JP2000512148A

JP2000512148A - パドロックプローブ検出

Info

Publication number: JP2000512148A
Application number: JP10501697A
Authority: JP
Inventors: クマール，ラジャン
Original assignee: サルノフコーポレーション
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1997-06-16
Publication date: 2000-09-19
Also published as: AU737598B2; US5912124A; EP1007725A4; EP1007725A1; CA2258742A1; WO1997047769A1; IL127561A0; AU3232297A

Abstract

(57)【要約】本発明はパドロックプローブを用いるポリヌクレオチドの検出に関し、それによりハイブリダイゼーションプロセスをライゲーションと組み合わせて関心のあるポリヌクレオチドを不可逆的に捕獲する。本発明はパドロックプローブそれ自体はもちろん使用方法にも関し、これらはその系に組み込まれた信号プロセスを増幅させることにより感受性の水準を変化させることが可能である。加えて、微量流体の使用を含む、パドロックプローブの使用に好ましい形式が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】パドロックプローブ検出本発明は、契約番号70ＮＡＮＢ5Ｈ1037に基づいて米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。本発明はポリヌクレオチド分析の分野に関し、具体的には、その核酸セグメントが既知であるポリヌクレオチドを検出するための方法に関する。本発明は、さらに、前述の方法の微量流体への適用に関する。ポリヌクレオチドの混合物において個々のポリヌクレオチドを同定する必要性が依然として存在している。このような個々のポリヌクレオチドは、ひとたび明確に同定されると、例えば、医学上の診断の基礎をもたらし、かつ医師が治療の過程を説明し、又は別の治療過程もしくはあらゆる治療に関して忠告することを可能にする。また、個々のポリヌクレオチドの同定は犯罪の法医学的調査の実施にも重要であり、加害者による犯行現場又は犠牲者に残された生物学的物質を用いて、その犯行現場又は犠牲者より採取された生物学的物質から単離されたポリヌクレオチドを、例えば被疑者からの、血液サンプルから採取されたポリヌクレオチドを用いて簡単な分析を行うことにより加害者の身元を被疑者に関連付けることができる。この種の分析は、通常の技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)又はリガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)を用いて特異的に増幅した大きなポリヌクレオチドの別々のセグメントに対して行われる機会が増加している。これらの別々のセグメントは特定の疾患もしくは状態の特定の指標であり、又は、増幅法の使用の例として、ヒトの集団において存在頻度が既知である代表的なセグメントである。これらの増幅法は、かなりの程度まで、すなわち、例えば１マイクロリットル当たり少なくとも約100コピー以上存在する精製標的核酸に対してはうまく作用するが、純度に劣り、又は極端に少量の標的核酸はこれらの増幅法の有効性を低下させる傾向にある。このような環境の下での低下した有効性の悪化は、特定のポリヌクレオチドの同定が、一般に、関心のあるポリヌクレオチドに特異的な標識プローブとアンプリコン（amplicon）とも呼ばれる増幅反応産物との間のハイブリダイゼーションに依存するという事実である。ハイブリダイゼーションは融解プロセスとアニーリングプロセスとの間に平衡が存在する動的プロセスである。したがって、標識プローブによってハイブリダイズしたアンプリコンの幾らかの割合はこのプローブから遊離し、それにより、検出を行うことを可能にする正の信号が低下する。したがって、例えば、アンプリコン又は生物学的サンプルに含まれる特定のポリヌクレオチドもしくはそれらの一部の検出において正の信号の出現を増強する検出手順が必要とされている。さらに、関心のあるポリヌクレオチドを信号中に不可逆的に含み、その信号によりその関心のあるポリヌクレオチドが生物学的サンプル中に含まれることが理解される検出手順が必要とされている。本発明は、以下に説明されるように、これらの要求に答える。発明の要約本発明は、ポリヌクレオチドの分析及び検出に有用な信号の不可逆的な捕獲に対する要求に答える。本明細書に開示されるプローブを用いることにより、ポリヌクレオチド混合物中のポリヌクレオチドを検出するための新規手段が考案されている。この設計は所定のポリヌクレオチドの検出効率を高める。具体的には、本発明は第２ポリヌクレオチドを同定するための第１ポリヌクレオチドに関し、この第１ポリヌクレオチドはその末端の各々に結合したリガンドを含んでなる。好ましくは、この第１ポリヌクレオチドは、第２ポリヌクレオチドの５’及び３’末端の各々の少なくとも４つの末端ヌクレオチドの相補物を含む少なくとも１つのセグメントをさらに含み、これらの第１ポリヌクレオチドに含まれる第２ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドの相補物は互いに隣接して位置する。この第１ポリヌクレオチドのセグメントは、好ましくは、いずれかの末端から少なくとも５ヌクレオチドの位置に配置され、かつその（すなわち、第１ポリヌクレオチドの）ほぼ中間に位置していてもよい。図面の簡単な説明図１はパドロック（padlock）プローブの模式図を示し、これは、リガンドを用いてこのようなプローブを生成させる方法を明らかにする。図２はパドロックプローブが作用すると考えられる機構の模式図を示す。図３はパドロックプローブが作用すると考えられる機構の模式図を示し、ここでは信号の増幅が存在し、パドロックプローブと標的核酸との直接ハイブリダイゼーションは存在しない。詳細な説明本発明は、ポリヌクレオチドの混合物、例えば、核酸増幅方法の増幅産物又は生物学的起源から単離された核酸溶液中のポリヌクレオチドを検出するための方法に関する。この方法は、研究室の実験台上での研究においてはもちろん、疾患もしくは状態を分析し、又は犯行現場から採取された証拠を分析するための臨床的もしくは法医学的サンプルの大規模スクリーニングの実施においても用いられる。この検出方法が、関連する同時係属米国特許出願番号60／010，513号（その内容は参照することにより本明細書中に組み込まれる）に開示されている、流体を自動的に反応チャンバーの内外に移動させるための微量流体系の装置において、及び関心のある１つもしくは複数のポリヌクレオチドの分析及び検出に適応する他の方法において用いることができることは重要である。本発明は、結合化剤（これは以下でさらに説明される）の適用を伴う関心のあるポリヌクレオチドの認識プロセスの作用により、一態様においては関心のあるポリヌクレオチドに、別の態様においては信号増幅第２プローブに不可逆的に関与するようになるプローブの生成に関する。このようなプローブは、少なくとも以前に記述された環状形態において、“パドロック（padlock）プローブ”と命名されている。Nilssonら，Sc ience，265，2085−2088（1994）を参照。このNilssonらの参考文献においては、環状パドロックプローブがオリゴヌクレオチドの末端のセグメントとハイブリダイズし、この末端がこのようなハイブリダイゼーションの際にそのオリゴヌクレオチドの３’及び５’末端を互いに隣接させ、リガーゼによる結合に利用可能である配列が含まれることが示された。ＤＮＡのらせん性のため、環状化プローブは標的鎖の周囲に巻き付き、これがこのプローブを連鎖により標的分子に位相的に接続する。このオリゴヌクレオチド標的はライゲーションにより環状パドロックプローブに固定される。本発明においては、このパドロックプローブの概念が拡張されている。第１に、このプローブは直鎖分子として調製され、その末端リガンドに結合することにより環状様相を呈するものであり、この末端リガンドは固体表面に直接結合するか、又はその後プローブ上のリガンドに結合する固体表面に結合した別のリガンドによって固体表面に間接的に結合する。当業者は、通常の方法、例えば、分子生物学におけるショートプロトコル（Short Protocol In Molecular Biology）（Frederick M．Ausubelら編1992）（以下Ausubelら）及びSambrookら，分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory Manual）（第２版，Cold Spring Habor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989）に説明されるものを用いてこのプローブを合成することができる。このような合成の異なる方策は技術者には明らかであろう；例えば、方策の１つは、各々の一方の末端にのみリガンドを有するプローブの２つの部分を、実際にはおそらくはこのリガンドを合成を方向付けるために用いて別々に合成し、次いでこれらの２つの部分を一緒に結合させてプローブ全体を形成することを含む。別の方策は、この合成をさらに分割し、又は核酸合成機においてこのプローブ全体を直接合成することを包含する。本明細書に説明されるプローブは、プローブの両端を固体表面に結合させるという工夫により、クローン化環状核酸の態様を有する。このようなプローブの一例が図１に示されており、ここでオリゴヌクレオチドプローブ103の各末端に結合するリガンド101は円で表され、固体表面104に結合する認識プローブ102は環状リガンドを包含しているところが示される上向きのカップ型半円で表されている。一例として、円101はビオチン又は抗原を表すことが可能であり、かつ半円102は、それぞれ、ストレプトアビジン又はその抗原を認識する抗体を表すことができる；同様に、いずれもリガンドを表す円を包含する上向きのカップ型半円は、リガンドが互いを特異的に認識する複雑な分子相互作用の典型を象徴するものである。第２に、溶液中で信号生成プローブと標的とをハイブリダイズさせ、続いて、この信号生成プローブがパドロックプローブとの結合に適格となった後にのみパドロックプローブを結合させることにより、信号を増強させることができる。パドロックに結合した信号は、信号生成プローブの末端にハイブリダイズする複数の配列を提供することによってではなく増強することが可能であり、すなわち、図２を参照して、例えば、複数のＡ’Ｂ’セグメントをパドロックプローブに含めることができる。加えて、各々のプローブに複数の標識を含めることができる。さらに、パドロックへのプローブのライゲーションのサイクルを、パドロックに関連する信号が観察されるまで繰り返すことができる。現在本発明が作用するものと考えられている基本的な機構が図２に模式的に示されている。標的ポリヌクレオチド205はそれぞれの末端に配列Ａ及びＢを含み、図１に示される通りに固体表面104に結合するパドロックプローブ103は、その内部配列の中に、Ａ’及びＢ’と命名されるＡ及びＢの相補物の配列を含む。このＡ’及びＢ’の位置付けは、標的ポリヌクレオチドの３’及び５’末端がパドロックプローブ103にハイブリダイズした際に互いに隣接するようなものである。アニーリングの後、化学的又は酵素的にライゲーションを行い、それにより標的ポリヌクレオチドをパドロックプローブに固定する。具体的には、本発明は、第２ポリヌクレオチドを同定するための方法において用いられる、本明細書において第１ポリヌクレオチドと呼ばれるパドロックプローブに関し、この方法において、第１ポリヌクレオチドは、その末端の各々に結合したリガンドを含んでなる。この第１ポリヌクレオチドは、好ましくは、第２ポリヌクレオチドの５’及び３’末端の各々の少なくとも約４〜10の末端ヌクレオチドの相補物を含む少なくとも１つのセグメントを含み、これは図２においてＡ’及びＢ’セグメントで表される。より好ましくは、このセグメント（１つもしくは複数）は第２ポリヌクレオチドの５’及び３’末端の各々の少なくとも約４〜７の末端ヌクレオチドの相補物を含み；最も好ましくは、このセグメント（１つもしくは複数）は第２ポリヌクレオチドの５’及び３’の各々の少なくとも約４又は５の末端ヌクレオチドの相補物を含む。好ましくは、第１ポリヌクレオチドに含まれる、第２ポリヌクレオチドの５’ 末端ヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドの相補物は互いに隣接して位置し、さらに、いずれかの末端から少なくとも約５ヌクレオチドの位置に配置される。態様の１つにおいては、このセグメントは第１ポリヌクレオチドのほぼ中間に位置する。好ましくは、第１ポリヌクレオチドに含まれるリガンドはあらゆる適切なリガンド、例えば、特にビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗原、この抗原を認識する抗体、アミン、又はヒドラジンである。好ましい適切なリガンドは第２リガンドに特異的に結合するものであるが、特定の態様においては、このリガンドが固体表面にも、又は第２リガンドの代わりに固体表面に直接結合する。各々のポリヌクレオチドに結合するリガンドは、好ましくは、このポリヌクレオチドに結合するリガンドの各々が固体表面に、又はそれ自体が固体表面に結合する第２リガンドに結合する限り、同じであるかもしくは異なるものである。固体表面にはあらゆる適切な表面が含まれ、これにはプラスチック、ガラス、セルロースもしくはセルロース誘導体、ナイロンもしくは他の合成膜材料、又はセラミックが含まれるがこれらに限定されるものではない。固体表面はいかなる適切なサイズ又は形状を有していてもよく、これには微粒子のものが含まれるがこれに限定されるものでばない。実際、好ましい固体表面は微粒子、例えば微小ビーズ、特には常磁性のものである。別の好ましい固体表面は柔軟かつ平坦であって、それにより１つの固体表面から円筒が形成されるか、又は多数のそのような固体表面を接合して円筒が形成されるものである。本発明の第１ポリヌクレオチドは、この円筒の内表面又は外表面上に位置する。上述の第１ポリヌクレオチドはあらゆる適切な様式、特には、前述の第２ポリヌクレオチドの検出において用いられる。他の適切な使用様式には、Kumar、ヌクレアーゼ保護アッセイ(Nuclease Protection Assays)、代理人整理番号ＤＳＲＣ／12038の同時出願された特許出願に説明されるもののようなヌクレアーゼ保護アッセイにおけるプローブとしての使用が含まれる。他のこのような使用は、一端を標識し、かつ他端を例えば固体表面に結合させるなど、ポリヌクレオチドの末端を区別して標識しなければならない状況に関連する。このような検出の方法の第１の態様は、（Ａ）第１ポリヌクレオチドを用意し、及び（Ｂ）該第１ポリヌクレオチドを、適切な固体表面又は該第１ポリヌクレオチドの第１リガンドに結合する第２リガンドを含む適切な固体表面と接触させ、それにより該第１ポリヌクレオチドを固定化することを包含する。この検出法において用いられる固体表面及びリガンドは、第１ポリヌクレオチドそれ自体に関して上述されるようなものである。この方法は、さらに、（Ｃ）固定化された第１ポリヌクレオチドを第２ポリヌクレオチドと、第１−第２ポリヌクレオチド複合体を形成する相補的核酸間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で接触させることを包含し、ここで、該第２ポリヌクレオチドは標識又は第３リガンドを含み、該第３リガンドは標識を含む第４リガンドによって認識される。適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術分野において公知であり、分子生物学的技術の様々な公開された情報源、例えば、Ausubelら（前出）及びSambrookら（前出）から直接導き出すことができる。用いられるハイブリダイゼーション条件は、実質的に完全に相補的な核酸セグメントの間でのハイブリダイゼーションのみを促進するもの、通常、高度にストリンジェントな条件と呼ばれるものである。第２ポリヌクレオチドに関して用いられるリガンド及び標識にはあらゆる適切なリガンド及び標識が含まれ、本願において説明されるあらゆる他の種の結合又は標識に用いられるものと同じリガンド及び標識である。例えば、ここで適切なリガンドは特定の標識への第２ポリヌクレオチドの特異的結合を可能とし、これにはビオチン、ストレプトアビジン、抗原、この抗原を認識する抗体、プロテインＡ、免疫グロブリンＧ、アミン、又はヒドラジンが含まれるがこれらに限定されるものではない。抗体−抗原の組み合わせは適切なものであればいかなるものでもよく、これは、その検出法を通して結合が保持されるのに十分な２成分間の親和性をこの組み合わせが示すことを意昧する。このような抗体−抗原の組み合わせには、抗原がハプテン、レクチン、免疫グロブリン、又は十分に結合する抗体が存在するか、もしくは生成させることが可能なあらゆる抗原性物質であるような組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。このような組み合わせにはシグマ・ケミカル社（Si gma Chemical Company）（セントルイス、ＭＯ）（以下、「シグマ」）によって商業的に提供されるものが含まれる。適切な標識は、例えば、サンプリングにおいて１ミリリットル当たり約100コピー未満の標的核酸が存在する場合にノイズ比を上回る十分な信号をもたらす；このような適切な標識には放射性同位体、蛍光染料、又は信号生成酵素が含まれる。適切な放射性同位体には³Ｈ、¹⁴Ｃ、及び³²Ｐが含まれるがこれらに限定されるものではない。適切な蛍光染料にはフルオレセイン、ローダミン、７−アミノ−４−メチルクマリン、ダンシルクロリド、Cy3、ヘキスト（Hoechst）33258、Ｒ−フィコエリトリン、カンタム・レッド^T ^M （Quantum Red^TM）、テキサス・レッド(Texas Red)、それらの適切な類似体及び誘導体等が含まれるがこれらに限定されるものではない。適切な信号生成酵素にはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及びウレアーゼが含まれるがこれらに限定されるものではない。前述の標識のいずれもが、例えばシグマから、商業的に入手することができる。好ましくは、少なくとも１つのリガンドが第１ポリヌクレオチド及び固体表面の各々に結合し、このリガンドは同じであるか又は異なり；かつ少なくとも１つの標識が第２ポリヌクレオチド又は第４リガンドに結合する。この方法は、好ましくは、（Ｄ）第１−第２ポリヌクレオチド複合体を適切な洗浄液で洗浄し、それにより非ハイブリダイズ第２ポリヌクレオチドを除去することをさらに包含する。このような洗浄液はAusubelら及びSambrookらに説明されており、典型的には、トリスのようなほぼ中性のｐＨを維持するための緩衝液、ＥＤＴＡのようなキレート化剤、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような洗浄剤が含まれる。その後に、又はその前に、この方法は、第１−第２ポリヌクレオチド複合体の第２ポリヌクレオチドの末端をAusubelら及びSambrookらに説明される通常の方法を用いて適切な結合化剤と結合させる工程(Ｅ)；及び、最終的に、再度Ausubelら及びSambrookらに説明される通常の方法を用いて第１ −第２ポリヌクレオチド複合体を検出する工程（Ｆ）を包含する。工程（Ｅ）の適切な結合化剤は、２つの連続するポリヌクレオチドの隣接する３’及び５’末端を特異的に結合させる化学薬品又は酵素であり、好ましくは、臭化シアン、カルボジイミド、又はリガーゼである。Ausubelら，Rubinら，Nucleic Acids Res. ，23，3547-3553(1995)；並びにＮｇ及びOrgel，Nucleic Acids Res.，15，3573 -3580（1987）を参照。本発明の方法は好ましくは、プラスチック、ガラス、セルロースまたはセルロース誘導体、ナイロンまたはその他の合成膜、セラミック、または任意の他の適当な材料を含んでなる固体表面の使用を包含する。好ましい固体表面は微粒子、特に常磁性微粒子の形状を有するものである。もう一つの好ましい態様には、一つの固体表面が好ましくは円筒状に形成されるかまたは多数のかかる固体表面が好ましくは接合し円筒状に形成されるよう、柔軟かつ平坦である固体表面が包含される。本発明の方法が円筒状の固体表面を包含する場合、第１のポリヌクレオチドは好ましくはその円筒の内部または外部表面上にあり、また、この第１のポリヌクレオチドはその円筒の内部および外部の両方の表面上にあってもよい。円筒状の固体表面を包含する本発明の方法は、その円筒を回転させて固定化された第１のポリヌクレオチドを含有する全ての表面を第２のポリヌクレオチド、洗浄液、または工程(Ｃ)、（Ｄ）または（Ｅ）の結合化剤と接触せしめることを包含するのが好ましい。本発明の方法は、適当な核酸増幅反応の産物であってアンプリコン(amplicon) とも呼ばれる産物である第２ポリヌクレオチドの検出に特に良く適合する。そのような適切な反応及び参考文献により記されるその標準操作には下記のものが包含される。すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ、例えば米国特許4,683,202 およびAusubelらのUnit 15.1を参照されたい)；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、例えばヨーロッパ特許公報320,308およびSchachterらのJ．Clin．Microbiol.,32:2 540-2543(1994)を参照されたい）；ストランド置換増幅(ＳＤＡ、例えばWalker らのPCR Methods and Applications，3:1-6(1993)を参照されたい)；核酸配列に基づく増幅(ＮＡＳＢＡ、例えばvan GemenらのJ．Virol．Methods,43:177-188(1 993)を参照されたい)；および転写に基づく核酸増幅(例えば米国特許5,194,370 および米国特許5,215,899を参照されたい)。最初の２種の増幅操作であるＰＣＲおよびＬＣＲ法はいずれもＤＮＡセグメントの増幅に関するものであり、そして通常かかるセグメントの検出法および分析法に用いられる。これらの操作は慣用的には循環性の変性−復元／反応温度を生成させるための熱サイクラー（cycler ）と一緒に反応に用いられる。他の３種の増幅操作であるＳＤＡ、ＮＡＳＢＡおよび他の転写に基づく核酸増幅もＤＮＡセグメントを増幅させるのに使用できるが、ＲＮＡ増幅産物を生ずる。代表的には、これらの操作はプライマーの添加に際してまたはそれに先立ち標的ＤＮＡを融解させるために少なくとも当初の高温インキュベーションを必要とし、その後にそれより低い温度の恒温で反応が実施される。例えば、公表されたＮＡＳＢＡ操作には65℃での当初インキュベーションに続く41℃でのインキュベーションが包含される。同様に、前記したＳＤＡ操作には95℃での当初インキュベーションに続く37℃でのインキュベーションが包含される。１種以上の第２のポリヌクレオチドを同時に検出するには、第１のポリヌクレオチドが複数の形態を有し、かかる形態のそれぞれが好ましくは異なる第２ポリヌクレオチドの５'および３'末端それぞれの少なくとも約４の末端ヌクレオチドの相補物に対して特異的な異なるセグメントを包含する場合に本発明の方法を好ましく使用できる。本発明の方法は各形態の第１ポリヌクレオチドを前記固体表面上の別個の位置に結合させることにより、かかる複数の検出スキームに充分に適合する。複数の形態の第１ポリヌクレオチドが固体表面上に固定化される場合、その固体表面が柔軟かつ平坦であって、それにより１つの固体表面が円筒に形成されるかまたは多数のかかる固体表面が接合し円筒に形成されるのが好ましい。この円筒状の固体表面は次に前記したように使用され、そこでは第１のポリヌクレオチドが円筒の内部または外部表面上にあリ、そして工程(Ｃ)、（Ｄ）および（Ｅ）に関しては、円筒が回転して、固定化された第１のポリヌクレオチドを含有する全ての表面を第２のポリヌクレオチド、洗浄液または結合化剤と接触せしめるのが好ましい。本発明のもう一つの態様はパドロックプローブのデザインにシグナル増幅を取り込むもので、これは図３の概略図に従って作用すると考えられる。標的ポリヌクレオチド308は、図３に示されるＤＮＡであってもよいがＲＮＡであってもよく、「Ｔ１」により表される分子のセグメントを包含し、「Ｔ２」により表される第２の分子セグメントと連続している。２種の遊離のプローブである307および306のそれぞれが、この検出スキーム用に構築される。すなわち、Ｔ１に対して相補的で標識された「Ｔ１’」を包含する一方の末端およびセグメントＡを包含する第２の末端を有するプローブ１、並びにＴ２に対して相補的で標識された「Ｔ２’」を包含する一方の末端およびセグメントＢを包含する第２の末端を有するプローブ２である。この態様も勿論、図３に例示されるようにセグメントＡおよびＢに対して相補的な標識された「Ａ’」および「Ｂ'」を包含する、ここでは第１のポリヌクレオチドと呼ばれる前記したパドロックプローブ103を包含する。このシグナル増幅態様においては、標的ポリヌクレオチド308および２種の遊離プローブ（307および306）がハイブリダイゼーションを促進する条件下に相互に接触するように配置される。これら遊離プローブは、それらの一方の５'末端が他方の３'末端に直接並置されて、それによりそれらを結合させるための結合化剤により仲介されるライゲーション反応が可能となるようにハイブリダイズする。従って、これら遊離プローブは一方の末端では結合するが、他方はなお遊離のままであり、直線状分子を構成する。従って、標的ポリヌクレオチドは遊離プローブから自由に解離する。この第１段階は完全に溶液中で起こるので、適切な条件下ではこの過程はハイブリダイゼーションおよびライゲーションに傾き、このようにしてＴ１’およびＴ２’末端により結合された遊離プローブの数を増大させる。遊離プローブの残留する遊離末端はパドロックプローブのＡ’Ｂ’セグメントとアニーリングできる。そうすることで、組合わさった遊離プローブの３'および５'末端のライゲーションにより、組合わさったプローブｌと２の構築物がパドロックプローブと不可逆的に絡み合ったものとなる。この方法におけるシグナルの増幅は２つの原因により生ずる。すなわち第１には、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション過程に全くまたは少ししか衝撃を与えるべきでない方法で複数の標識が遊離プローブに付着されうること。第２に、パドロックプローブにおけるアニーリングおよび恒久的な絡み合いの第２段階が、パドロックプローブに少ししかまたは全くシグナルが添加されなくなるまで、または適正な解釈ができるに充分なシグナルをパドロックプローブが捕捉するまで連続的に反復されうることである。特に、第２の態様は第１（すなわちパドロックプローブ）および第２ポリヌクレオチドが直接には相互にハイブリダイズしない第２ポリヌクレオチドの検出方法であって、（Ａ）(i)好ましくはその末端のそれぞれに付着した適当な第１のリガンド；および (ii)第１プローブおよび第２プローブのそれぞれの５'および３'末端または３ 'および５'末端のそれぞれの少なくとも約４〜10の末端ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４〜７の末端ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約４または５の末端ヌクレオチドの相補物を好ましくは包含する少なくとも１種の適当な第１セグメント（例えば、図３のＡ’およびＢ’）；を包含するものである適当な第１ポリヌクレオチドを好ましくは用意し；（Ｂ）その末端の一方に位置し、かつ第２ポリヌクレオチドの相補物の少なくとも約４〜約10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４〜７の末端ポリヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約４または５の末端ヌクレオチドを有する第２セグメント（例えば、図３のＴ１’）を包含する第１プローブを好ましくは用意し；（Ｃ）その末端の一方に位置し、かつ第２ポリヌクレオチドの相補物の少なくとも約４〜約10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４〜７の末端ポリヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約４または５の末端ヌクレオチドを有する第３セグメント（例えば、図３のＴ２’）を包含する第２プローブを好ましくは用意し、（但し、第２および第３のセグメントは異なっているのが好ましく、第２のポリヌクレオチドの連続したセグメントの相補物であるものとする）；（Ｄ）第１ポリヌクレオチドを、適当な固体表面または第１ポリヌクレオチドの第１リガンドに結合する適当な第２リガンドを包含する適当な固体表面と好ましくは接触させ、それにより第１のポリヌクレオチドを固定化させ；（Ｅ）前記した相補的核酸の間でのハイブリダイゼーションを促進する適当な条件下で、第１および第２プローブを適当な第２のポリヌクレオチド（すなわち、標的核酸）と好ましくは接触させて、プローブ−第２ポリヌクレオチド複合体を形成させ；（Ｆ）それらに限定されるものではないが臭化シアン、カルボジイミド、またはリガーゼのような適当な結合化剤を用いて、プローブ−第２ポリヌクレオチド複合体のハイブリダイズした第１および第２プローブの末端を好ましくは結合させ；（Ｇ）相補的核酸の間でのハイブリダイゼーションを促進する適当な条件下で、前記結合した第１および第２プローブを第１ポリヌクレオチドと好ましくは接触させて、プローブ−第１ポリヌクレオチド複合体を形成させ；（Ｈ）それらに限定されるものではないが臭化シアン、カルボジイミド、またはリガーゼのような適当な結合化剤を用いて、プローブ−第１ポリヌクレオチド複合体のハイブリダイズした第１および第２プローブの末端を好ましくは結合させ；（Ｉ）プローブ−第１ポリヌクレオチド複合体を適当な洗浄液で好ましくは洗浄して、それによりハイブリダイゼーションしなかった結合および遊離の第１および第２プローブを除去し；並びに（Ｊ）プローブ−第１ポリヌクレオチド複合体を好ましくは検出する、（ここで、第１または第２プローブが適当な標識または適当な第３リガンドを包含し、該第３リガンドは標識を包含する適当な第４リガンドにより好ましくは認識されるものである。）ことを包含する前記方法に関する。複数の標識および第３−第４リガンドを使用でき、それによりこの方法により同定される標的核酸当たりのシグナルを増大させるのに役立つ。勿論、当業者は工程(Ｅ)、(Ｆ)、（Ｇ）および（Ｈ）を組み合わせることができることを容易に認識するであろう。この方法の増幅可能性に対して大きな注意を向ければ、工程（Ｈ）の後に変性工程が実施されうる。その後に工程(Ｅ)、(Ｆ)、（Ｇ）および（Ｈ）が反復されて、パドロックプローブすなわち第１ポリヌクレオチドによるそれまでの工程（Ｅ）から（Ｈ）までの実施では捕捉されなかった結合プローブ１および２が捕捉されるであろう。好ましくは、工程（Ｈ）後の変性工程に続いて工程(Ｅ)、(Ｆ)、（Ｇ）および（Ｈ）が工程（Ｉ）および（Ｊ）の実施に先立って少なくとも３回反復される。変性工程は熱的、化学的、酵素的、静電的、またはそれらの任意の組み合わせにより達成できる。熱的変性は当該技術分野でよく知られており、Ausubelら（前出）により充分に記載されている。本発明の方法は目的のポリヌクレオチドを 90℃から100℃まで加熱する標準的熱変性を用いるか、または二本鎖核酸の融解温度を低減させる働きをするホルムアミドの存在下でより低度に加熱することにより、容易に適合される。化学的変性は塩基を用いて達成でき、そしてここに参考文献としてとリこまれる同時出願されたLoewyおよびKumarの特許出願（代理人文書番号No.ＤＳＲＣＩ/12050）に充分に記載されている。酵素的変性も当該技術分野でよく知られており、例えばリボＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性することが知られているヘリカーゼとして知られている酵素の種類に由来する酵素が通常用いられる。ヘリカーゼを用いる核酸のストランドの分離に好適な反応条件はKu hnらにより、Cold Spring Harbor Symposia on Quantative Biology，Vol.XLIII ,63-67(1978)に記載されている。静電変性も本発明に関連して使用でき、これは前記同時出願されたLoewyおよびKumarの特許出願に充分に記載されている。本発明に関連して好ましく使用される適当なリガンドは適当な標識が記載されたと同様に前に記載された。実施態様の如何に応じて、１より多いリガンド、好ましくは約１〜約４の間のリガンドが本方法に使用される。前記したように同じかまたは異なるリガンドが使用される。本発明においては、１つまたは複数の標識が使用され、これらの標識は同じかまたは異なることができる。第２の態様に関しては、第１または第２のプローブ（もちろん両プローブを含む）に標識を結合できること、および他の標識に加えてまたはそれらの代わりに第４のリガンドを標識に結合できることを指摘することは重要である。第２の態様における適当な固体表面は先に述べた好ましい固体表面の記載と少しも変わらず、好ましい固体表面としての常磁性微粒子および円筒状に形成された表面の記載、ならびにそれの使用方法が包含される。さらに、本発明の第２の態様ならびにすべての他の態様は、特定のポリヌクレオチドの検出が所望される場合、またはポリヌクレオチドの特定の群の検出が所望される場合に、任意の適用例で使用されることが意図される。例えば、特定の細胞型において発現されることが知られた遺伝子または遺伝子群の発現を検出し、それにより例えば転移癌を分析するための価値あるツールを提供することが望ましい。従って、第２ポリヌクレオチドは特定の細胞または組織から単離されたｍＲＮＡの混合物であることができる。法廷上の分析では、集団中での存在頻度が知られた個々の核酸配列の存在の評価は、例えばミクロフルイディックスまたは円筒状固体表面のアプローチを用いて本発明により容易に達成できる。これらの分析目的には、上述した任意の適当な核酸増幅反応を用いて誘導されたアンプリコンを分析することに関連して本発明の方法を使用することが意図される。個体におけるか、または個体若しくは他の供給源から採取された生物学的サンプルにおける任意のポリヌクレオチド配列群の存在をこのように分析するには、第１のポリヌクレオチドが複数の形態を有することが好ましく、ここでかかる形態物のそれぞれには適当な異なる第１のセグメントが包含され、そして第１および第２のプローブも異なる適当な第２および第３のセグメントをそれぞれ包含する複数の形態を有するものとする。複数の形態の第１ポリヌクレオチドは、前記固体表面上に固定化されるのが好ましく、その場合、一つの固体表面が円筒状に形成されるかまたは多数のかかる固体表面が結合されて円筒状に形成されるよう柔軟かつ平坦である。あるいはまた、複数の形態の第１ポリヌクレオチドはここに記載される標識または任意の他の適当な標識を用いて異なって標識される微粒子のような異なる適当な固体表面に付着される。本発明のさらなる好ましい態様には、ポリヌクレオチドの核酸増幅及び前記した検出方法の態様の一つを行うことを含んでなるポリヌクレオチドの増幅および検出を組み合わせた方法が含まれ、その場合、増幅と本方法を同じ反応室中で実施する。従って、上述した本発明の方法の第１の態様に関しては、本方法はさらに、適当な結合化剤を用いて第１−第２ポリヌクレオチド複合体の第２ポリヌクレオチドの末端を結合させることに関する工程（Ｅ）に先立ち適当なヌクレオチドポリメラーゼを添加することを含む。核酸プローブの合成方法は当該技術分野でよく知られている。かかる方法は例えばCaruthers，Science 230:281-285(1985);Itakuraら,Ann．Rev．Biochem．53 :323-356；Hunkapillarら，Nature310:105-110(1984)；および"Synthesis of Ol igonucleotide Derivatives in Design and Targeted Reaction of Oligonucleo tide Derivatives”，CRC press，Boca Raton，FL，100頁以下に概説されている。ホスホルアミダイトおよびホスフィットトリエステル法が最も広く用いられているが、他の方法にはホスホジエステル法、ホスホトリエステル法およびＨ−ホスホネート法が包含される。ポリヌクレオチドに標識（すなわちリポーター分子）を結合させる方法も当該技術分野でよく知られている。例えば、Biosearch Products of PerSeptive Bio systems(Framingham，ＭＡ)はホスホルアミダイト化学と適合する５'リンカー基を販売している。これらの基の１種は６炭素スペーサーおよびトリフルオロアセチル（"TFAc"）で保護された末端アミンが包含される。このTFAc保護基は塩基不安定であって、ホスホルアミダイト法によって合成されたオリゴヌクレオチドの、通常の合成後の後処理（これは水酸化アンモニウムの存在下における加水分解を包含する）中に除去される。この会社からのもう一つのアミン含有リンカーも６炭素スペーサー基を含有しており、メトキシトリチル（"ＭＭＴ"）基で保護されたアミンを有する。このＭＭＴ基は酸不安定であって、別の脱保護工程を必要とする。これらのアミンリンカーのいずれもビオチンまたはフルオレセインのような分子を結合させるのに使用できる。これらのアミンスペーサー基はまた、縮合反応によってアミン基とアミドを形成するのに使用できる遊離の酸を有する他の分子を結合させるのにも使用できる。Bi osearch Productsからのも一ーつのリンカーはトリチル基によって保護されたチオール基を有する６炭素スペーサーを有する。このトリチル保護基は硝酸銀およびジチオトレイトールでの処理により除去される。このリンカーは酵素およびマレイミドを組み入れてある分子を結合させるのに使用できる。複数の標識を結合させる方法には、多数のアミノまたはチオール基のような多数の反応性部位を有するポリマーの結合が含まれ、それらの反応性部位が標識を結合させるのに使用される。標識化方法は以下の文献に記載されている、すなわち：Sinha and Stri epeke，"Oligonucleotides with Reporter Groups Attached to the 5'Terminus （５'末端にリポータ基を結合させたオリゴヌクレオチド）"in Oligonucleotide s and Analogues:A Practical Approach，Eckstein編，IRL，Oxford，1991，p18 5以下;Sinha and Cook，"The Preparation and Application of Funtionalized Synthetic Oligonucleotides:３ Use of H-Phosphate Derivatives of Protecte d Amino-Hexanol and Mercapto-Propanol or Mercapto-Hexanol,（官能化合成オリゴヌクレオチドの製造および応用：３．保護アミノ−ヘキサノールおよびメルカプトープロパノールまたはメルカプト−ヘキサノールのＨ−ホスフェート誘導体の使用）"Nucleic Acids Research，1988，Vol.16，p.2659以下;Haugland，Mo lecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，Mo lecular Probes，Inc.，Eugene，OR，1992，p20以下;Theisenら、"Fluorescent Dye Phosphoramidite Labelling of Oligonucleotides，（オリゴヌクレオチドの蛍光染料ホスホルアミダイド標識づけ）"iTetrahedron Letters，1992，Vol.3 3，p3036以下;Rosenthal and Jones，"Genomic Walking and Sequencing by Oli gocassette Mediated Polymerase Chain Reaction，（オリゴカセット介在ポリメラーゼ連鎖反応によるゲノム歩行およびシーケンシング）"Nucleic Acids Res earch，1990，Vo l.18，p3095以下;Smithら，"The Synthesis of Oligonucleotides containing a n Aliphatic Amino Group at the 5'Terminus-Synthesis of Fluorescent ＤＮＡ Primers for Use in DNA-Sequence Analysis，（５'末端に脂肪酸アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成−ＤＮＡ配列解析用の蛍光ＤＮＡプライマーの合成）"Nucleic Acids Research，1985，Vol.13，2399以下。ここに記載される方法の多くの適用例において、多数の別個の位置のそれぞれに特有の核酸プローブを有するアレイ(array)を有することが有用である。かかるアレイを形成する方法の一つは、Zanzucchiらによって"Liquid Distribution System,"ＰＣＴ/ＵＳ95/14590(1995年11月９日出願のＰＣＴ出願）に記載された液体分配システムを用いて核酸プローブを製造することである。この液体分配システムは非常に多数の別々の反応ウェル、例えば10,000個の反応ウェル中で別個の合成を行うことができる。各反応ウェル中における合成はビーズまたは微粒子上で起こるか、表面が適切に処理されている場合にはウェルの表面上で起こる。これらウェルは、試薬を多数の反応ウェル中に折り返し輸送するのに使用される液体分配システムの部分から分離可能であるプレート上に形成される。従って、この装置は反応ウェルのそれぞれの中の固相支持体に結合された別個のオリゴヌクレオチドを合成するのに使用できる。次にこのプレートをここに記載されるヌクレアーゼ保護方法にかけることができる。このＰＣＴ/ＵＳ95/14590特許出願および対応する米国特許出願No.08/556,036（1995年11月９日出願）はここにその全体を参考文献として組み入れることにする。多数の別個の部位に別個の核酸プローブを有するアレイを形成させるもう一つの方法はAffymax，Inc．が所有する多数の特許および特許出願に記載される写真平板的合成法を適用することである。これらには、Fodorら，"Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis,"WO92/10092;Doverら，"Method of Synthesiz ing Diverse Collections of Oligomers,"WO93/06121;Campbellら，"Methods fo r Synthe sis of Phosphonate Esters,"米国特許5,359,115;Campbell，"Methods for Synt hesis of Phosphonate Esters,"米国特許5,420,328;Fodorら，"Very Large Scal e Immobilized Polymer Synthesis,"米国特許5,424,186;およびPirrungら，"Lar ge Scale Photolithographic Solid Phase Synthesis of Polypeptides and Rec eptor Binding Screening Thereof"米国特許5,143,854が包含される。勿論、アレイは例えばナイロンフィルター、ニトロセルロースフィルター、ポリカーボネート、ポリスチレンまたは他のプラスチックのような適切な吸着性表面上に核酸プローブを付着させることにより簡単に構築することができる。あるいはまた、核酸プローブが共有的に結合されうる反応性表面を有する市販のアレイ上にアレイを構築することもできる。例えば、Nunc，(Naperville，IL)は、１ −エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドのような水溶性カルボジイミドを縮合剤として使用して、核酸プローブを結合できるアミン基を共有結合させてある表面に有するアレイ（CovaLink NHモジュール）を販売している。本発明とともに使用される検出は標識の性質の如何によるであろう。比色性または蛍光性標識が使用される場合は、視覚による検査または光学的機器で充分であろう。好適な機器には、例えば、Olympus(Lake Success，NY)からの蛍光顕微鏡、BioTek Instruments（Winooski，VT）からのPlate Reader装置およびPrince ton Instruments（Princeton，NJ）からのＣＣＤ（charge coupled device）カメラが包含される。放射性同位体が使用される場合は、検出はPhosphor Imager 装置(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)のような空間的に感度の高い検出装置を包含しうるし、またはガンマカウンターや液体シンチレーションカウンターのような検出装置中で個々の固体表面を別々に検出することを包含しうる。本明細書の初めに記したように、ここに示されるパドロックプローブが好ましく使用される一つの背景は、種々のタイプの流体室を連結する流体交換流路を通じて少量の流体を移動させるために特定的に設計されたミクロフルイディックス装置の状況下であることが意図される。特に、かかる装置は流体試薬または反応体の貯蔵用に設計された室、すなわち反応を受ける反応体を置くための供給室、流体の容量を測定するための反応室、すなわち測量室、などを説明する一般的用語である流体室を包含する。より特定すると、本発明の装置は、例えば反応室中で核酸を増幅させるために適当な手段が使用される反応室を包含する。この反応室はすべての流体室と同様に、例えばガラス、プラスチック、セラミック、またはそれらの組み合わせのような任意の適当な材料から構成され、そして物質を反応室から出したり入れたりするための少なくとも２個の流体交換流路に連結されている。反応室は約２℃以内の一定した温度のままであるのが好ましく、ここで温度は約20℃〜65℃であり、あるいはまたそこで起こるべき反応の要件に従って調節可能な温度を有することもできる。反応室はまた前記した検出方法が行われる場所であることもできる。好ましくは、本発明方法がミクロフルイディックス装置の状況下で使用される場合、記載した方法の固体表面は微粒子であり、より好ましくは常磁性微粒子である。好ましい態様を強調して本発明を記載してきたが、好ましい組成物および方法における変動を行うことができることおよび本発明がここに詳細に記載されたもの以外のやりかたで実施できることは当業者には明白であろう。従って、本発明は以下の請求の範囲により限定される本発明の精神および範囲内に包含されるすべての改変を包含するものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．第２ポリヌクレオチドを同定するための第１ポリヌクレオチドであって、その末端の各々に結合したリガンドを含んでなる第１ポリヌクレオチド。２．第２ポリヌクレオチドの５’及び３’末端の各々の少なくとも４つの末端ヌクレオチドの相補物を含む少なくとも１つのセグメントをさらに含む、請求項１記載の第１ポリヌクレオチド。３．第１ポリヌクレオチドに含まれる、第２ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドの相補物が互いに隣接して位置する、請求項１記載の第１ポリヌクレオチド。４．第１ポリヌクレオチドに結合するリガンドの各々が固体表面又は固体表面に結合する第２リガンドに結合する、請求項１記載のポリヌクレオチド。５．第２ポリヌクレオチドを検出するための方法であって、（Ａ）(i) その末端の各々に結合する第１リガンド；及び (ii)前記第２ポリヌクレオチドの５’及び３’末端の少なくとも４つの末端ヌクレオチドの相補物を含む少なくとも１つのセグメント、を含む第１ポリヌクレオチドを用意し；（Ｂ）前記第１ポリヌクレオチドを前記第２ポリヌクレオチドと接触させて配置し；並びに（Ｃ）第１−第２ポリヌクレオチド複合体を検出する、ことを含む前記方法。６．工程（Ａ）が、前記第１ポリヌクレオチドを固体表面又は前記第１ポリヌクレオチドの第１リガンドに結合する第２リガンドを含む固体表面と接触させ、それにより前記第１ポリヌクレオチドを固定化することをさらに含む、請求項５記載の方法。７．第２ポリヌクレオチドを検出するための方法であって、（Ａ）(i) その末端の各々に結合する第１リガンド；及び (ii)それぞれ、第１プローブ及び第２プローブの５’及び３’末端又は３’及び５’末端の各々の少なくとも４つの末端ヌクレオチドの相補物を含む少なくとも１つの第１セグメント、を含む第１ポリヌクレオチドを用意し；（Ｂ）その末端の一方に位置する第２セグメントを含み、かつ前記第２ポリヌクレオチドの相補物の少なくとも４つのヌクレオチドを有する第１プローブを用意し；（Ｃ）その末端の一方に位置する第３セグメントを含み、かつ前記第２ポリヌクレオチドの相補物の少なくとも４つのヌクレオチドを有する第２プローブを、前記第２及び第３セグメントが異なり、かつそれらが前記第２ポリヌクレオチドの隣接セグメントの相補物であるという条件の下で用意し；（Ｄ）前記第１ポリヌクレオチドを固体表面又は前記第１ポリヌクレオチドの第１リガンドに結合する第２リガンドを含む固体表面と接触させ、それにより前記第１ポリヌクレオチドを固定化し；（Ｅ）前記第１及び第２プローブを第２ポリヌクレオチドと、プローブ−第２ポリヌクレオチド複合体を形成する相補的核酸間のハイブリダイゼーションを促進する条件下において接触させ；（Ｆ）前記プローブ−第２ポリヌクレオチド複合体のハイブリダイズした第１及び第２プローブの末端を結合化剤と結合させ；（Ｇ）結合した第１及び第２プローブを前記第１ポリヌクレオチドと、プローブ−第１ポリヌクレオチド複合体を形成する相補的核酸間のハイブリダイゼーションを促進する条件下において接触させ；（Ｈ）前記プローブ−第１ポリヌクレオチド複合体のハイブリダイズした第１及び第２プローブの末端を結合化剤と結合させ；（Ｉ）前記プローブ−第１ポリヌクレオチド複合体を洗浄液で洗浄し、それにより非ハイブリダイズ結合第１及び第２プローブを除去し；並びに（Ｊ）前記プローブ−第１ポリヌクレオチド複合体を検出する、ことを含み、かつ前記第１又は第２プローブが標識又は第３リガンドを含み、前記第３リガンドが標識を含む第４リガンドによって認識される前記方法。８．工程(Ｅ)、(Ｆ)、(Ｇ)、及び（Ｈ）が組み合わされている請求項７記載の方法。９．工程（Ｈ）の後に変性工程が実施され、該工程の後に工程(Ｅ)、(Ｆ)、( Ｇ)、及び（Ｈ）が繰り返される、請求項７記載の方法。 10．前記固体表面が常磁性微粒子であるか、又は前記固体表面が柔軟かつ平坦であって、それにより１つの固体表面から円筒が形成されるか、又は多数のそのような固体表面が接合して円筒が形成される、請求項７記載の方法。 11．前記第２ポリヌクレオチドが核酸増幅反応の産物である請求項７記載の方法。 12．前記第１ポリヌクレオチドが複数の形態を有し、該形態の各々が異なる第１セグメントを含み、前記第１及び第２プローブもそれぞれ異なる第２及び第３セグメントを含む複数の形態を有する、請求項７記載の方法。 13．ポリヌクレオチドの増幅及び検出を組み合わせた方法であって、ポリヌクレオチドの核酸増幅及び請求項５記載の方法の実施を含み、前記増幅及び請求項５記載の方法が同じ反応チャンバー内で実施される前記方法。 14．ポリヌクレオチドの増幅及び検出を組み合わせた方法であって、ポリヌクレオチドの核酸増幅及び請求項７記載の方法の実施を含み、前記増幅及び請求項７記載の方法が同じ反応チャンバー内で実施される前記方法。