JP2000512313A - ワクチンまたは診断検定用ｐｒｒｓウイルスのペプチド配列同定ｐｒｒｓｖ抗原部位 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＰＲＲＳＶ分離株の抗原部位を提供する。抗原部位は中和的、保存的、非保存的、立体配座的であって、抗体誘発能を有し、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ４およびＯＲＦ７によりエンコードされたプロテインＧＰ₄およびＮに見出される。この部位により同定されるペプチド配列はＰＲＲＳに対し直接作用するワクチンおよびＰＲＲＳの診断試験法に取込ませることができる。また、識別試験法の開発が可能であって、ブタの群れからＰＲＲＳを撲滅するために企画されたプログラムにおいてマーカーワクチンに続いて使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチンまたは診断検定用ＰＲＲＳウイルスのペプチド配列同定ＰＲＲＳＶ抗原 部位 本発明はミステリーブタ病（Mystery Swine Disease）の原因主体、ＰＲＲＳ ウイルスに関し、また、ＰＲＲＳウイルス中に同定されるペプチド配列およびそ の配列をワクチンおよび診断試験法に取り入れることに関する。 ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）はブタの病気の原因主体であって、現在はブ タ生殖・呼吸症候群（ＰＲＲＳ）と呼称される。当該ウイルスはブタの病気の原 因主体であって、米国では略１９８７年以来、また、ヨーロッパでは１９９０年 以来認められたものであり、当初は種々の病名、例えば、ミステリーブタ病、ブ タ不妊・呼吸症候群、その他多くの名称で知られていた。ウイルスそれ自体も多 くの名称を与えられ、とりわけ、レリスタッドウイルス(ＬＶ)、ＳＩＲＳウイル ス、等々であったが、現在は殆どブタ生殖・呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ） と呼ばれている。このウイルスはブタの流産および呼吸困難を惹起こすが、１９ ９１年ヨーロッパで最初に単離され(ＥＰ特許５８７７８０、ＵＳ特許５，６２ ０，６９１)、次いで米国および世界中の多くの国々で単離された。ＰＲＲＳＶ は小型の包膜ウイルスであり、プラス鎖ＲＮＡゲノムを含んでいる。ＰＲＲＳＶ はマクロファージ中で優先的に増殖する。マクロファージに加え、ＰＲＲＳＶは 細胞系ＣＬ２６２１およびサルの腎臓細胞系ＭＡ−１０４からクローン化した他 の細胞系でも増殖することができる(Benfield et al.、J．Vet．Diagn．Invest ．４：１２７〜１３３、１９９２)。 ＰＲＲＳＶのゲノム、約１５ｋｂのポリアデニル化ＲＮＡは１９９３年に配列 決定された(Meulenberg et al.、Virology １９２；６２〜７４、１９９３)。ヌ クレオチドの配列、ゲノム体制および複製戦略が物語るのは、ＰＲＲＳＶはアー テリウイルス(Arteriviruses)と呼ばれる小型包膜プラス鎖ＲＮＡウイルスの一 群に関係するということである。このウイルス群は乳酸デヒドロゲナーゼ高揚ウ イルス(ＬＤＶ)、ウマ動脈炎ウイルス(ＥＡＶ)、およびサル出血熱ウイルス（Ｓ ＨＦＶ）を包含する。これらのウイルスは類似のゲノム体制、複製戦略、形態、 およびウイルスタンパクアミノ酸配列を有する。アーテリウイルスは１２．５〜 １５ｋｂのゲノムを含み、複製に際して６種のサブゲノムＲＮＡの３'ネストセ ットを合成する。これらのサブゲノムＲＮＡはリーダー配列を含むが、これはウ イルスゲノムの５'端から誘導される。ＯＲＦ１ａおよび１ｂはウイルスゲノム の約２／３を構成し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをエンコードする。６種 の小型ＯＲＦ、すなわちＯＲＦ２〜７はウイルスゲノムの３'端に位置している 。ＯＲＦ２〜６は同様に包膜タンパクをエンコードするが、ＯＲＦ７はヌクレオ カプシドタンパクをエンコードする(Meulenberg et al.、Virology ２０６：１ ５５〜１６３、１９９５)。 ＰＲＲＳＶは最初のアーテリウイルスであり、このものについてはＯＲＦ２〜 ７によりエンコードされる６種すべてのタンパクがウイルス粒子と関わりのある ことが証明されている。１５ｋＤａのＮタンパク（ＯＲＦ７がエンコード）およ び１８ｋＤａの内在性膜タンパクＭ（ＯＲＦ６）はＮ−グリコシル化されていな いが、２９〜３０ｋＤａのＧＰ₂タンパク(ＯＲＦ２)、４５〜５０ｋＤａのプロ テインＧＰ₃タンパク(ＯＲＦ３)、３１〜３５ｋＤａのＧＰ₄タンパク(ＯＲＦ４) 、および２５ｋＤａのプロテインＧＰ₅（ＯＲＦ５）はグリコシル化されている 。これらのタンパクは細胞外ウイルスおよびＰＲＲＳＶの北米分離株、ＡＴＣＣ −ＶＲ２３３２、ならびに他のＰＲＲＳＶ分離株を感染させた細胞の溶解液にも 検出されている(ＰＲＲＳＶの他の分離株は、例えば、ＣＮＣＭ Ｉ−１１４０、 ＥＣＡＣＣ Ｖ９３０７０１０８、ＣＮＣＭ Ｉ−１３８７、ＣＮＣＭ Ｉ−１３ ８８、ＡＴＣＣ−ＶＲ２４０２、ＡＴＣＣ−ＶＲ２４２９、ＡＴＣＣ−ＶＲ２４ ３０、ＡＴＣＣ−ＶＲ２４３１、ＡＴＣＣ−ＶＲ２４７５、ＡＴＣＣ−ＶＲ２３ ８５であるが、他の多くのものは既知である)。 我々は以前に、ＧＰ₃、ＧＰ₄、ＭおよびＮに特異的な一群のＰＲＲＳＶ−特異 ＭＡｂの単離と特性化につき記載した(van Nieuwstadt et al.、J．Virol．７０ 、４７６７〜４７７２、１９９６)。興味深いことに、ＧＰ₄に対するＭＡｂは 中和性であり、タンパクの少なくとも一部がウイルス粒子表面に露出しているこ とを示唆していた。さらに、Ｎに対するＭａｂの殆どが試験したすべてのＰＲＲ ＳＶ分離株と反応した。 ＰＲＲＳそれ自体、世界の殆どの地域でのブタ産業にとって重要な関心事とな る問題である。ブタの群れにＰＲＲＳＶを持ち込むことは深刻な経済的損失をも たらすだろう。ＰＲＲＳに対する診断試験の実施は多くの畜産業者および研究室 で広く習慣化されている。殆どの診断試験、例えば、ＩＰＭＡ、ＩＦＴ、ＩＦＡ 、ＥＬＩＳＡなどでは、それぞれ適切な検出手段、例えば、接合酵素または蛍光 色素、および他の基質、ＰＲＲＳＶから誘導される抗原とＰＲＲＳＶに対する抗 体間の相互作用の使用から構成され、それによって試験すべき動物（ブタなど） から採取する生物サンプル、例えば、血液、血清、組織、組織液、洗浄液、尿、 糞便など中のＰＲＲＳＶ抗原あるいはＰＲＲＳＶに対する抗体の存在を測定する 。ＰＲＲＳを診断するためのこれらの診断試験、あるいは診断キットまたはアッ セイに使用する抗原および/または抗体は、ＰＲＲＳＶの起源により、あるいは ＰＲＲＳＶとの反応性により規定される。原則として、高い特異性と感度を明確 に必要としない場合には、スクリーニング検定にはこれで十分である。しかし、 ＰＲＲＳはさらに拡散し続け、ブタ産業内で重大な関心事となり、すべての群れ から、あるいはさらにブタを飼育するすべての地域、領域、または国からＰＲＲ Ｓを絶滅させる必要があると思われている。この要請の明瞭な一例はデンマーク でのＰＲＲＳに関する撲滅プログラムの提案である。もしＰＲＲＳを根絶させる と決定するならば、今日使用されている試験法よりもより高い特異性と感度を示 す診断試験法が必要となる。 ＰＲＲＳに対する予防接種も広く実施されている。幾つか例示すると既知のも のとして改良型の生ワクチンが使用されているが、不活化ワクチンも知られてい る。しかし、生ワクチンの一般的な問題は、ＰＲＲＳ生ワクチンでも同様であり 、その問題はこれらのワクチンが未予防接種のブタに拡散する傾向があり、その ためにブタの群れでの検出可能な感染を減少させる代りに拡大させることとなり 、根絶への生産性を帳消しにしてしまう。血清学的に野生型ウイルスと識別し得 る ラインマーカーワクチンを使用するならば、この問題は大幅に縮小されるだろう 。不利益が加わるとすれば、生ワクチンは未同定の抗原性成分のために、時とし て予防接種したブタにアナフィラキシー反応を惹起こすことである。不活化ワク チンは一般に予防接種したブタに保護作用を誘導すると報告されており、さらに 利点としてブタからブタへと拡散することもないが、不活化ワクチンの欠点は、 測定可能で予防効果のある免疫応答を引き出すためには、ワクチンの一回投与量 で十分な抗原量を生じさせるのが難しいことである。とりわけ、ブタで測定可能 で中和性のある抗体力価を誘発する不活化ワクチンは、予防接種ブタ集団におい てこれらの中和性抗体を測定することが役立つゆえに、ブタの群れの予防接種に より得られる予防効果の水準について理解を得るために有益である。さらに、た とえ必要な抗原量を集めることに成功するとしても、このことはまたさらに他の 未確定抗原量がワクチン内に存在することを意味し、それが上記のごときアナフ ィラキシー反応を引起こす可能性もある。この意味で、ＰＲＲＳＶ上のどの特異 部位が中和作用に関与しているかを知ることは有意義であり、より適切なワクチ ンの設計に役立ち、中和性抗体を誘導するために必要とする重要なペプチド配列 を取り込ませることができる。現在使用されているワクチンは米国で単離された ＰＲＲＳＶ分離株から由来するものであるが、その利点はかかるワクチンがＰＲ ＲＳＶのヨーロッパ分離株に対し完全に予防的であり、免疫学的に交差反応性を 有するにもかかわらず、未確定ではあるが、ヨーロッパＰＲＲＳＶ分離株と識別 し得るエピトープまたは抗原性部位を含んでいることである。逆に、ヨーロッパ で単離されたＰＲＲＳＶ分離株由来の生ワクチンは、ＰＲＲＳＶの米国分離株に 対し完全に予防的であり、免疫学的に交差反応性を有するにもかかわらず、未確 定ではあるが、米国ＰＲＲＳＶ分離株と識別し得る類似のエピトープまたは抗原 性部位を含んでいる。 血清学的試験法が利用可能であって、その方法が米国誘導ワクチンを接種した かあるいはヨーロッパ野生型ＰＲＲＳＶを感染させた（予防接種した、しないに かかわらず）ブタ同士を識別し得る（ＰＲＲＳＶ分離株間の小さなエピトープ差 にもとづく）か、あるいはヨーロッパ誘導ワクチンを接種したかあるいは米国野 生型ＰＲＲＳＶを感染させた（予防接種した、しないにかかわらず）ブタを識別 し得るものであるならば、マーカーワクチンおよび対応する診断試験法（当該識 別可能なエピトープまたは抗原性部位を取込んでいる）が開発可能であるが、そ れらはＰＲＲＳに対する撲滅プログラムにおいて十二分に信頼して使用すること ができる。例えば、デンマークでは米国誘導ワクチンで予防接種することが可能 であり、ヨーロッパ野生型ＰＲＲＳＶ上のユニークエピトープに対してのみ向け られ、米国株とは交差反応しないデンマークブタでの一群の抗体を測定すること ができる。これにより明確な検出が可能であり、続いて野生型感染ブタをデンマ ーク群から除去することが可能である。現在、かかる識別はＰＲＲＳＶ分離株間 の全体に広範な免疫交差反応性のために可能ではない。言うまでもないことであ るが、かかる組み合わせ予防接種試験プログラムはＰＲＲＳ撲滅のための基本で あり、他の国においても使用し得るが、要すればワクチンおよび/または診断試 験に使用される別のＰＲＲＳＶ抗原性部位とともに使用することができる。 本発明はＰＲＲＳＶのペプチド配列を含んでなる抗原性部位を提供するが、こ の部位は不活化または弱毒化ワクチンまたは組換えＤＮＡ技術を経て誘導したワ クチンなど、ワクチンの改良を可能とし、また、この部位は診断方法、試験法お よびキットの改良を可能とし、さらに新しい診断方法、試験法およびキットの生 産を可能とする。抗原性を維持する（例えば、ポリクローナル血清またはＭＡｂ との反応性により確定される）人工的改変またはアミノ酸残基の置換、およびそ の結果としての抗原性部位の機能性は、ペプチドの設計と合成に習熟した当業者 により、特異的分離株の抗原部位を構成する既知配列から容易に誘導し得る。例 えば、ある種アミノ酸残基は対応し得る性質の他のアミノ酸と常套的に置き換え 得る。例えば、塩基性残基は他の塩基性残基と、酸は酸と、嵩高い残基は嵩高い 残基と、疎水性またな親水性の残基は他の疎水性またな親水性の残基となどであ る。また、他の、あまり常套的ではないが、より特異的な変化も可能であり、そ れによって選択した配列の抗原性を維持し、あるいは改善さえする。かかる変更 は、例えば、ペプスキャン（ＰＥＰＳＣＡＮ）ベースのアミノ酸置換または置換 地図作製技術により実施し得る(van Amerongen et al.，Peptide Research（１ ９９２）５、２６９〜２７４)。要約すると、本発明により提供される抗原部位 内のアミノ酸残基は、例えば、常套手段により、または置換地図作製の手引きの もとで置換し得るが、それによって得られるペプチド配列は機能的に抗原性部位 と等価である。置換するアミノ酸はＬ−またはＤ−アミノ酸残基のいずれであっ てもよい。さらに、本発明により提供されるペプチド配列は、技術上既知のアジ ュバント（ＫＬＨなど）に接合することにより、より抗原性となし得る。さらに 、該ペプチドは１以上の（縦列ペプチドなど）繰返し配列でペプチドを調製する ことにより、あるいは重合または環化により、より抗原性となし得る。 Ｎタンパクが免疫原性であること(Meulenberg（１９９５）、J.Clin.Diagn.La b.Immunol．2、６５２〜６５６、ＧＢ２ ２８９ ２７９Ａ)、また、ヨーロッパ 株（ＬＶ）および米国株（ＶＲ２３３２）のＮタンパク間には保存領域と非保存 領域の存在すること(ＷＯ９６／０４０１０)はすでに示されているが、我々はこ こに初めてどの保存領域および非保存領域が抗原性であるか、また、どれが免疫 化または診断アッセイ法のための抗原として個々にまたは組み合わせで使用する ことができるかを証明する。さらに、Ｎタンパクの抗原性領域は直線および立体 配座依存性エピトープの両方から成り立っていることをここに証明する。 ＧＰ₄タンパクはＰＲＲＳＶの最初の構造タンパクであり、当該ウイルスを中 和することのできる抗体を誘発することが示されている。約４０アミノ酸の特異 領域が同定され、それが中和性抗体の標的としてウイルス粒子表面に露出されて おり、該抗体はウイルスが細胞に感染するのを妨げるということが明らかとなっ た。これは非常に驚くべき新知見である。その理由は、ＰＲＲＳＶの主要構造タ ンパクであるＧＰ５タンパクが宿主細胞の付着に関与するもっとも重要な候補だ からである。 本発明は主要な抗原性部位、ＰＲＲＳＶのＧＰ₄上の中和部位を提供する。本 発明は、その配列がＰＲＲＳＶのＯＲＦ４タンパク上に中和部位を含んでいるＰ ＲＲＳＶ分離株のアミノ酸コア配列とコア配列に隣接するアミノ酸配列とを含ん でなる有効なマーカーワクチンの設計にとって重要な主要中和部位の位置を提供 する。様々なタイプのワクチンに関連する中和部位配列を組込むことにより、予 防接種したブタに中和性抗体を特異的に誘発することが可能である。本発明によ り提供される中和部位を含んでなる不活化ワクチンは測定可能な中和性抗体を誘 発するために作製される。とりわけ、ＰＲＲＳＶ分離株Ｉ−１１０２に見出され るアミノ酸が約４０〜７９位の配列に相当するＰＲＲＳＶのＯＲＦ４エンコード タンパクの位置にある配列は中和部位を含んでなる。さらに、選択されたペプチ ド配列は技術上既知のアジュバントまたは他の担体と混合することによりさらに より免疫原性とする。このようにして得たペプチド組成物はワクチンとして使用 される。しかしまた、中和部位を含んでなる選択されたペプチド配列は、非相同 ウイルスまたはバクテリアから誘導される別個の組換えベクターであるワクチン ベクターシステムに組込まれるが、該選択されたペプチド配列はまた、それから 誘導されるＰＲＲＳＶベクターウイルスまたはワクチンに選択的に組込まれる。 本発明のさらなる側面において、約５２〜７５位に相当する位置にあるアミノ 酸配列は広範囲に反応性を有する中和部位をより特異的に構成する。本発明によ り提供される中和部位の他の態様は、既知のまたは見出されるべき（例えば、本 明細書の実験の部参照）種々のＰＲＲＳＶ分離株の中に見出すことができる。分 子生物学の分野の研究者にとって、本発明により提供される中和部位含有配列を さらに他のＰＲＲＳＶ分離株のＯＲＦ４エンコードタンパクのアミノ酸配列と比 較することは容易である。 また、本発明は抗原または抗体の検出試験である診断試験法を改良するＰＲＲ ＳＶのペプチド配列を提供する。本発明は様々なグループの抗原性部位を提供す るが、診断試験法においてはそれらを単独または組合わせて使用する。このよう に、本発明は診断および鑑別診断に関する分野に存在する様々な要請に応える診 断試験法を提供する。抗原−抗体の相互作用はアミノ酸配列の長さが５〜１５で あるアミノ酸配列の交差反応性エピトープ−パラトープ相互作用を常に必然的に 伴う。本発明は、アミノ酸配列の長さが５〜１５のアミノ酸配列であって、その 一部または全部が本発明抗原性部位のコア配列と重なり合っている配列を診断試 験に組込むために提供する。これらのペプチド配列は、試験に使用する配列を含 む抗原または抗原性物質を選択または設計するために使用する。またさらに、本 発明が提供するのは、本発明が提供した抗原性部位と反応する合成抗体である。 これらの部位または関連する配列は、ファージディスプレーライブラリーなどの システムから得られる合成抗体、または異種発現システムで容易に発現させるこ とのできる抗体様分子を構成する（重鎖）抗体のクローン選択から得られる合成 抗体と反応する。 本発明が提供する１群は、上記ですでに説明したように、当該中和部位に対応 するペプチド配列を含んでなる。この部位および/またはこの部位に対し特異的 な抗体を含んでなる診断試験法はブタの中和性抗体を検出する。本発明が提供す る他の群は、プロテインＮ上の保存抗原性部位を含んでなる。保存抗原性部位内 に、本発明はコア配列ＶＮＱＬＣＱＬＬＧＡまたはＶＮＱＬＣＱＭＬＧＫを与え る。この部位および/またはこの部位に対し特異的な抗体を含んでなる診断試験 法は、殆どのＰＲＲＳＶ分離株と特異的に反応するブタのこれら抗体を検出する 。また、診断試験法は、ＰＲＲＳＶ抗原を検出するために、保存部位に対する抗 体を使用するものとして提供されるが、それによってＰＲＲＳＶ分離株を、その 由来に関係なく、該試験法により検出することを可能とする。本発明が提供する 他の群は、プロテインＮ上の非保存分化性抗原性部位を含んでなる。この部位お よび/またはこの部位に対し特異的な抗体を含んでなる診断試験法は、別個のＰ ＲＲＳＶ分離株と特異的に反応するブタのこれら抗体を検出し、それによって、 例えば、予防接種したブタを野生型ＰＲＲＳＶに感染したブタから識別する。ま た、診断試験法は、ＰＲＲＳＶ抗原を検出するために、非保存部位に対する抗体 を使用するものとして提供されるが、それによって異なるＰＲＲＳＶ分離株を該 試験法により識別することを可能とする。かかる非保存抗原性部位の１つに、本 発明はコア配列ＰＲＧＧＱＡＫＫＫＫまたはＰＲＧＧＱＡＫＲＫＫまたはＰＲＧ ＧＱＡＫＫＲＫまたはＧＰＧＫＫＮＫＫＫＮまたはＧＰＧＫＫＮＫＫＫＴまたは ＧＰＧＫＫＮＲＫＫＮまたはＧＰＧＫＫＦＫＫＫＮまたはＧＰＧＫＫＩＫＫＫＮ またはＧＰＧＱＩＮＫＫＩＮを与える。他の非保存部位には、本発明はコア配列 ＭＡＧＫＮＱＳＱＫＫまたはＭＰＮＮＮＧＫＱＴＥまたは ＭＰＮＮＮＧＫＱＰＫまたはＭＰＮＮＮＧＫＱＱＫまたはＭＰＮＮＮＧＫＱＱＮ またはＭＰＮＮＮＧＫＱＱＫまたはＭＰＮＮＮＧＲＱＱＫを与える。また、ＧＰ ４またはＮタンパクの上記コア配列の抗原性およびそれによる機能性を維持する 人工的変更は、上記のように、ペプチドの設計と合成に習熟した当業者により、 容易に導入することができる。 また、本発明は立体配座エピトープ（これは種々の分離株間で大きく変化する ）からなる１群をも提供するが、これは分離株Ｉ−１１０２のプロテインＮ上の アミノ酸５１〜約６８位置(分離株Ｉ−１１０２のコア配列ＰＫＰＨＦＰＬＡＡ ＥＤＤＩＲＨＨＬ)または７９〜約９０位置（分離株Ｉ−１１０２のコア配列Ｓ ＩＱＴＡＦＮＱＧＡＧＴ）または１１１〜１２４位置(分離株Ｉ−１１０２のコ ア配列ＨＴＶＲＬＩＲＶＴＳＴＳＡＳ)に見出されるものに対応する位置に見出 すことができる。Ｎタンパクの保存および非保存、分化性および立体配座性部位 は、本発明が提供するものであるが、これらはＰＲＲＳＶ感染を明確に診断する 診断試験法を提供する。本試験法は非保存部位の使用を避け、それによって偽陰 性の結果を避けるように実施する。さらに、種々の非保存部位は、例えば、野生 型のＰＲＲＳＶ分離株に感染したブタから予防接種したブタを識別することので きる分別試験法の開発に使用される。再度付言するならば、分子生物学に携わる 当業者にとって、当該保存または非保存または立体配座性エピトープ部位からな る配列をさらに他のＰＲＲＳＶ分離株のＯＲＦ７エンコードタンパクアミノ酸配 列と並び換えることは容易である。本発明が提供する部位はＰＲＲＳ撲滅プログ ラムに使用するワクチン−識別診断試験法の新しい組合わせに使用される。 実験の部 材料と方法 細胞およびウイルス ＰＲＲＳＶのター・ハーン（Ter Huurne）株（ＣＮＣＭ Ｉ−１１０２）は１ ９９１年に単離された(Wensvoort et al.、１９９１)。米国ＡＴＣＣ−ＶＲ２３ ３２株はベンフィールド（Benfield）らが単離した(１９９２)。ＮＬ１株（オラ ンダ、１９９１）は我々の研究室で単離した。ＮＹ２株（英国、１９９１）はド リ ュウ（T．Drew）氏より恵与頂いた。ＤＥＮ株（デンマーク、１９９２）はボト ナー（A．Botner）氏より恵与頂いた。ＬＵＸ株（ルクセンブルク、１９９２） はロッシュ（Losch）氏より恵与頂いた。ＳＰＡ１およびＳＰＡ２（スペイン、 １９９２）はショコウヒ氏およびエスプナ氏（Shokouhi and Espuna）よりそれ ぞれ恵与頂いた。また、ＦＲＡ株（フランス、１９９２）はレフォーバン（Y．L eforban）氏より恵与頂いた。 ＰＲＲＳＶおよびＶＲ２３３２は既述のようにＣＬ２６２１細胞上増殖した(v an Nieuwstadt et al.、１９９６)。７種の異なるヨーロッパ分離株はブタ肺胞 マクロファージ中で増殖した。マクロファージは既述のように維持した(Wensvoo rt et al.、１９９１)。ＢＨＫ−２１細胞は５％ウシ胎児血清および抗性物質添 加ダルベッコ最少必須培地中で維持した。トランスフェクション実験のために、 ＢＨＫ−２１細胞をグラスゴウ最少必須培地（ギブコ−ＢＲＬ/ライフ・テクノ ロジー(株))中で増殖させた。 抗血清 ブタ抗−ＰＲＲＳＶ血清２１およびウサギ抗−ペプチド血清６９８および７０ ０を先の実験に用いた。血清７００はＰＲＲＳＶのＯＲＦ４がエンコードするア ミノ酸１０６〜１２２位（ＣＬＦＹＡＳＥＭＳＥＫＧＦＫＶＩＦ）に向けられた もので、ウサギから取得した。ＭＡｂの産生と特性化はすでに記載がある(van N ieuwstadt et al.、１９９６)。ハイブリドーマは５の連続的融合実験から誘導 し、ＯＲＦ４タンパクに対するもの（ＭＡｂ１２１．４、１２２．１、１２２． １２、１２２．２０、１２２．２９、１２２．３０、１２２．５９、１２２．６ ６、１２２．６８、１２２．７０、１２２．７１、１２６．１、１２６．７、１ ３０．７、１３８．２８、またはＯＲＦ７タンパク（ＭＡｂ１２２．１７、１２ ５．１、１２６．９、１２６．１５、１３０．２、１３０．４、１３１．７、１ ３８．２２、ＷＢＥ１、ＷＢＥ４、ＷＢＥ５、ＷＢＥ６、ＳＤＯＷＩ７）に対す るものであった。Ｍａｂ ＷＢＥはドリュウ博士（Dr．Drew）(ウエイブリッジ、 英国)の御好意により入手し得た。Ｍａｂ ＳＤＯＷ１７はベンフィールド博士( Dr．Benfield)（サウスダコタ、米国）の御好意により入手し得た。 プラスミドの構築 初期には、ＯＲＦ４の上流（ＰＲＲＳＶ１３）および下流（ＰＲＲＳＶ１４） に位置する２つのオリゴヌクレオチドを用い、プライマーに導入したＢａｍＨＩ とＨｉｎｄIIIを使用してｐＧＥＭ−４Ｚ中分離株Ｉ−１１０２のＯＲＦ４を増 幅し、クローン化していた(Meulenberg et al.１９９5)。得られたプラスミドは ｐＡＢＶ２０９と命名した。ＶＲ２３３２のＯＲＦ４における開始コドン（ＰＲ ＲＳＶ４）および終止コドン（ＰＲＲＳＶ５）に関し同様の位置にある２つのオ リゴヌクレオチドを使用し、以前の研究にて記載したようにＲＴ−ＰＣＲにより ＶＲ２３３２のＯＲＦ４を増幅した。ＶＲ２３３２のＯＲＦ４はその内部にＨｉ ｎｄIII部位を含んでいるので、ＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、部 分的にはＨｉｎｄIIIで消化して、ｐＧＥＭ−４Ｚにクローン化し、プラスミド ｐＡＢＶ２７０とした。組換えＤＮＡ技法は実質的にサムブルーク（Sambrook） らの記載どおりに実施した(分子クローニング、実験室マニュアル、コールド・ スプリング・ハーバー・ラボ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク 、１９８９)。ｐＡＢＶ２７０のＶＲ２３３２ＯＲＦ４のヌクレオチド配列は自 動ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステム）により決定したが、公 開されている配列に一致した(Murtaugh et al.，Arch．Virol．１４０；１４５ １〜１４６０、１９９５)。続いて、Ｉ−１１０２およびＶＲ２３３２のＯＲＦ ４をヤムリキ森林熱ウイルス発現ベクターｐＳＦＶ１に移入した。ｐＡＢＶ２０ ９およびｐＡＢＶ２７０をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII(ｐＡＢＶ２７０につい ては部分的に)で消化し、ＯＲＦ４フラグメントはクレノウ・ポリメラーゼ（フ ァルマシア）で処理して平滑末端を作り、これらをｐＳＦＶ１のＳｍａｌ部位に 結合させ、仔ウシ腸内アルカリホスファターゼ（ファルマシア）により脱リン酸 化した。適正な方向にＩ−１１０２（ｐＡＢＶ２６５）およびＶＲ２３３２（ｐ ＡＢＶ２７１）のＯＲＦ４を含むプラスミドにつきさらにＧＰ₄タンパクの発現 を試験した。さらに、Ｉ−１１０２およびＶＲ２３３２の４種の異なるキメラＯ ＲＦ４遺伝子を作製した。ＶＲ２３３２ ＧＰ₄タンパクのアミノ酸１〜３９位を エンコードするＯＲＦ４のヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドＰＲＲＳＶ ４と ＰＲＲＳＶ６によりプラスミドｐＡＢＶ２７０から増幅した。得られたフラグメ ントをＢａｍＨＩおよびＳａｃIIで消化した。このフラグメントをＢａｍＨＩお よびＳａｃIIで消化したｐＡＢＶ２０９に連結し、ｐＡＢＶ３０６内のＶＲ２３ ３２ＧＰ₄タンパクのアミノ酸１〜３９とＩ−１１０２ＧＰ₄タンパクのアミノ酸 ４０〜１８３位との間にインフレーム融合を創製した。ＶＲ２３３２ ＧＰ₄のア ミノ酸１〜７５位をエンコードするＯＲＦ４のヌクレオチド配列をオリゴヌクレ オチドＰＲＲＳＶ４およびＰＲＲＳＶ９により増幅した(表２参照)。このフラグ メントをＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩにて消化した。Ｉ−１１０２ ＧＰ₄タンパク のアミノ酸８０〜１８３位をエンコードするＯＲＦ４のヌクレオチド配列をＰＲ ＲＳＶ４６およびＰＲＲＳＶ１４により増幅し、増幅したフラグメントをＫｐｎ ＩおよびＢａｍＨＩにて消化した。両フラグメントをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII にて消化したｐＧＥＭ−４Ｚに一緒に連結し、プラスミドｐＡＢＶ３０８とした 。同様に、相補性構築物をｐＡＢＶ３１４に創製したが、このものはＶＲ２３３ ２のアミノ酸７６〜１７８位をエンコードするフラグメントに連結したＰＲＲＳ Ｖ１３とＰＲＲＳＶ５７で増幅したＩ−１１０２ ＧＰ₄タンパクのアミノ酸１〜 ７９位をエンコードするヌクレオチド配列から構成され、ｐＧＥＭ−４Ｚ中ＰＲ ＲＳＶ１０およびＰＲＲＳＶ５により増幅した。第四のキメラ構築物はＶＲ２３ ３２ ＧＰ₄タンパクのアミノ酸１〜３９位とアミノ酸７６〜１７８位をエンコー ドするフラグメントに融合したＰＲＲＳＶ ＧＰ₄タンパクのアミノ酸４０〜７９ 位をエンコードするフラグメントから構成されていた。これはｐＡＢＶ２７０の ＢａｍＨＩ/ＳａｃII ＯＲＦ４フラグメントとｐＡＢＶ３１４のＳａｃII/Ｈｉ ｎｄIII ＯＲＦ４フラグメントをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで消化したｐＧＥＭ −４Ｚに連結することにより達成した。このプラスミドは消化されたｐＡＢＶ３ ２５であった。プラスミドｐＡＢＶ３０６、ｐＡＢＶ３０８、ｐＡＢＶ３１４、 およびｐＡＢＶ３２５が適正な配列であるかどうかにつきオリゴヌクレオチド配 列決定法によりチェックした。キメラＯＲＦ４遺伝子を、ＶＲ２３３２とＰＲＲ ＳＶのＯＲＦ４遺伝子について上記したのと同様に、ｐＡＢＶ３０６、ｐＡＢＶ ３０８、ｐＡＢＶ３１４、およびｐＡＢＶ３２５からＰＳＦＶＩに移入し、 それぞれｐＡＢＶ２９６、ｐＡＢＶ３０５、ｐＡＢＶ３２１、およびｐＡＢＶ３ ２６とした(図３)。 ＯＲＦ７の上流（ＬＶ１０８；５'ＧＧＡＧＴＧＧＴＴＡＡＣＣＴＣＧＴＣＡ ＡＧＴＡＴＧＧＣＣＧＧＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣ３'）および下流（ＬＶ １１２；５'CＣＡＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＴＧＣＡＣ ＣＣＴＧＡ３'）に位置する２つのオリゴヌクレオチドを用い、ＯＲＦ７遺伝子 を増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔにクローン化し、ｐＡＢＶ４３１とした。ＯＲＦ７のフ ラグメントを増幅するのに使用したこれらと他のオリゴヌクレオチドの配列およ び位置を表１に掲げる。さらに、４つの異なるキメラ構築物をＰＣＲ指向変異誘 発により作製した。アミノ酸２５〜２６位、２８〜３０位（部位Ｂ；図３）をコ ードする配列をＥＡＶ Ｎタンパクの対応する配列と置換えた。これはＬＶ１０ ８とＬＶ１３４(５'ＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＡＡＴＧＡＣＣ ＴＧＴＧＣＣＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＡＡＧＴＣＣ３')でＯ ＲＦ７をＰＣＲ増幅することにより達成した。変異したＤＮＡフラグメントはＭ ｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を用いｐＡＢＶ４３１に導入し、ｐＡＢＶ４５５とし た。ＯＲＦ７のアミノ酸５１〜６７位をエンコードする領域はＬＤＶ ＯＲＦ７ の対応する領域に置き換えた。ｐＡＢＶ４３１をＥｃｏＮＩおよびＣｌａＩにて 消化し、プライマーＬＶ９８(５'ＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＡＧＧＧＧＡＧＧＡＣＡ ＧＧＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＣＣ ＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＡＣ３'）およびＬＶ９９（５'ＣＧＴＣＴ ＧＧＡＴＣＧＡＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＣＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＧ ＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣ３')で生 成させたＰＣＲフラグメントに連結し、同じ酵素で消化した。これをプラスミド ｐＡＢＶ４６３と命名した。アミノ酸８０〜９０をエンコードするＯＲＦ７領域 はＬＤＶ ＯＲＦ７遺伝子の対応する領域に置き換えた。ＬＶのＯＲＦ７遺伝子 はプライマーＬＶ１０１(５'ＧＣＴＴＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＴＧＡＣＧＣＴＴ ＴＴＣＡＡＴＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＣＣ Ａ３'）およびＬＶ１１２によるＰＣＲにて変異した。得られたフラグメントを ＮａｒＩおよび ＰａｃＩにて消化し、ＣｌａＩおよびＰａｃＩで消化したｐＡＢＶ４３１に連結 した。これによりｐＡＢＶ４５３を得た。最後に、ＮタンパクのＣ末端部分（ア ミノ酸１１１〜１２８位）をエンコードする領域を、ＬＤＶのＮタンパクの対応 するアミノ酸をエンコードする配列に置き換えた。ＯＲＦ７遺伝子をプライマー ＬＶ１０８およびＬＶ１０２（５'ＡＴＧＴＣＣＣＧＧＧＣＴＡＡＧＣＧＧＣＧ ＧＡＧＧＡＡＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＴＴＡＡＴＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＡ ＧＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＣＡＧ３'）により増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにク ローン化し、ｐＡＢＶ４５６とした。野生型ＯＲＦ７および突然変異ＯＲＦ７遺 伝子をＰａｃＩ（平滑末端）およびＨｐａＩでの消化によりｐＡＢＶ４３１、ｐ ＡＢＶ４５３、ｐＡＢＶ４５５、およびｐＡＢＶ４６３から、また、ＨｐａＩお よびＳｗａＩでの消化によりｐＡＢＶ４５６から切り出した。これらの遺伝子は 次いでセムリキ森林熱ウイルス発現ベクターｐＳＦＶ１の脱リン酸化ＳｍａＩ部 位に挿入した。適正な方向にそれぞれのＯＲＦ７遺伝子を含むプラスミドｐＡＢ Ｖ４７０、ｐＡＢＶ４６０、ｐＡＢＶ４６２、ｐＡＢＶ５１８およびｐＡＢＶ４ ７１については、さらにＮタンパクの発現について試験した。セムリキ森林熱ウ イルスＯＲＦ７ＲＮＡのin vitro転写およびトランスフェクションはＳＦＶ−Ｏ ＲＦ４構築物について上記したのと同じであった。 ７種の異なるヨーロッパ分離株のＯＲＦ４遺伝子をクローン化するために、マ クロファージにＮＬ１、ＮＹ２、ＤＥＮ、ＦＲＡ、ＳＰＡ１、ＳＰＡ２、および ＬＵＸを感染させ、ミューレンバーグ（Meulenberg）ら（１９９３）記載のとお りにＲＮＡを単離した。ＯＲＦ４遺伝子をオリゴヌクレオチドＰＲＲＳＶ１３お よびＰＲＲＳＶ１４でのＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ｐＧＥＭ−４Ｚ中ＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄIIIでクローン化した。それぞれの株について、２つの独立し たＰＣＲから誘導された２種クローンのＯＲＦ４ヌクレオチド配列を決定した。 このヌクレオチド配列から誘導されたタンパク配列は、複数配列アラインメント プログラムＰＣジーンＣＬＵＳＴＡＬ（インテリジェネティックス商標）を用い 直線化した。 ＳＦＶ−ＯＲＦ４ ＲＮＡのin vitro転写およびトランスフェクション 異なるＯＲＦ４構築物を含むｐＳＦＶ１プラスミドをＳｐｅｌでの消化により 直線化し、in vitro転写した。合成したＲＮＡを２４穴プレートの１５ｍｍウエ ル中にてリポフェクチンを用いＢＨＫ−２１細胞に移入した。細胞を氷冷した５ ０％(v/v)メタノール/アセトンで固定し、異なるＯＲＦ４構築物が発現したＧＰ ４タンパクを免疫ペルオキシダーゼ単層アッセイ法（ＩＰＭＡ）によりＭＡｂで 染色した。ＯＲＦ４発現産物を免疫沈降法により分析するために、ＢＨ Ｋ−２ １細胞１０⁷個にエレクトロポレーションにより１０μｇのin vitro転写ＳＦＶ- ｏＲＦ４ ＲＮＡを移入した。エレクトロポレーションした細胞を６穴プレート の３５ｍｍウエル３ヶ所に配分し、トランスフェクションの１８時間後に細胞を 標識した。 ペプスキャン法 重複ノナペプチドまたはドデカペプチドの完全セットを、先に決定したＰＲＲ ＳＶのＯＲＦ４またはＯＲＦ７配列から導かれるアミノ酸から合成した(Meulenb erg et al.、１９９３)。ポリエチレンロッド上固相ペプチドの合成および酵素 結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）型の分析による免疫スクリーニングを 確立したペプスキャン（ＰＥＰＳＣＡＮ）手法（Geysen et al.、ＰＮＡＳ、８ １、３９９８〜４００２、１９８４）に従い実施した。 結果 我々はすでに、ウエスタン免疫ブロット分析により、ＧＰ₄と命名したＰＲＲ ＳＶの３１〜３５ｋＤａタンパクと反応する一群の中和性ＭＡｂ、およびＮタン パクと反応する一群のＭａｂを記載した。ＧＰ₄はＯＲＦ４がエンコードする構 造糖タンパクであることが示され、ＮはＯＲＦ７がエンコードするヌクレオキャ プシドタンパクであることが示された。ＧＰ₄特異Ｍａｂによる免疫沈降実験に おいて、ＰＲＲＳＶを感染させた細胞の溶解液から誘導したＧＰ₄タンパクは、 ２８ｋＤａの分離したバンドとして、幾分見掛け上分子量の大きな僅かなスメア とともに移動した。ＭＡｂはＰＲＲＳＶ感染細胞の細胞外培地から約３１ｋＤａ の拡散（グリコシル化）ＧＰ₄タンパクを免疫沈降させたが、模擬感染細胞の細 胞外培地からは沈降させなかった。 ＧＰ₄中和性ドメインの同定 我々は先にＧＰ₄タンパクに特異的なＭＡｂがＩ−１１０２を認識し、米国分 離株ＶＲ２３３２は認識しないことを証明した(van Nieuwstadt et al.、１９９ ６)。ＧＰ₄タンパクにおける中和性ＭＡｂの結合ドメインを同定するために、我 々はＩ−１１０２およびＶＲ２３３２のＧＰ₄タンパクの融合タンパクを作製 ムリキ森林熱ウイルス発現系で発現した(Biotechnol、９、１３５６〜１３６２ 、１９９１)。先ず、Ｉ-１１０２のＯＲＦ４をｐＳＦＶ１にクローン化し、プラ スミドｐＡＢＶ２６５とした(図１)。ｐＡＢＶ２６５から転写したＲＮＡをＢＨ Ｋ−２１細胞に移入し、トランスフェクションの２４時問後に、細胞を１５種の 中和性ＭＡｂ群により陽性染色した。ＭＡｂはｐＳＦＶ１−ＲＮＡでトランスフ ェクションしたＢＨＫ−２１細胞とは反応しなかった。組換えＧＰ₄タンパクは ＭＡｂ１２６．１によりｐＡＢＶ２６５ ＲＮＡでトランスフェクションしたＬ −[³⁵Ｓ]−メチオニン標識ＢＨＫ−２１細胞から免疫沈降させた。このものはＩ −１１０２を感染させたＣＬ２６２１細胞内で合成した標準ＧＰタンパクと同様 のサイズを有しており、ＰＮＧaseＦとＥｎｄｏＨに感受性を示すＮ−グリカン をも含んでいた。ＶＲ２３３２のＧＰ₄タンパクをｐＳＦＶ１中でクローン化し たが、このタンパクはＢＨＫ−２１細胞での発現ではＭＡｂにより認識されなか った(図１)。ＭＡｂによるＧＰ₄タンパクの認識領域をさらに位置づけるために 、Ｉ−１１０２２およびＶＲ２３３２のＯＲＦ４の４種のキメラ遺伝子をｐＳＦ Ｖ１に構築した(図１)。プラスミドｐＡＢＶ２９６、ｐＡＢＶ３０５、ｐＡＢＶ ３２１、およびｐＡＢＶ３２６から転写したＲＮＡをＢＨＫ−２１細胞に移入し 、発現されたタンパクとＧＰ₄−特異ＭＡｂとの反応性をＩＰＭＡで試験した。 これら１５種類のＭＡｂの反応パターンは同一であり、これらのＭＡｂがＧＰ₄ タンパク内４０個のアミノ酸領域に向いていることを物語っていた。ｐＡＢＶ３ ２６の発現タンパクは分離株ＣＮＣＭ Ｉ−１１０２のＧＰ₄タンパクから導かれ るアミノ酸４０〜７９位から構成され、ＶＲ２３３２ＧＰ₄タンパクから誘導さ れる配列により囲まれているが、それでもこの一群のＭＡｂにより認識された。 異 なるＧＰ₄タンパク類、とりわけＭＡｂが認識しなかったものが、ＢＨＫ−２１ 細胞内で適切に発現されていることを確認するために、プラスミドｐＡＢＶ２６ ５、ｐＡＢＶ２７１、ｐＡＢＶ２９６、ｐＡＢＶ３０５、ｐＡＢＶ３２１、およ びｐＡＢＶ３２６からin vitroで転写したＲＮＡを移入したＢＨＫ−２１細胞の 溶解物からそれらを免疫沈降させた。免疫沈降はブタ抗−ＰＲＲＳＶ血清２１、 ＭＡｂ１２６．１、および抗−ペプチド血清６９８と７００により実施した。血 清７００は分離株ＣＮＣＭＩ−１１０２のＰＲＲＳＶ ＧＰ₄タンパクのアミノ酸 １０６〜１２２位に向けられたものであり、その配列は、アミノ酸１２１位を除 き、分離株ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２のＧＰ₄タンパクに一致する。従って、ＧＰ₄ タンパクのすべてが血清７００で免疫沈降した。それらはＳＤＳ−ＰＡＧＥによ る分析ではそのサイズを識別し得なかったが、例外としてｐＡＢＶ３０５および ｐＡＢＶ２７１により発現したＧＰ₄タンパクは僅かに速く移動した。これはＩ −１１０２配列に関係するＶＲ２３３２配列において、アミノ酸６２〜６４位間 での４個のアミノ酸が欠失したことによるとするのがもっとも可能性が高い(図 ３)。ＧＰ₄特異ＭＡｂの完全セットはｐＡＢＶ２６５、ｐＡＢＶ２９６、ｐＡＢ Ｖ３２１、ｐＡＢＶ３２６から発現したＧＰ₄タンパクを認識したが、ｐＡＢＶ ３０５およびｐＡＢＶ２７１から発現したタンパクは認識しなかった。これはＩ ＰＭＡにより得られた結果を確認するものである(図３)。血清６９８はＭＡｂと 同じ反応プロフィールを有していた。血清６９８はＰＲＲＳＶのＧＰ₄のアミノ 酸６２〜７７位に向けられたものであり、ＧＰ₄タンパクの今回同定された中和 ドメイン内に位置している。この領域はＶＲ２３３２ ＯＲＦ４において高度に 異質であり、従つて、この領域にＶＲ２３３２配列を含む発現産物はこの血清に より認識されなかった。しかし、中和性ポリクローナルブタ血清はＩ−１１０２ ＧＰ₄タンパク、キメラＧＰ₄タンパク、およびＶＲ２３３２ＧＰ₄タンパクを認 識し、ブタ抗−ＰＲＲＳＶ血清にはＧＰ₄タンパクのアミノ酸４０〜７９位よっ て形成された中和部位に対し向けられた多様な中和抗体が存在することを物語っ ている。 ＯＲＦ４およびＯＲＦ７タンパクのペプスキャン ＯＲＦ４タンパクと反応する１５のＭＡｂのすべてが、ウエスタンブロット分 析においてＧＰ₄タンパクと反応したので、それらは、分離株Ｉ−１１０２のＧ Ｐ₄の４０位〜７９位の範囲にあるアミノ酸の領域において、直線状エピトープ を認識すると推定された。ＭＡｂの結合領域の地図をさらに作製するために、こ の領域の重なり合っている９個のペプチドまたは１２個のペプチドを使用して、 ペプスキャン分析を行った。そのようなセットにおいて、最大値が、再現性をも って、バックグラウンドの２倍以上になっている場合には、ペプチドが抗原部位 を表していると考えられた。ＭＡｂ １２２−２９、１２２−３０、１２２−６ ６、１２２−７１、１３０−７、１３８−２８は、５９〜６７位のアミノ酸（Ｓ ＡＡＱＥＫＩＳＦ）からなる一つの特異的な抗原部位と陽性の反応をした（図２ ）。ＭＡｂ １２２−１２は、この抗原部位に弱くしか反応しなかったが、残り の７個のＭＡｂは、ペプスキャン分析において陰性であった。ブタポリクローナ ル血清も、ペプスキャンにおいてこの部位を認識した。ブタ２１をＰＲＲＳＶで 感染後、６週間で採取した中和血清２１は、該部位、およびそのフランキング領 域と強く、かつ広範に反応した。さらに、ＰＲＶ−ＯＲＦ４ベクターウイルスで ワクチン注射後５４日で採取したブタ中和ポリクローナル血清、およびＰＲＲＳ Ｖで対抗して３０日後、屠殺して採取したブタ中和ポリクローナル血清（ｖａ１ ２およびｖａ１４）は、ペプスキャンで認識された中和部位と強く、かつより広 範に反応した。 分離株Ｉ−１１０２において、中和部位のコア配列は、アミノ酸位置５９〜６ ７位に位置するアミノ酸配列ＳＡＡＱＥＫＩＳＦを含む。他の分離株においては 、そのコア配列は、対応するアミノ酸位置に、またはその周辺に認めることがで き、それは、ＧＰ₄タンパクの中和部位に対応するアミノ酸配列であり、たとえ ば、ＳＡＡＱＥＥＩＳＦ、ＳＴＡＱＥＮＩＳＦ、ＳＴＡＱＥＮＩＰＦ、ＳＥＥＳ ＱＳＶＴ、ＳＡＳＥＡＩＲ、ＳＡＳＥＡＦＲ、ＰＡＰＦＡＦＲ、ＰＡＰＥＡＩＲ 、ＳＡＰＥＴＦＲ、ＳＴＳＥＡＦＲのような配列を含むが、ＰＲＲＳＶの他の分 離株は、ＰＲＲＳＶのＩ−１１０２分離株のＯＲＦ４アミノ酸配列の５９〜６７ 位に対応するアミノ酸位置に、またはその周辺に位置する中和部位の、対応する がわずか に異なるコア配列を有すると推定されるべきである。また、上述のコア配列の抗 原性と、かかる機能性とを維持する人工的変異は、ペプチドの設計および合成の 分野における平均的専門家によって容易に導入可能である。また、ペプスキャン における中和ポリクローナル血清の非常に広範な反応によって明らかに実証され るように、種々のＰＲＲＳＶ分離株の、アミノ酸コア配列を含むアミノ酸配列と 、コア配列の両端に位置するアミノ酸配列が、さらにＰＲＲＳＶのＯＲＦ４タン パクの中和部位を構成している。特に、概ね、アミノ酸４０〜７９位に対応する 位置にある配列が中和部位を構成する（図１）。また、上述の抗原部位の抗原性 とかかる機能性とを維持する人工的変異は、ペプチドの設計および合成の分野に おける平均的専門家によって容易に導入可能である。また、ポリクローナル中和 性抗体ｖａ１２およびｖａ１４の広範な反応性を考慮すると、概ね、アミノ酸５ ２〜７５位に対応する位置にあるアミノ酸配列は、広範に反応する中和部位を、 より特異的に構成している。 ＯＲＦ７タンパクに対するＭａｂは、ペプスキャンの４つの異なる群、Ａ（４ ）、Ｂ（２）、Ｃ（３）、およびＤ（１）において反応した。群１（Ｄ）（該群 においては、特にＭａｂ １２２．１７、１３０．３、１３０．４、１３１．７ 、ＷＢＥ１、ＷＢＥ４、ＷＢＥ６、ＳＤＯＷＩ７であり、保存、および非保存の 反応部位を含む）は、ペプスキャンで検出されない立体配座エピトープと反応し た。群２（Ｂ）（該群においては、特に１２５．１、１２６．９、ＮＳ９５、お よびＮＳ９９であり、試験したＰＲＲＳＶの全ての分離株と反応し、保存された 抗原部位を認識する）は、コア配列ＶＮＱＬＣＱＬＬＧＡ（分離株Ｉ−１１０２ のアミノ酸位置２２〜およそ３２位に発見された）またはＶＮＱＬＣＱＭＬＧＫ を認識する。群３（Ｃ）（該群においては、特にＭａｂ １２６．１５であり、 ヨーロッパで分離されたＰＲＲＳＶ株と主に反応し、分化する抗原部位を認識す る）は、コア配列ＰＲＧＧＱＡＫＫＫＫ（分離株Ｉ−１１０２のアミノ酸位置４ １〜５０位に発見された）、ＰＲＧＧＱＡＫＲＫＫ、ＰＲＧＧＱＡＫＫＲＫ、Ｇ ＰＧＫＫＮＫＫＫＮ、ＧＰＧＫＫＮＫＫＫＴ、ＧＰＧＫＫＮＲＫＫＮ、ＧＰＧＫ ＫＦＫＫＫＮ、ＧＰＧＫＫＩＫＫＫＮ、またはＧＰＧＱＩＮＫＫＩＮを認識する 。群 ４（Ａ）（特にＭａｂ１３８．２２であり、ヨーロッパで分離されたＰＲＲＳＶ 株と主に反応し、分化する抗原部位を認識する）は、コア配列ＭＡＧＫＮＱＳＱ ＫＫ（分離株Ｉ−１１０２のアミノ酸位置１〜およそ１０位に発見された）、Ｍ ＰＮＮＮＧＫＱＴＥ、ＭＰＮＮＮＧＫＱＰＫ、ＭＰＮＮＮＧＫＱＱＫNＭＰＮＮ ＮＧＫＱＱＮ、ＭＰＮＮＮＧＫＱＱＫ、またはＭＰＮＮＮＧＲＱＱＫを認識する 。また、Ｎタンパクにおける上述の抗原部位の抗原性と、かかる機能性とを維持 する人工的変異は、ペプチドの設計および合成の分野における平均的専門家によ って容易に導入可能である。群１は、直線状エピトープを構成しないが、ＬＤＶ のアミノ酸配列とＰＲＲＳＶのアミノ酸配列を比較することによって、立体配座 エピトープ（これは種々の分離株間で大きく変化する）が、分離株Ｉ−１１０２ のアミノ酸位置５１〜およそ６８位（分離株Ｉ−１１０２のアミノ酸配列ＰＫＰ ＨＦＰＬＡＡＥＤＤＩＲＨＨＬ）、７９〜およそ９０位（分離株Ｉ−１１０２の アミノ酸配列ＳＩＱＴＡＦＮＱＧＡＧＴ）、または１１１〜１２４位（分離株Ｉ −１１０２のアミノ酸配列ＨＴＶＲＬＩＲＶＩＳＴＳＡＳ）に見出されるものに 対応する位置に発見し得ることがわかる。また、Ｎタンパクにおける上述の立体 配座エピトープ部位の抗原性と、かかる機能性とを維持する人工的変異は、ペプ チドの設計および合成の分野における平均的専門家、特に、ＰＲＲＳＶ分離株の 配列の比較、および他のアーテリウイルス科のＮタンパクの配列との比較によっ て収集された情報を有する専門家によって容易に導入可能である。これは、（Ｏ ＲＦ４に関して上述されたような）ＳＦＶ発現機構においてキメラＬＤＶ／ＰＲ ＲＳＶ ＯＲＦ７タンパクを発現させ、群１からのＭａｂとの反応性を測定して 決定された。 キメラＮタンパク ドメインＤの地図は、さらに、キメラＮタンパクを発現するＯＲＦ７の構築物 を用いて作製された。ドメインＤに対して向けられた１０個のＭａｂのうち６個 が、ＰＲＲＳＶのヨーロッパと北米の両方の分離株を認識したので、ＬＶと北米 の始原型ＶＲ２３３２とのＮタンパクの間で非常によく保存された領域（図４） を突然変異させた。アミノ酸５１〜６７位、８０〜９０位、および１１１〜１２ ８位をコードしているヌクレオチド配列を、ＬＤＶの対応するアミノ酸をコード する配列について置換した（図４）。完全のために、同様にヨーロッパと北米の 分離株で保存された部位Ｂ（アミノ酸２５〜３０位）を突然変異させた。部位Ｂ において、ＬＶのＮタンパクのアミノ酸配列が、ＬＤＶのＮタンパクのアミノ酸 配列に対して非常に類似していたので、ＬＶのＮタンパクのこの領域を、ＥＡＶ のＮタンパクの対応するアミノ酸をコードする領域について置換した（図４）。 突然変異Ｎタンパクおよび野生型Ｎタンパクを、ＢＨＫ−２１細胞において、セ ムリキ森林熱ウイルス発現機構を使用して発現させ、ＩＰＭＡにおいてＮ特異的 ＭＡｂで試験すると、Ｄ特異的ＭＡｂは、全く同じように反応した（表１）。そ の結合は、アミノ酸５１〜６７位の間、および８０〜９０位の間の突然変異によ って阻害されるが、アミノ酸１１１〜１２８位の間、または２５〜３０位（部位 Ｂ）の間の突然変異によっては阻害されない。推測されたように、アミノ酸５１ 〜６７位の間、および８０〜９０位の間にＬＤＶの配列を有するＮタンパクは、 部位Ａ、Ｂ、およびＣに対するＭＡｂによって、やはり染色された。しかしなが ら、染色された細胞数と、この染色の輝度は、野生型のＮタンパクおよび２５〜 ３０位（部位Ｂ）またはアミノ酸１１１〜１２８位に変異が生じたＮタンパクに ついて認められたものよりも低かった（表１）。これは、おそらく、アミノ酸５ １〜６７位の間または８０〜９０位の間に突然変異を含むＮタンパクの発現が低 いためであると思われ、なぜなら同量の翻訳量がin vitroで翻訳された際に、こ れらの突然変異Ｎタンパクも、他のＮタンパクと比較して、より低量しか得られ なかったためである（データ未掲載）。推測されたように、部位ＢにＥＡＶの配 列を含んだＮタンパクは、部位ＢにマップされたＭＡｂによっては認識されなか った（ペプスキャン分析による）が、部位Ａ、Ｃ、またはドメインＤにマップさ れたＭＡｂによっては、やはり認識された。これらのデータは、ドメインＤにマ ップされたエピトープが、立体配座依存的であり、アミノ酸５１〜６７位および ８０〜９０位から（部分的に）構成されていることを示す。 異なるＰＲＲＳＶ株のＧＰ₄タンパクの配列分析 ＧＰ₄特異的抗体が認識する主な抗原中和部位が、異なるＰＲＲＳＶ分離株間 で 保存されているかどうかを分析するために、ＭＡｂの反応性および中和活性を、 さらに７個の異なるヨーロッパの株において試験した。その結果、これらのＭＡ ｂは、他のドイツの株ＮＬ１およびイギリスの株ＮＹを認識し、中和するが、デ ンマークの分離株ＤＥＮ、スペインの２つの分離株ＳＰＡＩおよびＳＰＡ２、フ ランスの分離株ＦＲＡ、およびルクセンブルグで分離されたＬＵＸを認識せず、 中和もしないことが示された。したがって、我々は、そのアミノ酸配列、つまり これらの分離株のＧＰ₄タンパクの中和部位の領域に興味を持った。ＯＲＦ４遺 伝子は、ＰＲＲＳＶの配列由来のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってク ローニングした。このヌクレオチド配列由来の、異なる分離株のＧＰ₄タンパク のアミノ酸配列の８６〜９７％は、Ｉ−１１０２のＧＰ₄タンパクのアミノ酸配 列と同一であった。これらのアミノ酸配列の並びから、中和部位（アミノ酸４０ 〜７９位）は、そのタンパクの残りの部分よりもずっと多様であることがわかっ た。この領域、特に株ＤＡＮ、ＳＰＡ１、ＳＰＡ２、およびＦＲＡのアミノ酸配 列は、異なっている。これは、これらの株がＩ−１１０２特異的ＭＡｂによって 中和されないという結果に一致しており、さらには、この部位が、ヨーロッパの 分離株間で高度に保存されていないということが確認される。より高度に不均一 な領域は、ＧＰ₄タンパクのＮ末端に認められた。ＰＲＲＳＶのＧＰ₄タンパクと 、ＶＲ２３３２および他の北米の株のＧＰ₄タンパクのアミノ酸配列を比較する ことによって、後者もまた、タンパクの中和部位において不均一であることがわ かる。アミノ酸配列の並びによって、北米の分離株の中和部位に間隙が取り込ま れる結果となり（図３）、それは、これらの分離株のどれもが、ＭＡｂによって 認識されないという観察と一致している。全般的に、より高度な多様性が、ヨー ロッパの分離株の配列よりもアメリカの分離株の配列で発見された。これは、典 型的なウイルスのエンベロープについて示される特徴に一致し、たとえばＧＰ₄ のアミノ酸配列において同定される。 ワクチン開発のための中和部位の能力は、中和部位の不均一性に鑑み、非常に 重要である。異なるヨーロッパの株のＧＰ₄タンパクのアミノ酸配列を比較する ことによって、中和部位がそのタンパクの他の部分よりも非常に変異しやすいこ と が示され、この部位が、免疫選択法の作用を受けやすいことが示唆された。ヨー ロッパ、および北米の株の中和部位配列を比較することによって、ヨーロッパに 関して、北米の配列において４アミノ酸の間隙が示され、さらにはＰＲＲＳＶの 今回同定された中和部位のアミノ酸の大きな変異が示された。 ここで述べたＧＰ₄タンパクにおける中和部位は、レリスタッドウイルスにつ いて同定された最初の部位である。他の２つのアーテリウイスル、ＥＡＶおよび ＬＤＶについては、分離された中和ＭＡｂは全て、ＯＲＦ５によってエンコード されたＧ１／ＶＰ３タンパクに対して向けられた（Deregt et al，1994;Glaser et al，1995;Balasuriya et al，1995;Harty and Plagemann，1988）。中和を免 れた突然変異体を使用して、ＥＡＶの中和部位を、Ｇ₁のエクトドメインの特異 的なアミノ酸にマップした。 同様の配列の比較を、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ７タンパクについて行い、（図４） さらに、ＰＲＲＳＶの今回同定した抗原的に保存された部位、または非保存の部 位のアミノ酸の大きな変異が示された。この研究において、我々は、ＰＲＲＳＶ のＮタンパクにおいて、４つの異なつた抗原部位を同定した。Ａ，Ｂ，Ｃで示さ れた３つの部位は、直線状エピトープを含み、これらをアミノ酸２〜１２位の間 、２５〜３０位の間、および４０〜４６位の間でそれぞれマップした。それに対 して、ドメインＤと示した４つ目の部位は、立体配座依存的エピトープを含み、 アミノ酸５１〜６７位、および８０〜９０位から（部分的に）構成される。部位 ＡおよびＣは、ＰＲＲＳＶのヨーロッパの分離株において保存されているが、北 米の分離株においては保存されていないエピトープを含み、部位Ｂは、ＰＲＲＳ Ｖのヨーロッパの分離株および北米の分離株において保存されているエピトープ を含むが、部位Ｄは、ＰＲＲＳＶのヨーロッパの分離株、および北米の分離株に おける保存、および非保存の両方のエピトープを含む。ここで述べたＮタンパク において保存された部位は、ＰＲＲＳＶの感染の決定的な診断に標的を定めた診 断試験法の開発において非常に重要であり、これらの試験は、非保存の部位の使 用を避けるべきであり、それによって、間違ったネガティブな結果を回避する。 さらに、種々の非保存の部位に関する情報は、たとえば、ＰＲＲＳＶの野生型の 分 離株を感染したブタから、予防接種したブタを識別することができる分別試験の 発展において高い価値がある。 図１ ｐＳＦＶ１において発現させたＧタンパクと、ＧＰ₄特異的ＭＡｂとの それらの反応性の概略図。異なるＯＲＦ４遺伝子を含むプラスミドの名称が示さ れている。白いバーは、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ４がエンコードするＧタンパク由来 のアミノ酸配列を表し、黒いバーはＶＲ２３３２のＯＲＦ４がエンコードするＧ タンパク由来のアミノ酸配列を表す。アミノ酸数を、バーの上部に示す。材料と 方法欄に詳細に述べたように、遺伝子を、まずＰＧＥＭ−４Ｚに挿入し、そして ｐＳＦＶ１に移行させた。ＩＰＭＡにおいて１４個のＧＰ₄特異的ＭＡｂの完全 なセットを、異なる構築物と同様に反応させ、その反応性を陽性（＋）と陰性（ −）で示す。 図２ ２５位〜９４位のＧＰ₄の残基を含み、重なり合っている１２ｍｅｒの ペプチドを用いた、ＧＰ₄特異的ＭＡｂおよびポリクローナル血清のペプスキャ ン分析。４つの連続したペプチドを認識するＭＡｂ１３０．７および１３８．２ ８のスキャン結果を示す（２Ａ）。５つの他のＭＡｂ（１２２．２９、１２２． ３０、１２２．６６、１２２．７１、および１３８．２８）は、類似した特異性 を示した。免疫前の２頭のブタ（ｖａ１２−０およびｖａ１４−０）と、ＯＲＦ ４を発現する仮性狂犬病ウイルスを用いて免疫感作した後のブタ（ｖａ１２−５ ４およびｖａ１４−５４）と、さらにＰＲＲＳＶで対抗後のブタ（ｖａ１２−ｓ １およびｖａ１４−ｓ１）とから採取したポリクローナル血清のスキャン結果を 示し（２Ａおよび２Ｂ）、ブタの多価の抗ＬＶ血清２１（ｖａ２１）のスキャン 結果を示す（２Ｄ）。反応性ペプチドのアミノ酸配列を、四角で囲った共通残基 コアで示す。 図３ 種々のＰＲＲＳＶ株のＧＰ₄（Ａ）タンパクおよびＮ（Ｂ）タンパクの アミノ酸配列。Ｉ−１１０２配列とは異なるアミノ酸のみを示す。ペプスキャン 分析においてＭＡｂおよび／またはポリクローナル血清によって認識されたコア ペプチド配列には下線を付している。 図４ Ｎタンパクの配列における抗原結合部位の位置、およびＮタンパク配列 についての、北米の株ＶＲ２３３２とＬＤＶのＮタンパクの配列との比較。抗原 部位Ａ、Ｂ、Ｃ、およびドメインＤを影をつけて示す。部位Ａ、Ｂ、およびＣは 、 ペプスキャン分析で同定され、部位Ｄは、キメラＮタンパクの構築によって同定 された。ドメインＤをマップするために、ＬＤＶの対応するアミノ酸配列につい て置換されたＬＶのアミノ酸配列には下線を付している。アミノ酸２５〜３０位 の間に挿入し、部位Ｂを変異させたＥＡＶのＮタンパクのアミノ酸をＬＤＶの配 列の下に示す。同一のアミノ酸は垂直のバーで結んでいる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/531 33/531 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ミューレンベルフ，ヤネケ オランダ国 エヌエル―1018 ベーベー アムステルダム ラーフテ カデイク 17 エー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＰＲＲＳＶプロテインＧＰ４の中和部位に対応するアミノ酸配列から誘導 される少なくとも７〜４０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでなる、中和 性抗体を誘発するペプチド。 ２．アミノ酸残基が常套手段によりまたは置換地図作製の手引きのもとで置換 されているアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載の中和性抗体を誘発するペ プチド。 ３．該中和部位がＰＲＲＳＶ分離株Ｉ−１１０２のプロテインＧＰ４アミノ酸 の約４０〜７９位に位置するアミノ酸残基を含んでなる、請求項１または２記載 のペプチド。 ４．該中和部位がＰＲＲＳＶ分離株Ｉ−１１０２のプロテインＧＰ４アミノ酸 の約５２〜７５位に位置するアミノ酸残基を含んでなる、請求項１ないし３のい ずれかに記載のペプチド。 ５．該中和部位がＰＲＲＳＶ分離株Ｉ−１１０２のプロテインＧＰ４アミノ酸 の約５９〜６７位に位置するアミノ酸残基を含んでなる、請求項１ないし４のい ずれかに記載のペプチド。 ６．該アミノ酸配列がＳＡＡＱＥＫＩＳＦ、ＳＡＡＱＥＥＩＳＦ、ＳＴＡＱＥ ＮＩＳＦ、ＳＴＡＱＥＮＩＰＦ、ＳＥＥＳＱＳＶＴ、ＳＡＳＥＡＩＲ、ＳＡＳＥ ＡＦＲ、ＰＡＰＥＡＦＲ、ＰＡＰＥＡＩＲ、ＳＡＦＥＴＦＲおよびＳＴＳＥＡＦ Ｒからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１ないし５のい ずれかに記載のペプチド。 ７．少なくとも２種の異なるＰＲＲＳＶ分離株と反応する抗体を誘発するペプ チドであって、ＰＲＲＳＶプロテインＮの保存部位に対応するアミノ酸配列から 誘導される少なくとも約５〜約１５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでな るペプチド。 ８．アミノ酸残基が常套手段によりまたは置換地図作製の手引きのもとで置換 されているアミノ酸配列を含んでなる、請求項７記載の少なくとも２種の異なる ＰＲＲＳＶ分離株と反応する抗体を誘発するペプチド。 ９．該保存部位がＰＲＲＳＶ分離株Ｉ−１１０２プロテインＮのアミノ酸の約 ２２〜３２位に位置するアミノ酸残基を含んでなる、請求項７または８に記載の ペプチド。 10．該アミノ酸配列がＶＮＱＬＣＱＬＬＧＡおよびＶＮＱＬＣＱＭＬＧＫから なる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項７ないし９のいずれか に記載のペプチド。 11．少なくとも２種の異なるＰＲＲＳＶ分離株間を識別し得る抗体を誘発する ペプチドであって、ＰＲＲＳＶプロテインＮの非保存および分化部位に対応する アミノ酸配列から誘導される少なくとも５〜１５個のアミノ酸残基のアミノ酸配 列を含んでなるペプチド。 12．アミノ酸残基が常套手段によりまたは置換地図作製の手引きのもとで置換 されているアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１記載の少なくとも２種の異な るＰＲＲＳＶ分離株を識別し得る抗体を誘発するペプチド。 13．該保存部位がＰＲＲＳＶ分離株Ｉ−１１０２プロテインＮのアミノ酸の約 ４１〜５０位に位置するアミノ酸残基を含んでなる、請求項１１または１２に記 載のペプチド。 14．該アミノ酸配列がＰＲＧＧＱＡＫＫＫＫ、ＰＲＧＧＱＡＫＲＫＫ、ＰＲＧ ＧＱＡＫＫＲＫ、ＧＰＧＫＫＮＫＫＫＮ、ＧＰＧＫＫＮＫＫＫＴ、ＧＰＧＫＫＮ ＲＫＫＮ、ＧＰＧＫＫＦＫＫＫＮ、ＧＰＧＫＫＩＫＫＫＮおよびＧＰＧＱＩＮＫ ＫＩＮからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１ないし １３のいずれかに記載のペプチド。 15．該保存部位がＰＲＲＳＶ分離株Ｉ−１１０２プロテインＮのアミノ酸の約 １〜１０位に位置するアミノ酸残基を含んでなる、請求項１１に記載のペプチド 。 16．該アミノ酸配列がＭＡＧＫＮＱＳＱＫＫ、ＭＰＮＮＮＧＫＱＴＥ、ＭＰＮ ＮＮＧＫＱＰＫ、ＭＰＮＮＮＧＫＱＱＫ、ＭＰＮＮＮＧＫＱＱＮ、ＭＰＮＮＮＧ ＫＱＱＫおよびＭＰＮＮＮＧＲＱＱＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を 含んでなる、請求項１１、１２または１５に記載のペプチド。 17．ＰＲＲＳＶの立体配座エピトープまたはプロテインＮに対する抗体を誘発 するペプチドであって、アミノ酸残基５〜１５個の長さを有し、該アミノ酸残基 がレリスタッド（Lelystad）ウイルス分離株Ｉ−１１０２プロテインＮのアミノ 酸の約６８〜７９位置または７９〜９０位置または１１１〜１２４位置にある立 体配座ストレッチに相当するペプチド。 18．該アミノ酸配列がＰＫＰＨＦＰＬＡＡＥＤＤＩＲＨＨＬ、ＳＩＱＴＡＦＮ ＱＧＡＧＴおよびＨＴＶＲＬＩＲＶＴＳＴＳＡＳからなる群から選択されるアミ ノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載のペプチド。 19．請求項１ないし６のいずれかに記載の少なくとも１種のペプチドを含んで なるレリスタッド・ウイルスのプロテインＧＰ４の中和部位に対応する中和性抗 体を誘発するための免疫原性組成物。 20．請求項１ないし６のいずれかに記載のペプチドまたは請求項１９の免疫原 性組成物と、動物に投与するための適切なアジュバントまたは担体とを含んでな るＰＲＲＳ感染予防用ワクチン。 21．請求項１ないし１８のいずれかに記載のペプチドと反応する合成抗体。 22．ＰＲＲＳＶ分離株に対する抗体の検出用または同定用の診断試験キットで あって、請求項１ないし１８のいずれかに記載の少なくとも１種のペプチドと適 切な検出手段とを含んでなる診断試験キット。 23．ＰＲＲＳＶ分離株に対する抗体または該分離株から誘導される抗原の検出 用または同定用の診断試験キットであって、請求項２１に記載の抗体を含んでな る診断試験キット。 24．ブタの群れにおけるＰＲＲＳの発生を減少させるための、請求項２０に記 載のワクチン、または請求項２２または２３に記載の診断試験もしくはキットの 使用。 25．ブタまたはブタの群れにおいてＰＲＲＳ発生を試験するための請求項２２ または２３に記載の診断試験キットの使用。 26．ブタの群れにおけるＰＲＲＳの発生を減少または終息させるための撲滅プ ログラムにおける、請求項２０記載のワクチン、または請求項２２または２３記 載の診断試験もしくはキットの使用。 27．請求項２２または２４記載の診断試験キットの使用を含むブタまたはブタ の群れにおけるＰＲＲＳ発生試験方法。