JPS62100291A - 遺伝子断片およびプラスミド - Google Patents
遺伝子断片およびプラスミドInfo
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- JPS62100291A JPS62100291A JP23954385A JP23954385A JPS62100291A JP S62100291 A JPS62100291 A JP S62100291A JP 23954385 A JP23954385 A JP 23954385A JP 23954385 A JP23954385 A JP 23954385A JP S62100291 A JPS62100291 A JP S62100291A
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- Japan
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- gene fragment
- region
- fragment
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
- C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ａ、産業上の利用分野
本発明は、マウス免疫グロブリンに（カッパー）鎖遺伝
子中に存在するＶ領域およびＪ領域を含む遺伝子断片、
ヒト免疫グロブリンに（カッパー）鎖遍伝子中に存在す
るＣ領域を含む遺伝子断片およびこれら遺伝子断片を導
入した発現紫の新規なプラスミドに関するものである。
子中に存在するＶ領域およびＪ領域を含む遺伝子断片、
ヒト免疫グロブリンに（カッパー）鎖遍伝子中に存在す
るＣ領域を含む遺伝子断片およびこれら遺伝子断片を導
入した発現紫の新規なプラスミドに関するものである。
ｂ、従来技術
最近の遺伝子操作技術の急速な発展に伴い、免疫グロブ
リン遺伝子の解明が進み、数多くの報告がなされている
。
リン遺伝子の解明が進み、数多くの報告がなされている
。
従来より、抗原特異的なヒトモノクローナル抗体は、そ
の取得は困難とされている。一方マウスに関しては、抗
原特異性を有するモノクローナルであった。
の取得は困難とされている。一方マウスに関しては、抗
原特異性を有するモノクローナルであった。
Ｃ８発明の目的
そこで本発明者は、免疫グロブリンにおけるに（カッパ
ー）鎖の遺伝子の解明、殊にマウス免疫グロブリンに鎖
遺伝子中の■領域およびＪ領域を含む遺伝子断片並びに
じ（へ免疫グ［］プリンに鎖遺伝了中のＣ領域を含む遺
伝子断片を得ること１１３」、びこれら遺伝子断片を導
入したキメラ抗体光】（５型のプラスミドの開発を目的
として研究を進めた結果、本発明に到達した。
ー）鎖の遺伝子の解明、殊にマウス免疫グロブリンに鎖
遺伝子中の■領域およびＪ領域を含む遺伝子断片並びに
じ（へ免疫グ［］プリンに鎖遺伝了中のＣ領域を含む遺
伝子断片を得ること１１３」、びこれら遺伝子断片を導
入したキメラ抗体光】（５型のプラスミドの開発を目的
として研究を進めた結果、本発明に到達した。
ｄ１発明の構成
本発明者の研究によれば、前記本発明の目的は、（１）
および（２）の遺伝子断片と（３）オよび（４）のプラ
スミドを提供することによって達成される。
および（２）の遺伝子断片と（３）オよび（４）のプラ
スミドを提供することによって達成される。
（１）第１図示された制限酵素切断地図で表わされるマ
ウス免疫グロブリンに（カッパー）鎖遺伝子中の■領域
およびＪ領域を含む約４，２Ｋ ｂｌ）の長さを有する
遺伝子断片（Ａ）。
ウス免疫グロブリンに（カッパー）鎖遺伝子中の■領域
およびＪ領域を含む約４，２Ｋ ｂｌ）の長さを有する
遺伝子断片（Ａ）。
（２］ 第２図に示された制限酵素切断地図で表わさ
れるヒト免疫グロブリンに（カッパー）鎖遺伝子中のＣ
領域を含む約２．６Ｋ ｂｐの長さを有する遺伝子断片
（Ｂ）。
れるヒト免疫グロブリンに（カッパー）鎖遺伝子中のＣ
領域を含む約２．６Ｋ ｂｐの長さを有する遺伝子断片
（Ｂ）。
（３） （ｉ）前記遺伝子断片（Ａ＞および（ｔｉ）
前記遺伝子（Ｂ）を該遺伝子断片（Ａ）におけるＡ−２
側に、該遺伝子断片（Ｂ）におけるＢ−１側か配列され
る順序で導入された新規なプラスミド。
前記遺伝子（Ｂ）を該遺伝子断片（Ａ）におけるＡ−２
側に、該遺伝子断片（Ｂ）におけるＢ−１側か配列され
る順序で導入された新規なプラスミド。
（４１（＋）前記遺伝子断片（Ａ＞、（ｉ）前記遺伝子
断片（Ｂ ） ｊ５よび（ロ）ヒト免疫グロブリンＨｆ
ａ３１仏子中のエンハンサ−塩基配列を含む遺伝子断片
（Ｃ）を導入し、且つ該遺伝子断片（Ａ）および該遺伝
子断片（Ｂ）は、該遺伝子断片（Ａ＞における△−２側
に、該遺伝子断片（Ｂ）にあ（）る［１３−２側が配列
される順序で導入された新規なプラスミド。
断片（Ｂ ） ｊ５よび（ロ）ヒト免疫グロブリンＨｆ
ａ３１仏子中のエンハンサ−塩基配列を含む遺伝子断片
（Ｃ）を導入し、且つ該遺伝子断片（Ａ）および該遺伝
子断片（Ｂ）は、該遺伝子断片（Ａ＞における△−２側
に、該遺伝子断片（Ｂ）にあ（）る［１３−２側が配列
される順序で導入された新規なプラスミド。
前記本発明の遺伝子断片（Ａ＞および遺伝子断片（Ｂ）
は、これらを該遺伝子断片（△）におけるＡ−２側に、
該遺伝子断片（Ｂ）におけるＢ−１側が配列される順序
に、組合せることによってマウス・ヒト型のキメラに鎖
を形成させることができ、このキメラに鎖は、マウス免
疫グロブリンのＶ（可変領域）とヒト免疫グロブリンの
Ｃ（定常領域）とからなるマウス・ヒト型のキメラ抗体
遺伝子の形成に使用することができる。
は、これらを該遺伝子断片（△）におけるＡ−２側に、
該遺伝子断片（Ｂ）におけるＢ−１側が配列される順序
に、組合せることによってマウス・ヒト型のキメラに鎖
を形成させることができ、このキメラに鎖は、マウス免
疫グロブリンのＶ（可変領域）とヒト免疫グロブリンの
Ｃ（定常領域）とからなるマウス・ヒト型のキメラ抗体
遺伝子の形成に使用することができる。
一般にＶ領域の遺伝子は抗原性が低いことは知られてお
り、マウス由来のＶ領域とヒト由来のＣ領域とから形成
されたキメラ抗体は、種々の病気の治療、例えば種々の
癌の治療に）■い得る。
り、マウス由来のＶ領域とヒト由来のＣ領域とから形成
されたキメラ抗体は、種々の病気の治療、例えば種々の
癌の治療に）■い得る。
本発明における遺伝子断片＜Ａ）は、後述する実施例に
記載された方法によって取得することができ、約４．２
Ｋ ｂｐの長さを有する。そしてこの遺伝子断片（Δ）
は、第１図に示されるように、制限酵素ＢｏｍＨＩ （
Ａ−１）およびｌ−１ｉｎｄｌＩ［（△−２）による切
断可能サイトを両端に有する断片であり、その中に制限
酵素ＰｓｔＩによる切断可能サイトを２個所、×ｂａ王
による切断可能サイトを１個所有している。
記載された方法によって取得することができ、約４．２
Ｋ ｂｐの長さを有する。そしてこの遺伝子断片（Δ）
は、第１図に示されるように、制限酵素ＢｏｍＨＩ （
Ａ−１）およびｌ−１ｉｎｄｌＩ［（△−２）による切
断可能サイトを両端に有する断片であり、その中に制限
酵素ＰｓｔＩによる切断可能サイトを２個所、×ｂａ王
による切断可能サイトを１個所有している。
また遺伝子断片（Ｂ）も、後述する実施例に記載された
方法によって取得プることができ、約２．６Ｋ ｂｌ）
の良さを何している。そのてこの遺伝子断片（Ｂ）は、
第２図に示されるようにその両端は制限酵素ＦＣＯＲＩ
により切断可能サイ１−を有しており、その中に制限酵
素５ａＣＩによる切断可能サイトをそれぞれ２個所有し
ている。
方法によって取得プることができ、約２．６Ｋ ｂｌ）
の良さを何している。そのてこの遺伝子断片（Ｂ）は、
第２図に示されるようにその両端は制限酵素ＦＣＯＲＩ
により切断可能サイ１−を有しており、その中に制限酵
素５ａＣＩによる切断可能サイトをそれぞれ２個所有し
ている。
かくして本発明においては、前記遺伝子切断（Ａ）およ
び遺伝子断片（Ｂ）とは該遺伝子（Ａ）における（Ａ−
２）側すなわちｌ−１ｉｎｄｌ［サイトに、該遺伝子断
片（Ｂ）における（Ｂ−１）側が配列されるような順序
で結合させてプラスミドに導入することにより発現型の
プラスミドが得られる。
び遺伝子断片（Ｂ）とは該遺伝子（Ａ）における（Ａ−
２）側すなわちｌ−１ｉｎｄｌ［サイトに、該遺伝子断
片（Ｂ）における（Ｂ−１）側が配列されるような順序
で結合させてプラスミドに導入することにより発現型の
プラスミドが得られる。
その際遺伝子断片（Ａ）と（Ｂ）との結合は、それぞれ
の断片をそのまま結合してもよいし、また特に支障のな
い限り他の遺伝子を介して結合（）てもよい。
の断片をそのまま結合してもよいし、また特に支障のな
い限り他の遺伝子を介して結合（）てもよい。
また前記遺伝子断片（Ａ）および（Ｂ）を前記の如くプ
ラスミドに導入する場合、ヒト免疫グロブリン遺伝子の
Ｈ鎖中のエンハンザ−塩基配列を含む遺伝子断片（Ｃ）
を組合せて導入づることにより、より発現効率のよいプ
ラスミドを得ることが可能である。このエンハンサ−機
能を有する遺伝子断片（Ｃ）は、プラスミド中の種々の
位置に導入することが可能であり、例えば、遺伝子断片
（Ａ）における（Ａ−１）側であってもよく、また遺伝
子（Ａ＞と（Ｂ）との間に位置してもよく、ざらに遺伝
子断片（Ｂ）における（Ｂ−２）側のいずれであっても
よい。また、遺伝子断片（Ｃ）は、どちらの方向性を持
−）で導入された場合にもその機能を発揮しうる。特に
遺伝子断片〈Ｃ）は、遺伝子断片（Ａ）の（Ａ−１）側
に免疫グロブリン遺伝子とその読み取りの方向をそろえ
た形で導入すると発現効率のよい優れたプラスミドが１
１１られる。
ラスミドに導入する場合、ヒト免疫グロブリン遺伝子の
Ｈ鎖中のエンハンザ−塩基配列を含む遺伝子断片（Ｃ）
を組合せて導入づることにより、より発現効率のよいプ
ラスミドを得ることが可能である。このエンハンサ−機
能を有する遺伝子断片（Ｃ）は、プラスミド中の種々の
位置に導入することが可能であり、例えば、遺伝子断片
（Ａ）における（Ａ−１）側であってもよく、また遺伝
子（Ａ＞と（Ｂ）との間に位置してもよく、ざらに遺伝
子断片（Ｂ）における（Ｂ−２）側のいずれであっても
よい。また、遺伝子断片（Ｃ）は、どちらの方向性を持
−）で導入された場合にもその機能を発揮しうる。特に
遺伝子断片〈Ｃ）は、遺伝子断片（Ａ）の（Ａ−１）側
に免疫グロブリン遺伝子とその読み取りの方向をそろえ
た形で導入すると発現効率のよい優れたプラスミドが１
１１られる。
本発明において使用されるエンハンサ“−機能を右する
）ｍ包子断片（Ｃ）は、本発明者の一部によって見出さ
れ、先に掟案されたものであり。特開昭６０−１２０９
９１号公報に開示されでいる。この公報に開示されたエ
ンハンリーｊ！Ａ基配列を本発明の）１１伝子断片（Ｃ
）として使用することがでさる。
）ｍ包子断片（Ｃ）は、本発明者の一部によって見出さ
れ、先に掟案されたものであり。特開昭６０−１２０９
９１号公報に開示されでいる。この公報に開示されたエ
ンハンリーｊ！Ａ基配列を本発明の）１１伝子断片（Ｃ
）として使用することがでさる。
本発明の前記遺伝子断片を導入するベクターどしては、
種々のものが挙げられる。かかるベクターとしては、例
えばｃｈａｒｏｎ ４Ａ 、 ｃｈａｒｏｎ２８λｇｔ
ＷＥｓ・λＢの如き大腸菌用７７Ｆ−ジベクター ：ｐ
ＢＲ３２２，Ｄ ｒ３Ｒ３２５，ｐ ＭＢ９の如き大腸
菌用プラスミドベクター； ｏ ＵＢ １１０． ＋
１１ ＨＷＩの如き枯草菌用プラスミドベクター：ＹＥ
ｐ１３゜ｐ ＪＤＢ ２１９． ＹＲｐ７． ＹＲｐ１
６ 、 Ｙ ｉｐ５゜Ｙ ［ｐ３２の如き酵母用プラス
ミドベクター；Ｐ Ｓ２ｎｅｏ、 Ｄ Ｓ Ｖ２ｇｐｔ
、 ｏ Ｋ Ｓ Ｖ −１０の如き動物細胞用プラスミ
ドベクター： Ｄ Ｔｉ Ｂ ６−８０６の如き動物
細胞用プラスミドベクターが挙げられるが、これらプラ
スミドベクターは単に例として示したものであって、こ
れら以外のプラスミドであって使用し得る。これらの中
で好ましいのは大腸菌用プラスミドベクターおよび動物
ｌ［ｌ胞用プラスミドベクターである。
種々のものが挙げられる。かかるベクターとしては、例
えばｃｈａｒｏｎ ４Ａ 、 ｃｈａｒｏｎ２８λｇｔ
ＷＥｓ・λＢの如き大腸菌用７７Ｆ−ジベクター ：ｐ
ＢＲ３２２，Ｄ ｒ３Ｒ３２５，ｐ ＭＢ９の如き大腸
菌用プラスミドベクター； ｏ ＵＢ １１０． ＋
１１ ＨＷＩの如き枯草菌用プラスミドベクター：ＹＥ
ｐ１３゜ｐ ＪＤＢ ２１９． ＹＲｐ７． ＹＲｐ１
６ 、 Ｙ ｉｐ５゜Ｙ ［ｐ３２の如き酵母用プラス
ミドベクター；Ｐ Ｓ２ｎｅｏ、 Ｄ Ｓ Ｖ２ｇｐｔ
、 ｏ Ｋ Ｓ Ｖ −１０の如き動物細胞用プラスミ
ドベクター： Ｄ Ｔｉ Ｂ ６−８０６の如き動物
細胞用プラスミドベクターが挙げられるが、これらプラ
スミドベクターは単に例として示したものであって、こ
れら以外のプラスミドであって使用し得る。これらの中
で好ましいのは大腸菌用プラスミドベクターおよび動物
ｌ［ｌ胞用プラスミドベクターである。
以上本発明によれば、マウス免疫グロブリンκ鎖遺伝子
中のＶ Ｊ５よび、Ｊ領域を含む遺伝子断片（Ａ）、ヒ
ト免疫グロブリンに鎖遺伝子中のＣ領域を含む遺伝子断
片（Ｂ）が提供でき、またこれら遺伝子断片を導入した
発現型のプラスミドか提供される。
中のＶ Ｊ５よび、Ｊ領域を含む遺伝子断片（Ａ）、ヒ
ト免疫グロブリンに鎖遺伝子中のＣ領域を含む遺伝子断
片（Ｂ）が提供でき、またこれら遺伝子断片を導入した
発現型のプラスミドか提供される。
以下実施例を掲げて本発明を詳述する。
実施例１
ヒト培養細胞Ａ Ｒ＋−１７７株３ ｘ １０８個をガ
ラス棒でつぶし、２％Ｓ Ｄ Ｓ （４在下、プロテア
ーゼＫ（シグマ社製）で処理した後、Ｉｏｎ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ −トＩＣｊ （ｐ Ｈ８，０） −１ｍＭ
ＥＤＴＡ水溶液で飽和したフェノールを加えた。遠心分
離により水槽とフェノール層を分解（フェノール抽出）
、水相を２０ｍ Ｍ ＴｒｌＳ Ｈ（Ｊ （Ｄ Ｈ７
，５＞ −１００ｍＭＮａ （Ｊ−５ｍＭ ＥＤＴＡ水
溶液に対しで透析した。リボヌクレアーゼＡ（シグマ社
製）９１１埋をし、フェノール抽出を行なった後、水相
を１０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ −１−ＩＣｆ （１） Ｈ
８，０） −１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液に対して透析し
、ヒト染色体ＤＮＡ約１，２１１＋ｊｊを取）マした［
Ｎ、 Ｂ１１ｎ ａｎｄ Ｄ、 Ｗ、 ５ｔａｆｒ
ｏｒｄ 。
ラス棒でつぶし、２％Ｓ Ｄ Ｓ （４在下、プロテア
ーゼＫ（シグマ社製）で処理した後、Ｉｏｎ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ −トＩＣｊ （ｐ Ｈ８，０） −１ｍＭ
ＥＤＴＡ水溶液で飽和したフェノールを加えた。遠心分
離により水槽とフェノール層を分解（フェノール抽出）
、水相を２０ｍ Ｍ ＴｒｌＳ Ｈ（Ｊ （Ｄ Ｈ７
，５＞ −１００ｍＭＮａ （Ｊ−５ｍＭ ＥＤＴＡ水
溶液に対しで透析した。リボヌクレアーゼＡ（シグマ社
製）９１１埋をし、フェノール抽出を行なった後、水相
を１０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ −１−ＩＣｆ （１） Ｈ
８，０） −１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液に対して透析し
、ヒト染色体ＤＮＡ約１，２１１＋ｊｊを取）マした［
Ｎ、 Ｂ１１ｎ ａｎｄ Ｄ、 Ｗ、 ５ｔａｆｒ
ｏｒｄ 。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 、 ３
．２３０３（１９７６） 参照］。
．２３０３（１９７６） 参照］。
実施例２〈ヒト逍伝子ライブラリーの作成）実施例１で
得られたヒト染色体ＤＮＡを後述する実施例７に示した
方法に準じＣ制限酵素ＦｃｏＲ１（宝酒造）で切断した
後、アガロースゲル電気泳動を行ない、２Ｋｂ〜３Ｋｂ
に相当するＤＮＡ断片をエレク１−口・エリューシ］ン
法を用いて回収した。次にこのＤＮＡ断片のλｃ）ｔＷ
Ｅ ＳλＢベクター（アマ−ジャム）との連結を行な
い、λａｔＷ Ｅ ＳλＢベクターの右のアームと左の
アームとの間にヒト由来のＤＮＡが挿入されたハイブリ
ッドＤＮＡを得た。
得られたヒト染色体ＤＮＡを後述する実施例７に示した
方法に準じＣ制限酵素ＦｃｏＲ１（宝酒造）で切断した
後、アガロースゲル電気泳動を行ない、２Ｋｂ〜３Ｋｂ
に相当するＤＮＡ断片をエレク１−口・エリューシ］ン
法を用いて回収した。次にこのＤＮＡ断片のλｃ）ｔＷ
Ｅ ＳλＢベクター（アマ−ジャム）との連結を行な
い、λａｔＷ Ｅ ＳλＢベクターの右のアームと左の
アームとの間にヒト由来のＤＮＡが挿入されたハイブリ
ッドＤＮＡを得た。
連結にはＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ）を用い、連結反応は６６ｍ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ （ｐ Ｈ７，６＞ −６，６ｍ Ｍ
ＭｏＣｌ３−１０１０Ｍジチオスレイトール−１１１
１Ｍ ＡＴＰ水溶液中で、１１℃、１２時間行なった
。得られたハイブリッドＤＮＡについて、ｉｎ Ｖｉ
ｔｒＯパッケージングを行ない、ヒト遺伝子ライブラリ
ー（アマージャム社ギットを使用）とした。
ラボラトリーズ）を用い、連結反応は６６ｍ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ （ｐ Ｈ７，６＞ −６，６ｍ Ｍ
ＭｏＣｌ３−１０１０Ｍジチオスレイトール−１１１
１Ｍ ＡＴＰ水溶液中で、１１℃、１２時間行なった
。得られたハイブリッドＤＮＡについて、ｉｎ Ｖｉ
ｔｒＯパッケージングを行ない、ヒト遺伝子ライブラリ
ー（アマージャム社ギットを使用）とした。
実施例３（ヒト免疫グロブリンに鎖遺伝子のスクリーニ
ング） 前記実施例２で得られたヒト由来のＤＮＡを含むλｇｔ
’ＷＥｓλＢファージの集合（遺伝子ライブラリー）を
大腸菌ＬＥ３９２株に感染させ、プラークを形成させた
。ヒト免疫グロブリンに鎖遺伝子を含むクローンは、Ｂ
ｅｎｔｏｎと１）ａｖｉｓのプラーク・ハイブリダイ
ゼーシコン法［Ｗ、［、） 、 ［３ｅｎｔｏｎａｎｄ
Ｒ，Ｗ、 Ｄａｖｉｓ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １
９６． １８０（１９７７）参照］を使用して、［３２
ｐ］−標識マウス免疫グロブリンＣに遺伝子で選択した
。ヒト免疫グロブリンに１′１遺伝子を含むλＧＴｗｃ
λＢファージからのＤＮＡの調製は、Ｔ ｈｏｍａｓと
［）ａｖｉｓの方法［Ｍ、 Ｔｈｏｉｉａｓ ａｎｄ
Ｒ，Ｗ、 ［）ａｖｉｓ、 Ｊ。
ング） 前記実施例２で得られたヒト由来のＤＮＡを含むλｇｔ
’ＷＥｓλＢファージの集合（遺伝子ライブラリー）を
大腸菌ＬＥ３９２株に感染させ、プラークを形成させた
。ヒト免疫グロブリンに鎖遺伝子を含むクローンは、Ｂ
ｅｎｔｏｎと１）ａｖｉｓのプラーク・ハイブリダイ
ゼーシコン法［Ｗ、［、） 、 ［３ｅｎｔｏｎａｎｄ
Ｒ，Ｗ、 Ｄａｖｉｓ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １
９６． １８０（１９７７）参照］を使用して、［３２
ｐ］−標識マウス免疫グロブリンＣに遺伝子で選択した
。ヒト免疫グロブリンに１′１遺伝子を含むλＧＴｗｃ
λＢファージからのＤＮＡの調製は、Ｔ ｈｏｍａｓと
［）ａｖｉｓの方法［Ｍ、 Ｔｈｏｉｉａｓ ａｎｄ
Ｒ，Ｗ、 ［）ａｖｉｓ、 Ｊ。
Ｍｏｌ： 、 Ｂｉｏｌ 、 、 ９１． ３１５（１
９７４） 参照］ ニにり行なった。
９７４） 参照］ ニにり行なった。
実施例４（マウス染色体ＤＮＡの単Ｍ）マウスハイブリ
ドーマＮＬ−１１Ｘ１０Ｂ個を１％Ｓ Ｄ Ｓ （Ｓ
ｏｄｉｕｎ＋ Ｉａｕｒｙｌ ５ｕｌｆ’ａｔｅ
）存在下プロテアーゼＫ（シグマ社製）で処理した後、
水飽和フェノールを加えＤＮＡを抽出した、遠心により
水相を分離し、ｔＯｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈ（Ｊｐ Ｈ
７，４，０，１ｍ Ｍ Ｎａ Ｃオ、 ０．１ａ＋
Ｍ ＥＤＴＡ （ＴＮＥ）バッファーで透析した。リ
ボヌクレアーゼＡ（シグマ）で処理し、再反フェノール
抽出を行なった後、ＴＮＥバッファーで透析しマウス染
色体ＤＮＡ１．２ｒｎｇを得た〈実施例１に記載の８１
ｉｎと３ ｔａｆｆｏｒｄの報告参照）。
ドーマＮＬ−１１Ｘ１０Ｂ個を１％Ｓ Ｄ Ｓ （Ｓ
ｏｄｉｕｎ＋ Ｉａｕｒｙｌ ５ｕｌｆ’ａｔｅ
）存在下プロテアーゼＫ（シグマ社製）で処理した後、
水飽和フェノールを加えＤＮＡを抽出した、遠心により
水相を分離し、ｔＯｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈ（Ｊｐ Ｈ
７，４，０，１ｍ Ｍ Ｎａ Ｃオ、 ０．１ａ＋
Ｍ ＥＤＴＡ （ＴＮＥ）バッファーで透析した。リ
ボヌクレアーゼＡ（シグマ）で処理し、再反フェノール
抽出を行なった後、ＴＮＥバッファーで透析しマウス染
色体ＤＮＡ１．２ｒｎｇを得た〈実施例１に記載の８１
ｉｎと３ ｔａｆｆｏｒｄの報告参照）。
実施例５（マウス遺伝子ライブラリーの作成）実施例４
で得られたマウス染色体ＤＮＡ１５０μびを後述する実
施例７に示した方法に準じて制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ（
宝酒造）で完全分解した後、初頭密度勾配遠心［初頭１
０〜４０％（ｗｔ／ｖｏｌ ） 。
で得られたマウス染色体ＤＮＡ１５０μびを後述する実
施例７に示した方法に準じて制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ（
宝酒造）で完全分解した後、初頭密度勾配遠心［初頭１
０〜４０％（ｗｔ／ｖｏｌ ） 。
２８０００ｒ、 ｐ 、 ｍ 、 Ｘ１５時間、２０℃
］を行ない、４Ｋｂ〜９Ｋｂに相当するＤＮＡ断片を得
た。
］を行ない、４Ｋｂ〜９Ｋｂに相当するＤＮＡ断片を得
た。
次にこのＤＮＡ断片０．４５μ９とＣｈａｒｏｎ２８ベ
クターＤＮＡ （ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
）のＨｉｎｄＩＩ［７−ムとの連結をＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼで行ない、アマージャム社のキットを用いて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージングを行ない、マウスＮＬ−
１遺伝子ライブラリー４ｘ１０６ＰＦＵ／μりを得た。
クターＤＮＡ （ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
）のＨｉｎｄＩＩ［７−ムとの連結をＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼで行ない、アマージャム社のキットを用いて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージングを行ない、マウスＮＬ−
１遺伝子ライブラリー４ｘ１０６ＰＦＵ／μりを得た。
実施例６（マウス免疫グロブリンに鎖遺伝子のスクリー
ニング） 前記実施例５を得られたマウスＮＬ−１由来のＤＮＡを
含むＣｈａｒｏｎ２８ファージを大腸菌ＩＥ３９２株に
感染させ、プラークハイブリダイゼーション法（Ｗ、
Ｄ、 Ｂｅｎｔｏｎ ｓｎｄ Ｒ，Ｗ。
ニング） 前記実施例５を得られたマウスＮＬ−１由来のＤＮＡを
含むＣｈａｒｏｎ２８ファージを大腸菌ＩＥ３９２株に
感染させ、プラークハイブリダイゼーション法（Ｗ、
Ｄ、 Ｂｅｎｔｏｎ ｓｎｄ Ｒ，Ｗ。
Ｄａｖｉｓ、 、 ５ｃｉｅｎｃｅ１９６ １８０（
１９７７）を使用しで７２ｐ標識マウス抗体に鎖Ｊ遺伝
子で選別した。
１９７７）を使用しで７２ｐ標識マウス抗体に鎖Ｊ遺伝
子で選別した。
マウス免疫グロブリンに鎮遺伝子を含むＣｈａ−ｒｏｎ
２８ファージからのＤＮＡの調製はＴｈｏｍａｓとＱａ
ｖｉｓの方法（前記）により行なった。
２８ファージからのＤＮＡの調製はＴｈｏｍａｓとＱａ
ｖｉｓの方法（前記）により行なった。
実施例７く制限酵素切断地図の作成）
実施例３及び６で得られたヒト及びマウスに鎖遺伝子を
含むファージＤＮＡ１μグを、制限酵素切断用バッフＦ
−［Ｅｃｏ Ｒ１，ＭｌｕＩ、Ｘｂａｌ。
含むファージＤＮＡ１μグを、制限酵素切断用バッフＦ
−［Ｅｃｏ Ｒ１，ＭｌｕＩ、Ｘｂａｌ。
切断では５０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｆｆｌ （１
） Ｈ７２４） −１００ｍＭ Ｎａ （Ｊ−１０ｍ
Ｍ Ｍ９８０４水溶液を、ＢａｍＨＩ 、 Ｈｉｎ
ｄ ｍ 、 ＰｓｔＴ 、切断では１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＦ （Ｄ トｔ ７，５）
−６０ｍ Ｍ Ｎａ （Ｊ −７ｍＭ
Ｍ ｇ（Ｊ ２水溶液を、ＡＣＣＩ、 ５ａｃＩ切
断では１０１Ｍ Ｔｒｉｓ −Ｈ（Ｊ （ｐＨ７，４
） −１０１１１ＭＭＣＩ ＳＯ４−１１１Ｍジチオス
レイトール水溶液を、そしてト（１１ａ１．切断では１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ −１ｉｃｆ（Ｄ Ｈ８，０）
２０ｍ Ｍ ＫＣｆ−７１１Ｍ ＩＶＨＩ Ｃ１ｚ
−１１１Ｍ２−メルカプトエタノール水溶液を、それぞ
れ用いた。２０μ旦に溶解させ、制限酵素（Ａｃｃ工及
びＳａｃ：［はニュー・イングランド・バイオラブズ社
製、それ以外は宝酒造製を用いた）。２ユニツトを添加
して、３７℃、１時間以上消化を行なった。なお、二種
類の制限酵素による切断を行なう場合には、まず低塩濃
度で作用する制限酵素で処理し、次に所定濃度まで塩濃
度を上げてから、より高塩濃度で作用する制限酵素で処
理した。
） Ｈ７２４） −１００ｍＭ Ｎａ （Ｊ−１０ｍ
Ｍ Ｍ９８０４水溶液を、ＢａｍＨＩ 、 Ｈｉｎ
ｄ ｍ 、 ＰｓｔＴ 、切断では１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＦ （Ｄ トｔ ７，５）
−６０ｍ Ｍ Ｎａ （Ｊ −７ｍＭ
Ｍ ｇ（Ｊ ２水溶液を、ＡＣＣＩ、 ５ａｃＩ切
断では１０１Ｍ Ｔｒｉｓ −Ｈ（Ｊ （ｐＨ７，４
） −１０１１１ＭＭＣＩ ＳＯ４−１１１Ｍジチオス
レイトール水溶液を、そしてト（１１ａ１．切断では１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ −１ｉｃｆ（Ｄ Ｈ８，０）
２０ｍ Ｍ ＫＣｆ−７１１Ｍ ＩＶＨＩ Ｃ１ｚ
−１１１Ｍ２−メルカプトエタノール水溶液を、それぞ
れ用いた。２０μ旦に溶解させ、制限酵素（Ａｃｃ工及
びＳａｃ：［はニュー・イングランド・バイオラブズ社
製、それ以外は宝酒造製を用いた）。２ユニツトを添加
して、３７℃、１時間以上消化を行なった。なお、二種
類の制限酵素による切断を行なう場合には、まず低塩濃
度で作用する制限酵素で処理し、次に所定濃度まで塩濃
度を上げてから、より高塩濃度で作用する制限酵素で処
理した。
制限酵素による切断後、４μρの０．２５％ブロモフェ
ノールブルー・５０％グリセロール水溶液を加え、０．
８％〜２．５％アガロースゲル電気泳動を行なった。ア
ガロースはシグマ社のタイプ■電気泳動用を使用した。
ノールブルー・５０％グリセロール水溶液を加え、０．
８％〜２．５％アガロースゲル電気泳動を行なった。ア
ガロースはシグマ社のタイプ■電気泳動用を使用した。
電気泳動バッファーとして、４０ｍ Ｍ Ｔｒ
ｉｓ −ＣＨ３Ｃ０ＯＨ（ｐ Ｈ８，０） −１
ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ水溶液を用いた。厚さ２閤の垂
直ゲルにて、６〜９ Ｖ／＋ａ＋＋の電圧で、１．５〜
３時間電気泳動を行なった。この電気泳動の際、ＤＮＡ
断片の分子量マーカーとして、λファージのＤＮＡをｔ
−１ｉｎｄｎ［で消化したちのくベーリンガー・マンハ
イム）を用いた。電気泳動終了後、アガロースゲル中の
ＤＮＡを２μ９／ｄエチジウムブロマイド水溶液を染色
し、このゲルに対して長波長紫外線を照射して、切断パ
ターンの観察を行なった。
ｉｓ −ＣＨ３Ｃ０ＯＨ（ｐ Ｈ８，０） −１
ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ水溶液を用いた。厚さ２閤の垂
直ゲルにて、６〜９ Ｖ／＋ａ＋＋の電圧で、１．５〜
３時間電気泳動を行なった。この電気泳動の際、ＤＮＡ
断片の分子量マーカーとして、λファージのＤＮＡをｔ
−１ｉｎｄｎ［で消化したちのくベーリンガー・マンハ
イム）を用いた。電気泳動終了後、アガロースゲル中の
ＤＮＡを２μ９／ｄエチジウムブロマイド水溶液を染色
し、このゲルに対して長波長紫外線を照射して、切断パ
ターンの観察を行なった。
各種υ１限醇素単独による切断、及び二種の制限酵素の
組合せによる切断、これらの切断パターンを解析するこ
とにより、各制限酵素切断点の相対位置関係を決定した
。
組合せによる切断、これらの切断パターンを解析するこ
とにより、各制限酵素切断点の相対位置関係を決定した
。
マウス免疫グロブリンに鎖遺伝子断片の制限酵素切断地
図を第１図に、ヒト免疫グロブリンに鎖遺伝子断片の制
限酵素切断地図を第２図に示した。
図を第１図に、ヒト免疫グロブリンに鎖遺伝子断片の制
限酵素切断地図を第２図に示した。
実施例８（ヒト免疫グロブリンに鎖Ｃ領域遺伝子のサブ
クローニング） ヒト免疫グロブリンに鎖ＣｇＡ域遺伝子を含むλａｔＥ
ＷｓλＢファージＤＮＡ３μ７を、実施例７の方法に準
じてＥＣ０ＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行
なった。Ｃに遺伝子を含む２．６ＫｂのＤＮＡ断片を、
エレクトロ・エリューション法を用いてアガロースゲル
より回収した。一方、大腸菌用プラスミドＤＢＲ３２２
１μ９を実施例７に準じてＥｃｏＲ４で切断したものに
対して、アルカリ性ホスファターゼ（ｅ 、 ｃｏｌｉ
ｃ７５） （宝酒造製）を０．５ユニット加えて、４
５℃で１時間反応させた。反応終了後、反応液中のアル
カリ性ホスファターゼを失活・除去するめだに、フェノ
ール抽出を３回繰返した。このようにして得られた［１
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ／アルカリ性ホスファターゼ処
理液を、ゲルより回収した２、６に、ｂ ＥｃｏＲＩ断
片水溶液と混ぜ、ニチノール沈澱の模、連結反応用バッ
ファー（実施例２を参照）５０μΩに溶解させる。２ユ
ニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加え、１１℃、１２時
間反応させて、ハイブリッドＤＮＡを（９る。
クローニング） ヒト免疫グロブリンに鎖ＣｇＡ域遺伝子を含むλａｔＥ
ＷｓλＢファージＤＮＡ３μ７を、実施例７の方法に準
じてＥＣ０ＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行
なった。Ｃに遺伝子を含む２．６ＫｂのＤＮＡ断片を、
エレクトロ・エリューション法を用いてアガロースゲル
より回収した。一方、大腸菌用プラスミドＤＢＲ３２２
１μ９を実施例７に準じてＥｃｏＲ４で切断したものに
対して、アルカリ性ホスファターゼ（ｅ 、 ｃｏｌｉ
ｃ７５） （宝酒造製）を０．５ユニット加えて、４
５℃で１時間反応させた。反応終了後、反応液中のアル
カリ性ホスファターゼを失活・除去するめだに、フェノ
ール抽出を３回繰返した。このようにして得られた［１
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ／アルカリ性ホスファターゼ処
理液を、ゲルより回収した２、６に、ｂ ＥｃｏＲＩ断
片水溶液と混ぜ、ニチノール沈澱の模、連結反応用バッ
ファー（実施例２を参照）５０μΩに溶解させる。２ユ
ニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加え、１１℃、１２時
間反応させて、ハイブリッドＤＮＡを（９る。
大腸菌ＤＨ１株の形質転換は、通常のＣａＣ１ｚ法［Ｍ
、 Ｖ、 Ｎｏｒｇａｒｄ、 Ｋ、 ）（ｅｅｎ ａ
ｎｄ Ｊ。
、 Ｖ、 Ｎｏｒｇａｒｄ、 Ｋ、 ）（ｅｅｎ ａ
ｎｄ Ｊ。
Ｊ、 Ｍｏｎａｈａｉ、 Ｇｅｎｅ 、 ３． ２１
９（１９７８）参照］の改良法で行なった。すなわち、
５Ｉｄ、のし培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％Ｎａ ＣＬ ｌ） Ｈ７，２）に大腸菌Ｄ
Ｈ１株の１８時間培養基を接種し、６００ｎｍにおける
光学密度０．３まで生育させる。菌体を冷たいマグネシ
ウム・バッファ’ −［０，ＩＭ Ｎａ Ｃｊ−５ｍ
Ｍ ＭｇＣｆｚ −５＋ｉＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ （
ＩＪ Ｈ７，６，０℃）］中で２回洗い、２Ｉｄの冷し
たカルシウム・バッファ −［１００ｍＭＣａ Ｃｆ２
−２５０ｍＭ ＫＣｆ−５ｍＭ Ｍ＜ｌ Ｃｊｚ
−５ｍＭＴｒｉｓ −Ｈ（Ｊ （＋１８７．６．０℃）
］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。次に菌体
をこの容量の１７１０にカルシウム・バッファーの中で
濃縮し、ハイブリッドＤＮＡ水溶液と２：１（ＶＯＩ、
：ｖｏｌ 、 ）混合する。この混合物を６０分間、０
℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン。
９（１９７８）参照］の改良法で行なった。すなわち、
５Ｉｄ、のし培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％Ｎａ ＣＬ ｌ） Ｈ７，２）に大腸菌Ｄ
Ｈ１株の１８時間培養基を接種し、６００ｎｍにおける
光学密度０．３まで生育させる。菌体を冷たいマグネシ
ウム・バッファ’ −［０，ＩＭ Ｎａ Ｃｊ−５ｍ
Ｍ ＭｇＣｆｚ −５＋ｉＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ （
ＩＪ Ｈ７，６，０℃）］中で２回洗い、２Ｉｄの冷し
たカルシウム・バッファ −［１００ｍＭＣａ Ｃｆ２
−２５０ｍＭ ＫＣｆ−５ｍＭ Ｍ＜ｌ Ｃｊｚ
−５ｍＭＴｒｉｓ −Ｈ（Ｊ （＋１８７．６．０℃）
］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。次に菌体
をこの容量の１７１０にカルシウム・バッファーの中で
濃縮し、ハイブリッドＤＮＡ水溶液と２：１（ＶＯＩ、
：ｖｏｌ 、 ）混合する。この混合物を６０分間、０
℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン。
Ｏ，Ｓ％酵母エキス、１％ＮａＣ１，０，０８％グルコ
ース、 ｐ Ｈ７，２）を添加し、３７℃で１時間培養
する。培養液を、選択培地（アンピシリン３０μｇ／ｄ
を含むし培地プレート）に １００μｐ／プレートで接
種する。プレートを３１℃で１番培養して、形質転換株
を生育させる。得られたコロニーより、公知の方法を用
いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、
目的のハイブリッドＤＮＡを確認した。
ース、 ｐ Ｈ７，２）を添加し、３７℃で１時間培養
する。培養液を、選択培地（アンピシリン３０μｇ／ｄ
を含むし培地プレート）に １００μｐ／プレートで接
種する。プレートを３１℃で１番培養して、形質転換株
を生育させる。得られたコロニーより、公知の方法を用
いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、
目的のハイブリッドＤＮＡを確認した。
第３図に、得られたサブ・クローンｐＹＮ−）−ＩＬＣ
の制限酵素切断地図を示す。
の制限酵素切断地図を示す。
実施例９（マウス免疫グロブリンに鎖Ｖ−Ｊ領域遺伝子
のサブクローニング） マウス免疫グロブリンに鎖Ｖ−Ｊ領域遺伝子を含むＣｈ
ａｒｏｎ２８ファージＤＮＡを、実施例７の方法に準じ
てＨｉｎｄｌ［［で切断し、アガロースゲル電気泳動を
行なった。前記実施例８と同様な手法により、Ｖに−Ｊ
に遺伝子を含む６．５Ｋ ｂのＤＮＡ断片をＤＢＲ３２
２のＨｉｎｄＩ［［サイトにクローニングし、ｐ ＹＮ
−ＭＬＶｌ及びｐＹＮ−ＭＬＶ２を作製した。
のサブクローニング） マウス免疫グロブリンに鎖Ｖ−Ｊ領域遺伝子を含むＣｈ
ａｒｏｎ２８ファージＤＮＡを、実施例７の方法に準じ
てＨｉｎｄｌ［［で切断し、アガロースゲル電気泳動を
行なった。前記実施例８と同様な手法により、Ｖに−Ｊ
に遺伝子を含む６．５Ｋ ｂのＤＮＡ断片をＤＢＲ３２
２のＨｉｎｄＩ［［サイトにクローニングし、ｐ ＹＮ
−ＭＬＶｌ及びｐＹＮ−ＭＬＶ２を作製した。
第４図に、得られたサブクローンｐ ＹＮ−ＭＬＶｌ
、ｌ）ＹＮ−ＭＬＶ２の制限酵素切断地図を示す。Ｖに
−Ｊに３１伝子を含むＢａｍＨＩ （Ａ−１＞−Ｈｌｎ
ｄ ｍ （Ａ−２）断片のＨｉｎｄ ｍ （Ａ−２）が
［）ＢＲ３２２のＥＣ０ＲＩサイト寄りに連結されたち
の（Ｖに−Ｊに遺伝子の読み取り方向が、第４図におい
て、反時計まわり）が［）ＹＮ−ＭＬＶＩ。
、ｌ）ＹＮ−ＭＬＶ２の制限酵素切断地図を示す。Ｖに
−Ｊに３１伝子を含むＢａｍＨＩ （Ａ−１＞−Ｈｌｎ
ｄ ｍ （Ａ−２）断片のＨｉｎｄ ｍ （Ａ−２）が
［）ＢＲ３２２のＥＣ０ＲＩサイト寄りに連結されたち
の（Ｖに−Ｊに遺伝子の読み取り方向が、第４図におい
て、反時計まわり）が［）ＹＮ−ＭＬＶＩ。
その逆オリエンテーションのものがρＹＮ−ＭＬＶ２で
ある。
ある。
実施例１０（マウス・ヒト・キメラ抗体遺伝子の作製）
実施例９で得られた、マウス免疫グロブリンに鎖Ｖ−Ｊ
領域遺伝子を含む［）ＹＮ−ＭＬＶＩを、実施例７の方
法に準じて３ａｒｎＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動を行なった。
領域遺伝子を含む［）ＹＮ−ＭＬＶＩを、実施例７の方
法に準じて３ａｒｎＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動を行なった。
得られたＶに−Ｊに遺伝子を含む４．２１（ｂのＥＣＯ
ＲＩ−ＢＭＨＩ断片を、実施例８と同様な手法により、
ＤＳＶ２ｎｅｏベクター［Ｐ、 Ｊ、 ５ｏｕｔｈ −
ｅｒｎ ａｎｄ ｐ、 Ｂｅｒａ 、 Ｊ、 Ｍｏ
１． Ａｌｌ［）Ｉ 。
ＲＩ−ＢＭＨＩ断片を、実施例８と同様な手法により、
ＤＳＶ２ｎｅｏベクター［Ｐ、 Ｊ、 ５ｏｕｔｈ −
ｅｒｎ ａｎｄ ｐ、 Ｂｅｒａ 、 Ｊ、 Ｍｏ
１． Ａｌｌ［）Ｉ 。
Ｇｅｎｅｔ、 １． ３２７（１９８２） ］のＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間に挿入し、プラスミドｐＳＶ２ｎ
ｅｏ −ＭＬＶを作製した。これを第５図に示す。
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間に挿入し、プラスミドｐＳＶ２ｎ
ｅｏ −ＭＬＶを作製した。これを第５図に示す。
次に、実施例８で得られた、ヒト免疫グロブミンに鎖Ｃ
領域遺伝子を含むｏ ＹＮ−ＨＬＣを、実施例７の方法
に準じてＥＯＯＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動
を行なった。得られたＣに遺伝子を含む２．６Ｋ ｂの
ＤＮＡ断片を、実施例８と同様な手法を用いて、上記プ
ラスミドＤＳＶ２ｎｅ。
領域遺伝子を含むｏ ＹＮ−ＨＬＣを、実施例７の方法
に準じてＥＯＯＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動
を行なった。得られたＣに遺伝子を含む２．６Ｋ ｂの
ＤＮＡ断片を、実施例８と同様な手法を用いて、上記プ
ラスミドＤＳＶ２ｎｅ。
−ＭＬＶのＥＣ０ＲＩサイトに挿入した。得られたクロ
ーンのうち、ヒトＣｔｃＭ伝子を含むＥＣ０ＲＩ（Ｂ−
１）−ＥｃｏＲＩ （Ｂ−２＞の断片のＥｃｏＲＩ（Ｂ
−１）がマウス■に−Ｊに遺伝子側に連結されたもの（
マウスＶに−Ｊに遺伝子とヒトＣに遺伝子の読み取り方
向が一致しているもの）を選択し、このプラスミドをＦ
）ＳＶ２ｎｅＯ−ＭＨＬと名付けた。これを第５図に示
す。
ーンのうち、ヒトＣｔｃＭ伝子を含むＥＣ０ＲＩ（Ｂ−
１）−ＥｃｏＲＩ （Ｂ−２＞の断片のＥｃｏＲＩ（Ｂ
−１）がマウス■に−Ｊに遺伝子側に連結されたもの（
マウスＶに−Ｊに遺伝子とヒトＣに遺伝子の読み取り方
向が一致しているもの）を選択し、このプラスミドをＦ
）ＳＶ２ｎｅＯ−ＭＨＬと名付けた。これを第５図に示
す。
一方、特開昭６０−１２０９９１公報に記載のヒト免疫
グロブリンγ１鎖遺伝子を含むプラスミドｐＴＪ３を、
実施例７記載の方法に準じてＭｌｕＩ及びＨＤａＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動により、約０，９Ｋｂの
ヒトγ１鎖遺伝子エンハンサー領域を含むＭ ＩｕＩ
−Ｈ１）ａｌ断片を得た。このＤＮＡ断片をポリメラー
ゼ用バッファー（３７ｎ＋Ｍリン酸カリウム、 ６．
７１１１ Ｍ ＭＣ１Ｃ１ｚ 、 １１１Ｍ ２−
メルカプトエタノール、 Ｄ Ｈ７，４）に溶解し、ｄ
ＮＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼ・フレノウ（ｋｌ
ｅｎｏｗ）・フラグメントにュー・イングランド。バイ
オラブズ）を加えることにより、末端の平滑化を行なっ
た。さらに、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いてこの両端に
Ｂａ１ＲＨＩリンカ−（宝酒造）を連結した後、Ｂａｍ
ＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により約０．９
Ｋ ｂのヒトγ１鎮遭伝子エンハンサー領域を含むＢａ
ｍｆ−ＩＩ断片を得た。このＤＮＡ断片を上記プラスミ
ドｐＳＶ２ｎｅｏ −ＭＨＬのＢａｍ１−ＩＩサイトに
挿入し、挿入オリエンテーションのそれぞれ異なるプラ
スミドｐ ５Ｖ２ｎｅｏ −ＭＨＬＥＩ及び［）ＳＶ２
ｎｅｏ−ＭＨＬＥ２を作製した。
グロブリンγ１鎖遺伝子を含むプラスミドｐＴＪ３を、
実施例７記載の方法に準じてＭｌｕＩ及びＨＤａＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動により、約０，９Ｋｂの
ヒトγ１鎖遺伝子エンハンサー領域を含むＭ ＩｕＩ
−Ｈ１）ａｌ断片を得た。このＤＮＡ断片をポリメラー
ゼ用バッファー（３７ｎ＋Ｍリン酸カリウム、 ６．
７１１１ Ｍ ＭＣ１Ｃ１ｚ 、 １１１Ｍ ２−
メルカプトエタノール、 Ｄ Ｈ７，４）に溶解し、ｄ
ＮＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼ・フレノウ（ｋｌ
ｅｎｏｗ）・フラグメントにュー・イングランド。バイ
オラブズ）を加えることにより、末端の平滑化を行なっ
た。さらに、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いてこの両端に
Ｂａ１ＲＨＩリンカ−（宝酒造）を連結した後、Ｂａｍ
ＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により約０．９
Ｋ ｂのヒトγ１鎮遭伝子エンハンサー領域を含むＢａ
ｍｆ−ＩＩ断片を得た。このＤＮＡ断片を上記プラスミ
ドｐＳＶ２ｎｅｏ −ＭＨＬのＢａｍ１−ＩＩサイトに
挿入し、挿入オリエンテーションのそれぞれ異なるプラ
スミドｐ ５Ｖ２ｎｅｏ −ＭＨＬＥＩ及び［）ＳＶ２
ｎｅｏ−ＭＨＬＥ２を作製した。
これを第５図に示す。
添付第１図は本発明の遺伝子断片＜Ａ）の制限酵素切断
地図を示し、また第２図は本発明の遺伝子断片（Ｂ）の
制限酵素切断地図を示すものでり、第３図は本発明の実
施例８にて得られたサクローン１）ＹＮＩ−ＩＬｃの制
限酵素切断地図をすものであり、第４図は本発明の実施
例９に１０れたサブクローンｐＹＮ−ＭＬＶ１，１）Ｙ
Ｎ−ＬＶ２の制限酵素切断地図を示すものであり、５図
は、本発明の実施例で得られたプラスミド制限酵素切断
地図を示すものである。 特許出願人 帝 人 株 式 会 代 理 人 弁理士 前 １） 純あ
第３図 ブ 示 ０．５ Ｋｂｐ ドー−一→ 第４ 図 第５図−ｂ （連５図−〇５リフブ（） 手続ネ市正書く方式） 昭和６１年 ２月ンレ１：１
地図を示し、また第２図は本発明の遺伝子断片（Ｂ）の
制限酵素切断地図を示すものでり、第３図は本発明の実
施例８にて得られたサクローン１）ＹＮＩ−ＩＬｃの制
限酵素切断地図をすものであり、第４図は本発明の実施
例９に１０れたサブクローンｐＹＮ−ＭＬＶ１，１）Ｙ
Ｎ−ＬＶ２の制限酵素切断地図を示すものであり、５図
は、本発明の実施例で得られたプラスミド制限酵素切断
地図を示すものである。 特許出願人 帝 人 株 式 会 代 理 人 弁理士 前 １） 純あ
第３図 ブ 示 ０．５ Ｋｂｐ ドー−一→ 第４ 図 第５図−ｂ （連５図−〇５リフブ（） 手続ネ市正書く方式） 昭和６１年 ２月ンレ１：１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、第１図示された制限酵素切断地図で表わされるマウ
ス免疫グロブリンκ鎖遺伝子中のＶ領域およびＪ領域を
含む約４．２Ｋｂｐの長さを有する遺伝子断片。 ２、第２図に示された制限酵素切断地図で表わされるヒ
ト免疫グロブリンκ鎖遺伝子中のＣ領域を含む約２．６
Ｋｂｐの長さを有する遺伝子断片。 ３、（ｉ）第１図に示された制限酵素切断地図で表わさ
れるマウス免疫グロブリンκ鎖遺伝子中のＶ領域および
Ｊ領域を含む約４．２Ｋｂｐの長さを有する遺伝子断片
（Ａ）、および （ｉｉ）第２図に示された制限酵素切断地図で表わされ
るヒト免疫グロブリンκ鎖遺伝子中のＣ領域を含む約２
．６Ｋｂｐの長さを有する遺伝子断片（Ｂ）と該遺伝子
断片（Ａ）におけるＡ−２側に、該遺伝子断片（Ｂ）に
おけるＢ−１側が配列される順序で導入した新規なプラ
スミド ４、（ｉ）第１図示された制限酵素切断地図で表わされ
るマウス免疫グロブリンκ鎖遺伝子中のＶ領域およびＪ
領域を含む約４．２Ｋｂｐの長さを有する遺伝子断片（
Ａ）、 （ｉｉ）第２図に示された制限酵素切断地図で表わされ
るヒト免疫グロブリンκ鎖遺伝子中のＣ領域を含む約２
．６Ｋｂｐの長さを有する遺伝子断片（Ｂ）、および （ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンＨ鎖遺伝子中のエンハン
サー塩基配列を含む遺伝子断片（Ｃ）、を導入し且つ該
遺伝子断片（Ａ）および（Ｂ）は該遺伝子断片（Ａ）に
おけるＡ−２側に、該遺伝子断片（Ｂ）におけるＢ−１
側が配列される順序で導入された新規なプラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23954385A JPS62100291A (ja) | 1985-10-28 | 1985-10-28 | 遺伝子断片およびプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23954385A JPS62100291A (ja) | 1985-10-28 | 1985-10-28 | 遺伝子断片およびプラスミド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62100291A true JPS62100291A (ja) | 1987-05-09 |
Family
ID=17046372
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23954385A Pending JPS62100291A (ja) | 1985-10-28 | 1985-10-28 | 遺伝子断片およびプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62100291A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63283818A (ja) * | 1987-05-13 | 1988-11-21 | Shizuoka Seiki Co Ltd | 電解加工による仕上げ加工方法 |
| US5604102A (en) * | 1992-04-15 | 1997-02-18 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors |
| US5605811A (en) * | 1992-10-26 | 1997-02-25 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein |
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