JP2000513332A - 新規糖脂質複合体およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 疎水性域を含有する水溶性ポリマーと糖脂質の間の複合体、該複合体を免疫試薬として利用する免疫アッセイ法、並びに神経障害およびインスリン依存性糖尿病に関して用いられるべき診断方法。該診断方法は、抗糖脂質抗体をマーカーとして用いる。好ましい糖脂質はスルファチドである。

Description

【発明の詳細な説明】 新規糖脂質複合体およびそれらの使用 技術分野 本発明は、新規形態の糖脂質並びに抗糖脂質抗体をアッセイする新規方法に関 する。好ましい糖脂質は、スルファチドである。新規アッセイ方法は、特に、抗 糖脂質自己抗体の上昇レベルがマーカーとなるいかなる病気の診断についても適 用される。該病気は例えば神経障害およびインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ， Ｉ型糖尿病）であり得、ＩＩ型糖尿病、それと関連した後発性合併症を除外する 診断、およびＩＤＤＭの治療の監視を伴う。新規形態のスルファチドは、潜在的 に、ＩＤＤＭの治療において医薬として使用され得る。 本発明の最も重要な抗原であるスルファチドは、次の構造 を有するスフィンゴ糖脂質（＝ガラクトシルセラミド−３−ス ルフェート）である。 発現ＩＤＤＭの進行は、膵臓中のランゲルハンス島におけるインスリン産生細 胞が徐々に破壊される自己免疫過程を伴う。診断時に該細胞の７０〜８０％が破 壊されており、そして残りの細胞は一般に５年の期間内に消失する。前糖尿病個 体は、インスリン産生細胞の進行性破壊を受けているが、依然臨床的症状のない ものである。特定タイプの前糖尿病個体は、病気がＩＤＤＭに転じる非ＩＤＤＭ 患者である。 本発明に関して、用語ＩＤＤＭは、別段特記されていなければ発現ＩＤＤＭ並 びにその前病態を含む。 先行技術の状況 ＩＤＤＭにおいて見られる主なマーカー自己抗体は、島細胞抗体（ＩＣＡ）、 抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体（抗ＧＡＤ）、抗インスリン抗体（ＩＡ Ａ）、３７ｋＤ蛋白質（多分、チロシンホスファターゼと同じ）に対する抗体お よび抗スルファチド抗体である。これらのマーカーの主な欠点は以下の通りであ る。 ＩＣＡは、それらを大規模スクリーニングを行うには不適当な慣用の免疫組織 化学により決定される。それらは通常ＩＤＤＭ の良好な予測物質と考えられるが、しかしそれらのアッセイにはアッセイ内およ びアッセイ間で比較的大きな変動がある。 抗ＧＡＤ抗体は大規模スクリーニングにおいても決定するのが容易であるが、 しかしそれらは有力な予測価値を有さないことがあり得る。 ＩＡＡは決定がまずまず容易であるが、しかし新たに診断されたＩ型糖尿病の 子供の４０〜５０％超において存在せず、また成人患者においてそれほど一般的 でない。 抗３７ｋＤ蛋白質抗体は、ＩＣＡおよび抗ＧＡＤ抗体よりも有意的に低い頻度 （約５０％）を有する。 ＩＣＡおよび抗ＧＡＤ抗体は両方共、前糖尿病の診断について用いられてきた 。 抗スルファチド抗体は、発現ＩＤＤＭについての良好なマーカーとして認めら れてきた（Ｂｕｓｃｈａｒｄら，Ｌａｎｃｅｔ３４２（１９９３）第８４０頁− およびＢｕｓｃｈａｒｄら，ＡＰＭＩＳ １０１（１９９３）９６３〜９７０） 。このタイプの抗体とＩＤＤＭの前糖尿病病態の間の診断的関連を支持する結果 はこれまで発表されていない。抗スルファチド抗体の力価の増大が神経障害患者 において見られており、そしてそれは 神経障害が進行し得る個体の同定のために用いられ得よう。ＩＩ型糖尿病患者の 一部でもまた、神経障害が進行する。予備研究において本発明者の一人は神経障 害のないＩＩ型糖尿病患者が抗スルファチド抗体反応性を有さないことを示して おり、従って神経障害の進行のあるものは陽性である可能性があり、それゆえ抗 スルファチド抗体は診断手段として有用であり得よう。Ｆｒｅｄｍａｎら，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇ．２３８（１９９１）７５〜７９を参照されたい。 スフィンゴ糖脂質に対する抗体の血清レベルはしばしば、かかる抗原の薄層ク ロマトグラフィー（ＴＬＣ）および血清抗体の発生をアッセイするためにかかる クロマトグラフィーにかけられた物質を抗原として用いるＥＬＩＳＡ方法（酵素 結合免疫吸着剤アッセイ法）の組合わせ（ＴＬＣ−ＥＬＩＳＡ）によりアッセイ されてきた（Ｆｒｅｄｍａｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２３８（１９９１）７５〜 ７９およびＦｒｅｄｍａｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２４０（１９９３）３８１〜 ３８７）。 抗糖脂質抗体のアッセイ方法、特に抗スルファチド抗体についての方法は問題 を含んでいた。 硫酸化糖脂質、特にスルファチド、ラクトシルセラミド−３ −サルフェートおよびセミノリピド並びに対応する抗体が、糖尿病に関して診断 マーカーおよび治療剤として示唆されてきた（Ｂｕｓｃｈａｒｄ Ｋ，ＷＯ−Ａ −９２１９６３３）。 本発明が解決しようとする主な問題 我々はプラスチック製ウェルへのスルファチドの付着性を変動させることを試 み、そして直接的吸着は高い変動係数をもたらし、そしてしばしば以前のＴＬＣ −ＥＬＩＳＡ調査結果に対していかなる相関関係をも有さない非特異的反応を与 えるという明確な証拠を持っている。短炭水化物鎖糖脂質の脂質部および炭水化 物部の両方を正しく暴露することの臨界性もまた、モノクローナル抗スルファチ ド抗体を用いて示してきた。かくして、フレッドマン等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ２５１（１９８８）１７〜２２）により記載されたモノクローナル抗スルファチ ド抗体は、脂質部の変化に感受性である。別の見方ではサルフェートで置換され たガラクトースが幾つかの糖蛋白質および糖脂質における共通のエピトープであ るということであり、そしてこのエピトープに対する一般的反応性がＩＤＤＭお よびその後発性合併症の進行について関連があることを支持する結果はこれまで 存在しない。従って、本発明が解決しようとする主要課 題は、糖脂質エピトープの提供に関する。 本発明が解決しようとする別の問題は、ＩＤＤＭの前糖尿病病態の診断に関連 する。 本発明の目的 本発明の第１の目的は、免疫アッセイにおける、およびまた潜在的に治療にお ける糖脂質抗原／ハプテンの提供を改良することである。主に関係する抗原／ハ プテンは、短炭水化物鎖を示す。 第２の目的は、抗糖脂質抗体または糖脂質抗原／ハプテン、特に、硫酸化され ていてもよい単糖類および／または二糖類ユニットを示すスフィンゴ糖脂質抗原 に対する自己抗体を測定するための改良免疫アッセイ法を提供することである。 第３の目的は、ＩＤＤＭ（その前病態を含めて）を診断するために先に挙げら れた糖脂質抗原／ハプテンの一つまたはそれ以上に結合する自己抗体をマーカー として利用する改良診断方法を提供することである。 第４の目的は、ＩＤＤＭの前病態を決定するための診断方法を提供することで ある。 本発明 これらの目的は、上記に定められた糖脂質抗原／ハプテンを疎水性域を示す親 水性ポリマー担体に複合化させることにより満たされ得る。適当な担体分子の例 は、脂肪酸およびそれらの誘導体のような脂質化合物に会合することの可能な、 アルブミンのような親水性蛋白質の脱脂質化形態である。 従って、本発明の第１の側面は、水溶性担体ポリマーと、末端炭水化物ユニッ トの３位において硫酸化されていてもされていなくてもよい単糖類または二糖類 ユニットを示す糖脂質抗原、好ましくはスフィンゴ糖脂質抗原との間の複合体で ある。水溶性ポリマーは、好ましくは、脂肪酸のような脂質に結合することの可 能な疎水性域を有する蛋白質の脱脂質化形態である。優先権主張日において、最 も好ましい水溶性ポリマーは脱脂質化アルブミンであった。水溶性ポリマーは、 免疫アッセイまたはクロマトグラフィーにおいて用いられる公知の固相のいずれ かへの共有結合または物理的吸着により不溶化され得る。不溶化は、当該糖脂質 抗原／ハプテンとの複合体形成の前または後のいずれかにて行われ得る。本発明 のこの側面において、最良態様は、糖脂質抗原／ハプテンとしてスルファチドを 包含する。 糖脂質抗原／ハプテンの複合化を維持する力は主として疎水性であると信じられ 、これは、優先権主張時において本発明の複合体の好ましい変型は担体ポリマー と糖脂質の間の非共有的に会合された複合体であると考えられることを意味する 。 本発明の第２の側面は、上記の糖脂質複合体を抗原として利用する抗糖脂質抗 体または糖脂質抗原／ハプテンの免疫アッセイ法である。このタイプのアッセイ 法において、免疫複合体が、本発明のタイプの糖脂質−担体ポリマー複合体とサ ンプルの適切な抗糖脂質抗体（分析物）の間において、サンプル中の抗糖脂質抗 体の量に定性的または定量的に関連づけられる量にて形成される。別の実施態様 においては、糖脂質抗原／ハプテンが分析物であり、この分析物は、不足量の添 加抗糖脂質抗体に結合するために上記の糖脂質−担体ポリマー複合体と競合させ られる。測定を容易にするために、免疫複合体中に組み込まれることの可能な更 なる反応体が含まれ得、例えば標識反応体（標識抗体または標識抗原）または不 溶性もしくは不溶化性反応体である。使用可能な標識の例は、酵素、酵素基質、 補因子、補酵素、発蛍光団、色素、粒子（ラテックス粒子、カーボン粒子、金属 粒子のような）、放射性同位体、等である。標識反応体は、 （糖脂質）−−−（抗糖脂質抗体）複合体中に組み込まれたおよび／または組み 込まれていない量がサンプル中の分析物のレベルの尺度になるような量にて用い られる。免疫複合体中に組み込まれると標識からの信号が変化する場合、標識か らの信号を測定する前に、複合体に結合されていない形態の標識から複合体に結 合された形態の標識を物理的に分離することは必要でない。複合体の形成がいか なる信号変化も引き起こさない場合、複合体に結合されていない形態の標識から 複合体に結合された形態の標識を物理的に分離することが必要になる。分離が果 たされる場合不均質アッセイ法と言われ、一方そうでなければアッセイ法は均質 と呼ばれる。免疫複合体中に組み込まれた標識から免疫複合体中に組み込まれて いない標識を物理的に分離することは、通常、アッセイ媒質中に不溶性または不 溶化可能である反応体を利用することにより果たされる。 免疫アッセイ法を細分する他の様式は、競合アッセイ法および非競合アッセイ 法（サンドウィッチ法）である。更なる他のタイプは、凝集アッセイ法、比濁ア ッセイ法、沈殿アッセイ法（均質／不均質および／または競合／非競合であった りなかったりし得る）、等である。 免疫アッセイ法についての通常の条件が適用可能であり、これは、免疫反応中 のｐＨが通常４〜１１の範囲内にあり、温度が０〜３５℃の間にある、等を意味 する。不均質アッセイ法の場合、意図された様々な抗原−抗体反応の各々は通常 中間の分離および洗浄の工程が後に続き、非特異的に結合された免疫反応体およ び他の妨害物質が除去される。反応用の媒質は、通常、適切なｐＨに緩衝化され た水（水性）である。 用いられるサンプルは体液に由来し、そして全血、血清もしくは血漿のような 血液サンプルまたは当該抗糖脂質抗体もしくは糖脂質抗原／ハプテンを含有し得 るいかなる他のタイプのサンプル（尿、脳脊髄液、涙液、唾液、等）でもあり得 る。 本発明のこの側面の免疫アッセイ法は、診断のためにあるいは上記のタイプの 糖脂質抗原に指向されるモノクローナル抗体をスクリーニングまたは同定するた めに用いられ得る。 優先権主張日において本発明の第２の側面の最も好ましい態様は、実験の部に おいて与えられており、そして固相に固着された担体ポリマーとして脱脂質化ア ルブミンおよび糖脂質としてスルファチドを包含する。アッセイプロトコルは三 層サンドウィッチアッセイ法を包含し、このアッセイ法においては、サ ンプルは担体ポリマーと共にインキュベートされ、そして引き続いて標識抗ヒト 抗体と共にインキュベートされて、不溶化三元免疫複合体、即ち糖脂質−−−抗 糖脂質抗体−−−標識抗体が形成される。 本発明の第３の側面は、上記のタイプの免疫アッセイ法を利用することにより 上記に定められた抗糖脂質抗原／ハプテン抗体の上昇レベルに関連した障害を診 断する方法である。抗スルファチド抗体に関して、該方法は、神経障害またはＩ ＤＤＭ（その前糖尿病病態を含めて）の診断並びに予防的治療（例えば、インス リンでもって）のような治療法の監視に関して適用され得る。包含される使用は 、ＩＤＤＭ／非ＩＤＤＭの鑑別診断および／または糖尿病後発性合併症（神経障 害、網膜症および神経障害）の診断／予測および／または治療法の監視である。 包含される潜在的な重要な診断的使用は非ＩＤＤＭ個体におけるＩＤＤＭの前病 態の決定である。 本発明の第４の側面は、特に、サンプルが由来する患者における前糖尿病状態 についてのマーカーとして抗スルファチド抗体の上昇サンプルレベルを利用する ＩＤＤＭの前糖尿病病態の診断に関する。この側面において、いずれのタイプの アッセイ 法も用いられ得る（特に、免疫アッセイ法）けれども、最良の結果は現時点の知 識では、アッセイが抗スルファチド抗体を分析物として上記の第３の側面に従っ て行われる場合に得られる。 本発明の開発中、抗スルファチド抗体の上昇レベルについての本発明の免疫ア ッセイ方法の診断的使用は、上記に記載されたようなＩＤＤＭに関して見られる 他のマーカー自己抗体、例えば島細胞抗体（ＩＣＡ）、抗グルタミン酸デカルボ キシラーゼ抗体（抗ＧＡＤ）、抗インスリン抗体（ＩＡＡ）、３７ｋＤ蛋白質（ 多分、チロシンホスファターゼと同じ）に対する抗体の上昇レベルも考慮に入れ る場合更に改良され得る、ということが認識された。特に、抗スルファチド抗体 および抗ＧＡＤの上昇レベルについての同時に見られれば、特異性を増大するこ とにより診断価値を改善する、ということが信じられる。 本発明の効能のある第５の側面は、本発明の第１の側面に関して定められた複 合体を製薬組成物中の活性成分／薬物として用いることである。好ましい態様は 、糖尿病（ＩＤＤＭ）の進展を予防および／または遅延するための並びに糖尿病 （ＩＤＤＭ）の後発性合併症に関連した病気の治療のための上記の新規スルファ チド複合体を含む。本複合体は、例えば、発病過程に関与 する免疫学的リガンドおよび／または免疫活性細胞と相互作用し、それにより膵 臓のα−およびβ−細胞のような標的細胞における糖脂質／スルファチドへのそ れらの結合を阻止し得る。潜在的に、本発明の第１の側面の糖脂質複合体はまた 、病気の過程に関与し、スルファチドおよび／またはその代謝生成物により引き 起こされる細胞内現象において薬理学的に相互作用し得る。特に、上記に定めら れたスルファチド複合体は、ＩＤＤＭまたはその後発性合併症を予防し、遅延さ せまたは変化させるためにワクチンとして用いられ得る。 優先権主張年の間に、抗スルファチド抗体についてアッセイすることによるＩ ＤＤＭに関しての診断は、抗ＧＡＤ抗体の上昇レベルについても考慮する場合更 に改善され得る、ということが認識された。該改善は、主として特異性の増大に 関する。出願日の時点では抗スルファチド抗体をアッセイするために記載された ように新規形態の糖脂質を利用することが好ましかったが、このタイプの診断は 抗スルファチド抗体または抗ＧＡＤ抗体をアッセイするためのいかなる特定の方 法にも結びつけられていない。上記に記載されたＩＤＤＭに関してマーカーとし て抗スルファチド抗体および抗ＧＡＤ抗体の両方の上昇レベル を一緒に用いることは別個の発明である。 実験部 脱脂質化アルブミンの製造：アルブミンを、５％氷酢酸を含有するヘキサンでも って＋４℃にて脱脂質した。ヘキサンでの十分な洗浄後、このアルブミンをミリ （Ｍｉｌｌｉ）Ｑ−水に対して透析しそして凍結乾燥した。 ビオチニル化脱脂質化アルブミン：上記に記載されたような脂肪酸不含のアルブ ミンを、１０ｇ／Ｌの濃度まで０．１Ｍ−ＮａＨＣＯ₃中に溶解した。ジメチル ホルムアミド中０．１Ｍのビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを、０．０ ２Ｍの最終濃度まで添加した。この最終混合物を２０℃にて６０分間放置し、そ して等容量のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加した。この反応生成物を、＋ ４℃にて２４時間ＰＢＳを５回取替えて透析した。 スルファチドの製造：ウシの脳を、等容量の水でもって均質化した。次いで、メ タノールおよびクロロホルムを、４：８：３（容量による，クロロホルム−メタ ノール−水）の最終比率まで添加した。得られた脂質抽出物からは、遠心分離に より粒子が除かれた。低分子量成分を、４：２：１（容量による，ク ロロホルム−メタノール−水）の比率までのクロロホルムおよびメタノールの添 加後の分配により除去した。この粗製脂質抽出物を、シリカゲル上でクロマトグ ラフィーにかけた。単離されたスルファチド画分をケン化し、そしてシリカゲル 上で再びクロマトグラフィーにかけた。分配の繰返し後、スルファチド画分をイ オン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。最後に、精製画分をメタノー ル中に溶解し、そしてアセトンの添加により沈殿させた。単離されたスルファチ ド画分を、質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）により同定した。回収は、ウシの脳１ｋ ｇ当たり約１．５ｇのスルファチドであった。 アルブミンへのスルファチドの吸着：スルファチド（クロロホルム−メタノール −水の混合物中１００ナノモル）を蒸発乾固し、そして５００μｌの酢酸ナトリ ウム（０．０５Ｍ，ｐＨ４．５）中に再溶解し、そして室温にて１５分間音波破 砕した。この溶液に、同じ緩衝剤中に溶解された脱脂質化アルブミン（２ｍｇ／ ｍＬ）０．５ｍＬを添加した。この混合物を、慎重な混合下で室温にて一晩イン キュベートした。その後、スルファチドが吸着されたアルブミンを、＋４℃にて 水中の１０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）５０μＬの添加により沈殿させた。 ＋４℃にて３０分後、この混合物を２３，０００×ｇにて３分間遠心分離（＋４ ℃）した。このペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に懸濁し、そして＋４℃に保った。 この処理操作はまた、ビオチニル化アルブミンに適用され得た。 固相へのスルファチド−アルブミンの結合：スルファチド−アルブミンを２．５ ミリモル／ｍＬの濃度まで５０ｍＭ炭酸塩緩衝剤（ｐＨ９．６）中に懸濁し、そ してこの溶液の１００μＬをマイクロタイタープレート（デンマーク国ヌンク・ ストーウェル・マキシソープ社の免疫調節装置）のウェルに添加した。このプレ ートを３７℃にて２時間より長い時間インキュベートし、そして次いでパラフィ ルム（ｐａｒａｆｉｌｍ）でシールし、そして用いられるまで＋４℃に保った。 アッセイの直前に塗布溶液を振り落とし、そして非特異性結合について表面を遮 断するためにウェルを１％粉乳（ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳ１００μＬと共にイ ンキュベートした。この処理操作はまた、ビオチニル化アルブミンに結合された スルファチドに適用され得た。 アッセイプロトコル １％粉乳を含有するＰＢＳで１：４００に希釈された血清 ５０μＬである血清サンプルを、上記に記載されたように処理されたマイクロタ イタープレートのウェルに添加した。高スルファチド力価血清の場合、サンプル を更に希釈した。次いで、プレートを＋４℃にて一晩インキュベートした。血液 提供者からの血清のプール（５０個の血清サンプルは各々個々に、ＴＬＣ−ＥＬ ＩＳＡで分析された抗スルファチド反応性について陰性であった）を、参照とし て用いた。陽性血清を、内部標準として用いた。各サンプルを、三重反復試験に て分析した。インキュベーション後、サンプルを振り落とし、そしてヌンク社の 免疫洗浄機を用いてＰＢＳ中に溶解された０．１％アルブミンで６回ウェルを洗 浄した。その後、ＰＢＳ中の１％アルブミンで１：５００に希釈されたホスファ ターゼ結合抗ヒトＩｇＧ（ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ），スウェーデン国バイオザ ック社）５０μＬを添加し、そしてプレートを室温にて１時間インキュベートし た。次いで、未結合成分を、アルブミン（１％）含有ＰＢＳで５回洗浄すること により除去した。その後、インキュベーションを、１．０Ｍジエタノールアミン 緩衝剤（ｐＨ９．８）中に溶解されたｐ−ニトロフェニルホスフェート（１ｍｇ ／ｍＬ）（ホスファターゼ−基質タブレット１０４，米国シグマ社） １００μＬと共に＋３７℃にて遂行した。酵素反応を、５０μＬの３Ｍ−ＮａＯ Ｈを添加することにより停止した。吸光度を、４０５ｎｍにて読み取った。 臨床サンプルについての結果はＩＤＤＭに関してより安全な診断を指摘し、ま た抗スルファチド抗体の上昇レベルがＩＤＤＭの前病態についてのマーカーとし て機能することを初めて示した。治療法を監視するためのマーカーとしての抗ス ルファチド抗体の有用性に加えて、該結果は、この抗体をマーカーとする糖尿病 の後発性合併症の診断／予測を示唆した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 モンソン，ヤン―エリツク スウエーデン国、エス―417 46・イエー テボルイ、ポストローダ・2124

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 疎水性域を含有する水溶性ポリマーと糖脂質の間の複合体。 ２． ポリマーおよび糖脂質が互いに非共有的に結合されていることを特徴とす る、請求の範囲第１項の複合体。 ３． 水溶性ポリマーが脱脂質化蛋白質であり、しかも該蛋白質は未変性形態で は脂質と結合していることを特徴とする、請求の範囲第１項から第２項のいずれ か一項の複合体。 ４． 糖脂質がスフィンゴ糖脂質であることを特徴とする、請求の範囲第１項か ら第３項のいずれか一項の複合体。 ５． 糖脂質が１個の単糖類または二糖類ユニットを含有し、しかも好ましくは その末端単糖類ユニットにおける３位において硫酸化されていることを特徴とす る、請求の範囲第１項から第４項のいずれか一項の複合体。 ６． 糖脂質がスルファチドであることを特徴とする、請求の範囲第１項から第 ５項のいずれか一項の複合体。 ７． 水溶性ポリマーがアルブミンであることを特徴とする、請求の範囲第１項 から第６項のいずれか一項の複合体。 ８． 複合体が、吸着または共有結合により固相に不溶化されていることを特徴 とする、請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項の複合体。 ９． 糖脂質に指向される抗体の、または、糖脂質の免疫アッセイ法であって、 該抗体または該糖脂質を含有するサンプルを、該糖脂質を含有する複合体であっ てかつ請求の範囲第１項から第８項のいずれか一項に記載の複合体と接触させ、 該糖脂質がアッセイされる場合は随意に不足量の添加抗糖脂質抗体と接触させる ことを特徴とする上記免疫アッセイ法。 １０． 抗体が抗スルファチド抗体であることを特徴とする、請求の範囲第９項 の免疫アッセイ法。 １１． 免疫アッセイ方法が不均質方法であることを特徴とする、請求の範囲第 ９項から第１０項のいずれか一項の免疫アッセイ方法。 １２． 方法が非競合方法であることを特徴とする、請求の範囲第９項から第１ １項のいずれか一項の免疫アッセイ方法。 １３． 神経障害およびＩＤＤＭに関しての診断方法であって、抗スルファチド 抗体を請求の範囲第９項から第１１項のいずれか一項に記載のアッセイ法にてア ッセイすることを特徴とする、 上記診断方法。 １４． 個体におけるＩＤＤＭの前糖尿病病態を診断する方法であって、患者か らのサンプルを抗スルファチド抗体についてアッセイし、そして健康な母集団と 比較される測定上昇レベルを該患者の前糖尿病状態についてのマーカーとして採 用することを特徴とする上記方法。