JPH02264864A - Ｇｓａ―２結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫学測定用キット - Google Patents
Ｇｓａ―２結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫学測定用キットInfo
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- JPH02264864A JPH02264864A JP8631589A JP8631589A JPH02264864A JP H02264864 A JPH02264864 A JP H02264864A JP 8631589 A JP8631589 A JP 8631589A JP 8631589 A JP8631589 A JP 8631589A JP H02264864 A JPH02264864 A JP H02264864A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、悪性腫瘍、特に消化器系癌の診断に用いるこ
とができるＧ Ｓ Ａ −２（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａｓｉ
＋ｎｐｌｉｆｏｌｉａ ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ−２）
結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫
学測定用キットに関するものである。
とができるＧ Ｓ Ａ −２（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａｓｉ
＋ｎｐｌｉｆｏｌｉａ ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ−２）
結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫
学測定用キットに関するものである。
細胞の悪性化に伴い、細胞表層に存在する糖蛋白質や糖
脂質の糖鎖構造に変化を生じることが、モノクローナル
抗体を用いた研究によって明らかになってきている。こ
れら糖鎖の変化した腫瘍関連糖鎖抗原を検出することに
よって癌の組織学的診断及び血清学的診断が可能となり
、ＣＡ（Ｃａｒｂｏｎｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ
） ｌ ９−９やシアリル５ＳＥＡ−１等い（つかの腫
瘍関連糖鎖抗原が診断に利用されている。これらの腫瘍
関連糖鎖抗原はガラクトース（Ｇａｌ）とＮ−アセチル
グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる基幹構造を有し
、これがフコース（Ｆｕｃ）やシアル酸（ＮｅｕＡｃ）
によって修飾されたものが多い。ＣＡ１９−９やシアリ
ル５ＳＥＡ−ｉもこのような構造を有している。これら
の腫瘍関連糖鎖抗原をマウス、ラット、兎、山羊あるい
は羊などの哺乳動物に免疫してこれらの抗原に対する特
異抗体を作成し、これを用いて組織学的あるいは血清学
的にこれらの抗原を検出することにより癌の診断を行な
っている。
脂質の糖鎖構造に変化を生じることが、モノクローナル
抗体を用いた研究によって明らかになってきている。こ
れら糖鎖の変化した腫瘍関連糖鎖抗原を検出することに
よって癌の組織学的診断及び血清学的診断が可能となり
、ＣＡ（Ｃａｒｂｏｎｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ
） ｌ ９−９やシアリル５ＳＥＡ−１等い（つかの腫
瘍関連糖鎖抗原が診断に利用されている。これらの腫瘍
関連糖鎖抗原はガラクトース（Ｇａｌ）とＮ−アセチル
グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる基幹構造を有し
、これがフコース（Ｆｕｃ）やシアル酸（ＮｅｕＡｃ）
によって修飾されたものが多い。ＣＡ１９−９やシアリ
ル５ＳＥＡ−ｉもこのような構造を有している。これら
の腫瘍関連糖鎖抗原をマウス、ラット、兎、山羊あるい
は羊などの哺乳動物に免疫してこれらの抗原に対する特
異抗体を作成し、これを用いて組織学的あるいは血清学
的にこれらの抗原を検出することにより癌の診断を行な
っている。
しかしながら、糖鎖抗原の癌性変化は発生した癌の部位
、組織型及び分化塵等によって極めて多様性を有してい
る。そのため一つの腫瘍関連糖鎖抗原で、全ての癌を診
断することは困難である。 この欠点を補う方法として複数種の腫瘍関連抗原が開発
されており、それらをの組み合わせて癌の診断効率を高
めようとする試みなどがなされている。しかし、いずれ
も未だ十分とは言い難いのが現状である。
、組織型及び分化塵等によって極めて多様性を有してい
る。そのため一つの腫瘍関連糖鎖抗原で、全ての癌を診
断することは困難である。 この欠点を補う方法として複数種の腫瘍関連抗原が開発
されており、それらをの組み合わせて癌の診断効率を高
めようとする試みなどがなされている。しかし、いずれ
も未だ十分とは言い難いのが現状である。
そこで本発明者らは、かかる課題に鑑みて、新規な腫瘍
関連糖鎖抗原を見出し、癌の診断効率を更に高めるべ（
鋭意検討した。その結果、糖鎖の非還元末端Ｎ−アセチ
ルグルコサミン構造に特異的に反応するレクチンである
Ｇ Ｓ Ａ −２（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｆ
ｏｌｉａ ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ−２）と特異的に反
応する糖鎖抗原が高頻度で癌細胞表層に存在することを
見出し本発明に到達した。 すなわち本発明の第１発明は、非還元末端Ｎ−アセチル
グルコサミンに特異的に反応するＧＳＡ−２に結合性を
有する糖蛋白質（ＧＢＰ： ＧＳＡ−２Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｌに対する抗体とＧＳＡ−
２とを主要構成要素とし、いずれか一方な固相担体に固
定し、他方を検出可能な標識物質で標識した試薬を組み
合わせたＧＳＡ−２結合性蛋白質の免疫学的測定試薬で
ある。 本発明の第２発明は、非還元末端Ｎ−アセチルグルコサ
ミンに特異的に反応するＧＳＡ−２に結合性を有する糖
蛋白質に対する抗体とＧＳＡ−２とを主要構成要素とし
、いずれか一方を固相担体に固定し、他方を検出可能な
標識物質で標識した試薬を組み合わせてなる測定試薬と
、これに検量線作成用標準物質、溶解剤および洗浄剤を
組み合わせてなるＧＳＡ−２結合性蛋白質の免疫学測定
用キットである。 本発明の第３発明は、第２発明に記載された標識物質が
酵素であり、その酵素活性を測定するための基質及びそ
の反応停止剤を第２発明の免疫学測定用キットに追加し
て組み合わせてなるＧＳＡ−２結合性蛋白質の免疫学測
定用キットである。 測定試薬の固相担体に固定化する成分は、抗ＧＢＰ抗体
またはＧＳＡ−２であるが、抗体の方がレクチン類より
反応の特異性が高いので、抗ＧＢＰ抗体を用いるのが望
ましい。固相担体としては、例えばポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエス
テル、弗素樹脂、多糖類等の高分子化合物の他、紙、ガ
ラス、金属及びこれらの組み合わせなどが使用できる。 固相担体の形状としては、例えばトレイ状、球状、繊維
状、棒状、盤状、容器状、試験管等の種々の形状を用い
ることができる。 測定試薬のもう一つの主要構成要素である標識化試薬は
、抗ＧＢＰ抗体またはＧＳＡ−２を標識物質と結合させ
た標識化試薬が用いられる。この標識物質としては、酵
素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質などを使用する
ことができる。酵素には、例えばペルオキシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等
がある。蛍光物質には、例えばフルオレッセインイソチ
オシアネート、フィコビリプロティン等がある。発光物
質には、例えばイソルミノール、ルシゲニン、アクリジ
ニウム塩等がある。放射性物質には１例えば１″ＩＩ、
＋ｓ＋１．３＊ｐ、３Ｈ等がある。これらは例示したも
のに限らず、免疫学的測定法に使用し得るものであれば
、他のものを使用することもできる。 標識物質として酵素を用いる場合には、その活性を測定
するために基質、また、必要により発色剤が用いられる
。酵素にペルオキシダーゼを用いる場合には、基質とし
て例えば過酸化水素を用い、発色剤として例えば２．２
°−アジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン
酸アンモニウム塩］（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル
酸、０−フ二二レンジアミン、４−アミノアンチピリン
、３．３°、５，５゜テトラメチルベンジジン等を用い
る。酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合には
、基質として例えば０−二トロフェニルフオスフエート
等を用いる。酵素に一一〇−ガラクトシダーゼを用いる
場合には、基質として例えばフルオレツセインージ（ｔ
Ｊ−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベＪフ
ェリルートＤ−ガラクトピラノシド等を用いることがで
きる。 上記の抗ＧＢＰ抗体は、公知の方法でＧＢＰを抗原とし
て動物に免疫して得られる抗ＧＢＰ抗血清の抗体成分と
して得られるもの、及びそのフラグメントを用いること
ができる。免疫に用いられる動物としては、兎、山羊、
羊、マウス、ラット等が好適である。ＧＢＰは、ヒト大
腸癌細胞をホモジナイズし、これを可溶化剤で処理した
後、ゲル濾過してＧＳＡ−２と反応性を有する分画を採
取することによって分離することができる。
関連糖鎖抗原を見出し、癌の診断効率を更に高めるべ（
鋭意検討した。その結果、糖鎖の非還元末端Ｎ−アセチ
ルグルコサミン構造に特異的に反応するレクチンである
Ｇ Ｓ Ａ −２（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｆ
ｏｌｉａ ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ−２）と特異的に反
応する糖鎖抗原が高頻度で癌細胞表層に存在することを
見出し本発明に到達した。 すなわち本発明の第１発明は、非還元末端Ｎ−アセチル
グルコサミンに特異的に反応するＧＳＡ−２に結合性を
有する糖蛋白質（ＧＢＰ： ＧＳＡ−２Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｌに対する抗体とＧＳＡ−
２とを主要構成要素とし、いずれか一方な固相担体に固
定し、他方を検出可能な標識物質で標識した試薬を組み
合わせたＧＳＡ−２結合性蛋白質の免疫学的測定試薬で
ある。 本発明の第２発明は、非還元末端Ｎ−アセチルグルコサ
ミンに特異的に反応するＧＳＡ−２に結合性を有する糖
蛋白質に対する抗体とＧＳＡ−２とを主要構成要素とし
、いずれか一方を固相担体に固定し、他方を検出可能な
標識物質で標識した試薬を組み合わせてなる測定試薬と
、これに検量線作成用標準物質、溶解剤および洗浄剤を
組み合わせてなるＧＳＡ−２結合性蛋白質の免疫学測定
用キットである。 本発明の第３発明は、第２発明に記載された標識物質が
酵素であり、その酵素活性を測定するための基質及びそ
の反応停止剤を第２発明の免疫学測定用キットに追加し
て組み合わせてなるＧＳＡ−２結合性蛋白質の免疫学測
定用キットである。 測定試薬の固相担体に固定化する成分は、抗ＧＢＰ抗体
またはＧＳＡ−２であるが、抗体の方がレクチン類より
反応の特異性が高いので、抗ＧＢＰ抗体を用いるのが望
ましい。固相担体としては、例えばポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエス
テル、弗素樹脂、多糖類等の高分子化合物の他、紙、ガ
ラス、金属及びこれらの組み合わせなどが使用できる。 固相担体の形状としては、例えばトレイ状、球状、繊維
状、棒状、盤状、容器状、試験管等の種々の形状を用い
ることができる。 測定試薬のもう一つの主要構成要素である標識化試薬は
、抗ＧＢＰ抗体またはＧＳＡ−２を標識物質と結合させ
た標識化試薬が用いられる。この標識物質としては、酵
素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質などを使用する
ことができる。酵素には、例えばペルオキシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等
がある。蛍光物質には、例えばフルオレッセインイソチ
オシアネート、フィコビリプロティン等がある。発光物
質には、例えばイソルミノール、ルシゲニン、アクリジ
ニウム塩等がある。放射性物質には１例えば１″ＩＩ、
＋ｓ＋１．３＊ｐ、３Ｈ等がある。これらは例示したも
のに限らず、免疫学的測定法に使用し得るものであれば
、他のものを使用することもできる。 標識物質として酵素を用いる場合には、その活性を測定
するために基質、また、必要により発色剤が用いられる
。酵素にペルオキシダーゼを用いる場合には、基質とし
て例えば過酸化水素を用い、発色剤として例えば２．２
°−アジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン
酸アンモニウム塩］（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル
酸、０−フ二二レンジアミン、４−アミノアンチピリン
、３．３°、５，５゜テトラメチルベンジジン等を用い
る。酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合には
、基質として例えば０−二トロフェニルフオスフエート
等を用いる。酵素に一一〇−ガラクトシダーゼを用いる
場合には、基質として例えばフルオレツセインージ（ｔ
Ｊ−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベＪフ
ェリルートＤ−ガラクトピラノシド等を用いることがで
きる。 上記の抗ＧＢＰ抗体は、公知の方法でＧＢＰを抗原とし
て動物に免疫して得られる抗ＧＢＰ抗血清の抗体成分と
して得られるもの、及びそのフラグメントを用いること
ができる。免疫に用いられる動物としては、兎、山羊、
羊、マウス、ラット等が好適である。ＧＢＰは、ヒト大
腸癌細胞をホモジナイズし、これを可溶化剤で処理した
後、ゲル濾過してＧＳＡ−２と反応性を有する分画を採
取することによって分離することができる。
上記本発明の測定試薬またはキ・ントを用いて検体中の
ＧＢＰを測定するには、固相担体に結合した試薬と、溶
解剤等で希釈した検体試料及び濃度既知の標準物質とを
夫々別個に一定の時間の予備温度で接触させて反応させ
る。次に固定化試薬より反応溶液を分離してから固定化
試薬を良く洗浄した後、適当な標準物質で標識した標識
化試薬を加えて一定の時間及び温度で反応させる。さら
に反応溶液を分離して固定化試薬を良く洗浄した後、結
合された標識化試薬量を測定し、既知濃度の標準物質の
測定値から作成した検量線より検体試料中のＧＢＰ濃度
を読み取ることによって行なうことができる。 本発明の測定試薬またはキットを用いるととににより血
清中等に存在するＧＢＰを高い特異性、感度で正確且つ
迅速に測定することが可能となる。その結果、消化器癌
等の診断に役立つ。
ＧＢＰを測定するには、固相担体に結合した試薬と、溶
解剤等で希釈した検体試料及び濃度既知の標準物質とを
夫々別個に一定の時間の予備温度で接触させて反応させ
る。次に固定化試薬より反応溶液を分離してから固定化
試薬を良く洗浄した後、適当な標準物質で標識した標識
化試薬を加えて一定の時間及び温度で反応させる。さら
に反応溶液を分離して固定化試薬を良く洗浄した後、結
合された標識化試薬量を測定し、既知濃度の標準物質の
測定値から作成した検量線より検体試料中のＧＢＰ濃度
を読み取ることによって行なうことができる。 本発明の測定試薬またはキットを用いるととににより血
清中等に存在するＧＢＰを高い特異性、感度で正確且つ
迅速に測定することが可能となる。その結果、消化器癌
等の診断に役立つ。
以下、実施例により本発明を詳述する。なお実施例中の
％は重量基準である。 （ＧＢＰの分離精製） ヒト大腸癌新鮮組４９９．５ｇをクロロホルム−メタノ
ール混合液（容量比２：ｌ） ５００ｍｊ中でホモジナ
イズし、室温で１時間撹拌した後、濾紙にて濾過した。 その残渣をクロロホルム−メタノール混合液（容量比１
：１） １００ｒａεで洗浄してからエタノール２００
ｍｇで三回洗浄した後、蒸溜水に懸濁させて凍結乾燥し
て乾燥重量１．２５ｇの試料が得られた。 この試料１．０ｇをＰＨ７，４のＯ，ＱＩＩｉｌｏｌリ
ン酸緩衝生理食塩水に加えて、４℃で２４時間撹拌し３
０００ｒｐＩ１１゜６０分間の遠心分離による沈殿の後
、残漬部分に０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水５０
ｍ１を加えて４℃で２４時間撹拌し、上清を前記の沈殿
で得られた上清と合わせて２２，０００ｒｐ１１１．３
時間の遠心分離による沈殿を行ない、得られた残渣部分
を前の残渣部分と合わせた。この残渣部分をｌ １ｌＩ
ｏｏｌのジチオスレイトール及び２５ｍＭｏｌの３−［
（３−クロラミドブロビル）−ジメチル−アンモニオ］
−１−プロパンスルフォネート（ＣＩＡＰＳ）を含有す
る０、０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水５０ｍ！を用い
て、４℃、２４時間で可溶化を行なった後、３０．００
Ｏｒｐｍ 、 ２時間の遠心分離による沈殿を行なう。 残渣部分を、ｌ ｍＭｏ１のジチオスレイトール及び１
６ｍＭｏｌのＣＨＡＰＳを含有する０、０１Ｍｏｌリン
酸緩衝生理食塩水５０ｇ＋＋１に加えて４℃、２４時間
の撹拌を行なってから３０．００Ｏｒｐｍ、２時間の遠
心分離処理する。両方の上清を合わせて０．０ＩＭｏｌ
リン酸緩衝生理食塩水に対して透析を行なった。これ
を濃縮した後、 ８ｇＭｏｌのＣＨＡＰＳを含む０．Ｏ
ＩＭｏｌリン酸緩衝生理食塩水を用いて、セファクリル
Ｓ−４００（ファルマシア社）カラムによりゲル濾過し
、各両分からｌＯｇｊずつを取ってドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｎ
＋ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙ
ｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：
５ＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。その電気泳動が終了後
、２５■で１．５時間の通電によりスラブゲルからニト
ロセルロース膜へ蛋白類を移した。 このニトロセルロース膜を３％牛血清アルブミンを含有
する０、０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水でブロッキン
グした後、ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標識
ＧＳＡ−２溶液を加えて室温で１時間反応させた。次に
充分洗浄し、０．０４％の３．３°−ジアミノベンジジ
ン及び０．００３４％のＨｚＯ□を含む０．０１Ｍｏｌ
リン酸緩衝生理食塩水からなる基質溶液を加えて発色さ
せた後、ＧＳＡ−２陽性画分を集めて０．０１Ｍｏｌリ
ン酸緩衝生理食塩水に対して透析し凍結乾燥することに
より、８．６ ｒａｇのＧＢＰを得た。 （抗ＧＢＰ抗体の作製） 前記の如くしてヒト大腸癌組織から抽出、採取したＧＢ
Ｐの１ｍｍｇを１＋ｓ！の生理食塩水に懸濁してフロイ
ント完全アジュバントで乳化し、雄家兎（体重１．９Ｋ
ｇ）の後肢足踏に投与して免疫した。 １４日後にＧＢＰｏ、５−ｇを０．５ｍｇの生理食塩水
に懸濁してフロイント完全アジュバントで乳化した抗原
を皮肉に投与して追加免疫した後、最初の免疫から３５
日目に屠殺して抗血清を得た。得られた抗血清に５０％
飽和硫安水溶液を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿物を
濾別してから０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水に溶
解させた。そして０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水
に対して透析後、プロティンＡ−セファロースＣＬＪＢ
カラム（ファルマシア社製）にかけ、抗体を０．２Ｍｏ
ｌグリシンー塩酸緩衝液（ＰＨ３，Ｑ）で溶出し、中和
して精製抗ＧＢＰ抗体を得た。 実施例１ ＧＢＰ測定試薬の調製及びそれを用いたＧＢＰの測定 （１） 抗ＧＢＰ抗体固定化担体の調製ポリスチレン
製マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに、兎
抗ＧＢＰ抗体のｌＯｘｇ／ｍｓの濃度を有する ０．Ｏ
５Ｍｏ１の炭ｊ１２緩衝液（ＰＨ９，６）中に４℃の温
度で１昼夜放置した。それを０．Ｏ５Ｍｏ１の炭酸緩衝
液で洗浄してから１％牛血清アルブミンを含有する０、
０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水中に４℃の温度で１昼
夜放置してポストコーティング処理を実施して、抗ＧＢ
Ｐ抗体固定マイクロプレートを得た。 （２） ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標識Ｇ
ＳＡ−２溶液の調製 ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標識Ｇ Ｓ Ａ
−２（ＥＹ・ラボラトリーズ社製）を０．０ＩＭｏｌ
リン酸緩衝生理食塩水で１００倍に希釈してホースラデ
イツシュ・ペルオキシダーゼ標識ＧＳＡ−２を調製した
。 （３） サンドイツチ法によるＧＢＰの測定抗ＧＢＰ抗
体固定マイクロプレートの各ウェルに、精製したＧＢＰ
（標準物質）を０〜１００／ｍｊ（本測定法で測定し
た際に波長４９２ｎｍにおける吸収強度が１．０を与え
る濃度を１００／−１に設定した）の範囲で含有する１
％牛血清アルブミン含有０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理
食塩水を１００ＩＩｊずつ添加して３７℃の温度で２時
間培養した。次に、各ウェル内の溶液を吸引除去し、０
．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水で洗浄してから（２
）で調製したホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標
識ＧＳＡ−２溶液１００ｍ１ずつを各ウェルに加えて３
７℃の温度で培養した。各ウェル内の溶液を吸引除去し
てｌ）、（１１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して
から、オルトフェニレンジアミン０．０２％、ＨｔＯ□
０．０５％を含有する０、ｌＭｏ１のリン酸−クエン酸
緩衝液（ＰＨ５，０１を１００ｕｆｆｉずつ各ウェルに
加えて３７℃の温度で３０分間培養した後、反応停止剤
としてＩＮ硫酸１００μｉずつ加えて酵素反応を停止さ
せた。この溶液の４９２ｎｍの波長における吸収強度を
マイクロプレートリーグを用いて測定し、これを標準物
質濃度に対してプロットすることにより濃度依存性の良
い検量線を得た。結果を第１図に示しである。 実施例２ 臨床検体のＧＢＰの測定 健常人及び癌患者として胃癌、膵臓癌及び大腸癌患者の
血清を各１０．ｊずつ採取し、これに１％牛血清アルブ
ミン含有０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水９０ｇｊ
を加えてから実施例１の（１）で調製した抗ＧＢＰ抗体
固定マイクロプレートの各ウェルに添加し、３７℃の温
度で２時間培養した後、溶液を吸引除去して０．０１Ｍ
ｏｌリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。この各ウェルに
実施例１の（２）で調製したホースラデイツシュ・ペル
オキシダーゼ標識ＧＳＡ−２溶液ｔｏｏ、ｊずつを加え
て３７℃の温度で２時間培養した。その溶液を吸引除去
し０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水でよ（洗浄して
から、オルトフェニレンジアミン０．０２％、Ｈ＊０＊
０．０５％を含有する０、ｌＭｏ１リン酸−クエン酸緩
衝液（ＰＨ５，０）を １００１１ずつ加えて３７℃の
温度で３０分間培養し、反応停止剤として５Ｎ硫酸１０
０Ｉ１１ずつを加えて酵素反応を停止させた。 この溶液の波長４９２ｎｎ＋における吸収強度を測定し
、実施例１と同様の方法で作成した検量線を用いて濃度
を読み取った。その結果は、健常人０．６Ｕ／ｍ（胃癌
５１．６０／ｍ１、膵臓癌１３．８Ｕ／ｍｌ、大腸癌３
２．４Ｕ／ｍｌであった。
％は重量基準である。 （ＧＢＰの分離精製） ヒト大腸癌新鮮組４９９．５ｇをクロロホルム−メタノ
ール混合液（容量比２：ｌ） ５００ｍｊ中でホモジナ
イズし、室温で１時間撹拌した後、濾紙にて濾過した。 その残渣をクロロホルム−メタノール混合液（容量比１
：１） １００ｒａεで洗浄してからエタノール２００
ｍｇで三回洗浄した後、蒸溜水に懸濁させて凍結乾燥し
て乾燥重量１．２５ｇの試料が得られた。 この試料１．０ｇをＰＨ７，４のＯ，ＱＩＩｉｌｏｌリ
ン酸緩衝生理食塩水に加えて、４℃で２４時間撹拌し３
０００ｒｐＩ１１゜６０分間の遠心分離による沈殿の後
、残漬部分に０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水５０
ｍ１を加えて４℃で２４時間撹拌し、上清を前記の沈殿
で得られた上清と合わせて２２，０００ｒｐ１１１．３
時間の遠心分離による沈殿を行ない、得られた残渣部分
を前の残渣部分と合わせた。この残渣部分をｌ １ｌＩ
ｏｏｌのジチオスレイトール及び２５ｍＭｏｌの３−［
（３−クロラミドブロビル）−ジメチル−アンモニオ］
−１−プロパンスルフォネート（ＣＩＡＰＳ）を含有す
る０、０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水５０ｍ！を用い
て、４℃、２４時間で可溶化を行なった後、３０．００
Ｏｒｐｍ 、 ２時間の遠心分離による沈殿を行なう。 残渣部分を、ｌ ｍＭｏ１のジチオスレイトール及び１
６ｍＭｏｌのＣＨＡＰＳを含有する０、０１Ｍｏｌリン
酸緩衝生理食塩水５０ｇ＋＋１に加えて４℃、２４時間
の撹拌を行なってから３０．００Ｏｒｐｍ、２時間の遠
心分離処理する。両方の上清を合わせて０．０ＩＭｏｌ
リン酸緩衝生理食塩水に対して透析を行なった。これ
を濃縮した後、 ８ｇＭｏｌのＣＨＡＰＳを含む０．Ｏ
ＩＭｏｌリン酸緩衝生理食塩水を用いて、セファクリル
Ｓ−４００（ファルマシア社）カラムによりゲル濾過し
、各両分からｌＯｇｊずつを取ってドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｎ
＋ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙ
ｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：
５ＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。その電気泳動が終了後
、２５■で１．５時間の通電によりスラブゲルからニト
ロセルロース膜へ蛋白類を移した。 このニトロセルロース膜を３％牛血清アルブミンを含有
する０、０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水でブロッキン
グした後、ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標識
ＧＳＡ−２溶液を加えて室温で１時間反応させた。次に
充分洗浄し、０．０４％の３．３°−ジアミノベンジジ
ン及び０．００３４％のＨｚＯ□を含む０．０１Ｍｏｌ
リン酸緩衝生理食塩水からなる基質溶液を加えて発色さ
せた後、ＧＳＡ−２陽性画分を集めて０．０１Ｍｏｌリ
ン酸緩衝生理食塩水に対して透析し凍結乾燥することに
より、８．６ ｒａｇのＧＢＰを得た。 （抗ＧＢＰ抗体の作製） 前記の如くしてヒト大腸癌組織から抽出、採取したＧＢ
Ｐの１ｍｍｇを１＋ｓ！の生理食塩水に懸濁してフロイ
ント完全アジュバントで乳化し、雄家兎（体重１．９Ｋ
ｇ）の後肢足踏に投与して免疫した。 １４日後にＧＢＰｏ、５−ｇを０．５ｍｇの生理食塩水
に懸濁してフロイント完全アジュバントで乳化した抗原
を皮肉に投与して追加免疫した後、最初の免疫から３５
日目に屠殺して抗血清を得た。得られた抗血清に５０％
飽和硫安水溶液を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿物を
濾別してから０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水に溶
解させた。そして０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水
に対して透析後、プロティンＡ−セファロースＣＬＪＢ
カラム（ファルマシア社製）にかけ、抗体を０．２Ｍｏ
ｌグリシンー塩酸緩衝液（ＰＨ３，Ｑ）で溶出し、中和
して精製抗ＧＢＰ抗体を得た。 実施例１ ＧＢＰ測定試薬の調製及びそれを用いたＧＢＰの測定 （１） 抗ＧＢＰ抗体固定化担体の調製ポリスチレン
製マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに、兎
抗ＧＢＰ抗体のｌＯｘｇ／ｍｓの濃度を有する ０．Ｏ
５Ｍｏ１の炭ｊ１２緩衝液（ＰＨ９，６）中に４℃の温
度で１昼夜放置した。それを０．Ｏ５Ｍｏ１の炭酸緩衝
液で洗浄してから１％牛血清アルブミンを含有する０、
０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水中に４℃の温度で１昼
夜放置してポストコーティング処理を実施して、抗ＧＢ
Ｐ抗体固定マイクロプレートを得た。 （２） ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標識Ｇ
ＳＡ−２溶液の調製 ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標識Ｇ Ｓ Ａ
−２（ＥＹ・ラボラトリーズ社製）を０．０ＩＭｏｌ
リン酸緩衝生理食塩水で１００倍に希釈してホースラデ
イツシュ・ペルオキシダーゼ標識ＧＳＡ−２を調製した
。 （３） サンドイツチ法によるＧＢＰの測定抗ＧＢＰ抗
体固定マイクロプレートの各ウェルに、精製したＧＢＰ
（標準物質）を０〜１００／ｍｊ（本測定法で測定し
た際に波長４９２ｎｍにおける吸収強度が１．０を与え
る濃度を１００／−１に設定した）の範囲で含有する１
％牛血清アルブミン含有０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理
食塩水を１００ＩＩｊずつ添加して３７℃の温度で２時
間培養した。次に、各ウェル内の溶液を吸引除去し、０
．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水で洗浄してから（２
）で調製したホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標
識ＧＳＡ−２溶液１００ｍ１ずつを各ウェルに加えて３
７℃の温度で培養した。各ウェル内の溶液を吸引除去し
てｌ）、（１１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して
から、オルトフェニレンジアミン０．０２％、ＨｔＯ□
０．０５％を含有する０、ｌＭｏ１のリン酸−クエン酸
緩衝液（ＰＨ５，０１を１００ｕｆｆｉずつ各ウェルに
加えて３７℃の温度で３０分間培養した後、反応停止剤
としてＩＮ硫酸１００μｉずつ加えて酵素反応を停止さ
せた。この溶液の４９２ｎｍの波長における吸収強度を
マイクロプレートリーグを用いて測定し、これを標準物
質濃度に対してプロットすることにより濃度依存性の良
い検量線を得た。結果を第１図に示しである。 実施例２ 臨床検体のＧＢＰの測定 健常人及び癌患者として胃癌、膵臓癌及び大腸癌患者の
血清を各１０．ｊずつ採取し、これに１％牛血清アルブ
ミン含有０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水９０ｇｊ
を加えてから実施例１の（１）で調製した抗ＧＢＰ抗体
固定マイクロプレートの各ウェルに添加し、３７℃の温
度で２時間培養した後、溶液を吸引除去して０．０１Ｍ
ｏｌリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。この各ウェルに
実施例１の（２）で調製したホースラデイツシュ・ペル
オキシダーゼ標識ＧＳＡ−２溶液ｔｏｏ、ｊずつを加え
て３７℃の温度で２時間培養した。その溶液を吸引除去
し０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水でよ（洗浄して
から、オルトフェニレンジアミン０．０２％、Ｈ＊０＊
０．０５％を含有する０、ｌＭｏ１リン酸−クエン酸緩
衝液（ＰＨ５，０）を １００１１ずつ加えて３７℃の
温度で３０分間培養し、反応停止剤として５Ｎ硫酸１０
０Ｉ１１ずつを加えて酵素反応を停止させた。 この溶液の波長４９２ｎｎ＋における吸収強度を測定し
、実施例１と同様の方法で作成した検量線を用いて濃度
を読み取った。その結果は、健常人０．６Ｕ／ｍ（胃癌
５１．６０／ｍ１、膵臓癌１３．８Ｕ／ｍｌ、大腸癌３
２．４Ｕ／ｍｌであった。
第１図はＧＢＰ測定用検量線を示す図である。
特許出願人 信越化学工業株式会社
第１図
ＧＢＰ唄・１定用授層廠
ＧＢＰ沫＆（Ｕ／ｍ２）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に反
応するＧＳＡ−２に結合性を有する糖蛋白質に対する抗
体とＧＳＡ−２とを主要構成要素とし、いずれか一方を
固相担体に固定し、他方を検出可能な標識物質で標識し
た試薬を組み合わせてなることを特徴とするＧＳＡ−２
結合性蛋白質の免疫学的測定試薬。 ２、非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に反
応するＧＳＡ−２に結合性を有する糖蛋白質に対する抗
体とＧＳＡ−２とを主要構成要素とし、いずれか一方を
固相担体に固定し、他方を検出可能な標識物質で標識し
た試薬を組み合わせてなる測定試薬と、これに検量線作
成用標準物質、溶解剤および洗浄剤を組み合わせてなる
ＧＳＡ−２結合性蛋白質の免疫学測定用キット。 ３、前記標識物質が酵素であり、その酵素活性を測定す
るための基質及びその反応停止剤を請求項第２項記載の
免疫学測定用キットに追加して組み合わせてなるＧＳＡ
−２結合性蛋白質の免疫学測定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8631589A JPH02264864A (ja) | 1989-04-04 | 1989-04-04 | Ｇｓａ―２結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫学測定用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8631589A JPH02264864A (ja) | 1989-04-04 | 1989-04-04 | Ｇｓａ―２結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫学測定用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02264864A true JPH02264864A (ja) | 1990-10-29 |
Family
ID=13883401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8631589A Pending JPH02264864A (ja) | 1989-04-04 | 1989-04-04 | Ｇｓａ―２結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫学測定用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02264864A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6135858A (en) * | 1997-07-03 | 2000-10-24 | Canon Kabushiki Kaisha | Substrate holding device and polishing method and polishing apparatus using the same |
| WO2003016915A1 (en) * | 2001-08-20 | 2003-02-27 | Biotie Therapies Corp. | Tumor specific oligosaccharide sequences and use thereof |
| WO2004017810A3 (en) * | 2002-08-20 | 2004-06-10 | Biotie Therapies Corp | Tumor specific oligosaccharide epitopes and use thereof |
-
1989
- 1989-04-04 JP JP8631589A patent/JPH02264864A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6135858A (en) * | 1997-07-03 | 2000-10-24 | Canon Kabushiki Kaisha | Substrate holding device and polishing method and polishing apparatus using the same |
| WO2003016915A1 (en) * | 2001-08-20 | 2003-02-27 | Biotie Therapies Corp. | Tumor specific oligosaccharide sequences and use thereof |
| US8697061B2 (en) | 2001-08-20 | 2014-04-15 | Glykos Finland Oy | Tumor specific oligosaccharide epitopes and use thereof |
| WO2004017810A3 (en) * | 2002-08-20 | 2004-06-10 | Biotie Therapies Corp | Tumor specific oligosaccharide epitopes and use thereof |
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