも、ｐ２７ＳＩＶ抗原血清反応陽性で証明される通り、感染していた（表１８）。比較すると、4mg/kgのＢ４を受けた実験用２群のサル４匹中１匹のみ(No．Ｇ４Ｂ）が第１５日までに感染した（表１８）。次に、第２２日および第２９日に全てのサルから採取した血漿試料を、ｐ２７イムノアッセイで分析した。この結果を、第１５日に観察したサルのＳＩＶ抗原血の状態で確認した。ＳＩＶ感染を評価するための別のパラメータは、ＳＩＶ反応性への血清変換に関する動物免疫状態のモニタリングであった。コントロール１群のサルは２匹とも、ウイルス投与の２〜３週間後に開始したＨＩＶ１，２（ＳＩＶ）ＥＩＡ試験で検出された通り、抗ＳＩＶ抗体が現れた。未免疫化非投与サルの非反応性コントロール血清（ＮＲＣ）の吸光度の４倍のカットオフ値より高いとき、血清反応陽性と評価した。表１９の血清変換は下線で表示されている。参考のため、St rong Reactive Control(SRC)の吸光度を示す。実験２群の防護されたサル３匹（ＤＷ３、ＧＮ−末端Ｖ３およびＮＵ３）は試験期間を通じて血清反応陰性のままであった。それ故、ｐ２４抗原血でＳＩＶ感染したことが確認された実験群のサル１匹（Ｇ４Ｂ）のみに、この期間中に抗ＳＩＶ抗体が現れたことも確認された。第１５日、２２日および２９日に、両群のサル６匹の各々のアカゲザルＰＢＭＣも採取した。ウイルス培養によってＳＩＶ感染を検出するために、各日の血漿標本およびＰＢＭＣ標本を分裂促進因子刺激ヒトＰＢＭＣと合せた。培養を３週間続け、ｐ２７抗原の有無について、この同時培養の上清を検査した。また、ＰＢＭＣ標本も血漿標本も、ウイルス培養成績が陽性であったことによって実証される通り、コントロール群のサル２匹（No．170および110）および実験群の非防護サル１匹（ＧＢ４）が感染していることが証明された（表１８）。結論：以上の結果から、適度の用量（4mg/kg）のモノクローナル抗体Ｂ４でアカゲザルを受動免疫化すると、ほとんどの（７５％）のサルをＳＩＶ−次分離ウイルスによる感染から効果的に防護することがわかった。この用量は、ＳＩＶ_mac2 ₅₁ の１回量投与後、歴史的コントロール動物全てと本試験のコントロール動物２匹中２匹に持続的感染を効果的に引起こした量である。実施例１８モノクローナル抗体Ｂ４が介在するヒト免疫不全ウイルス感染の一次分離ウイルスに対する物曝露前防護および曝露後防護ＨＩＶ−１感染に対する免疫予防の概念を支持する上で、モノクローナル抗体（MAb）およびポリクローナル血清は非ヒト霊長類およびヒト末梢血リンパ球再構成ＳＣＩＤ（hu-PBL-SCID）マウスをＨＩＶ−１感染（Emini et al.，J ．Viro l , 1990，64：3674、Prince et al., AIDS Res Hum Retroviruses，1991，７：9 71、Emini et al., Nature，1922，355：728、Safrit et al., AIDS，1993，7： 15）およびＳＩＶ感染（Putkonen et al.，Nature，1991，352：436、Lewis et al.，Vaccine，11:1347）から防護することが証明されている。しかし、ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用した上記試験は、Ｔ細胞株由来の実験用菌株のみを中和しただけで、免疫不全ウイルスの一次分離ウイルスを中和しなかった。本試験では、モノクローナル抗体B4を使用して、本発明のモノクローナル抗体、すなわち、ＣＤ４タンパクおよびケモカイン受容体を含み、且つＨＩＶの一次分離ウイルス全てに対して広い中和活性を有する、宿主細胞抗原複合体上の不連続な点在する立体配座エピトープに向けられたモノクローナル抗体が、ＨＩＶ− １一次分離ウイルスによる感染に対して生体内で防護するかどうかを決定した。本試験の目的は、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤと呼ばれる正常ヒト末梢血白血球（ｈｕ−ＰＢＬ）を移植された重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにＢ４を投与すると、その後、中和抵抗性であることが予め判明しているＨＩＶの一次分離ウイルスを投与したとき、防護できることを証明することであった。複数の動物を含む多くの実験群を妥当な費用で比較的短時間に行うことができるため、この効果を評価するために、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルを選択した。この利点は、ＨＩＶ−１投与−防護試験のための代替動物モデルである、チンパンジーのＨＩＶ−１による感染だけでは得られない利点である。ＳＣＩＤマウスでヒト免疫系を再構成するための具体的な手順およびＨＩＶ−１感染防護を決定するための具体的な手順ＭＡｂ。本試験で使用したコントロール抗体は、マウス骨髄腫細胞株ＲＰＣ５．４（ATCC No．TIB12）によって分泌される、結合特異性が未知の抗体、ネズミＩｇＧ_2aであった。Ｂ４もコントロールＩｇＧ_2aＲＰＣ５．４も、Protein-Aアフィニティカラムクロマトグラフィーによって腹水から精製し、使用前に、２mg /mLの滅菌ＰＢＳで再構成した。抗体は全て、腹腔内（i.p.）注射でｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤに投与した。ＳＣＩＤマウス再構成。本試験で使用したＣＢ．１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウ・スは、特殊病原菌非汚染条件下で維持した。新たに単離してＰＢＳ０．５mL に懸濁した正常ヒトＰＢＬ２×１０⁷を腹腔内注射するにことよって、非漏出表現型マウスを再構成した。ＰＢＬ注射の２週間後、マウス血清中にヒトイムノグロブリンが存在することをＥＬＩＳＡで分析することによって再構成を確認した（Sangstat，Menlo Park，CA）。ヒトイムノグロブリン陽性マウスのみをＨＩＶ −１感染試験に使用した。ウイルスストック。記載（Ho et al.，N Engl J Med，1989，321：1621‐5）の通りに、感染させたＰＢＬの上清からＨＩＶ−１ＡＤ６ウイルスストックを調製し、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの感染性を滴定した。この値をミリリットル当たり５０％マウス感染用量（ＭＩＤ₅₀）として示す。ウイルス中和アセッイ。記載（Ho et al.,J Virol，1991，65：489‐493）の通りに、ｐ２４アッセイでＨＩＶ−１中和を実施した。中和を、抗体処理していないコントロールウェルと比較して、抗体処理したウェルから培養上清に放出されるｐ２４抗原量の減少率と定義した。ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのウイルス投与。大抵の中和抗体による中和に対して抵抗性であることが判明しているＡＤ６を、本試験のＨＩＶ−１一次分離ウイルスとして選択した。ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの感染および維持に関する手順はすべて、生物学的研究における安全性レベル３の動物施設で実施した。ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの感染は、ＰＢＬ再構成の２週間後に実施した。１０ＭＩＤ₅₀を含有する無細胞ＨＩＶ−１ストック希釈液０．５mLをマウスに腹腔内注射した。ウイルス接種原は、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスで滴定することによって予め決定し、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの少なくとも８０％を感染させることがわかった。培養によるＨＩＶ−１の検出。記載（Safrit et al.，AIDS 1993，７：15-21 ）の通りに、ウイルス投与の３週間後にマウスを屠殺して腹腔洗浄液および脾臓から細胞を回収した。次に、エンドポイント希釈培養中で、マウスの腹腔洗浄液細胞２×１０⁵個または脾臓細胞５×１０⁶個（１０倍階段希釈による）を、ＨＩＶ−１血清反応陰性のヒトドナー由来のＰＨＡ活性化ＰＢＬ２×１０⁶個とインキュベートした。培養上清にＨＩＶ−１ｐ２４コア抗原が存在することについて、培養を４週まで毎週モニタリングした。１試料が＞１０００pg/mLを含んでいた場合、または連続２試料が＞２００pg/mLを含んでいた場合、培養を陽性と考えた。検出可能な感染細胞を含有する希釈率の最も高いウェルをエンドポイントとして採用し、ウイルス力価を細胞１０⁶個当たり組織培養感染用量Tissue Cu lture Infectious Dose（ＴＣＩＤ）として表した。 MAb B4による曝露前予防効果および曝露後予防効果に関する用量試験および動力学試験実験１デザインおよび方法。曝露前防護を評価するために、ＨＩＶ−１接種の１時間前に、ＰＢＳ０．５mL中のモノクローナル抗体Ｂ４を腹腔内注射した。マウス２群はＭＡｂＢ４を受け（２群および３群、群当たりｎ＝６、それぞれ、濃度５０ mg/kgおよび５mg/kg）、１群は無関係な骨髄腫ＲＰＣ５．４のマウスＩｇＧ_2aを受けた（１群、ｎ＝４、濃度５０mg/kg）。その後、予め免疫化したマウスに、１０ＭＩＤ₅₀のＨＩＶ−１−次分離ウイルスＡＤ６を腹腔内投与した。曝露後防護を評価する場合、４群の動物（ｎ＝６）にウイスルを投与し、３０分後に濃度５０mg/kgのＢ４を投与した。各マウスの体重は平均２０ｇであった。ウイルス投与の３週間後にマウスを屠殺し、ウイルス培養によって感染を決定するために、脾細胞および腹腔洗浄液を採取した。結果：いずれの動物群でも、抗体による毒性は全く認められなかった。表２０Ａに示す通り、５０mg/kgのコントロールＩｇＧ_2aを投与した１群のマウス４匹中３匹（No．4296、4297および4303）のＰＨＡ活性化ヒトＰＢＬを用いて同時培養した脾細胞からも腹腔洗浄液細胞からも、４週間まで実施した培養中にＨＩＶ− １が回収され、このコントロール群の感染率は７５％であった。ウイルス投与の１時間前（２群および３群）またはウイルス投与の０．５時間後（４群）に投与された、５０mg/kg（３群および４群）または５mg/kg（２群）のどちらかのＢ４を受けたマウス１８匹のいずれからもウイルイスは回収されなかった（表２０Ａ）。実験２ザインおよび方法。この曝露後防護実験のために、抗体投与前に１０ＭＩＤ₅ ₀ のＨＩＶ−１一次分離ウイルスＡＤ６をマウスに腹腔内投与した。ＨＩＶ−１投与後直ちに、５mg/kgのマウスＩｇＧ_2a（ＲＰＣ５．４）をコントロール１群のマウス（ｎ＝５）に腹腔内注射した。ＨＩＶ−１投与後直ちに、５０mg/kgのＭＡｂＢ４を２群のマウス（ｎ＝４）に投与した。３群、４群および５群の動物（それぞれ、群当たりｎ＝４、４、５）に、濃度５０mg/kgのＭＡｂＢ４を投与した。１時間後、６群および７群の動物（群当たりｎ＝４）にそれぞれ濃度１５mg/kgおよび５mg/kgのＭＡｂＢ４を投与した。各マウスの体重は平均２０ｇであった。ウイルス投与の３週間後にマウスを屠殺し、ウイルス培養によって感染を決定するために、脾細胞および腹腔内洗浄液を採取した。結果：いずれの動物群でも、抗体による毒性は全く認められなかった。表２０Ｂに示す通り、５mg/kgのＩｇＧ_2a（ＲＰＣ５．４）を投与した１群のマウス５匹中３匹（No．４４６７、４４７１および４４７３）由来のＰＨＡ活性化ヒトＰＢＬを用いて同時培養した脾細胞からも腹腔洗浄液細胞からも、４週間まで実施した培養中にＨＩＶ−１が回収され、このコントロール群の感染率は６０％であった。ウイルス投与の０時間、２時間または４時間後に５０mg/kgを受けるか（２群、３群および４群）、ウイルス投与後に１時間間隔で１５mg/kg（６群）および５mg/kg（７群）を受けた２群、３群、４群、６群および７群のマウス２１匹のいずれからもＨＩＶ−１ウイルスは回収されなかった。ウイルス投与の２４時間後に５０mg/kgのＭＡｂを受けた群である５群のマウス４匹中２匹のウイルス培養で、ＨＩＶ−１が検出された。しかし、動物No．４４６９の腹腔内洗浄液のみからＨＩＶ−１が回収された（表２０Ｂ）。実験３デザインおよび方法。４時間までの曝露後期間に、今まで試験した最低Ｂ４濃度（５mg/kg）で、特に、曝露後防護実験を繰り返した。抗体投与前に、１０ＭＩＤ₅₀のＨＩＶ−１一次分離ウイルスＡＤ６をマウスに腹腔内投与した。ＨＩＶ −１投与後直ちに、５mg/kgのマウスＩｇＧ_2a（ＲＰＣ５．４）をコントロール１群のマウス（ｎ＝５）に腹腔内注射した。ＨＩＶ−１投与後直ちに、５mg/kg のＭＡｂＢ４を２群のマウス（ｎ＝５）に投与した。１、２、および４時間後に、それぞれ３群、４群および５群の動物（群当たりｎ＝５）に濃度５mg/kgのＭＡｂＢ４を投与した。各マウスの体重は平均２０ｇであった。ウイルス培養によって感染を決定するために、ウイルス投与の３週間後にマウスを屠殺して脾細胞および腹腔洗浄液を採取した。結果：いずれの動物群でも、抗体による毒性は全く認められなかった。表２０Ｃに示す通り、５mg/kgのＩｇＧ_2a（ＲＰＣ５．４）を投与した１群のマウス５匹全てのＰＨＡ活性化ヒトＰＢＬを用いて同時培養した脾細胞からも腹腔洗浄液細胞からも、４週間まで実施した培養中にＨＩＶ−１が回収され、このコントロール群の感染率は１００％であった。表２０Ｃに示す通り、ウイルス投与の０、１、２または４時間後に５mg/kgのＭＡｂＢ４を受けた２群、３群、４群および５群のマウス２０匹のいずれからも、ＨＩＶ−１ウイルスは回収されなかった。ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおけるＭＡｂＢ４によるＨＩＶ−１_AD6感染の曝露前予防および曝露後予防要するに、上記連続３実験で得られた結果から、曝露前状態でも曝露後状態でも、ＭＡｂによる受動免疫化によって、代表的なＨＩＶ−１一次分離ウイルスによる感染から完全に防護されることが生体内動物モデルで明確に証明される。職業的ＨＩＶ−１曝露後にヒトが感染することは希であるため、大抵の不慮の臨床曝露は≦１ヒト感染量であると推定される。したがって、ＨＩＶに職業的に曝露した後、本ＳＣＩＤマウス試験で使用したものよりはるかに低い血清抗体濃度でヒトを感染から守ることが可能である（本実施例の５mg/kg用量および５０m g/kg用量で、それぞれ＞１０μｇ/mLおよび＞１００μｇ/mLのピーク血清抗体濃度が生じる）。曝露前状態では、５mg/kg、１５mg/kgおよび５０mg/kgの濃度で、高用量（１０ＭＩＤ₅₀）ＨＩＶ−１ＡＤ６感染に対する完全防護が確認された。曝露前状態では、５０mg/kgで４時間を超え２４時間未満の完全防護が、５mg/kgで少なくとも４時間までの完全防護が確認された。以上の観察結果から、職業的にＨＩＶ −１に曝露した後４時間までの予防に関する本発明のＭＡｂＢ４実施態様の有用性がわかる。実施例１９ＭＡｂＢ４−ｒｓＶＤ４−ケモカイン受容体ドメインを代表する合成ペプチドを使用した「ＭＡｂＢ４−ｒｓＶＤ４−ケモカイン受容体ドメイン」相互作用の研究合成ケモカイン受容体ドメインペプチド Fmoc化学を使用するApplied Biosystems自動ペプチドシンセサイザー（モデル４３０、４３１および４３３Ａ）を用いて、Merrifield固相合成技術によって、表２１および表２２に記載の合成ケモカイン受容体ドメインペプチドを合成した。所望のペプチドを完全に組み立てた後、樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖の防護基のブロックを解除するために、トリフルオロ酢酸を使用する標準手順Ｖ）のgly−glyスペーサーおよびＴ細胞ヘルパーエピトープも含む。切断し、抽出して洗浄したペプチドをＨＰＬＣで精製し、質量分析計および逆相ＨＰＬＣで特性化した。それぞれのＥＬＩＳＡによる「ＭＡｂＢ４−ケモカイン受容体ドメイン」相互作用の測量。表２２に示す通り、０．２５μｇ/mのｒｓＣＤ４と予備インキュベートしておいた微量滴定ウェルを４℃で一晩、様々な濃度（０、０．１６、０．０６３，０．２５、１および４μｇ/mL）の指定されたケモカイン受容体ドメインペプチドで被覆した抗原被覆工程以外は、本質的に本願明細書に記載のｒｓＣＤ４ＥＬＩＳＡの通りに、それぞれのＥＬＩＳＡを実施した。結果：ｒｓＣＤ４の非存在下で、５μｇ/mLの指定のケモカイン受容体ドメインペプチドで微小ウェルを３７℃で１時間被覆した、それぞれのＥＬＩＳＡで測定したとき、ＭＡｂＢ４（濃度１０、１、０．１および０．０１μｇ/mL）と個々のケモカイン受容体ドメインペプチドのいずれかとの間の相互作用は検出されなかった。微量滴定ウェルを、０．２５μｇ/mLのｒｓＣＤ４のみで、４℃、一晩被覆したｒｓＣＤ４ＥＬＩＳＡで測定したとき、ＭＡｂＢ４とｒｓＣＤ４との間の限界反応性のみが検出された。しかし、ｒｓＣＤ４（０．２５μｇ/mL）を、様々な濃度の指定された各ケモカインドメインペプチドと予備インキュベートしたとき、それぞれのＥＬＩＳＡ・ＯＤ₄₉₂の読みで測定すると、ｒｓＣＤ４への異なるＭＡｂＢ４結合パターンが確認された。ｒｓＣＤ４とあるケモカン受容体ドメインペプチド（たとえば、ＣＣ−ＣＫＲ２ｂドメイン２および３、ＣＣ−ＣＫＲ５ドメイン３、およびＣＣ −ＣＫＲ３ドメイン４）との先行相互作用は、ＭＡｂＢ４へのｒｓＣＤ４結合にかなり寄与した。このような増強はペプチド濃度依存性である。増強された「ＭＡｂＢ４−ｒｓＣＤ４」相互作用のこの傾向は、１０、１、０．１および０．０１μｇ/mLの全てのＭＡｂＢ４濃度で一貫して確認された。０．２５μｇ/mLのみのｒｓＣＤ４へのＭＡｂＢ４結合と比べたとき、それぞれのケモカイン受容体ドメインペプチドに最も適当な濃度、一般に１μｇ/mL、の、ＭＡｂＢ４−ｒｓＣＤ４結合のＯＤ₄₉₂の増加で測定したときの、増強度を算出した。下表２３に示す通り、０．１μｇ/mLの最適ＭＡｂＢ４濃度でのそれぞれのシグナル増加率（％）に基づいて、０〜８まで等級付けした。表２３は、８種のケモカイン受容体の外面ドメイン４個全てによるＭＡｂＢ４結合への寄与を示す一覧表である。表２３からわかるように、様々な共受容体との接触によって乱されるため、ＣＤ４配座の乱交雑性を表すｒｓＣＤ４へのＭＡｂＢ４結合が、幾つかのケモカイン受容体ドメインペプチドによって増強された。複数の免疫調節機能に関与するＣＤのような分子の場合、その曝露表面については、このような動的性質を想定することが妥当である。この結果から、ＭＡｂＢ４によって認識されるエピトープのマッピングが困難なことが説明される。このエピトープは、表４に示した様々なＣＤ４ペプチドによって表される線状部位または不連続部位で容易に表すことができない、不連続で且つ点在するエピトープと見なされる。さらに、表２２に示した様々なケモカイン受容体ペプチドによって表される部位も含むことが、表２３のデーターによって特徴づけられる。要するに、Ｂ４認識部位は、ＨＩＶのケモカイン受容体、と接触したＣＤ４由来の部位、共受容体、を含む、点在する構造エピトープであり、このエピトープは、その曝露後ウイルス中和の標的としての状態に反映される通り、宿主細胞へのＨＩＶ結合および／またはＨＩＶ進入にに重要である。増強度＠ペプチド濃度１μｇ/mL：＊＠４μｇ/mL 0-50％ 0 250-300 5+ 50-100 1+ 300-350 6+ 100-150 2+ 350-400 7+ 150-200 3+ >400 8+ 200-250 4+ 実施例２０ｒｓＣＤ４およびケモカイン受容体相互反応およびモノクローナル抗体アフィニティに関する研究ケモカイン受容体ＣＣ−ＣＫＲ５ドメイン３ペプチドによる、抗ＣＤ４中和抗体に対するｒｓＣＤ４のアフィニティ改善実施例１９の表２３から、ＣＣ−ＣＫＲ２ｂ（ドメイン２および３）の＞＋４、ＣＣ−ＣＫＲ３（ドメイン４）の８＋およびＣＣ−ＣＫＲ５（ドメイン３）の５＋により、「ＭＡｂＢ４−ｒｓＣＤ４」結合の有意な増強度が明らかになったが、限界増強だけは、ＣＸＣ−ＣＫＲ４（融合またがＬＥＳＴＲとも呼ばれる）のドメインに相応するペプチドによって影響を受けた。最近、Feng et al．(Science，1996，272：872)は、受容体ＣＸＣ−ＣＫＲ４受容体は向Ｔ性ＨＩＶ−１菌株が標的細胞に効率よく進入する原因である共受容体であると報告したが、一連の追跡調査報告(Doranz et al.，Cell，1996，85： 1149、Dragic et al.，Nature，1996，381:667、Choe et al.，Cell，1996，85: 1135、Deng et al.，Nature，1996，381:661、Alkhabit et al.，Science，1996 ，272：1955)は、β−ケモカイン受容体ＣＣ−ＣＫＲ５、ＣＣ−ＣＫＲ２ｂおよびＣＣ−ＣＫＲ３が、感染を確立する原因である主要分離ウイルス、向Ｍ性ＨＩＶ−１の共受容体であることを証明した。表１３の５群からわかるように、ＭＡｂＢ４は、向Ｔ性実験用菌株ＭＮＨ９よりも全クレードの一次野生単離ウイルスを中和するのに有効であった。したがって、ケモカイン受容体ペプチドが寄与する抗ＣＤ４抗体のｒｓＣＤ４に対するアフィニティの改善と一次野生単離ウイルス中和活性との間の関連の有無を試験することが適切であった。向Ｍ型ＨＩＶの主要野生単離ウイルスＣＣ−ＣＫＲ５のドメイン３を表すペプチド２０４７ａ、および中和活性を有するＭＡｂＢ４およびＭＡｂＭ２および中和活性のないＭＡｂＥ６およびＭＡｂＪ３３を含む濃度０．１μｇ/mLの４種のモノクローナル抗体をこの増強試験に使用した。図４からわかるように、２種の中和抗体（すなわち、ＭＡｂＢ４およびＭＡｂＭ２）は、ペプチド２０４７ａによる「ＭＡｂ−ｒｓＣＤ４」結合を用量依存様式で有意に増強した。この増強は、１μｇ/mLのペプチド２０４７ａを０．２５μｇ/mLのｒｓＣＤ４と予備インキュベートした時に最適であった。ｒｓＣＤ４のみより優れたｒｓＣＤ４／ケモカイン受容体ＣＣ−ＣＫＲ５ドメイン３ペプチド混合物に対するＭＡｂＢ４のアフィニティの増強の測量ＥＬＩＳＡ阻害アッセイｒｓＣＤ４（０．２５μｇ/mL）またはＣＣ−ＣＫＲ５ドメイン３（Ｄ３）ペプチド２０４７ａ（１μｇ/mL）と予備インキュベートしたｒｓＣＤ４（０．２５μｇ/mL）を被覆した微量滴定プレートでＭＡｂＢ４結合のｒｓＣＤ４誘導性阻害を実施した。ｒｓＣＤ４およびｒｓＣＤ４／ＣＣ−ＣＫＲ５−Ｄ３被覆微量滴定ウェル上のＭＡｂＢ４のエンドポイント結合濃度は、それぞれの微量滴定ウェルでＯＤ_492nmの読み１．０を与えるＭＡｂＢ４の濃度を基づいて、それぞれ２μｇ／mLおよび０．１μｇ／mLと予め決定した。次に、０〜１０μｇ/mLの範囲のｒｓＣＤ４の希釈試料を、予め決定されたＭＡｂＢ４エンドポイント濃度（すなわち、ｒｓＣＤ４被覆ウェルの場合は２μｇ／mL、ｒｓＣＤ４／ＣＣ− ＣＫＲ５−Ｄ３被覆ウェルの場合は０．１μｇ／mL）のＭＡｂＢ４と３７℃で１時間予備インキュベートし、続いて本願明細書の実施例３に記載の標準ｒｓＣＤ４ＥＬＩＳＡ法を実施することによって、それぞれに被覆された微量滴定ウェルへのｍＡＢＢ４結合を測定した。図５からわかるように、ＭＡｂＢ４−ｒｓＣＤ４結合およびＭＡｂＢ４−ｒｓＣＤ４／ＣＣ−ＣＫＲ５−Ｄ３結合の５０％阻害を生じるｒｓＣＤ４濃度（すなわちＩＣ₅₀）は、それぞれ２μｇ／mLおよび０．１μｇ／mLのＭＡｂＢ４濃度の存在下で０．７２μｇ／mLおよび０．０４７μｇ／mLであった。それ故、ｒｓＣＤ４のみに対するＭＡｂＢ４のアフィニティより優れた、ＣＣ−ＣＫＲ５−Ｄ３（ペプチド２０４７ａ）と混合したｒｓＣＤ４に対するＭＡｂＢ４のアフィニティの改善は１５倍の改善であると測量することができる。実施例２１ＣＤ１マウスをＳＵＰ−Ｔで免疫化することによって発生したＣＤ４を含む宿主細胞抗原複合体に対するモノクローナル抗体ヒトリンパ腫由来Ｔ細胞株、ＳＵＰ−Ｔ（NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramカタログNo．100）を使用してＣＤ１マウスを免疫化した。初回投与は完全フロイントアジュバント中の１０×１０⁶細胞の腹腔内投与であった。続いて、実施例３に記載の通り、５〜１０×１０⁶細胞の腹腔内多回追加抗原刺激を、隔週の日程で行った。最後の２回の追加抗原刺激は、完全フロイントおよび不完全フロイントで投与した。さもなければ、追加抗原刺激はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に加えた洗浄細胞であった。最終免疫化後、脾摘出術を実施した。単核脾細胞を調製し、ＮＳ−１マウス骨髄腫細胞に融合させ、ハイブリドーマを獲得し、実施例３に記載の通りにクローニングした。ハイブリドーマ上清の反応性をｒｓＣＤ４ＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ｒｓＣＤ４／ｐ２０４７ａＥＬＩＳＡで反応性の増強をスクリーニングした。ペプチド２０４７ａ（ｐ２０４７ａ）は、実施例１９、２０および表２１に記載されているＣＣ−ＣＫＲ５ドメイン３ペプチドである。実施例２０で最適化した通り、０．２５μｇ/mLのｒｓＣＤ４および１μｇ/mLのｐ２０４７ａで被覆された微量滴定ウェルで、ｒｓＣＤ４／ｐ２０４７ａＥＬＩＳＡを実施した。ｒｓＣＤ４ＥＬＩＳＡでＡ₄₉₂が０．３５であり、ｒｓＣＤ４／ｐ２０４７ａＥＬＩＳＡでＡ₄₉₂が１．５２６であった、Ｂ１３と呼ばれるハイブリドーマの１種が抗体を分泌した。すなわち、Ｂ１３はｒｓＣＤ４反応性に比べて増強されたｒｓＣＤ４／ｐ２０４７ａ反応性をＥＬＩＳＡで示した。次に、ハイブリドーマＢ１３をさらに希釈とスクリーニングによる１０サイクルのサブクローニングに供した。各サイクルで、ＥＬＩＳＡで増強されたｒｓＣＤ４／ｐ２０４７ａ反応性を示すｒｓＣＤ４反応性モノクローナル抗体を分泌するクローンを生じた。モノクローナル抗体Ｂ１３（ＭＡｂＢ１３）は、ＭＡｂＢ４とアイソタイプであった。ＣＤ４を含む宿主細胞抗原複合体へのＭＡｂＢ４の結合を、Ｂ１３が阻害する能力を証明するために、実施例１１に記載の競合間接免疫蛍光分析法で、ＭＡｂＢ１３をさらに分析した。ビオチニル化ＭＡｂＢ４を、Ｂ１３上清またはマウス抗ＣＤ４抗血清のいずれかと予備インキュベートしておいたＳＵＰ−Ｔ標的細胞とインキュベートした。コントロール細胞は、陽性率９５％で、ＦＩＴＣ染色強度３＋まで染色された。対照的に、抗ＣＤ４中で予備インキュベートした後、９５％を超えるＳＵＰ−Ｔ細胞が１．５〜２．０の強度まで染色され、Ｂ１３上清との予備インキュベート後、細胞の染色は全くみられなかった。ＭＡｂＢ４と同様、Ｂ１３はＣＤ４を含む宿主細胞抗原複合体と特異的に結合すると結論づけることができる。様々なクレードの主要ＨＩＶ−１単離ウイルスに対する中和活性を比較することによって、ＭＡｂＢ１３とＭＡｂＢ４の類似性も証明された。ＨＩＶ−１クレードＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを代表する一次分離ウイルスに対して、ＭＡｂＢ１３の中和活性はＭＡｂＢ４に匹敵するものであった。ウイルス、宿主細胞、およびＭＴ−２ミクロプラーク中和アッセイは、実施例１３に記載の通りであった。Ｂ１３およびＢ４の交差クレード中和活性を表２４に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号０８／８６７，１４９ (32)優先日平成９年６月２日(1997．6．2) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣＤ４ケモカイン受容体を含む宿主細胞抗原複合体に対する、以下にステップを含む抗体を産生する方法である。ａ．ｉ．末梢血単核Ｔ細胞と、胸腺細胞と脾細胞とから成る群から選択された正常なＴリンパ球、または ii．ＳＵＰ−ＴとＨＰＢ−ＡＬＬとから成る群から選択されたＴリンパ腫または白血病に由来するＴ細胞株細胞から成る群から選択された免疫原ＣＤ４発現Ｔ細胞として使用するステップと、ｂ．ＰＢＳ中でＣＤ４発現Ｔ細胞を分離して洗浄するステップと、ｃ．ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＣＤ１マウス、トランスジェニックマウス、ラットまたはアカゲザルから成る群から選択された動物を、分離してＰＢＳまたは完全フロイントアジュバント中でＰＢＳ洗浄したＴ細胞中のＴ細胞５〜１０×１０⁶個で腹腔内免疫化し、続いて、分離してＰＢＳ洗浄したアジュバントを含まないＴ細胞５〜１０×１０⁶個を、毎週または隔月の間隔で合計３〜６ヶ月間、多回腹腔内追加抗原刺激し、融合の３日前に最後の追加抗原刺激を静脈内投与してハイブリドーマを形成するステップと、ｄ．免疫化された動物の血清を、ｒｓＣＤ４に結合する抗体の存在について試験するステップと、ｅ．ステップｄで血清の試験結果が陽性であった免疫化された動物に脾摘出術を実施して、脾細胞を入手するステップと、ｆ．脾細胞を不死悪性細胞株の細胞に融合してハイブリドーマを形成し、ハイブリドーマをクローニングし、ｉ．ｒｓＣＤ４に結合することと、 ii．高解像力蛍光顕微鏡で検査したとき結合パターンが「キャップ」の形である免疫蛍光アッセイでＣＤ４発現細胞に結合することと、 iii．ＨＩＶｇｐ１２０がＣＤ４発現細胞に結合するのを妨害することと、 iv．ＨＩＶｇｐ１２０と予め結合したＣＤ４発現細胞に結合することと、ｖ．１０μｇ/mL未満の濃度、好ましくは５０％中和の場合は０．０１〜１０μｇ/mLの範囲の濃度、９０％中和の場合には０．１〜３５ μｇ/mLの範囲の濃度で、生体外ミクロプラークアッセイでＨＩＶ一次分離ウイルスを中和することという特徴を有する抗体を分泌するハイブリドーマを選択するステップ。２．分泌された抗体の特徴が vi．５０mg/kg未満のＥＤ₅₀で、ＨＩＶまたはＳＩＶの一次分離ウイルスによる感染で霊長類またはｈｕ−ＰＢＬ／ＳＣＩＤマウスに受動免疫化を提供することをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。３．分泌された抗体の特徴が vii．ペプチド：ＡＡ₁−ＡＡ₂₀、ＡＡ₈₁−ＡＡ₉₂、ＡＡ₇₉−ＡＡ₈₈ 、ＡＡ₆₀−ＡＡ₁₀₉、ＡＡ₁₁₈−ＡＡ₁₆₅、ＡＡ₂₃₅−ＡＡ₂₅₁、ＡＡ₂₉₇−ＡＡ₃₅₁、またはＡＡ₃₆₁−ＡＡ₃₇₅によって表されるような、ＣＤ４の４つの細胞外ドメインのいずれかに結合することをさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。４．分泌された抗体の特徴が viii ｒｓＣＤ４よりｒｓＣＤ４／ケモカイン受容体に優先的に結合することをさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。５．ケモカイン受容体がＣＣ−ＣＫＲ５Ｄ３ペプチドであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。６．ＣＤ４発現細胞がＳＵＰ−Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。７．ＣＤ４発現細胞がＨＰＢ−ＡＬＬ細胞であることを特徴とする、請求項１、２、３、４またはは５に記載の方法。８．動物がＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣＤ１マウスであることを特徴とする、請求項１、２、３、４またはは５に記載の方法。９．動物が、ヒト重鎖とヒト軽鎖をコード化している導入遺伝子ヒト配列を含むトランスジェニックマウスであることを特徴とする、請求項１、２、３、４またはは５に記載の方法。１０．下記の特徴を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法で産生された抗体。ｉ．ｒｓＣＤ４に結合することと、 ii．高解像力蛍光顕微鏡で検査したとき結合パターンが「キャップ」の形である免疫蛍光アッセイでＣＤ４発現細胞に結合することと、 iii．ＨＩＶｇｐ１２０がＣＤ４発現細胞に結合するのを妨害することと、 iv．ＨＩＶｇｐ１２０と予め結合したＣＤ４発現細胞に結合することと、ｖ．１０μｇ/mL未満の濃度、好ましくは５０％中和の場合は０．０１〜１０μｇ/mLの範囲の濃度と、90％中和の場合には０．１〜３５ μｇ/mLの範囲の濃度で、生体外ミクロプラークアッセイでＨＩＶ−次分離ウイルスを中和すること。１１．分泌された抗体が以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項１０の記載の方法で産生された抗体。 vi．５０mg/kg未満のＥＤ₅₀で、ＨＩＶまたはＳＩＶの一次分離ウイルスによる感染で霊長類またはｈｕ−ＰＢＬ／ＳＣＩＤマウスに受動免疫化を提供すること。１２．分泌された抗体が以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項１１の記載の方法で産生された抗体。 vii．ペプチド：ＡＡ₁−ＡＡ₂₀、ＡＡ₈₁−ＡＡ₉₂、ＡＡ₇₉−ＡＡ₈₈ 、ＡＡ₆₀−ＡＡ₁₀₉、ＡＡ₁₁₈−ＡＡ₁₆₅、ＡＡ₂₃₅−ＡＡ₂₅₁、ＡＡ₂₉₇−ＡＡ₃₅₁、またはＡＡ₃₆₁−ＡＡ₃₇₅によって表されるような、ＣＤ４の４つの細胞外ドメインのいずれかに結合すること。１３．分泌された抗体が以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項１２の記載の方法で産生された抗体。 iii．ｒｓＣＤ４よりｒｓＣＤ４／ケモカイン受容体に優先的に結合すること。１４．ケモカイン受容体がＣＣ−ＣＫＲ５Ｄ３ペプチドであることを特徴とする、請求項１３の記載の方法で産生された抗体。１５．請求項１０、１１、１２、１３、１４または１５に記載の抗体を分泌するハイブリドーマ。１６．下記の特徴を有する抗体。ｉ．ｒｓＣＤ４に結合することと、 ii．高解像力蛍光顕微鏡で検査したとき結合パターンが「キャップ」の形である免疫蛍光アッセイでＣＤ４発現細胞に結合することと、 iii．ＨＩＶｇｐ１２０がＣＤ４発現細胞に結合するのを妨害することと、 iv．ＨＩＶｇｐ１２０と予め結合したＣＤ４発現細胞に結合することと、ｖ．１０μｇ/mL未満の濃度、好ましくは５０％中和の場合は０．０１〜１０μｇ/mLの範囲の濃度、９０％中和の場合には０．１〜３５ μｇ/mLの範囲の濃度で、生体外ミクロプラークアッセイでＨＩＶ一次分離ウイルスを中和すること。１７．以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項１６に記載の抗体。 vi．５０mg/kg未満のＥＤ₅₀で、ＨＩＶまたはＳＩＶの一次分離ウイルスによる感染で霊長類またはｈｕ−ＰＢＬ／ＳＣＩＤマウスに受動免疫化を提供すること。１８．以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載の抗体。 vii．ペプチド：ＡＡ₁−ＡＡ₂₀、ＡＡ₈₁−ＡＡ₉₂、ＡＡ₇₉−ＡＡ₈₈ 、ＡＡ₆₀−ＡＡ₁₀₉、ＡＡ₁₁₈−ＡＡ¹⁶⁵、ＡＡ₂₃₅−ＡＡ₂₅₁、ＡＡ₂₉₇−ＡＡ₃₅₁、またはＡＡ₃₆₁−ＡＡ₃₇₅によって表されるような、ＣＤ４の４つの細胞外ドメインのいずれかに結合すること。１９．以下の特徴を含むことをさらに特徴とする、請求項１８に記載の抗体。 iii．ｒｓＣＤ４よりｒｓＣＤ４／ケモカイン受容体に優先的に結合すること。２０．ケモカイン受容体がＣＣ−ＣＫＲ５Ｄ３ペプチドであることを特徴とする、請求項１９に記載の抗体。２１．抗体がＭ２またはＢ１３であることを特徴とする、請求項１６、１７、１８、１９、または２０に記載の抗体。２２．請求項１６、１７、１８、１９、または２０に記載の抗体を分泌するハイブリドーマ。２３．請求項１６、１７、１８、１９、または２１に記載の抗体を分泌するハイブリドーマ。２４．請求項１６、１７、１８、１９、または２０に記載の抗体を含む医薬品。２５．Ｂ４、Ｍ２およびＢ１３から成る群から選択された抗体を含む医薬品。２６．Ｂ４を含むことを特徴とする、請求項２５に記載の医薬品。２７．Ｍ２を含むことを特徴とする、請求項２５に記載の医薬品。２８．Ｂ１３を含むことを特徴とする、請求項２５に記載の医薬品。２９．下記の特徴を有する抗体を含む医薬品を非経口的に投与することによって、哺乳類のＨＩＶに対して受動免疫を提供する方法。ｉ．ｒｓＣＤ４に結合することと、 ii．高解像力蛍光顕微鏡で検査したとき結合パターンが「キャップ」の形である免疫蛍光アッセイでＣＤ４発現細胞に結合することと、 iii．ＨＩＶｇｐ１２０がＣＤ４発現細胞に結合するのを妨害することと、 iv．ＨＩＶｇｐ１２０と予め結合したＣＤ４発現細胞に結合することと、ｖ．１０μｇ/mL未満の濃度、好ましくは５０％中和の場合は０．０１〜１０μｇ/mLの範囲の濃度、９０％中和の場合には０．１〜３５ μｇ/mLの範囲の濃度で、生体外ミクロプラークアッセイでＨＩＶ一次分離ウイルスを中和すること。３０．抗体が以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。 vi．５０mg/kg未満のＥＤ₅₀で、ＨＩＶまたはＳＩＶの一次分離ウイルスによる感染で霊長類またはｈｕ−ＰＢＬ／ＳＣＩＤマウスに受動免疫化を提供すること。３１．抗体が以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。 vii．ペプチド：ＡＡ₁−ＡＡ₂₀、ＡＡ₈₁−ＡＡ₉₂、ＡＡ₇₉−ＡＡ₈₈ 、ＡＡ₆₀−ＡＡ₁₀₉、ＡＡ₁₁₈−ＡＡ₁₆₅、ＡＡ₂₃₅−ＡＡ₂₅₁、ＡＡ₂₉₇−ＡＡ₃₅₁、またはＡＡ₃₆₁−ＡＡ₃₇₅によって表されるような、ＣＤ４の４つの細胞外ドメインのいずれかに結合すること。３２．抗体が、以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。 viii．ｒｓＣＤ４よりｒｓＣＤ４／ケモカイン受容体に優先的に結合すること。３３．ケモカイン受容体がＣＣ−ＣＫＲ５Ｄ３ペプチドであることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。３４．医薬品が静脈内投与されることを特徴とする、請求項２９、３０、３１、３２または３３に記載の方法。３５．医薬品が１mg/kg体重〜１００mg/kg体重の範囲の用量で投与されることを特徴とする、請求項２９、３０、３１、３２または３３に記載の方法。３６．医薬品が５mg/kg体重〜５０mg/kg体重の範囲の用量で投与されることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。３７．医薬品が５mg/kg体重の用量で投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。３８．可変結合領域が、下記の特徴を有する抗体から誘導されることを特徴とするキメラ抗体。ｉ．ｒｓＣＤ４に結合することと、 ii．高解像力蛍光顕微鏡で検査したとき結合パターンが「キャップ」の形である免疫蛍光アッセイでＣＤ４発現細胞に結合することと、 iii．ＨＩＶｇｐ１２０がＣＤ４発現細胞に結合するのを妨害することと、 iv．ＨＩＶｇｐ１２０と予め結合したＣＤ４発現細胞に結合することと、ｖ．１０μｇ/mL未満の濃度、好ましくは５０％中和の場合は０．０１〜１０μｇ/mLの範囲の濃度、９０％中和の場合には０．１〜３５ μｇ/mLの範囲の濃度で、生体外ミクロプラークアッセイでＨＩＶ一次分離ウイルスを中和すること。３９．以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項３８に記載のキメラ抗体。 vi．５０mg/kg未満のＥＤ₅₀で、ＨＩＶまたはＳＩＶの一次分離ウイルスによる感染で霊長類またはｈｕ−ＰＢＬ／ＳＣＩＤマウスに受動免疫化を提供すること。４０．以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項３９に記載のキメラ抗体。 vii．ペプチド：ＡＡ₁−ＡＡ₂₀、ＡＡ₈₁−ＡＡ₉₂、ＡＡ₇₉−ＡＡ₈₈、ＡＡ₆₀−ＡＡ₁₀₉、ＡＡ₁₁₈−ＡＡ₁₆₅、ＡＡ₂₃₅−ＡＡ₂₅₁ 、ＡＡ₂₉₇−ＡＡ₃₅₁、またはＡＡ₃₆₁−ＡＡ₃₇₅によって表されるような、ＣＤ４の４つの細胞外ドメインのいずれかに結合すること。４１．以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項４０に記載のキメラ抗体。 viii．ｒｓＣＤ４全体のｒｓＣＤ４／ケモカイン受容体に優先的に結合すること。４２．ケモカイン受容体がＣＣ−ＣＫＲ５Ｄ３ペプチドであることを特徴とする、請求項４１に記載のキメラ抗体。４３．可変結合領域がＭ２から誘導されることを特徴とするキメラ抗体。４４．可変結合領域がＢ４から誘導されることを特徴とするキメラ抗体。４５．可変結合領域がＢ１３から誘導されることを特徴とするキメラ抗体。４６．可変結合領域が、下記の特徴を有する抗体から誘導されることを特徴とする、ヒト化抗体。ｉ．ｒｓＣＤ４に結合することと、 ii．高解像力蛍光顕微鏡で検査したとき結合パターンが「キャップ」の形である免疫蛍光アッセイでＣＤ４発現細胞に結合することと、 iii．ＨＩＶｇｐ１２０がＣＤ４発現細胞に結合するのを妨害することと、 iv．ＨＩＶｇｐ１２０と予め結合したＣＤ４発現細胞に結合することと、ｖ．１０μｇ/mL未満の濃度、好ましくは５０％中和の場合は０．０１〜１０μｇ/mLの範囲の濃度、９０％中和の場合には０．１〜３５ μｇ/mLの範囲の濃度で、生体外ミクロプラークアッセイでＨＩＶ一次分離ウイルスを中和すること。４７．以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項４６に記載のヒト化抗体。 vi．５０mg/kg未満のＥＤ₅₀で、ＨＩＶまたはＳＩＶの一次分離ウイルスによる感染で霊長類またはｈｕ−ＰＢＬ／ＳＣＩＤマウスに受動免疫化を提供すること。４８．以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項４７に記載のヒト化抗体。 vii．ペプチド：ＡＡ₁−ＡＡ₂₀、ＡＡ₈₁−ＡＡ₉₂、ＡＡ₇₉−ＡＡ₈₈ 、ＡＡ₆₀−ＡＡ₁₀₉、ＡＡ₁₁₈−ＡＡ₁₆₅、ＡＡ₂₃₅−ＡＡ₂₅₁、ＡＡ₂₉₇−ＡＡ₃₅₁、またはＡＡ₃₆₁−ＡＡ₃₇₅によって表されるような、ＣＤ４の４つの細胞外ドメインのいずれかに結合すること。４９．抗体が、以下の特徴をさらに含むことを特徴とする、請求項４８に記載のヒト化抗体。 viii．ｒｓＣＤ４よりｒｓＣＤ４／ケモカイン受容体に優先的に結合すること。５０．ケモカイン受容体がＣＣ−ＣＫＲ５Ｄ３ペプチドであることを特徴とする、請求項４９に記載のヒト化抗体。５１．可変結合領域がＭ２から誘導されることを特徴とするヒト化抗体。５２．可変結合領域がＢ４から誘導されることを特徴とするヒト化抗体。５３．可変結合領域がＢ１３から誘導されることを特徴とするヒト化抗体。５４．組換えによって製造される請求項４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、または５３に記載のヒト化抗体。５５．フラグメントがＦａｂ'、Ｆ(ａｂ')₂、Ｆ(ｖ)、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、重鎖１本と軽鎖１本から成るダイマーから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１６、１７、１８、１９、または２０に記載の抗体のフラグメント。５６．フラグメントがＦａｂ'、Ｆ(ａｂ')₂、Ｆ(ｖ)、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、重鎖１本と軽鎖１本から成るダイマーから成る群から選択されることを特徴とする、Ｂ４の抗体のフラグメント。５７．フラグメントがＦａｂ'、Ｆ(ａｂ')₂、Ｆ(ｖ)、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、重鎖１本と軽鎖１本から成るダイマーから成る群から選択されることを特徴とする、請求項３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５に記載の抗体のフラグメント。５８．フラグメントがＦａｂ'、Ｆ(ａｂ')₂、Ｆ(ｖ)、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、重鎖１本と軽鎖１本から成るダイマーから成る群から選択されることを特徴とする、請求項４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、または５３に記載の抗体のフラグメント。５９．請求項１６、１７、１８、１９、または２０に記載の抗体の酵素的消化によって得られたフラグメント。６０．Ｂ４の酵素的消化によって得られたフラグメント。６１．請求項３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５に記載の抗体の酵素的消化によって得られたフラグメント。６２．請求項４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、または５３に記載の抗体の酵素的消化によって得られたフラグメント。