JP2000514178A

JP2000514178A - アミロイド―βペプチド（ｘ―≧４１）の生産を変更する能力についての化合物のスクリーニング

Info

Publication number: JP2000514178A
Application number: JP10503316A
Authority: JP
Inventors: シトロン，マーティン; ジェイ．セルコー，デニス; エー．スーバート，ピーター; シェンク，デイル
Original assignee: アテナニューロサイエンシズ，インコーポレイティド; ブリガムアンドウィメンズホスピタル
Priority date: 1996-06-18
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 2000-10-24
Anticipated expiration: 2017-06-18
Also published as: CA2258348A1; DE69738961D1; US7993627B2; EP0906577B2; ATE407362T1; EP0906577B1; US20030148392A1; WO1997048983A1; EP0906577A1; AU3572797A; JP3694033B2; CA2258348C; US6610493B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ａβ（ｘ≧41）のみ、又はＡβ（ｘ≦40）と組合してのＡβ（ｘ≧41）の生成を変更する化合物の能力についてそれらの化合物もスクリーニングするための方法を提供する。本発明の方法は、細胞に化合物を投入し、細胞により生成されるＡβ（ｘ≦40）及びＡβ（ｘ≧41）の量を特異的に測定し、そして化合物の投入なしに細胞により生成されるそれらの量を比較することを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】アミロイド−βペプチド（ｘ−≧41）の生産を変更する能力についての化合物のスクリーニング発明の背景１．発明の分野本発明は、一般的に、神経学、及びより特定には、Ａβの種々のアイソフォームの生成を特異的に変更する化合物をスクリーニングするためのアッセイ、たとえばイムノアッセイに関する。アルツハイマー病（AD）は、深い精神的な衰退及び究極的には死を徐々に導びく、記憶、認識、理性、判断及び情緒安定性の進行性損失により臨床学的に特徴づけられる退化性脳障害である。ADは、老いたヒトにおける進行性精神不全（痴呆）の非常に共通する原因であり、そしてアメリカ合衆国においては、死の四番目の共通する医学的原因を示していると思われる。ADは世界じゅうのすべての人種及び民族グループにおいて観察されており、そして主要な現在及び未来の公衆衛生問題を示している。その疾病は現在、アメリカ合衆国のみでも２〜３百万人の人々に影響を及ぼすことか推定される。 ADは現在、不治である。ADを効果的に防ぎ、又はその症状もしくは経過を効果的に反転する処置は現在知られていない。 ADを有する個人の脳は、老人性プラーク及び神経細線維のもつれと称する特徴的な損傷を示す。多数のそれらの損傷が一般的に、記憶及び認識機能のために重要なヒト脳のいくつかの領域に、AD患者において見出されている。より制限された解剖学的分布におけるより少ない数のそれらの損傷が時々、臨床的ADを有さない老人の脳に見出されている。老人性プラーク及び血管性アミロイド付着（アミロイド血管障害）はまた、トリソミー (Trisomy)21（ダウン症）及びダッチタイプ（Dutch-Type）のアミロイドーシスによる遺伝性脳出血(HCHWA-D)を有する一定年齢以上の個人の脳を特徴づける。A D及び上記で言及された他の疾病の特徴的な老人性プラーク及び血管アミロイド付着の主要な化学的構成成分は、アミロイド−βペプチド（Ａβ）又は時々、β AP， AβP又はβ／Ａ４と称するタンパク質である。Ａβが最初に精製され、そして部分的なアミノ酸配列が、Glenner and Wong（1984）Biochem.Biophys.Res. Commun．120:885-890に報告されている。その単離方法及び最初の28個のアミノ酸についての配列データは、アメリカ特許第4,666,829号に記載されている。番号40以上のアミノ酸を有するＡβの形は最初に、Kangなど．（1987）Nature 325 :733-736により報告された。 Roherなど．（1993）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 90:10836-840は、NH₂−末端として有意な量の異性体化され、そしてラセミ化されたアスパルチル残基を含むＡβ（１−４２）が神経炎性プラークにおける主要構成成分であることを示した。その著者はまた、Ａβ(17−42)(p3 (42))が拡散性（初期）プラークにおいて支配的であり、そしてＡβ（１−４０）が髄膜血管付着物における主要構成成分であり、それらの血管において全Ａβの60％を占めることも報告している。Iwat suboなど．（1994）Neuron 13:45-53は、Ａβ42（43）−含有老人性プラークが散発性AD脳において老人性プラークの主要種であることを示した。Iwatsuboなど．（1995） Annals of Neurology 37:294-299及びLemereなど．（1996）Neurobi ology of Disease 3:16-32は、Ａβ42（43）は、ダウン症候群において老人性プラークの主要構成成分であり、そしてそれらの患者においてAD−型の神経病理学的分類の進行において最初に沈着されたＡβ種であることを報告している。さらに、Gravinaなど.，（1995）J.Biol.Chem．270:7013-7016 は、Ａβ42（43）ペプチドが、AD脳において老人性プラークの最とも豊富な構成成分であり、そしてそのようなプラークにおいてＡβ40ペプチドの量を越える、生化学的及び免疫細胞化学的証拠を報告している。過去数年間行なわれて来た分子生物学的及びタンパク質化学的分析は、Ａβがヒトを包含する種々の動物の多くの組織中の細胞により通常生成される、β−アミロイド前駆体タンパク質(APP)として言及される、より大きな前駆体タンパク質の小さなフラグメントであることを示している。APPをコードする遺伝子の構造体の知識はまた、知られていない酵素（プロテアーゼ）によりAPPのカルボキシ−末端から分解されるペプチドフラグメントとしてＡβが生じることを示した。ＡβフラグメントがAPPから分解され、そして続いて、脳組織、脳及び髄膜血管の壁にアミロイドプラークとして付着される正確な生化学的機構は現在、知られていない。重要なことには、Haassなど．（Nature 359:322-325）及びSeubert など．（(1992)Nature 359:325-327)は、APP遺伝子を発現する実質的にすベての細胞が通常、一連のＡβペプチドを分泌し、そしてそれらのペプチドが細胞培養流体（ならし培地）及びヒト生物学的流体、たとえば血漿及び脳脊髄液において容易に検出され、そしてアッセイされ得ることを発見した。それらの流体はより多くのＡβ40−終結（ending）ペプチド及び少ない量のＡβ42（43）−終結（en ding）ペプチドの両者を含むことが続いて示された(Doveyなど．（1993）Neuror eport 4:1039-1042及びVigo-Pelfreyなど．（1993）J.Neurochem．61:1965-68) 。証拠のいくつかの系統は、Ａβの進行性大脳付着がADの病因において発生的(s eminal)役割を演じ、そして数年又は10年後に認識できる症状を示すことがある（Schenk（1995）J.Med.Chem．38:4141−4154;Selkoe （1994）J.Neuropath．and Exp.Neurol．53:438-447;及びSelkoe（1991）Neuron 6:487を参照のこと）。証拠の最も重要な系統の１つは、APPの770−アミノ酸アイソフォームのアミノ酸717でのAPP遺伝子におけるミスセンスDNA突然変異が、影響されたメンバーに見出され得るが、しかしADの遺伝子的に決定された形を有するいくつかのファミリーの影響されていないメンバーには見出され得ないという1991年の発見である(Goateなど．（1991）Nature 349:704-706;Chartier Harl anなど．（1991）Nature 353:844-846;及びMurrellなど．（1991）Science 254: 97-99)。Suzukiなど．（1994）“An increased percentage of long amyloid β -protein secreted by familial amyloid β-protein precursor（βAPP717）mu tants,”Science 264:1336-1340は、続いて、正常な個人に比較して、717突然変異がＡβ（１−４２）ペプチドのより高い相対的な生成を引き起こすことを示した。さらに、リジン⁶⁷⁰−メチオニン⁶⁷³をアスパラギン⁶⁷⁰−ロイシン⁶⁷¹に変える二重突然変異(APPの770アイソフォームに関して）が、1992年に、家族性ADを有するスウェーデンの家族に報告されており（Mullanなど．（1992）Nature Gen et 1:345-347）、そしてスウェーデンAPP変異体として言及される。遺伝的連鎖分析（genefic linkage analysis）は、前述の突然変異が、それらの変異体APP遺伝子を担持するそのような家族のメンバーにおけるADの特定の分子的原因であることを示している。さらに、APPの770−アミノ酸アイソフォームのアミノ酸693での突然変異がＡβ沈着疾患、すなわちHereditary Cerebral Hem orrhage with Amyloidosis Dutch型(HCHWA-D)の原因として同定されており、そしてアミノ酸692でアラニンからグリシンへの突然変異が、いくつかの家族メンバーにおけるADの表現型及び他の家族メンバーにおけるHCHWA- Dの表現型の原因であるように見える。ADの遺伝的原因におけるそれらのAPP突然変異の発見は、APPの遺伝子的変更及びそのＡβフラグメントの続く沈着がADを引き起こし得ることを示す。最近、Ａβ（42）がADにおける老人性プラークの過程において重要な役割を演じることを示唆する証拠が増大している。最初に、インビトロデータは、Ａβ（ 42）が核形成依存性機(nuclention dependent mechanism)によりＡβフィブリルの形成（及び従って、老人性プラーク）を促進することを示す(Jarrettなど．（ 1993）Biochemistry 32:4693-4697)。第２に、細胞から分泌される合計のＡβの 10％以下を考慮して（約90％がＡβ（40）である）(Doveyなど．（1993） Neuro report 4:1039-1042;Asami-Odakaなど．（1995）“Long amyloid β-protein s ecreted from mild-type human neuroblastoma IMR-32 cells,”Biochemistry 3 4:10272-10278)、Ａβ（42）は主要プラーク成分である（Kangなど．（1987）Na ture 325:733-736;Iwatsuboなど．（1994）Neuron 13:45-53;Iwatsuboなど．（1 995）Ann.Neurol．37:294-299;Gravinaなど．（1995）J.Biol.Chem．270:7013-7 016;Lemereなど．（1996）Neurobiology of Disease 3:16-32)。さらに、今日までに同定されたすべての３種の初期開始家族のAD遺伝子は、Ａβ（42）の細胞分泌の上昇を導びくことが示された。スウェーデンAPPミスセンス突然変異のみが、Aβ（40）及びＡβ（42）の両ペプチドの分泌を高め(Doveyなど．(1993）Neur oreport 4:1039-1042)、そしてAPP717突然変異及び初老性突然変異がＡβ（40）ペプチドを高めないように思える（Suzukiなど．（1994）Science 264:1336-134 0;Scheunerなど．（1995）Neurosci.Abstracts in Press）。従って、より長いＡβ（42）ペプチドは、治療的介入のための重要な標的物であると思われる。しかしながら、AP Pプロセッシングの主要段階に関与するプロテアーゼ、たとえばγ−セクレターゼ、すなわちＡβのＣ−末端を生成するプロテアーゼは、明確には同定されていない。同じプロテアーゼがＡβ（40）及びＡβ（42）の両者を生成することが一般的に仮定されており、そして両形が酸性細胞内区画、たとえば後期ゴルジ又は初期エンドソームを包含する通常の分泌機構を共有することが示されている(Koo and Squazzo（1994）J.Biol.Chem．269:17386-17389;Asami-Odakaなど．（1995 ）Biochemistry 34:10272-10278)。最近、Higakiなど（(1995)Neuron，14:651-6 59）は、カルパインインヒビター、すなわちMDL28170が全Ａβ及び全ｐ３の両者の生成を阻害し、そして処理された細胞におけるそれらのそれぞれ12kDa及び10k DaのAPP前駆体フラグメントの蓄積を導びくことを示した。それらのデータは、Ａβ及びｐ３の特定の形が影響されることに関するデータは提供されていないが、化合物が少なくともいくつかの形のγ−セクレターゼを直接的に阻害することを示唆している。 ADの根本的な機構を理解することにおいてなされて来た進歩にもかかわらず、疾病を予防し、又は処置するための候補体化合物を同定するためのアッセイについての必要性が残っている。発明の要約現在の理論によれば、APPのプロセッシングは、プロテアーゼによるいくつかの特異的切断を包含していると思われる。アミノ酸 671／672間のAPP(βAPP₇₇₀ アイソフォームと言及される）を切断する酵素は、β−セクレターゼと呼ばれ、 APPのアミノ酸687／688(Ａβの16／17）間を切断する酵素はα−セクレターゼと呼ばれる。現在まで、Ａβ（40）及びＡβ（42）を生成するAPPの切断はγ− セクレターゼと呼ばれる単一の酵素により行われたと思われていた。しかしながら、本発明者は、ある化合物がＡβ（42）ではなくＡβ（40）の生成を阻害することができることを発見した。特に、本発明者は、一般的にＡβ生成を阻害すると思われる化合物がＡβ（42）ではなく、Ａβ（40）の生成を実際阻害することを発見した。これは、複数のγ−セクレターゼ機構が、薬理学的に関連している作用で存在することを示す。Ａβ（42）はβ−アミロイドプラークの主要成分であり、そしてAD患者においてアミロイドプラークの形成を開始するので、Ａβ（42）及びＡβ（40）の生成を、同時に又は別々に、特異的に阻害する化合物を同定するために、それらの化合物をスクリーンするための手段を有することは重要である。本発明は、そのようなアッセイを提供する。本発明は、ある化合物が、細胞により生成される少なくとも１つのＡβ（ｘ− ≧41）ペプチドの量を変更するかどうかを決定するための方法を提供する。この方法は、前記化合物を、細胞を含んで成る培養物に投入し；培養物からのサンプルにおけるＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を特異的に測定し；そしてその測定された量が、化合物が投与されていない、細胞を含んで成る培養物からのサンプルにおいて予測される量とは異なっているかどうかを決定することを包含する。測定された量と予測される量との間の差異は、化合物が細胞により生成されるＡβ （ｘ−≧41）ペプチドの量を変更することを示す。もう１つの観点においては、本発明は、ある化合物が細胞により生成される少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を変更し、そして前記細胞により生成される全Ａβ又は少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を変更するかどうかを決定するための方法を提供する。前記方法は、前記化合物を、前記細胞を含んで成る培養物に投入し；前記培養物からのサンプルにおけるＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を特異的に測定し；前記培養物からのサンプルにおける全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を特異的に測定し；そしてそれらの測定された量が、化合物が投入されていない、細胞を含んで成る培養物からのサンプルにおいて予測される量とは異なるかどうかを決定することを包含する。測定された量と予測される量との間の差異は、前記化合物が、細胞によるＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を変更し、そして／又は細胞による全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を変更することを示す。１つの態様において、Ａβペプチドの量は、イムノアッセイ、及び特に、固相に結合される捕獲結合物質及びラベルされた検出結合物質を含んで成るサンドイッチイムノアッセイにより測定される。少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を決定するためのサンドイッチイムノアッセイにおいては、捕獲抗体は好ましくは、たとえばペプチドNH₂-Cy s-NH-CH₂−(CH₂)₅-CO-GLMVGGVVIA-COOH（配列番号４）に対して生ぜしめられた、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的である。このアッセイにおける検出結合物質は、アミノ−末端のアミノ酸がＡβの第１番であるＡβペプチドに対して特異的な抗体であり得、又はＡβの結合領域内のエピトープに対して特異的であり得る。もう１つの態様においては、少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を測定するための捕獲結合物質は結合領域内のエピトープに対して特異的であり、そして検出結合物質はＡβ（ｘ−≧41）に対して特異的である。少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を決定するためのサンドイッチアッセイにおいては、捕獲結合物質は好ましくは、たとえばペプチドNH₂-Cys- NH-CH₂-(CH₂)₅-CO-GLMVGGVV-COOH（配列番号５）に対して生ぜしめられた、Ａβ（ｘ−≦40）ペプチドに対して特異的な抗体である。ラベルされた検出結合物質は、そのアミノ末端アミノ酸がＡβの第１番、又はＡβの結合領域内のエピトープに対して特異的な抗体であるＡβペプチドに対して特異的な抗体であり得る。もう１つの態様においては、少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を測定するための捕獲結合物質は、Ａβの結合領域内のエピトープに対して特異的であり、そして検出結合物質は、Ａβ（ｘ≦40）に対して特異的な抗体である。全Ａβの量を決定するためのサンドイッチアッセイにおいては、捕獲結合物質は好ましくは、Ａβの結合領域内のエピトープに対して特異的な抗体である。検出結合物質は好ましくは、そのアミノ末端のアミノ酸がＡβの第１番であるＡβ ペプチドに対して特異的である。イムノアッセイのもう１つの態様においては、培養物からのサンプルにおけるＡβ（ｘ−≧41）ペプチド、全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を測定する段階は、タンパク質について放射性ラベルにより培養物をパルスし；放射性ラベルなしに培養物を追跡し;その追跡の間、細胞に化合物を投人し；培養物からのサンプルとＡβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的な結合物質とを接触せしめ；培養物からのサンプルと全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドに対して特異的な結合物質とを接触せしめ；そして前記結合物質に結合される放射性ラベルの量を決定することを含んで成る。前記方法のもう１つの態様においては、培養物は、一次ヒトニューロン、トランスジェニックPDAPPマウス（すなわち細胞がPDAPP構造体を有するトランスジェニックマウス）からの一次ニューロン、293ヒト腎細胞系、ヒト神経膠腫細胞系、ヒトHeLa細胞系、一次内皮細胞系、一次ヒト線維芽細胞系、一次リンパ芽球系、ヒト混合脳細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系を含んで成る。１つの態様において、細胞は、ヒトAPP、たとえばHardy突然変異、たとえばV717F又はスウェーデン変異体をコードし；細胞のＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの過剰生成を引き起こす組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞である。もう１つの観点においては、前記方法は、化合物が細胞に対して毒性であるかどうかを決定する段階を含んで成る。もう１つの観点においては、本発明はサンプル中の少なくとも１つのＡβ（ｘ −≧41）ペプチド及び少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドを特異的に検出するためのキットを提供する。キットは、Ａβ（ｘ≧41）ペプチドに対して特異的な結合物質；及びＡβ（ｘ−≦40）ペプチドに対して特異的な結合物質を含む。もう１つの態様において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つのＡβ（ｘ −≧41）ペプチド、及び全Ａβ又は少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドのいづれかをサンドイッチイムノアッセイにより特異的に検出するためのキットを提供する。キットは、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を検出するための少なくとも２つの異なった結合物質；及び全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を測定するための少なくとも２つの異なった結合物質を含む。もう１つの態様において、本発明は、ある化合物が非ヒト哺乳類により生成される少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を変更し、そして非ヒト哺乳類に生成される全Ａβ又は少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドのいづれかの量を変更するかどうかを決定するための方法を提供する。前記方法は、アルツハイマー病のモデルとして使用される非ヒト動物からのサンプルにおけるＡ β（ｘ−≧41）ペプチドの第１量を測定し；非ヒト動物からのサンプルにおける全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの第１量を測定し；非ヒト動物に化合物を投入し；非ヒト動物からのサンプルにおけるＡβ（ｘ −≧41）ペプチドの第２量を測定し；非ヒト動物からのサンプルにおける全Ａβ 又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの第２量を測定し；そして前記第１量と前記第２量とを比較することを包含する。前記比較は、化合物がＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を高めるか、低めるか又はそのままにするか、そしてＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を高めるか、低めるか、又はそのままにするかどうか示す。ある態様において、非ヒト動物はゲッ歯動物、特にマウスである。非ヒト動物は、Hardy 突然変異(たとえばV717F)、又はヒトβ−アミロイド前駆体タンパク質(APP)のスウェーデン突然変異をコードする発現可能なトランスジーン配列のコピーを有することができる。図面の簡単な説明図１は、捕獲抗体として2G3を有するＡβ（１−４０）及びＡβ（１−42）の標準曲線を示す。図２は、捕獲抗体として21F12を有するＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）の標準曲線を示す。図３は、化合物MDL28170がβAPP代謝に影響を及ぼすことを示す。（０）未処理のK695sw細胞；(200)追跡期間の間、200μＭのMDL28170により処理されたK695 ew細胞。レーンｌ，２：ゲル上で直接的移動する合計の追跡培地のアリコート。レーン３，４：追跡培地の抗体1736免疫沈殿。レーン５，６：追跡培地の抗体19 2sw免疫沈殿。β−切断APP（レーン５，６）は、予測されるように、α−切断AP P(レーン３，４)よりもわずかに下に移動する。レーン７，８：細胞溶解物の抗体Ｃ７免疫沈殿。レーン９，10：細胞溶解物の抗体1282免疫沈殿。図４Ａ−４Ｂ。Ａβ（42）及びＡβ(40)形成の示差阻害。（Ａ）ラベルされた K695sw細胞を示される濃度のMDL28170により追跡し、そして追跡培地を21F12(上方パネル)、続いて抗体1282（下方パネル）により沈殿せしめた。（Ｂ）ホスホイメージングによる追跡培地中のＡβ及びｐ３に対する200μＭのMDL28170の効果の定量化。棒は、未処理の対照(100％で設定される）に比較しての相対的ピクセル数を示す。未処理の対照に対するＡβtotal及びp3totalの低下は有意であり（^*）(両側ｔ−検定、ｎ＝４、ｐ＜0.001)、そしてMDL28170による処理に基づいてのＡβ（42）及びｐ３（42）の低下は有意性に達しなかった。Ａβ（42）レベル対合計Ａβレベルの低下の差異は有意である（両側ｔ−検定、ｎ＝４、ｐ＜0. 01）。ｐ３（42）対合計ｐ３の阻害性における差異はまた有意である（両側ｔ− 検定、ｎ＝４、ｐ＜0.05）。図５Ａ−５Ｆ。種々の条件下でのK695sw細胞によるＡβ生成の示差阻害性。（Ａ）ｌμＭのPDBu（Ｐ）による処理はＡβ（42）及びＡβtotalの両者を低める。上方パネル：抗体21F12沈殿、下方パネル：続く抗体1282沈殿。（Ｂ−Ｅ）K69 5sw細胞を(Ｍ)200μＭのMDL28170により又は(Ｏ)200μＭのMDL28170なしに追跡し、そして追跡培地を（Ｂ）最初に抗体BC05（上方パネル）及び次に抗体1282（下方パネル）により；（Ｃ）最初に抗体Ｃ42（上方パネル）及び次に抗体1282（下方パネル）により；（Ｄ）抗体2G3（上方パネル）及び次に抗体21F12(下方パネル)により；（Ｅ）２種のアリコートに培地を分けた後、抗体21F12(上方パネル)又は抗体1282（下方パネル）により免疫沈殿せしめた。（Ｆ）細胞を100μＭのMDL28170の存在下で３時間ラベルし、そして培地を、最初に抗体21F12(上方パネル)及び次に、抗体1282（下方パネル）により免疫沈殿せしめた。図６Ａ−６Ｃ。異なった細胞型におけるＡβ生成の示差阻害性。³⁵Ｓ−メチオニンによりラベルされた細胞を、示される濃度のMDL28170により追跡し、そして抗体21F12(上方パネル)、続いて抗体1282（下方パネル）により沈殿せしめた。（Ａ）V717F細胞。比較的低いAPP発現が薄いＡβ42バンドを導びく。（Ｂ）CHO6 95細胞。CHO細胞において、ｐ３バンドは、Koo and Squazzo，（1994）“Eviden ce that production and release of amyloid β-protein involves the endoc ytic pathway.”J.Biol.Chem．269:17386-17389により記載されるように、ダブレットとして移動することを注目すること。（Ｃ）SKN695細胞。Ａβ（42）及びｐ３（42）は200μＭのMDL28170でわずかに高められるが、Ａβtotal及びp3tota lは低められる。図７は、いくつかの既知のAPPのタンパク質分解プロセッシング経路の要約したスケッチを示す。図８Ａは、KPI及びOX-2エキソンの選択的スプライシングを可能にする組合せのcDNA／ゲノムコード配列の図示である。図８Ｂは、位置717で突然変異を担持し、そしてKPI及びOX-2エキソンの選択的スプライシングを可能にする組合せのcDNA／ゲノムコード配列の図示である。図９。APPスプライシングカセット及びPDAPPベクターを構成するために使用される中間構造体の図示。図10Ａ−Ｄ。APP770のDNA配列（配列番号２）及び推定されるアミノ酸配列（配列番号３）。図11。PDAPP構造体に存在するAPPのゲノム領域の図。元のイントロン６，７及び８のサイズ、及び最終イントロンのサイズが図に示されている。PDAPP構造体に存在するイントロン６及び８における欠失の位置がまた示される。図12。PDAPPベクター、すなわち組合せのcDNA／ゲノムAPP構造体の図解地図。図13Ａ−13Ｄは、例VIIIに記載される脳細胞培養方法を用いてのいくつかの化合物によるＡβの％阻害率を示す。グラフは、全Ａβの阻害率（“％Ａβ阻害率 ”）、Ａβ（42）の阻害率（“％1−42阻害率”）及びMTTの代謝の阻害率（“％ MTT阻害率”）を示す（より高い阻害率は、より高い細胞毒性を示す）。発明の特定の記載Ｉ．定義用語“結合物質”とは、分析物（抗原）を特異的に結合し、そして認識する、免疫グロブリン遺伝子又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそれらのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを言及する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプリロン、及びミュ不変領域遺伝子及び無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を包含する。抗体は、たとえば損なわれていない免疫グロブリンとして、又は種々のペプチダーゼによる消化により生成される多数の十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。これは、たとえば Fab’及び F(ab)’フラグメントを包含する。用語“ 結合物質”とは、本明細書において使用される場合、また、完全な抗体の修飾により生成される抗体フラグメント、又は組換えDNA方法を用いて新しく合成された抗体フラグメントを包含する。用語“イムノアッセイ”とは、分析物を特異的に結合するために結合物質を利用するアッセイである。イムノアッセイは、単離物を単離し、標的化し、そして／又は定量化するためへの特定抗体の特異的結合性質の使用により特徴づけられる。結合物質は、その結合物質が異種集団のタンパク質及び他の生物学的物質の存在下でタンパク質の存在を決定する結合反応において機能する場合、タンパク質 “に特異的に結合し”又は“それと特異的に免疫反応する”。従って、企画されたイムノアッセイ条件下で、特定された結合物質は、特定のタンパク質に選択的に結合し、そしてサンプルに存在する他のタンパク質に有意な量で結合しない。そのような条件下でのタンパク質に対する特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択される抗体を必要とする。種々のイムノアッセイ型が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する結合物質を選択するために使用され得る。たとえば、固相 ELISAイムノアッセイは通常、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために使用される。Harlow and Lane （1988） Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Pablication s，New Yorkを、特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ型及び条件の記載のためには参照のこと。 “ラベル”は、分光学、光化学、生化学、免疫化学又は化学的手段により検出できる組成物である。たとえば、有用なラベルは、³²Ｐ、螢光染料、電子密集試薬、酵素（たとえば、ELISAに通常使用されるようなもの）、ビオチン、ジオキシゲニン、又はヘプテン、及び抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるタンパク質を包含する。結合物質は、たとえば放射性ラベルをペプチド中に組込むことによって検出可能になされ得、そしてペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用され得る。ラベルはしばしば、測定できるシグナル、たとえば放射能、螢光又は酵素活性（結合されたラベルの量を定量化するために使用される）を生成する。 II．インビトロスクリーニングアルツハイマー病は、脳に、アミロイドプラークの形でのＡβ（ｘ−≧41）の初期沈着により特徴づけられる。従って、ADのための効果的な処置は、それらのペプチドの生成を低めることが予測されるが、ところがその疾病の進行を促進する物質がペプチドの生成を高めると予想される。従来のスクリーニング方法は、全Ａβを低める化合物を見出した。しかしながら、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドは全Ａβのうち少ない割合であるので、それらのアッセイは、その化合物がＡβ（ｘ−≧41）ペプチドを特異的に阻害するかどうかを決定できなかった。本明細書に記載される結果が示すように、化合物は、Ａβ（ｘ−≦40）の生成を変更するが、しかしＡβ（ｘ−≧41）の生成は変更しない。Ａβ（42）は栄養プラークの主要成分であるので、Ａβ（ｘ−≦40）ペプチドの他に、又はその代わりにＡβ （ｘ−≧41）ペプチドの生成を特異的に阻害する化合物を同定することが有用である。従って、本発明は、細胞によるＡβ（ｘ−≧41）の量の生成を特異的に高めるか又は低める化合物、及びＡβ（ｘ−≧41）及びＡβ(ｘ−≦40)(たとえば、全Ａβ)、又はそれらのペプチドの１つ又は他のペプチドの生成を高めるか又は低める化合物をスクリーニングするための方法を提供する。Ａβ（ｘ−≧41）の生成を低める化合物は、前記疾病の処置への使用のための候補体であり、そしてその生成を高める化合物はその疾病を促進し、従って、ヒトにより回避されるべきである。細胞により生成されるＡβ（ｘ−≧41）の量を、試験化合物が特異的に変更するかどうかを決定するための本発明のスクリーニング方法は、前記化合物を細胞、通常培養物における細胞に投入し、細胞により特異的に生成されるＡβ（ｘ− ≧41）の量を測定し、そしてこの量が、細胞が前記化合物の不在下で生成することが予測される量よりも多いか、少ないか又は同じであるかどうかを決定することを包含する。その量が異なる場合、化合物は細胞によるＡβ（ｘ−≧41）の生成に影響を及ぼす。この量は、たとえば培養物、たとえば培養物における細胞により条件づけられた培地からのサンプルにおいて、又は培養物から収穫された細胞に由来する抽出物において、測定され得る。予測される量は一般的に、化合物の不在下で細胞により生成されるＡβ（ｘ− ≧41）を測定することによって決定される対照量であろう。しかしながら、また、推定により、すなわち異なった量の化合物の細胞への投与に基づいて生成されるＡβ（ｘ−≧41）の量を測定し、そして予測される量を計算するためにそれらの測定値を用いることによって予測される量を決定することができる。ある場合、比較目的のための対照量の測定は、Ａβ（ｘ−≧41）生成に対する化合物の効果が明確であるので、必要ではない。たとえば、化合物が検出できる量を通常生成する細胞においてＡβ（ｘ−≧41）を検出できなくし、このことは、その化合物がその不在下で予測される量からＡβ（ｘ−≧41）の生成を低めることを示す。もう１つの観点においては、本発明は、化合物が細胞によるＡβ（ｘ−≧41）の生成を、それがその細胞による合計Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）の生成を変更するよりも異なった程度に、変更するかどうかを決定するためのスクリーニング方法を提供する。それらの方法は、化合物が、合計Ａβの他にＡβ（ｘ−≧41）の生成を変更し、又はＡβ（ｘ−≧41）及びＡβ（ｘ−≦40）の１つ又はそれら以外のものの生成を変更するかどうかを決定するために有用である。前記方法は、化合物を細胞（通常、培養物における）に投入することを包含する。次に、化合物が特に細胞によるＡβ（ｘ−≧41）の生成を変更する程度が決定される。化合物が細胞による全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）の生成を変更する程度もまた決定される。次に、それらの程度が比較される。比較は、化合物がＡβ（ｘ−≦40）の代わりに又はその他に、Ａβ（ｘ−≧41）の生成を変更するかどうかを示す。化合物が１つのペプチド又は他のペプチドの生成を変更する程度の決定は一般的に、培養物からのサンプルにおけるペプチドの特定量を決定し；そしてそれと、化合物が投入されていない、細胞を含んで成る培養物からのサンプルに予測される量とを比較することを包含する。 III．アミロイド−βペプチド、及び関連するタンパク質及びペプチド APPのための種々の細胞プロセッシング経路が図７に示されている。用語“ アミロイド−βペプチド”、“Ａβ”又は“βAP”とは、本明細書において使用される場合、AD、Down症候群、HCHWA-D及び何人かの正常な老人対象の脳における大脳及び髄膜の小さな血管におけるアミロイド沈着物（アミロイド血管障害）及び老人性（アミロイド）プラークを含んで成るアミロイド線維のサブユニットを形成する約4.2kDのタンパク質を言及する。Ａβは線状ポリマー形で存在することができる（この形で、それは、それに関連して記載されるアミロイドのコンゴレッド及びチオフラビン−Ｓ染色−結合特性を示す）。Ａβはまた、脳組織において非線維形で存在することができ（“プレアミロイド”又は“非晶質”又は “分散”沈着物）、この形で、コンゴレッドによる複屈折染色は生じない。髄膜血管から得られる不溶性形でのこのタンパク質の一部が、アメリカ特許第4,666, 829号に記載されている。Ａβは、ヒト染色体21の長いアーム上の遺伝子によりコードされる、β−アミロイド前駆体タンパク質(APP)として言及される、大きな膜−スパンの糖タンパク質の約39〜43個のアミノ酸のフラグメントである。43個のアミノ酸よりも大きなＡβの形もまた、本明細書において考慮される。Ａβはさらに、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)におけるその相対的移動性により特徴づけられる。Ａβの43−アミノ酸バージョンの配列は、次の通りである：1 Asp Ala Glu Phs Arg His Asp Ser Gly Tyr 11 Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 21 Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala 31 Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 41 Ile Ala Thr (配列番号１)．本明細書において使用される場合、Ａβはまた、Ａβの関連する多形、たとえばAPP遺伝子のＡβ領域における突然変異に起因する多形も言及する。用語“Ａβフラグメント”とは、本明細書において使用される場合、哺乳類細胞により低濃度で生成される、Ａβのフラグメント及び分解生成物を言及する。特定のＡβフラグメントは、約３kDの分子量を有し、そして現在、たとえばＡβ のアミノ酸残基３−34，６−27，６−34，６−35，６−42，11−34，11− 40，11−43，12−43，17−40及び17−42を有するペプチドを含むと思われる(Vig o-Pelfreyなど．（1993）J.Neurochem．61:1965-1968)。本明細書において使用される場合、用語“Ａβ（ｘ−≧41）”とは、アミノ末端がＡβのアミノ酸番号１で又はその後に開始し（すなわち、アミノ末端切断されている）、そしてカルボキシ末端がアミノ酸番号40 以上に延長するＡβ又はＡβフラグメントを言及する。それらのペプチド及びフラグメントは、異種グループを含んで成る。たとえば、Ａβ（６−42），Ａβ（ 11−43）及びＡβ（12−43）はすべて、CSFに見出されている。しかしながら、この列挙は排他的ではない。前記グループ間からの他のペプチドは、APPを発現する細胞の培養物培地に存在することが推定され、そして本明細書に記載される方法により検出できる。本明細書に記載される場合、用語“Ａβ（42）”とは、Ｃ−末端アミノ酸がＡβの第42番目であるＡβ又はＡβフラグメントを言及する。本明細書で使用される場合、用語“Ａβ（ｘ−≦40）”とは、アミノ末端がＡ βのアミノ酸番号１で開始し、又はアミノ末端切断されており、そしてカルボキシ末端がアミノ酸番号40以上に延長しないＡβ又はＡβフラグメントを言及する。用語“Ａβ（40）”は、Ｃ−末端アミノ酸がＡβの第40番目であるＡβ又はＡ βフラグメントを言及する。本明細書において使用される場合、用語“ｐ３”とは、アミノ酸配列がＡβに実質的に類似するが、しかしアミノ末端のアミノ酸がＡβのアミノ酸17で開始するペプチドを言及する。用語“ｐ３フラグメント”とは、本明細書において使用される場合、ｐ３のフラグメント及び分解生成物を言及する。ｐ３はＡβとは異なったプロセッシング経路を通して生成されるが、本発明の検出方法のためには、ｐ３及びｐ３フラグメントは、カルボキシ末端からＡβのみを認識する一定の検出技法がまた一般的に、ｐ３を認識するであろうから、Ａβペプチドのサブセットであると思われる。また、同じ明らかな機構がｐ３及びＡβカルボキシ末端を生成することが示されている。用語“Ａβ連結領域”とは、本明細書において使用される場合、APPのタンパク質分解プロセシングのための主要標的物である、アミノ酸残基16と17(Lys¹⁶と Leu¹⁷)との間の部位に中心を置かれたＡβの領域を言及する。“α−分泌”プロセッシングとして言及されるそのようなプロセッシングは、たとえば、Ａβのアミノ酸16で終結し、そして従って、本発明の方法に使用される予定である損なわれていないＡβ分子に対する抗体と免疫学的に交差反応する種々のAPPフラグメントをもたらす。アミノ酸残基13−28を包含する合成ペプチドに対して生ぜしめられた抗体は、連結領域に対する必要な特異性を示すことが見出された。用語“アミロイド−β前駆体タンパク質”(APP)は、本明細書において使用される場合、染色体21の長いアーム上にヒトにおいて位置する同じ名称の遺伝子によりコードされ、そしてそのコード領域の第３カルボキシ内のＡβ領域を包含するポリペプチドとして定義される。APPは、多くの哺乳類組織における広範囲の種類の細胞において発現される、グリコシル化された単一膜−スパンニングタンパク質である。ヒトにおいて現在、存在することが知られている APPの特定イソタイプの例は、Kangなど．（1987）Nature 325:733-736により記載される695個のアミノ酸のポリペプチド；Ponteなど．（1988）Nature 331:525-527及びTanzi など．（1988）Nature 331:528-530により記載される751個のアミノ酸のポリペプチド；及びKitaguchiなど．（1988）Nature 331:530-532により記載される770 個のアミノ酸のポリペプチドである。APPの特定の変異体の例は、位置及び得られる神経病理学的表現型の両者において異なることができる点突然変異体を包含する（既知の変異体突然変異のためには、Hardy（1992）Nature Genet．1:233-2 34を参照のこと）。用語“Ａβ−関連状態”とは、本明細書において使用される場合、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病を包含する）、Dow's症候群、HCH WA-D及び脳の進行した老化として定義される。 IV．Ａβ（ｘ−≧41）を発現する細胞Ａβ（ｘ−≧41）の生成を阻害する化合物を発見することが治療目的であるので、本発明の方法に使用される試験細胞は一般的に、Ａβ（ｘ−≧41）を分泌できる細胞である。適切な細胞培養物からのならし培地におけるＡβ（ｘ−≧41）レベルのインビトロモニターが、薬物スクリーニングのために使用され得る。培養物培地中へのＡβ（ｘ−≧41）の分泌をもたらす条件下で細胞を増殖し、そしてその細胞を試験化合物に暴露することによって、Ａβ（ｘ−≧41）分泌に対するそれらの試験化合物の効果を観察し得る。適切な細胞系は、ヒト及び動物細胞系、たとえば、好ましくは、一次ヒトニューロン及びヒトAPP遺伝子を有するトランスジェニックマウスからの一次ニューロン、たとえばトランスジェニックPDAPP動物（たとえばマウス）からの細胞、並びに、293ヒト腎細胞系、ヒト神経膠腫細胞系、ヒトHeLa細胞系、一次内皮細胞系（たとえばHUVEC細胞）、一次ヒト線維芽細胞系又は一次リンパ芽球系(APP 突然変異を有する患者に由来する内因性細胞を包含する)、一次ヒト混合脳細胞培養物（ニューロン、星状細胞及び神経膠を包含する）、又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系を包含する。突然変異V717I(APP770番号付けシステムにおける位置717でのバリンからイソロイシンへの変化)を担持するAPP₆₉₉により安定してトランスフェクトされた細胞が特に有用である。Ａβ（ｘ−≧41）のレベル又は割合を選択的に高める細胞系が、本発明の方法において特に有用である。位置717での有用な変異体(Hardy突然変異)は、V717F，V717I又はV717Gを包含する。Ａβを過剰生成する、APP変異体を発現できる細胞系が、本発明の薬物スクリーニング方法への使用のために好ましい。“過剰生成する”とは、変異体APPから生成されるＡβの量が、正常なAPPアイソフォーム、たとえば前で記載された6 95，751及び770個のアミノ酸のアイソフォームのいづれか又はすべてから生成される量の少なくとも約1.5倍及び好ましくは少なくとも２又は５倍であろうことを意味する。Ａβ切断部位のアミノ末端で１又は複数のアミノ酸置換を有するAP P変異体が特に好ましい。たとえば、スウェーデンFAD家族に見出される二重突然変異Lys⁵⁹⁵→Asn⁵⁹⁵及びMet⁵⁹⁶→Leu⁵⁹⁶(695の番号付けシステム))を担持するAP P₆₉₅DNAを発現するK293細胞は、正常なAPPを発現する細胞よりもＡβを約５〜８倍、生成する(Citronなど．（1992）Nature，360:672-674)。残基596での突然変異は、その上昇を主として担当できると思われる。Ｖ．APP のための発現ベクター APPをコードする組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞は、本発明のスクリーニング方法における細胞として有用である。APPをコードする配列を担持するプラスミドは、pCMV695である（Selkoeなど．（1988）Pro c.Natl.Acad.Sci．USA 85:7341-7345）。 APPをコードする核酸は、当業界において知られている方法により得られる。たとえば、APPをコードする核酸は、APPのDNA配列に基づくプライマーを用いて、ヒト脳cDNAライブラリ−又はヒトゲノムライブラリーからのcDNA又はゲノム DNAのポリメラーゼ鎖反応により単離され得る。PCR方法は、たとえばアメリカ特許第4,683,195号；Mullisなど．（1987）Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol ．51:263；及びErlich，ed.，PCR Technology，（Stockton Press，NY，1989）に記載される。 APPの変異型、たとえばスウェーデン人突然変異は、APPをコードする他の核酸の部位特異的突然変異誘発により、又は0.1mMのMnCl及び不均衡にされたヌクレオチド濃縮物により元のポリヌクレオチドのPCRの誤差割合を高めることによって引き起こされるランダム突然変異誘発により行なわれ得る。発現ベクターの構成、及びトランスフェクトされた細胞における遺伝子の発現は、当業界においてまた十分に知られている分子クローニング技法の使用を包含する（Sambrookなど.，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，（1989）及びCurrent Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubelなど.，eds.，（Current Protocols，a jo int venfure between Greene Publishing Associates， Inc．and John Wiley & Sons，Inc）を参照のこと）。興味あるポリペプチドの発現をコードする配列により細胞をトランスフェクトするために使用される核酸は一般的に、ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列に操作可能的に連結される発現制御配列を包含する発現ベクターの形で存在するであろう。本明細書において使用される場合、用語、ポリヌクレオチド“の発現をコードする”ヌクレオチド配列とは、mRNAの転写及び翻訳に基づいて、ポリペプチドを生成する配列を言及する。当業者が認識するように、これは、同じアミノ酸配列をコードするすべての変性核酸配列を包含する。本明細書で使用される場合、用語、“発現制御配列”とは、操作可能的に連結される核酸配列の発現を調節する核酸配列を言及する。発現制御配列は、その発現制御配列が転写、及び核酸配列の翻訳を制御し、そして調節する場合、核酸配列に“操作可能的に連結される”。従って、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン(すなわちATG)、イントロンのためのスプライシングシグナル、mRNAの正しい翻訳を可能にするための遺伝子の正しい読取り枠の維持、及び停止コドンを含むことができる。組換え核酸は、その組換え核酸に操作可能的に連結される発現制御配列を含んで成る発現ベクター中に組込まれ得る。発現ベクターは、適切なプロモーター、複製配列、マーカー等の包含により、原核生物又は真核生物における機能のために適合され得る。発現ベクターは、組換え核酸の発現のために宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。宿主細胞は、タンパク質を精製するために、高レベルの発現について選択され得る。宿主細胞は、細胞により生成される酵素の活性を研究するために選択される原核又は真核細胞であり得る。細胞は、たとえば培養された細胞、又はインビボでの細胞であり得る。本発明において有用なトランスフェクトされた宿主細胞は、ヒト腎293細胞系、たとえばK695sw及びK695⁷³⁷³、神経膠腫、たとえばHS695、及び神経芽細胞系、たとえばSKN695を包含する（それらは、実験セクションに記載される）。 VI．Ａβ（ｘ−≧41）の測定Ａβペプチドは、当業界において知られているいづれかの方法により検出され得る。好ましくは、前記方法は、ペプチドに対して特異的な結合物質を用いるイムノアッセイを包含する。たとえばHPLC又は質量分析法によりＡβペプチドのサイズを決定することにより、それらのペプチドを検出することができる。Ａ．結合物質本発明のスクリーニング方法の１つの段階は、サンプルにおける少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を、特異的に測定することを包含する。Ａβ （ｘ−≧41）ペプチドの測定とは、Ａβ のより短い種、すなわちカルボキシ末端がＡβのアミノ酸第40よりもさらに延長しないそれらの種とＡβ（ｘ−≧41）ペプチドとを区別するためにその分子を測定することを特に意味する。Ａβ（ｘ−≧41）の特異的測定は好ましくは、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドを特異的に認識する結合物質、たとえばアミノ酸番号40以上のＡβのアミノ酸を認識する結合物質により実施される。本発明のもう１つの方法は、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチド及び全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの両者の生成を変更する化合物の能力を決定するためにそれらの化合物をスクリーニングすることを包含する。そのような方法は、Ａβ（ｘ −≦40）ペプチドと、Ａβのより長い種、たとえばＡβ（ｘ−≧41）ペプチドとを区別できる結合物質の使用を包含する。Ｂ．イムノアッセイ免疫学的検出技法、すなわち結合物質を使用するイムノアッセイの使用が好ましい。特に適切な検出技法は、ELISA、ウェスターンブロット、ラジオイムノアッセイ、及び同様の技法を包含する。単一の抗体を使用する適切な免疫学的方法はまた、Ａβの≧41形に対して特異的な抗体を使用するラジオイムノアッセイ、又は単一抗体のELISA方法を包含する。そのような方法により検出されるＡβの特定の形が、使用される特定の結合物質に依存することは明確であろう。たとえば、連結領域に向けられた結合物質は、そのアミノ末端がＡβのアミノ酸番号１まで延長しないＡβ（ｘ−≧41）ペプチドを検出することができる。また、Ａβ （ｘ−≧41）のカルボキシ末端に向けられた結合物質は、アミノ酸41，42又は43 で終結するペプチドを検出することができる。従って、結合物質の特異性の決定は、アッセイが検出するＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの正確な決定を助けるであろう。１つの態様においては、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドを検出するための方法は、２種の抗体を包含するイムノアッセイである。１つの抗体はＡβにおける番号40 以上のアミノ酸を含むエピトープに対して特異的であり、そしてもう１つの抗体は、サンプルに見出される他のAPPフラグメントとＡβ及びＡβフラグメントとを区別することができる。特に、Ａβの連結領域に対して単特異的である抗体がＡβと他のAPPフラグメントとを区別できることが見出された。Aβの連結領域は、アミノ酸残基16及び17に中心を置き、典型的には、アミノ酸残基−13〜−28に及ぶ。そのような“連結−認識”抗体は、免疫原としてその配列を有する合成ペプチドを用いて調製され得る。好ましいイムノアッセイ技法は、２−部位又は“サンドイッチ”アッセイである。このアッセイは、通常固相に結合される捕獲結合物質、及びラベルされた検出結合物質を含む。この方法においては、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドが、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的な第１結合物質（通常、固相に結合される）を用いてサンプルから捕獲される。Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの捕獲は、Ａβに対して特異的なラベルされた結合物質を用いて検出される。ラベルされた結合物質は、たとえば連結領域に向けられる物質（アミノ酸−13〜−28）又はアミノ末端アミノ酸に対して特異的な結合物質（１−５又は１−12）を含む。そのような抗体を調製し、そしてそのような抗体を典型的なELISAに利用するための特定の方法が、この後の実験セクション及び関連するアメリカ特許出願07 ／965,972号に示されている。連結領域に対する抗体を用いるサンドイッチアッセイが、アミノ末端がＡβのアミノ酸13の前で開始するＡβ及びＡβフラグメントを特異的に測定するために使用され得る。そのようなアッセイは、それらのペプチドがＡβのアミノ酸第17で始まるので、ｐ３又はｐ３フラグメントを認識しない。Ａβ（ｘ−≧41）に対して特異的な、すなわちＡβ（≦40）と交差反応しない抗体が、本発明の方法において特に有用である。それらの抗体は、Ａβの番号40 以上のアミノ酸を含む合成ペプチドにより動物を免疫化することによって製造され得る。たとえば、合成ペプチドは、アミノ酸33−42を含むことができる。そのような抗体の生成の特定の例が、実験セクションに提供されている。すべてのＡβ（ｘ−≧41）のグループ間から測定される特定のペプチドは、使用される特定の測定方法に依存する。結合物質、たとえば抗体を用いる場合、結合物質はペプチドのグループ間の１又は複数のグループに向けられ得る。たとえば、Ａβ（１−４０）と交差反応しないＡβのアミノ酸33−42に対して生ぜしめられた抗体が、Ａβ（ｘ−４２）に結合するであろう。それはまた、Ａβ（ｘ− ４１）及びＡβ（ｘ−４３）に結合することができる。本発明の１つの態様によれば、前記方法は、Ａβの少なくともアミノ酸13−41を有するＡβ（ｘ−≧41）の量を決定することを包含する。それらの種は、連結領域（アミノ酸13−26）を認識する抗体、及びＡβアミノ酸33−42を有するヘプテンによる免疫化により生成される抗体を用いるサンドイッチアッセイを用いて測定され得る。全Ａβは、連結領域に対する捕獲抗体（たとえば、本明細書に記載される２６６抗体）、及びＡβペプチド及びＡβフラグメントの実質的にすべてを検出すべきであるレポーター抗体、たとえばＡβのアミノ酸１−12に対して生ぜしめられた抗体を用いて測定され得る。Ｃ．パルス−追跡アッセイサンプル中のＡβ（ｘ−≧41）の量を測定するもう１つの方法は、パルス−追跡方法を包含する。それらの方法においては、培養物が、タンパク質のための放射性ラベル、たとえば放射性アミノ酸、たとえば³⁵Ｓメチオニンによりパルスされる。次に、培養物がラベルなしに追跡される。次に、化合物が細胞に投入される。次に、細胞がＡβ（ｘ−≧41）に対して特異的な結合物質と接触せしめられ、そして結合物質に結合される放射性ラベルの量が決定される。Ｄ．抗体の調製Ａβに対して特異的な抗体は、たとえばアミノ酸配列がＡβのアミノ酸−13〜 28に対応するペプチドにより動物を免疫化することによって調製され得る。Ａβ （ｘ−≧41）に対して特異的な抗体は、たとえばアミノ酸配列がＡβのアミノ酸 33−42に対応するペプチドにより動物を免疫化することによって調製され得る。Ａβ（ｘ−≦40）に対して特異的な抗体は、たとえばアミノ酸配列がＡβのアミノ酸33−40又は28−40と反応するペプチドにより動物を免疫化することによって調製され得る。連結領域に対する抗体は、全Ａβを検出するために有用である。合成ポリペプチド、ハプテンは、アミノ酸が増殖する鎖に連続して付加される良く知られているMerrifield固相合成技法により生成され得る（Merrifield（19 63）J.Am.Chem.Soc．85:2149-2156）。適切なペプチドハプテンは通常、Ａβ内の少なくとも５個の隣接した残基を含んで成り、そして６個以上の残基を包含する。アミノ酸配列は、上記に示されるＡβの配列に基づかれ得る。十分な量のポリペプチドハプテンが得られるとすぐに、それは、Hudson and H ay，Practical Immunology，Blackwell Scientific Publications，Oxford，Cha pter 1，3，1980に一般的に記載のようにして、適切な免疫原性キャリヤー、たとえば血清アルブミン、キーホールリンペット（Keyhole limpet）ヘモシアニン、又は他の適切なタンパク質キャリヤーに結合され得る。下記例に使用される典型的な免疫原性キャリヤーはα−CD3ε抗体（Boehringer-Mannheim，Clone No.1 45-2C11）。所望するエピトープに対して特異的な抗体は、インビトロ、又はインビボ技法により生成され得る。インビトロ技法は、リンパ球の免疫原への暴露を包含し、そしてインビボ技法は適切な脊椎動物宿主中への免疫原の注入を必要とする。適切な脊椎動物宿主は、非ヒト、たとえばマウス、ラット、ウサギ、羊、ヤギ、及び同様のものを包含する。免疫原は、予定されたスケジュールに従って、動物中に注入され、そして動物が定期的に放血され、そして連続的な放出は改良された力価及び特異性を有する。注入は、筋肉内、腹腔内、皮下、又は同様の手段で行なわれ、そしてアジュバント、たとえば不完全フロイントアジュバントが使用され得る。所望には、モノクローナル抗体は、所望する特異性を有する抗体を生成できる不滅化された細胞系を調製することによって得られる。そのような不滅化された細胞系は、種々の手段で生成され得る。便利には、小さな脊椎動物、たとえばマウスが、上記方法により、所望する免疫原により過剰免疫化される。次に、脊椎動物が、最終免疫化の後、数日で殺され、肺臓細胞が除かれ、そして牌臓細胞が不滅化される。不滅化の態様は決定的ではない。現在、最とも共通する技法は、 Kohler and Milstein （1975） Nature 256:495-497により最初に記載されたように、骨髄腫細胞パートナーとの融合である。他の技法は、EBV形質転換、裸DNA 、たとえば腫瘍遺伝子、レトロウィルス、等による形質転換、又は、細胞系の安定した維持及びモノクローナル抗体の生成を提供するいづれか他の方法を包含する。モノクローナル抗体を調製するための特定の技法は、Antibodies:A Laborat ory Manual，Harlow and Lane，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，1988に記載されている。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体（抗血清）の他に、本発明の検出技法はまた、抗体フラグメント、たとえばF(ab)，Fv，V_L，V_H及び他のフラグメントを使用することができる。しかしながら、ポリクローナル抗体の使用においては、単一特異的抗体集団を生成するために標的エピトープに対する抗血清を吸着することが必要である。特許及び科学文献に現在十分に記載されるように、組換え的に生成された抗体（免疫グロブリン）及びその変異体を使用することもまた可能であろう。たとえば、EPO 8430268.0;EPO 85102665.8;EPO 85305604.2;PC T／GB85／00392;EPO 85115311.4；PCT／US86／002269;及び日本特許出願第85239 543号（それらの開示は引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。上記のようにして調製された抗体の結合特異性を模倣する他の組換えタンパク質を調製することもまた可能である。 VII．キット本発明はまた、本発明のアッセイを実施するためのキットを提供する。キットは、Ａβ（ｘ−≧41）を特異的に検出するための手段及びＡβ（ｘ−≦40）を特異的に検出するための手段を包含する。前記手段は、既知の又は上記のいづれかの手段、たとえば結合物質を包含することができる。１つの態様においては、キットは、Ａβ（ｘ−≧41）に対して特異的な結合物質（すなわち、Ａβ（≦40）と交差反応しない）、及びＡβ（≦40）に対して特異的な結合物質（すなわち、Ａβ（ｘ−≧41）と交差反応しない）を包含する。そのようなキットは、たとえばパルス−追跡アッセイにおいて有用である。もう１つの態様においては、キットは個々の抗原に対して２種の抗体を含むイムノアッセイのために有用である。たとえば、キットはさらに、Ａβの連結領域に対して特異的な結合物質を含むことができる。そのような抗体は、Ａβ（ｘ−≧41）及びＡβ（≦40）の両者の捕獲又は検出のために有用である。サンドイッチELISAのために有用な１つのキットにおいては、連結領域に対して特異的な結合物質は、固相に結合され、そしてＡβ （ｘ−≧41）及びＡβ（≦40）に対して特異的な結合物質が検出可能的にラベルされる。検出可能なラベルは、当業界において知られており、そして使用されるいづれかのもの、たとえばビオチニル化されたラベル、放射性ラベル、光散乱ラベル、酵素ラベル、螢光ラベル及び同様のラベルであり得る。ラベルが酵素的である場合、キットはさらに、酵素のための基質を含んで成る。 VIII．試験化合物試験化合物は、細胞又は動物生存性を実質的に妨害しないで、細胞培養物に添加され得又は試験動物に投与され得る、いづれかの分子、化合物又は他の物質であり得る。適切な試験化合物は、小さな分子（すなわち、その分子質量が1000ドルトンよりも多くない分子）、生物学的ポリマー、たとえばポリペプチド、ポリサッカリド、ポリヌクレオチド及び同様のものであり得る。試験化合物は典型的には、約１nM〜１mM、通常、約10μＭ〜１mMの範囲での濃度で培養物培体に投入されるであろう。試験化合物は典型的には、１ng／kg〜100mg／kg、通常10μｇ／kg〜１mg／kgの用量で投与されるであろう。Ａβ（ｘ−≧41）の分泌又は生成を阻害することができるこの化合物は、動物及びヒトにおけるβ−アミロイド生成を阻止する能力のさらなる決定のための修補体として考劇される。そのような化合物は、下記のように、インビボ研究により試験され得る。分泌又は生成の阻害は、アミノ酸42／43間でのＡβの分解がたぶん少なくとも部分的に阻止され、β−アミロイドプラークを形成するために利用できるＡβ（ｘ−≧41）の量を減じることを示す。 IX．インビボスクリーニング動物モデルは現在、アルツハイマー病を研究するために使用される。（たとえば、国際特許出願WO 93／14200、1993年10月27日に出願されたアメリカ特許出願 08／143,697号（Atty.docket 4.20、許可されている）、アメリカ特許第5,387,7 42号、及び1995年６月７日に出願されたアメリカ特許出願08／486,538号を参照のこと。）それらのモデルは、アルツハイマー病の経過に影響を及ぼす、すなわち病状を緩和し、そしてさらに悪化させるそれらの能力に関して、本発明のアッセイにおいてＡβ（ｘ−≧41）の生成を変更する化合物をスクリーニングするために有用である。トランスジェニック哺乳類モデル、より特定には、ゲッ歯動物モデル、及び特にネズミ、ハムスター及びテンジクネズミモデルが、この使用のために適切である。好ましい非ヒトトランスジェニック動物は、その細胞がPDAPP構造体を有する動物である。PDAPP構造体は、APPの発現をコードするcDNA−ゲノムDNAハイブリッドに操作可能的に連結される哺乳類プロモーターを含んで成る核酸構造体である。cDNA−ゲノムDNAハイブリッドは、APP770をコードするcDNA配列、又はAPP77 0及びゲノムDNA配列により置換された天然に存在する突然変異（たとえば、Hard y突然変異又はスウェーデン人突然変異）をコードするcDNA配列を含む。ゲノムD NA配列は、エキソン６及びスプライシングのために十分な量の隣接する下流のイントロン、KI及びOX-2コード領域及びスプライシングのために十分な量のそれらの上流及び下流のイントロンの個々、及びエキソン９及びスプライシングのために十分な量の隣接する上流のイントロン（APP770をコードするcDNA配列、又はAP P770及び天然に存在する突然変異をコードするcDNAの対応する領域中に置換される）から成る。その構造体は、哺乳類細胞において転写され、そして特異的にスプライスされ、コードし、そしてAPP695，APP751及びAPP770 中に翻訳されるmKNAが形成される。一定の態様においては、その構造体は、Hard y突然変異(V717F)を有するAPP遺伝子をコードするハイブリッド配列により操作可能的に連結されるPDGF−βプロモーター、及びSV40ポリアデニル化シグナルを含む。PDAPP構造体の１つの型が例IXに示されている。もう１つの有用な非ヒト動物モデルは、APPのスウェーデン人突然変異(アスパラギン⁵⁹⁵−ロイシン⁵⁹⁶)をコードする発現可能なトランスジーン配列のコピーを有する。前記配列は一般的に、天然に存在する内因性APP遺伝子（存在するなら）を通常発現する細胞において発現される。そのようなトランスジーンは典型的には、スウェーデン人突然変異APP発現カセットを含んで成り、ここで連結されるプロモーター及び好ましくは、エンハンサーが、スウェーデン人突然変異を含んで成る異種APPポリペプチドをコードする構造配列の発現を操作する。Ａβ レベルは、いづれかの体液又は組織サンプル、たとえば脳均質物において測定され得る。トランスジーン又は標的構造体を授精卵又は胚幹（ES）細胞中に、典型的にはマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、又はバイオリスティクス（biolistics）により導入することによって生成されるトランスジェニック動物が使用される。トランスジェニック動物は、典型的には脳組織において、トランスジーン（又は相同的に組換えられた標的構造体）のスウェーデン人突然変異APP遺伝子を発現する。好ましくは、１つ又は両者の内因性APP 対立遺伝子が不活性化され、そして野生型APPを発現することができない。すべての場合、試験化合物の不在下で試験動物におけるＡβ（ｘ −≧41）及び／又は全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）の生成レベルの特徴である対照値を得ることが必要であろう。動物が殺される場合、ヒトAPPのスウェーデン人変異体を発現するようトランスジェニック的に修飾されているが、しかしいづれかの試験化合物又はＡβ（ｘ−≧41）及び／又はＡβ又はＡβ（ｘ−≦40）の生成レベルに影響を及ぼすことが予測されるいづれか他の物質の投与を受けていない他の試験動物からの平均値又は典型的な値を基礎とする必要があろう。そのような対照レベルが決定されると、試験化合物が追加の試験動物に投与され、ここで平均対照値からの偏差は、試験化合物が動物においてγ−セクレターゼ活性に対する効果を有したことを示す。陽性と思われる、すなわちアルツハイマー病又は他のβ−アミロイド−関連症状の処置において有益であると思われる試験物質は、Ａβ（ｘ−≧41）の生成レベルを、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％及び最とも好ましくは少なくとも80％、減じることができる物質であろう。次の例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。実験Ｉ．抗体の調製Ａ．Ａβ連結領域に対するモノクローナル抗体Ａβの連結領域に対するモノクローナル抗体を、アミノ酸残基13〜30に及ぶ合成ペプチドを用いて調製し、但し、AI、すなわちアミノ酸30及び31は、GC（“連結ペプチド”）により置換された。連結ペプチドを、ｍ−マレイミドベンゾイル −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MHS)を用いて、製造業者（Pierce）の説明書に従って、免疫原(α−CD３ε抗体：クローンNo.145-2C11、Boehringer -Mannheim)に接合せしめた。Ａ／Ｊマウスを最初に、完全フロイントアジュバントと共に混合されるＡβ接合体により腹腔内（IP）免疫化した。14日後、マウスを、14日間隔で、リン酸緩衝溶液(PBS)と共に混合されるＡβ接合体によりIP追加免疫化した。合計６回の追加免疫化の後、マウスを最後に、不完全フロイントアジュバントと共に混合されるＡβ接合体により静脈内追加免疫化し、そして３日後、融合せしめた。p.653骨髄腫細胞との脾臓細胞の融合は、Oi and Herzenberg，Selectiv e Methods in Cellular Immunology，Mishell and Shigii，Eds.，W.H.Freeman and Company，San Francisco，Chapter 17 (1980)に記載のようにして実施された。血清力価及び初期スクリーンを、下記RIA方法により実施した。いくつかのクローンを、24−ウェルプレートに拡張し、そして下記のようにして追加の分析にゆだねた。興味あるクローンを、マウス腹水において生成した。血清流出物及び融合ハイブリドーマ上清液をスクリーンするために使用される RIA方法は、Wangなど．（1977）J.Immunol.Methods18:157-169により開発された方法に基づかれている。手短に言及すれば、上清液（又は血清）を、¹²⁵Ｉ−ラベルされたＡβ_1-28、及び単抗−マウスIgGが臭化シアンを通して結合されているSepharo した。個々のウェルからのビーズを、細胞収穫機によりガラス繊維フィルターディスク上に収穫し、そしてPBSにより数度、洗浄した。次に、フィルターディスクをγ管に移し、そして結合された放射能をγカウンターにより数えた。すべてのハイブリドーマを、初期スクリーンにおける上記方法を用いて、Ａβ_1-28 に対する結合について試験し、そして次に、３日後、再び試験した。Ａβ_1- ₂₈ 陽性クローンをさらに、上記RIA方法を用いて、¹²⁵Ｉ−ラベルされたＡβ_1-28 に対する反応性について特徴づけた。クローンはＡβ_1-28を結合することが見出されなかった。ペプチド捕獲ELISAにおいては、すべてのクローンは、Ａβ_13-28と反応することが見出されたが、ところがＡβ_17-28とは反応しなかった。従って、すべてのクローンは、アミノ酸16及び17に及ぶ連結領域内にエピトープを有することが決定された。上記アッセイの結果に基づいて、いくつかのクローンを24ウェルプレート中に拡張した。それらのクローンをさらに、飽和分析により特徴づけた。50％力価点（上記RIR方法により決定されるようなの¹²⁵Ｉ−ラベルされたＡβ_1-28、及び種々の量のラベルされていない連結ペプチド又はＡβ_17-28を含むウェルに添加した。50％阻害性についての冷ペプチドの濃度を、個々の抗体のために決定した。Ａβ_17-28に関しては、阻害性は、いづれのクローンについても100ng／ウェルで見出されなかった。連結ペプチドについての50％阻害点は、10〜80ng／ウェルの範囲であった。クローンをまた、ウェスターンブロットにより、反応性に基づいて特徴づけた。力価点、感度（50％阻害点により決定されるような）、及びウェスターンブロット上での反応性に基づいて、いくつかのクローンを腹水において生成した。266と称するハイブリドーマからの抗体（“266抗体”）を、下記アッセイにおいて捕獲抗体として使用するために選択した。ハイブリドーマ細胞を含むウェルからの上清液を、免疫沈殿(Notebook 1101) により溶液における¹²⁵Ｉ−ラベルされたＡβ_1->42を捕獲する能力を有する抗体についてスクリーンした。Ｂ．2G3 の生成Ａβ（ｘ−40）に対して特異的な抗体2G3を、注射当たり100μｇの免疫原により雌のＡ／Ｊマウスを腹腔内注射することによって生成した。免疫原は、マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて羊抗−マウスIgGに結合されるペプチドNH₂-Cys-NH-CH₂-(C H₂)₅-CO-GLMVGGVV-COOH（配列番号５）から成った。免疫原を、最初の免疫化のために、完全フロイントアジュバントにより乳化し、そしてすべての続く免疫化を、約２週間隔で、不完全フロイントアジュバントにより乳化された免疫原100 μｇにより行なった。融合の３日前、マウスを、50μｇの免疫原を含むPBS溶液により静脈内追加免疫化し、そしてPBS中、50μｇの免疫原により腹腔内追加免疫化した。マウスを殺し、脾臓を除き、脾臓細胞を単離し、そしてKoehler and Milsteinの方法の変法を用いて、SP２／０マウス骨髄腫により融合せしめた。ハイブリドーマ細胞を含むウェルからの上清液を、ELISAプレート上に被覆されたＡβ（１−40）を認識する抗体を生成する能力についてスクリーンした。“ 陽正体”を、免疫沈殿により、溶液における¹²⁵Ｉ−Ａβ（１−40）を捕獲するそれらの能力についてさらにスクリーンした。Ｃ．21F12 の生成Ａβ（ｘ≧41）に対して特異的な抗体21F12を、注射当たり100μｇの免疫原によりＡ／Ｊマウスを腹腔内注射することによって生成した。免疫原は、マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(MHS)を用いて羊抗−マウスIgG に結合される合成ペプチドNH₂-Cys-NH-CH₂-(CH₂)₅-CO-GLMVGGVVIA-COOH（配列番号４）から成る。免疫原を、最初の免疫化のために、完全フロイントアジュバントにより乳化し、そしてすべての続く免疫化を、約２週間隔で、不完全フロイントアジュバントにより乳化された免疫原100μｇにより行なった。融合の３日前、マウスを、50μｇの免疫原を含むPBS溶液により静脈内追加免疫化し、そしてPBS中、50μｇの免疫原により腹腔内追加免疫化した。注射後３日目に、マウスを殺し、脾臓を除き、脾臓細胞を単離し、そしてKo ehler and Milsteinの方法の変法を用いて、SP２／０マウス骨髄腫により融合せしめた。Ｄ．2G3 及び21F12の特異性抗体2G3及び21F12の特異性が図１及び２に示されている。このアッセイにおいては、抗体2G3又は21F12を、精製された抗体をウェル−被覆緩衝液（0.01ＭのPO₄ 、pH 8.5）において10μｇ／mlの濃度に希釈し、そしてその抗体溶液100μｌを個々のウェル中にピペットで入れることによって、ELISAプレートのウェル中に積層した。前記溶液を室温で一晩放置し、そして次に、アスビレーションにより除去した。ウェルの非特異的部位を、PBS中、0.25％のヒト血清アルブミン溶液2 00mlの添加によりブロックし、そして室温で少なくとも１時間インキュベートした。前記ブロックされた溶液を除去し、そしてウェルを洗浄緩衝液（トリス緩衝溶液、0.05％のTween 20）により１度洗浄した。次に、80〜20,000pg／mlのＡβ（１−40）又はＡβ（１−42）を含む標準を、検体希釈剤（１mMのPO₄、0.15MのNaCl、pH7.4、0.6％のウシ血清アルブミン、グロブリン−フリー、0.05％のTriton X-405及び0.05％のチメロザール）における希釈により調製し、そしてそれらの標準100μｌを適切なウェルに添加した。標準を室温で１時間インキュベートし、次にアスピレートし、そしてウェルを洗浄緩衝液により４度洗浄した。 100μｌの第２抗体（レポーター抗体）を、検体希釈剤において0.５μｇ／m lの濃度で添加した。このレポーター抗体は、抗体とNHS−ビオチンとの反応により調製された、ビオチニル化された3D6(Ａβ（１−５）を認識する）である（Pi erce）。これを室温で１時間インキュベートし、次に、洗浄緩衝液により４度洗浄した。個々のウェルに、アビジンHRP（Vector Labs）のｌ／5000希釈溶液100μｌを添加し、そして室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液により４度洗浄し、そしてSlow TMB（Pierce）100μｌを個々のウェルに添加し、そして1 5分間インキュベートした。反応を、２ＭのH₂SO₄(25μｌ)の添加により停止し、そしてプレートをＶ_maxリーダー(Molecular Devices)上で450-650で読み取った( Notebook 1344)。図２に見られるように、抗体2G3はＡβ（１−40）と強く反応するが、しかしＡβ（１−42）とは交差反応性を実質的に有さない。図２においては、抗体21Fl 2が同様に、Ａβ（１−40）に対してよりもＡβ（１−42）に対してひじょうに高い特異性を有することが示される。20,000pg／mlの濃度で、0.4％以下の交差反応性が観察される。 II．ELISA アッセイＡ．マイクロタイターウェルへの捕獲抗体の結合Ａβ（ｘ≧41）又はＡβ（ｘ≦40）に対するモノクローナル抗体を、0.23g／ｌのNaH₃PO₄・H₂O、26.2g／ｌのNa₂HPO₄・7H₂O、１ｇ／ｌのNaN₃（pH8.5）を含む緩衝液において10μｇ／mlの濃度に希釈する。次に、100μｌ／ウェルのこの溶液を、96−ウェルのWhite Dynatech Microliter２（96ウェル平底プレート）に分散する。プレートを密封し、そして室温で一晩インキュベートした。被覆に続いて、残る溶液をアスピレートし、そして非特異的結合部位を、0.2ｇ／ｌのN aH₂PO₄・H₂O、0.8ｇ／ｌのNa₂HPO₄・7H₂O、結晶化され、そして凍結乾燥された2 .5ｇ／ｌのヒト血清アルブミン(HSA)の溶液(pH7.4)200μｌ／ウェルによりブロックする。それらのプレートを、ブロック用溶液において室温で１時間インキュベートすることによってブロックする。Ｂ．アッセイプロトコールキャリブレーターを、DMSO中、１μｇ／mlのＡβ_1-47の原液から調製する。検体希釈剤(0.2ｇ／ｌのNaH₂PO₄・H₂O、2.16ｇ／ｌのNa₂HPO₄・7H₂O、６ｇ／ｌのウシ血清アルブミン(BSA)(グロブリンフリー)、0.5ml／ｌのTriton X-405、8.5 ｇ／ｌのNaCl、pH7.4)において、最高のキャリブレーター、すなわち1000pg／ml (10mlのカゼイン検体希釈剤において10μｌのＡβ_1-42原液(１μｇ／mlのDMSO)) のキャリブレーターを調製する。一連の希釈溶液を検体希釈剤により製造し、50 0，250，125，62.5及び31.25pg／mlの濃度のＡβ_1-42を得る。 100μｌ／ウェルのキャリブレーター又はサンプルを、マイクロタイタープレートに適用した。プレートを密封し、そして室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄緩衝液（80ｇ／ｌのNaCl、3.85ｇ／ｌのKCl、31.75ｇ／ｌのトリス−HCl、0.5ml／ｌのTween-20、pH7.5）により３度、洗浄する。抗体を検体希釈剤において１μｇ／mlに希釈し、そして100μｌをウェル当たりに添加する。このプレートを被覆し、そして室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液により３度、洗浄する。アルカリホスファターゼ親和性精製されたF(ab’)₂フラグメントロバ抗−ウサギIgG(H+L)(Jackson)を、検体希釈剤において１：1000に希釈する。その100μｌ／ウェルを添加する。プレートを被覆し、そして室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液により３度洗浄し、次に100μｌ／ウェルの化学ルミネセンス基質を添加する。その化学ルミネセント基質は、化学ルミネセンス試薬、すなわちAMPPD(Tropix)及びエンハンサー、すなわちエナメルグリーン（Tropix）を、１mMのMgCl₂及び0.2％のNaN₃を含む１Ｍのジエタノールエミン緩衝液(pH10)によりそれぞれ１：1000及び１：100 に希釈することによって調製される。プレートを密封し、そして室温で10〜15分間インキュベートする。溶液をアスピレートしない。この時点で、異なった抗体ロットのために最適化されるべきである。化学ルミネセントを、Dynatech ML1000を用いて、15分後に、読み取り、そして相対化学ルミネセント単位(CLU)として表わす。 III．MDL 28170 インヒビターによるAPPプロセッシングの阻害本発明者は最初に、スウェーデン人FAD突然変異を有するAPP₆₉₅を安定して発現するヒト腎臓293細胞（K695sw細胞）を用いて、APPプロセッシングに対する化合物MDL 28170の作用に基づいて、Higakiなど．（1995）Neuron，14:651-659の公開された結果を再生するよう計画する。この実験はパルス−追跡範例を用いて行なわれた：K695sw細胞を³⁵Ｓ−メチオニンにより２時間ラベルし、そして次に、200μＭのMDL 28170の存在下で２時間、追跡した。処理された及び処理されていない細胞からの追跡培地のアリコートを、SDS-PAGEにゆだねた。主要の分泌された細胞タンパク質の量における有意な差異は検出されず（図３、レーン１，２）、このことは、この実験の条件下で、MDL 28170は一般的なタンパク質分泌を妨害しないことを示唆する。次に、個々の形に対して特異的な抗体を用いて、α−及びβ−切断されたAPP₅ の量の変化について、追跡培地を分析した。抗体1736はα−切断されたAPP₅を特異的に免疫沈殿せしめる(Haassなど．（1994）J.Biol.Chem．269:17741-17748;H aassなど．（1995）Nature Med．1:1291-1296)。この抗体は処理に基づいてα− APP₅生成の上昇を示し（図３、レーン３，４）、このことは、MDL 28170がα− セクレターゼを有意に阻害しないことを示す。 192swは、スウェーデン人変異体met₅₉₆で終結するβ−切断されたAPP₅種を特異的に沈殿せしめ(Knopsなど．（1995）J.Biol.Chem．270:2419-2422;Haassなど．（1995）Nature Med．1:1291-1296)。この抗体による免疫沈殿は、MDL 2817 0がβ−セクレターゼ活性を有意に阻害しないことを示した（図３、レーン５，６）。次に、APPの少なくとも20個のアミノ酸に向けられる、抗体Ｃ７を用いての細胞性の十分な長さのAPP及びそのＣ−末端フラグメントの変化についてK695sw細胞の溶解物を分析した（Podlisnyなど．（1991）Am.J.Pathol．138:1423-1435）。この抗体は、Ｎ’−及びＮ′／Ｏ′−グリコシル化された十分な長さのAPP、及びα−セクレターゼ分解の後、膜結合されたまま存続するその10kDaのＣ−末端フラグメント(APP₆₉₅の残基613〜695)を沈殿せしめる。MDL 28170による処理に基づいて、10kDaのＣ−末端フラグメントのレベルの著しい上昇が、観察された（図３、レーン７，８）。 K695sw細胞においては、β−セクレターゼ分解の後、膜結合されたまま存続する12kDaのＣ−末端フラグメント(APP₆₉₅の残基597−695)は、容易に溶解され得ず、そして抗体Ｃ７によって検出され得ない(Citronなど.，1995)。従って、本発明者は、合成Ａβ（１−40）に対して生ぜしめられた抗体1282を用いてこのフラグメントを沈殿せしめた。この抗体は12kDaのＣ−末端フラグメントを沈殿せしめることができるが、しかし10kDaのフラグメントは沈殿せしめることができず、そして従って、薄い色の12kDaのバンドはより豊富な10kDaバンドによりうすくされない。12kDaのフラグメントは処理されていない細胞において検出できないが、このバンドはMDL 28170による処理に基づいて明確に観察された（図３、レーン９，10）。要約すると、α−又はβ−セクレターゼ分解の有意な阻害性は存在しないが、しかし10及び12kDaのＣ−末端フラグメントの両者における上昇がM DL 28170による処理に基づいて観察され、このことは、それぞれｐ３及びＡβペプチドへの10及び12kDaフラグメントの転換を阻害するγ−セクレターゼインヒビターとしてのこの化合物の役割を強く支持する。 IV．MDL 28170 は、Ａβ（40）及びｐ３（40）の生成を阻害するが、しかしＡβ （42）及びｐ３（42）の生成を阻害しない MDL 28170は、Ａβ及びｐ３の分泌を阻害することがこれまでに示されており、そして従って、γ−セクレターゼを阻害することが示唆されている。この阻害は、合成Ａβ（１−40）に対して生ぜしめられたポリクローナル抗体により、処理された細胞からの培地を免疫沈殿することによって観察された(Higakiなど. ，（1995）Neuron，14:651-659)。分泌されたＡβ及びｐ３ペプチドの大部分はアミノ酸40で終結するので、この実験は、位置40での主要γ−セクレターゼ分解のみが阻害されるかどうかを区別できない。この問題を解決するために、本発明者は、異なった用量のMDL 28170を用いてのK695sw細胞に対するパルス−追跡実験を、続いて、最初に21F12による、位置4 2で終結するＡβペプチドを特異的に沈殿せしめる、Ａβのアミノ酸33−42（上記）に対して生ぜしめられたモノクローナル抗体による、及び次に、Ａβ及びｐ３のすべての形を沈殿せしめる抗体1282による、同じ培地の連続的免疫沈殿を実施した(Haassなど.，（1992b）Nature 359:322-325)(図４Ａ)。興味あることには、21F12は、Ａβのみならず、またｐ３ペプチドも沈殿せしめ、従って、これまで記載されたことがない、分泌されたｐ３（42）の存在を示した。全Ａβ及び全ｐ３は、50μＭ以上(たとえば200μＭで、ｐ＜0.001)の用量のMDL 28170により強く且つ有意に低められた。対照的に、Ａβ（42）及びｐ３（42）は、200 μＭ、Higakiなど．（1995）Neuron，14:651-659により使用される用量、及びここで試験される最高の用量で、単なる小さく且つ有意でない低下を伴って、ベルー形状用量応答曲線を示した。200μＭでのMDL 28170を用いて、実験を４度くり返し、そして結果をホスホルイメージング(phosphorimaging)により定量化した（図４Ｂ）。それらのデータは、上記条件下で、示差効果がＡβ及びｐ３の両者に関して有意であることを示す。Ｖ．示差阻害が多くの条件下で達成されるＡβ（40）／Ａβ（42）及びｐ３（40）／ｐ３（42）沈殿に観察される示差効果が意義あることを確かめるために、本発明者は、K695sw細胞を用いて多くの対照実験を行なった。最初に、本発明者は、たぶん、β−セクレターゼ経路からα −セクレターゼ路にβAPP基質を向けることによって、全Ａβを低めるが、しかし全ｐ３を高めることが示されている１μＭのホルボールエステルPDBuにより、２時間のパルス２時間の追跡の形式でK695sw細胞を処理した(Buxbaumなど.，（1 993）“Protein phosphorylation inhibits production of alzheimer amyloid β/A4 peptide,”Proc.Natl.Acad.Sci．USA 90:9195-9198;Hungなど.，（1993） “Activation of protein kinase C inhibits cellular production of the amy loid β-protein,”J.Biol.Chem．268:22959-22962)。この効果は、続くγ−セクレターゼ分解とは無関係であるべきであり、そして従って、個々の代謝物の40 及び42形は、ここで使用される免疫沈殿形式が正しく作動する場合、同等に低められ、又は高められるべきである。実際、PDBu−処理された細胞のならし培地が 21F12により沈殿せしめられる場合、Ａβ（42）の予測される低下及びｐ３（42 ）の予測される上昇が観察され、このことは、Ａβ（42）免疫沈殿シグナルが沈殿できる材料の量の変化に影響を及ぼしていることを示す。R1282 による続く免疫沈殿は、全Ａβ及び全ｐ３に関して、同じ効果を示す（図５Ａ）。Ａβ（42）及びｐ３（42）がMDL 28170により低められないという言及は、21F 12抗体の性質に決定的に依存する。この抗体による観察される効果を確かめるために、２種の他のこれまで公開されているＡβ（42）−特異的抗体を、200μＭでのMDL 28170によるパルス追跡形式に使用した。モノクローナル抗体BC05を、Ａβ（42）を検出するために、ELISAアッセイに広範に使用した(Asami-Odakaなど.，（1995）Biochemistry 34:10272-10278;Gravinaなど.，（1995）J.Biol.Ch em．270:7013-7016;Suzukiなど.，（1994）Science 264:1336-1340）。 MDL 28170−処理されたK695sw細胞からの培地がこの抗体により沈殿せしめられる場合、Ａβ（42）及びｐ３（42）の両者において実際の上昇が観察された。R1282による続く沈殿は、全Ａβ及びｐ３において通常の低下を示した（図５Ｂ）。ポリクローナル抗体Ｃ42はまた、Ａβ（42）に対して特異的であることが示された(Saidoなど.，（1994）Spatial resolution of the primary β-amyloidoge nic process induced in postischemic hippocampus．J.Biol.Chem．269:15253- 15257)。同様に、この抗体は、処理に基づいて、Ａβ（42）及びｐ３（42）の低下を示さないが、ところがR1282による続く沈殿は全Ａβ及びｐ３における通常の低下を示した（図５Ｃ）。Ａβ（40）及びｐ３（40）における低下はまた、Ａβ（40）及びｐ３（40）の遊離カルボキシル末端に対して特異的なモノクローナル抗体2G3(上記)が最初に、続いて21G12により沈殿せしめるために使用される場合にも見出された（図５Ｄ）。予測されるように、MDL 28170によるＡβ生成の示差阻害性はまた、沈殿が、連続的ではなく（上記のように）、標準のパルス−追跡の後、同時に実施される場合にも検出された。すなわち、処理された細胞及び処理されていない細胞からの培地のアリコートがＡβ42形に関して、21F12により沈殿され、そして他のアリコートが全Ａβ及び全ｐ３に関して、抗体1282により沈殿せしめられた。この同時の沈殿は、上記の連続的沈殿と同じ結果をもたらした（図５Ｅ）。要約すると、３種の異なったＡβ（42）末端−特異的抗体は、MDL 28170がＡ β（42）及びｐ３（42）の生成を強く低めないが、ところがＡβ（40）及びｐ３（40）に対するモノクローナル抗体及び全Ａβ及びｐ３に対する異なったポリクローナル抗体は強い低下を示すことを示す。最終的に、21F12、続く抗体1282による免疫沈殿は、インヒビター（100ｐＭ）がパルス−追跡型においての代わりに、３時間のラベリング期間に適用される場合、再びこの示差阻害性を示した（図５Ｆ）。 VI．示差阻害性がいくつかの細胞系において観察される示差阻害性がK695ewに対して特異的であるかどうかを調べるために、３種の追加の細胞系を標準の２時間パルス−２時間追跡形式で処理し、そしてそのならし培地を21F12により最初に、そして次に抗体1282により沈殿せしめた。腎細胞系K 695₇₁₇₁は7171突然変異を担持するAPP₆₉₅を発現する。この系は、それが突然変異のために高められたレベルのＡβ（42）を生成するので、選択された（Suzuki など.，（1994）Science 264:1336-1340）、200μＭのMDL 28170で、Ａβ（42）及びｐ３（42）の低下は観察されず、ところがＡβ（40）及びｐ３（40）は実質的に低められた（図６Ａ）。野生型βAPP₆₉₅cDNAによりトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞系CHO695を、200μＭのMDL 28170により処理し、そしてＡβ（42）及びｐ３（42）の単なるわずかな低下が観察されたが、ところがＡβ（40）及びｐ３（40）は実質的に低められた（図６Ｂ）。野生型 βAPP₆₉₅を発現するヒト神経芽腫細胞系SKN695を、200μＭのMDL 28170により処理した（図６Ｃ）。Ａβ（42）及びｐ3（42）はわずかに高められたが、全Ａβ 及び全ｐ３は強く低められた。従って、Ａβ（42）対Ａβ（40）及びｐ３（42）対ｐ３（40）生成の示差阻害性は、K695swにおいてのみならず、またβAPP717ミスセンス突然変異を有する、アルツハイマー病の細胞系、ハムスター細胞系、及び野生型βAPPを発現するヒト神経細胞系においても観察された。 VII．実験方法Ａ．細胞系本明細書に記載されるすべてのトランスフェクトされた細胞系は、CMVプロモーターの制御下で、pCMV695の誘導体、すなわちAPP₆₉₅を担持するプラスミドを担持する（Selkoe，（1988）Proc.Natl.Acad.Sci．85:7341-7345）。K695swは、 AD−連結された二重（“スウェーデン人”）突然変異K595N／M596Lを担持する構造体により安定してトランスフェクトされたヒ胚腎293細胞であり(Citronなど．（1992）Nature，360:672-674);K695₇₁₇₁は突然変異V717I(APP770番号付けシステムにおいて位置717でバリンのイソロイシンへの変化)を担持するAPP₆₉₅により安定してトランスフェクトされた293細胞である。CHO695は、pCMV695により安定してトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞であり（Oltersdo rf（1990）J.Biol.Chem．265:4432-4437)、SKN695は、pCMV695により安定してトランスフェクトされたSK-N-SHヒト細胞芽腫細胞である。Ｂ．パルス−追跡実験及び免疫沈殿 APPのプロセッシングに対するMDL 28170の効果を分析するために、細胞を、２枚の10cm皿において集密的に増殖し、血清フリーの培地４mlにおいて〔³²Ｓ〕−メチオニン600μＣｉにより２時間、パルス−ラベルし、そして次に、10％ウシ胎児血清及び示される最終濃度のMDL 28170(最初に、DMSOに200m Mで溶解されている)を含む培地４mlにより２時間追跡した。対照の皿は、DMSOのみにより処理した。ならし培地及び細胞溶解物を、Haassなど．Nature 359:322-325に記載のようにして、免疫沈殿により分析した。APP₆₉₅の残基595−611に対するポリクローナル抗体R1736を用いて、α−APP₅を沈殿せしめた(Haass，（1994）J.Biol.Chem． 269:17741-17748)。この抗体は、α−分解されたAPP₅の遊離COOH−末端に対して特異的であるエピトープを認識する。合成Ａβ_1-40に対するポリクローナル抗体 R1282を生成した(Haassなど．（1992）Nature 359:322-325)。この抗体は培養された細胞の培地からの全Ａβ及びｐ３（及び少量であるが、種々の量のAPP₅）を沈殿せしめる（Haassなど．（1992）Nature 359:322-325）。モノクローナル抗体2G3を、ペプチドＣ（アミノヘプタン酸）GLMVGGVV（配列番号５）に対して生ぜしめ、そしてＡβ（40）及びｐ３（40）を特異的に沈殿せしめる。この抗体20 μｇを用いて、２枚の皿の追跡培地を免疫沈殿せしめた。モノクローナル抗体21 F12を、ペプチドＣ（アミノヘプタン酸）GLMVGGVVIA（配列番号４）に対して生ぜしめ、そしてＡβ（42）及びｐ3（42）を特異的に沈殿せしめた。この抗体20 μｇを用いて、２枚の皿の追跡培地を免疫沈殿せしめた。モノクローナル抗体BC 05は特異的にＡβ（42）及びｐ３（42）を検出する(Suzukiなど．（1994）Scien ce 264:1336-1340)。APP細胞質端の少なくとも20個の残基に対するポリクローナル抗体Ｃ７（Podlisny，（1991）Am.J.Path．138:1423-1435）は、Ｎ’−及びＮ ’並びにＯ’−グリコシル化された十分な長さのAPP、及びそのＣ−末端タンパク質分解フラグメントを沈殿せしめる。抗体sw192(Knopsなど．（1995）J.Biol.Chem．270:2419-2422;Haassなど．（1995）Nature Med．1:1291-1296)は、スウェーデン人突然変異を担持する β−分解されたAPP₅を特異的に沈殿せしめる。細胞抽出物又は培地からのＡβの免疫沈殿物のSDS-PAGEを、10〜20％トリス− トリシンゲル(Novex)上で実施し、そしてAPP₅沈殿物を10％SDS−ポリアクリルアミドトリスグリシンゲル上で電気泳動した。すべての定量化を、Image-QuaNTソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いて、Phosphorimager 400Aにより行なった。パルス／追跡−免疫沈殿法は、同じアッセイにおいてＡβ及びｐ３のいづれかの変化を同時に評価することを可能にし、そしてそれらのペプチドの個々は電気泳動ゲルにおいて直接的に可視化されることを注目すべきである。 VIII．ヒトニューロンヒトニューロンを、前記のようにして培養した(Seubertなど．Nature（1992） 359:325-327)。但し、細胞は、ウシ胎児血清を含まないが、しかしＢ27（Gibco ）により補充された神経培地を含む６−ウェルプレートに接種された。細胞を、使用の前、血清フリーの培地において２〜３週間、培養した。生後16日目の胎児の大脳皮質からのPDAPPマウス脳細胞を、ヒトニューロンについてのプロトコールに従って培養した。但し、細胞は５％ウシ胎児血清(Sigma )及び５％Chang's補充物（Irvine Science）を含む神経培地を有する24−ウェルプレートに接種された。細胞を、実験に使用する前、５〜７日間、培養した。Ａβ生成に対する物質の効果を試験するための方法は次の通りである。新鮮な培地を培養物ウェルに添加し、そして次に、24（８〜 30）時間後、集める。これは、処理されたサンプルと比較される、個々のウェルからの“対照”サンプルである。次に、試験されるべき物質を含む新鮮な培地を添加し、そして再び、さらに24時間（８〜30）のインキュベーションの後に収穫する。この“処理された”サンプルの収集の後、細胞毒性アッセイを細胞に対して実施する。細胞毒性アッセイを行なうために、細胞を、チアゾリルブル（MTT ，Sigma）を１mg／mlで含む培地において15分間インキュベートする。次に、培地を捨て、そして沈殿物を、50％DMF及び20％SDSを含む緩衝液に溶解することによって分析する。溶解された染料を、Molecular Devices V_max上で定量化した。培養培地の対照及び処理されたサンプルを、２種のモノクローナル抗体から成るサンドイッチELISAを用いて、全Ａβについてアッセイする。Ａβのアミノ酸1 1−28に対して特異的な第１抗体266を、捕獲抗体として使用する(Seubertなど. ，Nature、前記)。Ａβのアミノ酸１−５に対して特異的な第２抗体3D6を、ビオチニル化し、そしてレポーター抗体として使用した。この3D6のビオチニル化方法は、免疫グロブリンをラベリングするNHS−ビオチン（Pierce）についてのプロトコールを用いた。但し、100mMの炭酸水素ナトリウム（pH 8.5）緩衝液を使用した。この3D6抗体は分泌されたAPP又は十分な長さのAPPを認識しないが、しかし位置１で始まるＡβ種を認識する。サンプルをまた、捕獲抗体として、Ａβのアミノ酸33−42に対して生成されたモノクローナル抗体21F12を使用するＡβ（42）特異的サンドイッチELISAによりＡβ（42）について分析した。この抗体は、それがELISA又は競争ラジオイムノアッセイ(RIA)においてＡβ（1−40）と交差反応しないので、Ａβのより長い形に対して特異的である。ビオチニル化された3D6はまた、このアッセイにおいてもレポーター抗体である。 266及び21F12mAbを、10μｇ／mlで、96−ウェルイムノアッセイプレート（C ostar）中に室温で一晩、被覆した。プレートをアスピレートし、そして0.25％のヒト血清アルブミンPBS緩衝液により室温で少なくとも１時間ブロックし、次に使用まで４℃で乾燥貯蔵した。サンプル及び標準をプレートに添加し、そして室温で1.5時間インキュベートした。ビオチニル化された3D6を0.5μｇ／mlに希釈し、そして室温で１時間、ウェルにおいてインキュベートした。プレートを、アッセイのそれぞれの段階の間、洗浄緩衝液（トリス緩衝溶液、0.05％のTween 20）により３度洗浄した。１：1000 に希釈された、ストレプタビジン−アルカリホスファターゼ(Boehringer Mannhe im)を、全Ａβアッセイのためにウェルに添加し、そして１：4000に希釈されたアビジン−HRP(Vector)をＡβ（42）アッセイのためにウェルに添加した。それらの接合体を室温で１時間インキュベートした。全Ａβアッセイのためには、螢光基質４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートをウェルに30分間にわたって添加し、次にMillipore Cytofluor 2350螢光計により読取った。比色基質、すなわちSlow TMB-ELISA（Pierce）を、Ａβ（42）アッセイのために添加し、そして 15分間、読み取り、その後、酵素反応を２Ｎ(7)H₂SO₄により停止した。プレートを、Molecular Devices V_max上で読み取った。全Ａβ及びＡβ（42）の両者についての％阻害率を下記のように定義する： (１−((処理された／対照_t)／(処理されていない／対照_u)))×100％ここで、処理された＝処理された細胞からの値対照_t＝試験の前、24時間、同じ処理されたウェルからの値処理されていない＝試験物質を受けていないウェルからの値対照_u＝試験の前、24時間、同じ処理されていないウェルからの値処理された及び処理されていないサンプルの値を、24時間の試験期間の前、24 時間、それらのそれぞれの値により割り算することが最適であり、変化の作用として、培地は単独で、Ａβ生成の５〜10％低下をもたらすことができる（処理されていない値と対照_uの値とを比較して）。いくつかの化合物を、全Ａβ及びＡβ（42）の両者を阻害するそれらの能力についてスクリーンした。結果は、図13Ａ−130に示される。 IX．PDAPP 構造体イントロン６，７及び８を含むcDNA／ゲノムAPP構造体を、エキソン１−６及び９−18をコードするAPP cDNAと、イントロン６，７及び８、及びエキソン７及び８をコードするゲノムAPP配列とを組合すことによって調製する（図８Ａ−８Ｂを参照のこと）。pUCベクターにおける便利な挿入のために十分に小さなスプライシングカセットを創造するために、イントロン配列における２つの欠失を創造する。欠失は、イントロン６の位置143からエキソン７の開始の上流に位置するBamH I部位（エキソン７の開始の前、1658bp）まで、イントロン６において行なわれる。もう１つの欠失は、イントロン８における最初のBamHＩ部位からエキソン９の開始の前、263bpでの部位まで、イントロン８において行なわれる。混乱を回避するために、APPイントロン６及び８のそれらの切断された形は、イントロンΔ６及びΔ８として本明細書において言及される。BamHＩ部位をそれらの欠失の部位で構築し、その結果、それらはBamHＩ部位の存在により印を付けられる。PDAPPとして言及されるこの構造体においては、エキソン７及び８、及びイントロン７は、損なわれていないゲノム配列であり、但し、イントロン７におけるユニークXhoＩ部位が破壊された。切断されたイントロンを含むDNAフラグメントを次の通りにして生成する：Bam HＩ部位を、PCR突然変異誘発によりイントロン６ヌクレオチド中の143bpで構築し（“Mutagenesis by PCR”in PCR Technology:Current Innovations(Griffith and Griffith，eds.，CRC Press，1994）Pages 69-83)、そしてもう１つのBamH Ｉ部位を、エキソン６の開始の前、263bpで、PCR突然変異誘発により構築する。それらの部位は、それぞれ、エキソン６及びイントロン６、及びイントロン８及びエキソン９の連結部を含む別々のAPPゲノムDNAクローン中に構築され、修飾されたAPPゲノムDNAクローンをもたらす。完全なカセットを、次の通りにして、APP cDNAクローンにおいてアセンブルする（図９）。エキソン１〜５、及びエキソン６の一部を含む、APP cDNAの889bp のBamHＩ−XcmＩフラグメント（図10のヌクレオチド１〜843(配列番号２)を包含する）を、挿入部位から下流のBamHＩ及びXhoＩ部位を含むベクター中にクローン化し、APP770x−オリゴ−ｘを創造する。次に、２つのフラグメントを、XcmＩ及びBamHＩにより切断することによって、上記エキソン６及びイントロン６の連結部を含む修飾されたAPPゲノムDNAクローンから得た。エキソン６におけるXcm Ｉからイントロン６におけるXcmＩまでのその得られる34bpのフラグメント、及びイントロン６におけるXcmＩからイントロン６の位置143bpでの人工的に創造されたBamHＩ部位までの131bpのフラグメントを、三方向連結段階により、APP770x −オリゴ−ｘ中に連結し、APP770x−Ｅ６オリゴ−ｘを創造する。フラグメントの配向を配列決定により確かめる。次に、 APP770x−Ｅ６オリゴ−ｘを、BamHＩ及びXhoＩにより切断する。次に、イントロン８及びエキソン９の連結部を含む修飾されたAPPゲノムDNAクローンからの313b pのBamHＩ及びXhoＩフラグメントを、APP770x−Ｅ６オリゴ−ｘに連結し、APP77 0xE6E9xを創造する。次に、APP770xE6E9xをBamHＩにより切断し、そしてXPI及びOX-2ドメイン（エキソン７及び８）をコードするAPPゲノムDNAの6.8kbのBamHＩフラグメントを、この部位で挿入する。このフラグメントは、エキソン７の開始の1658bp上流のBa mHＩ部位で開始し、そしてイントロン８における最初のBamHＩ部位まで延長する。このBamHＩフラグメントを、Stratageneから得られたλFIXIIベクターにおけるヒト胎盤ゲノムライブラリーから得られた、APP遺伝子のこの部分をコードするλファージゲノムクローンから得る。このBamHＩフラグメントは、フィルイン及び再連結を切断することによって破壊されたXhoＩ部位を元来含んでいた。欠失の位置は図11に示される。エキソン１−８及び９の一部、及びイントロン６，７，８を含むこのクローンは、“APPスプライシングカセット”と命名される。このAPPスプライシングカセットをNruＩ及びXhoＩにより切断し、そしてHardy突然変異を担持するAPP cDNAのNruＩ〜XhoＩ cDNAフラグメントを置換するために使用する。APP cDNAのこの変異体形を、ヌクレオチド位置2145でのＧをＴに特定部位の突然変異誘発により転換することによって生成する。これはコードされたアミノ酸をValからPheに変える。得られる構造体は、cDNA／ゲノムAPP“ミニ遺伝子”である。この構造体を生成するために使用されるAPPゲノムクローンに由来するAPPエキソン７及び８を含む6.8kbのBamHＩフラグメントの配列決定は、イントロン７が2 .6kbの長さであり、そしてイントロン８における最初のBamHＩ部位、すなわちAPPミニ遺伝子構造体中に構築されるイントロン８における欠失の上流の部位がエキソン８の末端から2329bp下流であることを示した。これは、Yoshikaiなど．(1990)及びYoshikaiなど．(1991)により公開されたAPP遺伝子の制限地図と一致しない。それらの地図と本発明者の配列との比較は、Yoshikaiなどが、彼らの制限地図における２つのEcoRＩフラグメントの順序を交換したことを示す。エキソン８を含む1.60kbのEcoRＩフラグメントは、1.48kbのEcoRＩフラグメントの上流に実際的に存在し、そしてイントロン７中にマッピングされたYoshikaiなどのその1.48kbのEcoRＩフラグメントはイントロン８に実際的に存在する。本発明者は、ヒトDNAからのPCR生成されたフラグメントのサイジングにより、エキソン８を含むEcoRＩフラグメントのためのこの位置を確かめた。このAPPミニ遺伝子をPDGF−βプロモーターに操作可能的に連結し、哺乳類細胞においてAPP cDNA／ゲノム構造体の発現を提供する。PDGFβ−鎖５’フランキング配列を、APPミニ遺伝子の開始でNruＩ部位の上流に挿入する。このフラグメントは、PDGF−βプロモーターが存在する、1.3kbの上流の転写開始部位、及びA urII部位で終結する約70bpの５’未翻訳領域を含む(Higginsなど．(1994))。240 bpのBamHＩ〜BclＩフラグメント上に担持される後期SV40ポリアデニル化シグナルを、APPミニ遺伝子の下流に付加する。PDGF−βプロモーター、APPスプライシングカセット、Hardy突然変異、及びSV40ポリアデニル化シグナルを組合すこの構造体を、PDAPPとして言及する（図12）。本発明は、化合物がＡβ（ｘ−≧41）及び／又はＡβ（ｘ−≦40）又は全Ａβ の生成を変更するかどうかを決定するためのスクリーニング方法を提供する。特定の例が提供されて来たが、それらは例示的であって、制限するものではない。本発明の多くの修飾は、本明細書の再考に基づいて、当業者に明らかになるであろう。従って、本発明の範囲は、上記の記載に関して、決定されるべきではなく、しかし代わりに、添付する特許請求の範囲により決定されるべきである。本明細書に引用されるすべての出版物及び特許記録は、それぞれ個々の出版物又は特許記録が個々に示されているかのように、同じ程にそれらの全体を引用により本明細書中に組込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者シトロン，マーティンアメリカ合衆国，マサチューセッツ 02215，ボストン，リバーウェイ＃８ 116 (72)発明者セルコー，デニスジェイ. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02130，ジャマイカプレイン，モスヒルロード 166 (72)発明者スーバート，ピーターエー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94080, サウスサンフランシスコ，ノースウッドドライブ 222 (72)発明者シェンク，デイルアメリカ合衆国，カリフォルニア 94010, バーリンガム，ロスアルトスドライブ 1542

Claims

【特許請求の範囲】１．ある化合物が細胞により生成される少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を変更するかどうかを決定するための方法であって：前記化合物を、前記細胞を含んで成る培養物に投入し；前記培養物からのサンプル中の前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を特異的に測定し；そして前記測定された量が、化合物を投入されていない、細胞を含んで成る培養物からのサンプル中の予測された量と異なるかどうかを決定する；段階を含んで成り、それにより、前記測定された量と前記予測された量との間の差異が、前記化合物が細胞により生成されるＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を変更することを示す；ことを特徴とする方法。２．前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量がイムノアッセイにより測定される請求の範囲第１項記載の方法。３．前記イムノアッセイが、固相に結合された捕獲結合物質及びラベルされた検出結合物質を用いるサンドイッチイムノアッセイである請求の範囲第２項記載の方法。４．前記捕獲結合物質がＡβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的である請求の範囲第３項記載の方法。５．前記結合物質がペプチドNH₂-Cys-NH-CH₂(CH₂)₅-CO-GLMVGGVVIA-COOH(配列番号４)に対して生じさせた結合物質の特異性を有する請求の範囲第４項記載の方法。６．前記ラベルされた検出結合物質がＡβの連結領域内のエピトープに対して特異的である請求の範囲第４項記載の方法。７．前記ラベルされた検出結合物質がＡβの連結ペプチドに対して生じさせた結合物質の特異性を有する請求の範囲第６項記載の方法。８．前記ラベルされた検出結合物質が、そのアミノ−末端のアミノ酸がＡβのアミノ酸番号１であるＡβペプチドに対して特異的である請求の範囲第４項記載の方法。９．前記捕獲抗体がＡβの連結領域内のエピトープに対して特異的であり、そして前記ラベルされた検出抗体がＡβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的である請求の範囲第３項記載の方法。 10．前記培養物が、一次ヒトニューロン、又はPDAPP構造体を有するトランスジェニックマウスからの一次ニューロンを含んで成る請求の範囲第３項記載の方法。 11．前記PDAPP構造体が突然変異V717Fを含む請求の範囲第10項記載の方法。 12．前記培養物からのサンプル中のＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を特異的に測定する段階が、前記培養物をタンパク質のための放射性ラベルによりパルスし；前記培養物を放射性ラベルなしに追跡し；前記化合物を、前記追跡期間の間、前記細胞に投入し；前記培養物からのサンプルと、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的な結合物質とを接触せしめ；そして前記結合物質に結合される放射性ラベルの量を検出する；ことを含んで成る請求の範囲第２項記載の方法。 13．前記培養物が一次ヒトニューロン、又はPDAPP構造体を有するトランスジェニックマウスからの一次ニューロンを含んで成る請求の範囲第ｌ項記載の方法。 14．前記PDAPP構造体が突然変異V717Fを含む請求の範囲第13項記載の方法。 15．前記培養物が、293ヒト腎細胞系、ヒト神経芽腫細胞系、ヒトHeLa細胞系、一次内皮細胞系、一次ヒト線維芽細胞系、一次リンパ芽球系、混合されたヒト脳細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系を含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 16．前記細胞が、ヒトAPPをコードする組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞である請求の範囲第１項記載の方法。 17．前記ヒトAPPがHardy突然変異を有する請求の範囲第16項記載の方法。 18．前記細胞がＡβ（ｘ−≧41）ペプチドを過剰生成する請求の範囲第１項記載の方法。 19．前記サンプルが培養物における細胞により条件づけされた培地である請求の範囲第１項記載の方法。 20．前記化合物が前記細胞に対して毒性であるかどうかを決定する段階をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 21．ある化合物が細胞により生成される少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を変更し、そして前記細胞により生成される全Ａβ又は少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドのいづれかの量を変更するかどうかを決定するための方法であって：前記化合物を、前記細胞を含んで成る培養物に投入し；前記培養物からのサンプル中の前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を特異的に測定し；前記培養物からのサンプル中の前記全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40)ペプチドの量を特異的に測定し；そして前記測定された量が、化合物を投入されていない、細胞を含んで成る培養物からのサンプルにおける予測された量とは異なるかどうかを決定する段階を含んで成り；それにより、前記測定された量と前記予測された量との間の差異が、前記化合物が細胞により生成されるＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの量、及び／又は細胞により生成される全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を変更することを示す；ことを特徴とする方法。 22．前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量及び前記全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量がイムノアッセイにより測定される請求の範囲第21項記載の方法。 23．前記イムノアッセイが、固相に結合される捕獲結合物質及びラベルされた検出結合物質を含んで成るサンドイッチイムノアッセイである請求の範囲第22項記載の方法。 24．前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を測定するための捕獲結合物質がＡβ （ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的である請求の範囲第23項記載の方法。 25．前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的な結合物質が、ペプチドNH₂ -Cys-NH-CH₂-(CH₂)₅-CO-GLMVGGVVIA-COOH（配列番号４）に対して生じさせた結合物質の特異性を有する請求の範囲第24項記載の方法。 26．前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を測定するためのラベルされた検出結合物質が、Ａβの連結領域内のエピトープに対して特異的であるか、又はそのアミノ末端のアミノ酸がＡβのアミノ酸番号１であるＡβペプチドに対して特異的である請求の範囲第24項記載の方法。 27．前記全Ａβの量を測定するための捕獲結合物質がＡβの連結領域内のエピトープに対して特異的であり、そして前記Ａβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を測定するための捕獲結合物質がＡβ（ｘ−≦ 40）ペプチドに対して特異的である請求の範囲第23項記載の方法。 28．前記Ａβの連結領域内のエピトープに対して特異的な結合物質がＡβの連結ペプチドに対して生じさせた結合物質の特異性を有し、そして前記Ａβ（ｘ− ≦40）ペプチドに対して特異的な結合物質がペプチドNH₂-Cys-NH-CH₂-(CH₂)₅-CO -GLMVGGVV-COOH（配列番号5）に対して生じさせた結合物質の特異性を有する請求の範囲第27項記載の方法。 29．前記Ａβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を測定するためのラベルされた検出結合物質が前記連結ペプチドに対して生じさせた結合物質の特異性を有し、そして前記全Ａβの量を測定するための結合物質が、そのアミノ酸配列がＡβの１〜５内のアミノ酸又はＡβのアミノ酸17〜24であるペプチドに対して生じさせた結合物質の特異性を有する請求の範囲第27項記載の方法。 30．前記少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチド、全Ａβ又はＡβ（ｘ− ≦40）ペプチドの量を測定するための捕獲結合物質がＡβの連結領域内のエピトープに対して特異的である請求の範囲第23項記載の方法。 31．前記培養物が、一次ヒトニューロン、又はPDAPP構造体を有するトランスジェニックマウスからの一次ニューロンを含んで成る請求の範囲第23項記載の方法。 32．前記培養物からのサンプル中のＡβ（ｘ−≧41）ペプチド、全Ａβ又はＡ β（ｘ−≦40）ペプチドの量を測定する段階が、前記化合物の投入の前、前記培養物を、タンパク質のための放射性ラベルによりパルスし；前記培養物を放射性ラベルなしに追跡し；前記化合物を、前記追跡期間の間、前記細胞に投入し；前記培養物からのサンプルと、少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的な結合物質とを接触せしめ；前記培養物からのサンプルと、全Ａβ又は少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドに対して特異的な結合物質とを接触せしめ；そして前記結合物質に結合される放射性ラベルの量を検出する；ことを含んで成る請求の範囲第22項記載の方法。 33．前記培養物が一次ヒトニューロン、又はPDAPP構造体を有するトランスジェニックマウスからの一次ニューロンを含んで成る請求の範囲第23項記載の方法。 34．前記培養物が、293ヒト腎細胞系、ヒト神経芽腫細胞系、ヒトHeLa細胞系、一次内皮細胞系、一次ヒト線維芽細胞系、一次リンパ芽球系、混合されたヒト脳細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系を含んで成る請求の範囲第22項記載の方法。 35．前記細胞が、ヒトAPPをコードする組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞である請求の範囲第22項記載の方法。 36．前記ヒトAPPがHardy突然変異を有する請求の範囲第35項記載の方法。 37．前記細胞がＡβ（ｘ−≧41）ペプチドを過剰生成する請求の範囲第22項記載の方法。 38．前記サンプルが培養物における細胞により条件づけされた培地である請求の範囲第22項記載の方法。 39．前記化合物が前記細胞に対して毒性であるかどうかを決定する段階をさらに含んで成る請求の範囲第22項記載の方法。 40．サンプル中の少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチド及び少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドを特異的に検出するためのキットであって、少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的な結合物質；及び少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドに対して特異的な結合物質；を含んで成るキット。 41．前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的な結合物質がペプチドNH₂- Cys-NH-CH₂-(CH₂)₅-CO-GLMVGGVVIA-COOH（配列番号4）に対して生じさせた結合物質の特異性を有し；そして前記Ａβ（ｘ−≦40）ペプチドに対して特異的な結合物質がペプチドNH₂-Cys-NH-CH₂-(CH₂)₂-CO-GLMVGGVV-COOH（配列番号5）に対して生じさせた結合物質の特異性を有する請求の範囲第40項記載のキット。 42．サンプル中の少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチド、及び全Ａβ又は少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドをサンドイッチイムノアッセイにより特異的に検出するためのキットであって、ａ）Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を測定するための少なくとも２種の異なった結合物質；及びｂ）全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を測定するための少なくとも２種の異なった結合物質；を含んで成るキット。 43．前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を測定するための結合物質の１つが、固相に結合されるＡβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的な捕獲結合物質である請求の範囲第42項記載のキット。 44．前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドに対して特異的な結合物質が、ペプチドNH₂ -Cys-NH-CH₂-(CH₂)₅-CO-GLMVGGVVIT-COOH（配列番号4）に対して生じさせた結合物質の特異性を有する請求の範囲第43 項記載のキット。 45．前記Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの量を測定するための結合物質の１つが、Ａβの連結領域内のエピトープに対して特異的であるラベルされた検出結合物質である請求の範囲第42項記載のキット。 46．前記全Ａβの量を測定するための結合物質の１つが固相に結合されるＡβ の連結領域内のエピトープに対して特異的な捕獲結合物質であり、そして前記Ａ β（ｘ−≦40）ペプチドの量を測定するための結合物質の１つが、固相に結合されるＡβ（ｘ−≦40）ペプチドに対して特異的な捕獲結合物質である請求の範囲第42項記載のキット。 47．前記Ａβの連結領域内のエピトープに対して特異的な結合物質がＡβの連結ペプチドに対して生じさせた結合物質の特異性を有し、そして前記Ａβ（ｘ− ≦40）ペプチドに対して特異的な結合物質がペプチドNH₂-Cys-NH-CH₂-(CH₂)₅-CO -GLMVGGVV-COOH（配列番号5）に対して生じさせた結合物質の特異性を有する請求の範囲第46項記載のキット。 48．前記Ａβ（ｘ−≦40）ペプチドの量を測定するためのラベルされた検出結合物質が前記連結ペプチドに対して生じさせた結合物質の特異性を有し、そして前記全Ａβの量を測定するための結合物質が、そのアミノ酸配列がＡβの１〜５内のアミノ酸又はＡβのアミノ酸17〜24であるペプチドに対して生じさせた結合物質の特異性を有する請求の範囲第45項記載のキット。 49．前記少なくとも１つのＡβ（ｘ−≧41）ペプチド、全Ａβ又はＡβ（ｘ− ≦40）ペプチドの量を測定するための捕獲結合物質がＡβの連結領域内のエピトープに対して特異的である請求の範囲第42項記載のキット。 50．前記検出できるラベルが、ビオチニル化されたラベル、放射性ラベル、光散乱性ラベル、酵素ラベル又は螢光ラベルである請求の範囲第45項記載のキット。 51．前記検出できるラベルが、ビオチニル化されたラベル、放射性ラベル、光散乱性ラベル、酵素ラベル又は螢光ラベルである請求の範囲第48項記載のキット。 52．ある化合物が、非ヒト哺乳類により生成される少なくとも１つのＡβ（ｘ −≧41）ペプチドの量を変更し、そして非ヒト哺乳類により生成される全Ａβ又は少なくとも１つのＡβ（ｘ−≦40）ペプチドのいづれかの量を変更するかどうかを決定するための方法であって、アルツハイマー病のモデルとして使用される非ヒト動物からのサンプルにおけるＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの第１の量を測定し；前記非ヒト動物からのサンプルにおける全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの第１の量を測定し；前記化合物を、前記非ヒト動物に投入し；前記非ヒト動物からのサンプルにおけるＡβ（ｘ−≧41）ペプチドの第２の量を測定し；前記非ヒト動物からのサンプルにおける全Ａβ又はＡβ（ｘ−≦40）ペプチドの第２の量を測定し；そして前記第１の量と第２の量とを比較する；ことを含んで成り、それにより、前記比較が、前記化合物が前記Ａβ（ｘ−≧ 41）ペプチドの量を高め、低め、又は未変化のまま存続せしめ、そして前記Ａβ （ｘ−≦40）ペプチドの量を高め、低め、又は未変化のまま存続せしめるかどうかを示すことを特徴とする方法。 53．前記非ヒト動物がゲッ歯動物である請求の範囲第52項記載の方法。 54．前記ゲッ歯動物がマウスである請求の範囲第53項記載の方法。 55．前記非ヒト動物が、Hardy突然変異の発現可能なトランスジーン配列のコピーを有する請求の範囲第52項記載の方法。 56．前記非ヒト動物が、ヒトβ−アミロイド前駆体タンパク質(APP)のスウェーデン人突然変異を発現するよう形質転換される請求の範囲第52項記載の方法。 57．前記非ヒト動物が、PDAPP構造体を有するトランスジェニック動物である請求の範囲第52項記載の方法。 58．前記動物がマウスである請求の範囲第57項記載の方法。