JP2000514286A

JP2000514286A - ルーメン微生物のフィターゼをコードするｄｎａ配列

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Publication number: JP2000514286A
Application number: JP10501994A
Authority: JP
Inventors: ジョアンチェンクオ; ブレントセリンジャーレオナルド; ジェイヤンケリンゼイ; ドンベーヒー; ゾウリューミング; ウォレスフォースバーグセシル
Original assignee: Agriculture and Agri-Food Canada
Current assignee: Agriculture and Agri-Food Canada
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 2000-10-31
Also published as: PL330532A1; CA2257101A1; NO985804L; BR9709793A; KR20000016576A; EP0904385A2; US5985605A; NO985804D0; AU716845B2; NZ333332A; WO1997048812A2; IL127477A0; CA2257101C; AU3021697A; WO1997048812A3

Abstract

(57)【要約】ルーメン微生物から誘導されるフィターゼが提供される。このフィターゼはフィチン酸からの無機リンの放出を触媒することができる。このフィターゼの有利な供給源はSelenomonas，Prevotella，Treponema及びMegasphaeraが含まれる。Selenomonas ruminantium JY35(ATCC 55785)のフィターゼをコードする精製単離されたＤＮＡが提供される。フィターゼをコードするＤＮＡを有する組換え発現ベクター及びフィターゼをコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞も提供される。このフィターゼは、特に動物飼料補給剤における使用を含めた、フィチン酸塩の脱リン酸を必要とする広範囲の適用に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】ルーメン微生物のフィターゼをコードするＤＮＡ配列発明の利用分野本発明はルーメン微生物から誘導されたフィターゼに関する。発明の背景家畜の飼料の植物要素はリンを豊富に含んでいるが、有機リンの補充は単胃の動物の良好な成長効率を得るために必要である。フィチン酸（ミオイノシトール六リン酸）は一般に、カルシウム、マグネシウム及びカリウム塩及び／又はタンパク質の複合体として存在し、これは穀類、脂肪種子及び豆類中のリンの主要な形態であり、種子乾燥重量の１〜３％、及び種子中に存在する全体のリンの６０〜９０％に当たる（Graf，1986）。しかしながら、単胃の動物（例えばブタ、家禽及び魚）は胃腸管中でフィチン酸塩の加水分解が可能な酵素が不完全であるためフィチン酸塩をあまり利用していないか又は全く利用していない。フィチン酸塩はほとんど無傷で上方胃腸管を通過し、この場合、鉱物（例えばカルシウム及び亜鉛）、アミノ酸及びタンパク質の結合（Graf，1986）及び酵素の阻害により栄養素の生物学的利用能を低下させてしまう。堆肥中のフィチン酸塩のリンは、単胃の家畜を集中的に生産している地域の表面水の富栄養化を生じる多様な汚染問題を引き起こす。フィチン酸塩が原因である生産性の非効率及びリン汚染は、単胃動物の飼料にフィターゼを補充することにより有効に取り扱うことができる。フィターゼはフィチン酸塩をミオイノシトールと有機リンとへ加水分解することを触媒し、これらは次に小腸中で吸収される。さらに、リンを補充する必要性を減少させ、かつ放出されるフィチン酸塩汚染量を減少させ、つまりフィターゼはフィチン酸塩の反栄養素作用を減少させる。フィターゼは動物及び植物（主に種子）組織中で及び多様な微生物により作り出されている（米国特許第３２９７５４８号明細書、Shieh and ware，1968;War e and Shieh，1967）。一連の潜在的フィターゼ源にもかかわらず、土壌菌（Asp ergillus niger又はAspergillus ficuum）だけが現在フィターゼの市販品のために使用されている。A．ficuumにより製造されたフィターゼは著しく比活性（１００ユニット／タンパク質ｍｇ（その際、ユニットは１分あたり放出されたホスフェートのμｍｏｌとして定義される））を有し、他の微生物から特徴付けられたフィターゼと比較して熱安定性である（欧州特許出願番号第０４２０３５８号（van Corcum et al.，1991）及び米国特許第５４３６１５６号明細書（van Gor cum et al.，１９９５年７月２５日発行））。このA．Ficuumフィターゼは酸性のフィターゼであり、ｐＨ５．５より上では僅かな活性を示す（Howson and Davis，1983;van Gorcum et al.，1991）。従って、活性は単胃の消化管の比較的狭い範囲に制限され、消化管内でｐＨは２〜３（胃中）から４〜７（小腸中）に変動する。単胃の飼料のフィターゼ補充の考えは２５年以前に提案されている（米国特許第３２９７５４８号明細書、Ware and Shieh，1967）が、酵素の製造のための高いコストは、家畜産業においてフィターゼの使用を制限している。北アメリカにおいて、補充フィターゼはリン補充よりも一般により費用がかかる。同様の事情で、フィターゼ利用のコストは、この酵素の使用がカルシウムのような第２の栄養素の補充の必要性を減少させる場合に相殺することができる。北アメリカにおけるフィターゼの使用は、ブタ及び家禽の個体数の増加及び家畜生産と関連する汚染の減少の一般的圧力の増大に対して有利である。リン補充剤の高いコスト及びフィターゼの使用を要求する立法措置は、この捕捉剤の使用を北アメリカにおけるよりも欧州及び東洋の一部により一般的にしている。オランダ、ドイツ、韓国及び台湾の政府は、単胃家畜生産により引き起こされるリン汚染を減少させるために立法化しているか又は立法化措置を行っている。フィターゼ使用を増加させるためのより有効な手段は、コストの削減である。フィターゼのコストは製造コストの削減及び／又は優れた活性を有する酵素の生産により低減させることができる。バイオテクノロジーにおける近年の進歩は、酵素製造のコスト的に有効なもう一つの方法を提供することにより、商業的酵素産業に革命を起こすことができる。組換えＤＮＡ技術の適用は、製造者に酵素の収率及び有効性の向上及び新規の製品を製造を可能にするための手段を与える。この起源生物は市販の酵素の製造を制限する必要はない。優れた酵素をコードする遺伝子は、嫌気性菌及び菌類のような生物から、実際に工業的製造のために一般的に、十分に特性決定された工業的微生物製造宿主（例えばAspergillus及びB acillus spp.）中へ挿入される。さらに、これらの遺伝子は新規の植物及び動物発現系に挿入することもできる。単胃動物とは異なり、反芻動物（例えばウシ及びヒツジ）は、フィチン酸中のリンを難なく利用している。このことは、フィターゼがルーメン中に存在することの証拠であり、反芻動物はルーメンフィターゼのために飼料のリン補充を必要とせずに高穀類飼料（フィチン酸塩が豊富）で飼育できる。このフィターゼ製造がルーメン微生物に起因しているという唯一の報告（Raun et al.，1956）があるが、総合的にフィチン酸塩を利用する反芻動物の独自の能力を主に無視している。Raun et al．（1956）は遠心により沈殿させることにより微生物懸濁液を製造している（Chang et al.，1955）。このような微生物懸濁液はほとんど植物材料の微細粒子で汚染されている。植物がフィターゼを製造しているため、この研究は植物フィターゼ又は微生物フィターゼが観察された活性を作り出しているかどうかは結論に達していない。Raun et al.はルーメンフィターゼ製造がルーメン微生物に起因することができる可能性を提案したが、この可能性は調査しなかった。前記のことから、動物飼料補充剤中で使用するのに適した生化学的特性を有するローコストのフィターゼの必要性が残っている。本発明の概要本発明は、ルーメンが工業的適用、例えば動物飼料補充及びイノシトール製造に適当な生化学的特性（例えば温度及びｐＨ安定性、低い金属イオン感受性及び高い比活性）を有するフィターゼを製造する微生物の豊富な供給源であることを見出した。ルーメン微生物は嫌気性条件下にも耐性で、かつ通性又は偏性嫌気性菌であってもよい。ルーメン微生物は原核生物（例えば細菌）又は真核生物（例えば菌類、プロトゾア）であってもよい。本願明細書中に使用したような「ルーメン微生物」の用語は、反芻動物の消化物又は分から分離した微生物を包括する。特定の活性フィターゼを提供することが明らかにされたルーメン細菌種は、Se lenomonas ruminantium，Prevotella sp，Treponema bryantii及びMegaphaera e lsdeniiである。prevotella及びSelenomonasは細菌類（family Bacteriodaceae ）のグラム陰性嫌気性桿菌である。本発明により、ルーメン微生物から誘導された新規でかつ有用なフィターゼをコードするＤＮＡ配列が提供された。 Selenomonas ruminantium菌株JY35からのフィターゼ遺伝子（ｐｈｙＡ）がクローンニングされ、シーケンジングされ、ｐｈｙＡ遺伝子のヌクレオチド配列が提供された。本発明はフィターゼをコードしかつｐｈｙＡ遺伝子配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列に関する。本願明細書中で使用する「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる」とは、目的ヌクレオチド配列又はその相補的な鎖を、無関係の配列のアニーリングを制限する標準条件（例えば高温及び／又は低塩含有率）下でアニーリングすることを意味する。本願明細書中で使用する「低いストリンジェンシー条件」とは、ハイブリダイゼーション及び４０〜５０℃の洗浄条件、６×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ（約５０〜８０％の相同性を示す）を意味する。本願明細書中で使用する「中程度のストリンジェンシー条件」とは、ハイブリダイゼーション及び５０〜６５℃の洗浄条件、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ（約８０〜９５％の相同性を示す）を意味する。本願明細書中で使用する「高いストリンジェンシー条件」とは、ハイブリダイゼーション及び６５〜６８℃の洗浄条件、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ（約９５〜１００％の相同性を示す）を意味する。本願明細書で使用した「フィターゼ」という用語は、ミオイノシトールホスフェートからの有機リンの除去を触媒することができる酵素を意味する。本願明細書で使用した「ミオイノシトールホスフェート」という用語は、制限はないが、ミオイノシトールヘキサホスフェート、ミオイノシトールペンタホスフェート、ミオイノシトールテトラホスフェート、ミオイノシトールトリホスフェート、ミオイノシトールジホスフェート及びミオイノシトールモノホスフェートを包含する。本願明細書で使用した「フィチン酸塩」とは、ミオイノシトールヘキサリン酸の塩を意味する。本発明は、s．ruminantium JY35(ATCC55785)生物自体にも関しており、フィターゼ活性を示すこの微生物及び他のルーメン微生物の同定及び分離方法にも関しており、並びにｐｈｙＡ遺伝子配列の一部又は全部を試料として使用するフィターゼ活性を示すルーメン微生物からのフィターゼ遺伝子の分離、クローニング及び発現方法にも関している。さらに、本発明は、微生物の酸性産物により引き起こされる擬似陽性の結果を排除した、微生物によるフィターゼ製品の分析方法に関する。微生物のコロニーはフィターゼを含有する成長培地上で成長させる。この培地を塩化コバルトの水溶液と接触させ、次いでこの培地を透明な区域について試験した。有利にこの培地をすぐに検査するよりも、塩化コバルト溶液を除去し、この培地をモリブデン酸アンモニウム及びバナジン酸アンモニウムの水溶液と接触させ、次いで透明な区域を検査したほうがよい。酸形成微生物が透明な区域を作った場合に生じる擬似陽性の結果は排除される。本発明は、適当な宿主細胞中でフィターゼの直接的発現が可能な制御配列と操作可能に結合した本発明のフィターゼをコードするＤＮＡを有する発現構造体に関する。さらに、本発明は、本発明のフィターゼをコードするＤＮＡで形質転換されかつ発現する宿主細胞に関する。本願明細書中で使用された「宿主細胞」とは、動物、植物、酵母、菌類、プロトゾア及び原核生物の宿主細胞である。さらに、本発明は、本発明のフィターゼをコードするＤＮＡで形質転換され、その結果、形質転換された植物はフィターゼを発現することができるたトランスジェニック植物及びこうして形質転換された植物の製造方法に関する。本願明細書中で使用された「トランスジェニック植物」とは、トランスジェニック植物、組織及び細胞である。本発明のフィターゼはフィターゼの脱リン酸化を必要とする広範囲な適用において利用できる。このような適用は、動物飼料補充剤、調整飼料、ヒト栄養素及びフィチン酸からのイノシトールの製造における使用である。本発明のフィターゼは、フィチン酸塩金属キレート化の有害作用を最小限にするために使用することも可能である。特定の飼料、例えば大豆粉末の高いフィチン酸塩含有量は、魚類、単胃動物、若年及び幼年の反芻動物のためのタンパク質源としてのその価値を減少させる、それというのもこのフィチン酸塩は鉱物類のキレート化により及びアミノ酸及びタンパク質の結合により、栄養素の生物学的利用能を減少させるためである。このような飼料を本発明のフィターゼで処理することは、フィターゼにより媒介される脱リン酸化によりフィチン酸含有量が減少し、タンパク源として使用するのにより適当な飼料を提供する。従って、本発明は、本発明のフィターゼで処理した飼料からなる新規の飼料組成物、及び本発明のフィターゼを含有する飼料添加剤に関する。このような飼料組成物及び添加物は、他の酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ及び酸ホスファターゼも含有することができる。このフィターゼは、未処理の飼料、ペレット化された飼料又は他の加工された飼料に直接添加することができるか、又は飼料とは別に、たとえばミネラルブロック、ピル、ゲル調整剤、液体調整剤、又は飲料水中に供給することができる。本発明は、通常の成長条件下で本発明のフィターゼを発現する凍結乾燥された微生物を含有する飼料接種材料調製物に関する。このような飼料接種材料調製物に関して、「通常の成長条件」とは、微生物の収穫及び凍結乾燥の前の培地条件を意味する。この微生物は大規模発酵器中で微生物培地の成長の間にフィターゼを発現する。微生物中のフィターゼの活性は、フィターゼを含有する収穫された微生物濃縮物の凍結乾燥により保存される。本発明は、さらに、動物に有効量の本発明のフィターゼを給餌することにより飼料用ホスフェートの動物の利用能を改善する方法に関する。本願明細書中で使用されたフィターゼの「有効量」とは、動物によるリンの利用能を統計的に明らかに改善する量を意味する。フィチン酸塩のリンの利用能は、例えば動物の成長の改善及び動物堆肥中のフィチン酸塩の濃度の減少によって証明することができる。図面の説明図１は、フィチン酸塩を含有する対比染色した寒天培地の、酸形成又はフィターゼ活性により作られた透明な区域に関する効果を示す写真である。フィチン酸塩寒天にS．bovis（左側のペトリ皿の上方）及びS．ruminantium JY35（左側のペトリ皿の下方）を接種し５日間３７℃でインキュベートした。このコロニーを切り取り、塩化コバルト及びモリブデン酸アンモニウム／バナジン酸アンモニウム溶液（右側のペトリ皿）で対比染色した。図２は改良Scott and Dehority(1965)肉汁中でのS.ruminantium JY35の成長（タンパク質）及びフィターゼ製造をグラフで示す図である。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、基質としてフィチン酸ナトリウムを使用して、フィターゼにより沈着した反応生成物についてインキュベートしたS．ruminantium J Y35の中間指数的成長相の培養からの細胞の透過型電子顕微鏡写真である。未処理の対照細胞を、比較のために図３Ｄ、３Ｅ及び３Ｆに示した。図４は、異なる５種の緩衝液中のS．ruminantium JY35の洗浄のためのフィターゼｐＨプロファイルをグラフで示す図である。図５は、異なる５種の緩衝液中でのS．ruminantium JY35 ＭｇＣｌ₂細胞抽出物のｐＨプロファイルをグラフで示す図である。図６は、S．ruminantium JY35 ＭｇＣｌ₂細胞抽出物の温度プロファイルをグラフで示す図である。図７は、S．ruminantium JY35フィターゼ活性に関するイオン（１０ｍＭ）の効果をグラフで示す図である（Ｃｔｒ＝対照）。図８は、S．ruminantium JY35フィターゼ活性に関するフィチン酸ナトリウムの効果をグラフで示す図である。図９は、フィターゼ活性の確認のために現像したザイモグラムである。S．rum inantium JY35 ＭｇＣｌ₂細胞抽出物（レーンＢ〜Ｅ）、低分子量マーカー（レーンＦ、BioRad Laboratories Canada Ltd,Mississauga，Ontario）及びA．Ficu umフィターゼ（Sigma，1.6U,レーンＡ）の濃縮物（１０×）を１０％ポリアクリルアミドゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。レーンＡ〜Ｅはフィターゼ活性に関して染色され、レーンＦはクーマシーブリリアントブルーで染色した。図１０は、ｐＳｒＰ．２（上側）、ｐＳｒＰ．２ΔＳｐｈＩ（左下側）及びｐＳｒＰｆ６（右下側）で形質転換したE．Coli DH5αのフィターゼ活性についてのフィターゼ加水分解プレートアッセイの写真である。透明の区域は４８時間３７℃でプレートをインキュベートした後に見られた。図１１は、プローブとしてｐＳｒＰ．２からの２．７ｋｂ断片を用いて、S．r uminantium JY35から分離されたＳｐｈ１消化ｐＳｒＰ．２ＤＮＡ（レーンＢ）及びＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡ（レーンＣ）に対するサザンブロット分析写真である。図１２はｐＳｒＰ．２の物理的地図である。S．ruminatium JY35ゲノムＤＮＡのＳａｕ３Ａ部分消化物からの２．７ｋｂ断片を、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ部位中へクローニングした。この断片はS．ruminatium JY35からのフィターゼをコードする全体の遺伝子を有している。連結の結果として失われるＢａｍＨＩ部位の位置は角括弧内で示した。図１３はS．ruminatiumフィターゼ遺伝子の欠失分析を示す図である。ｐｈｙＡの位置は水平の矢印により示される。２．７ｋｂのＳａｕ３Ａ断片の斜め線の棒で示した区分は異なるプラスミド誘導体により運搬された。フィターゼ活性は、右側の欄に示した。図１４はフィターゼ活性について現像したザイモグラムである。E．coli DH5 α（ｐＳｒＰ．２）細胞（レーンＡ）、E．ｃoli DH5α（ｐＳｒＰ．２ΔＳｐｈＩ）細胞（レーンＢ）及び低分子量マーカー（レーンＣ、BioRad Laboratories ）を、１０％ポリアクリルアミドゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。レーンＡ及びＢはフィターゼ活性について染色し、レーンＣはクーマシーブリリアントブルーを用いて染色した。図１５は、S．ruminantium JY35フィターゼ遺伝子（ｐｈｙＡ）（配列番号１）のヌクレオチド配列及びこの導き出されたアミノ酸配列（配列番号２）である。ヌクレオチド１はｐＳｒＰ．２の２．７ｋｂ挿入体のｎｔ１２３２に相当する。推定のリボソーム結合部位は下線を引き、Ｒ．Ｂ．Ｓ．として配列の上方に示した。Heijne(1986)の方法により予測したシグナルペプチド分割部位は↑で示した。E．coli（ｐＳｒＰｆ６）から分泌されるこのフィターゼのＮ末端アミノ酸配列は下線を引いた。有利な実施態様の詳細な記載ルーメンは３００種を越える細菌、菌類及びプロトゾアが存在する複雑な生態系である。フィターゼ活性についてのこれらの生物のスクリーニングは個々の単離種のフィターゼ活性を識別する能力が必要である。これは、培養技術（ストリークプレーティング、希釈及びマイクロマニピュレーション）により個々の細胞を採集、分離、培養する貯蔵培地から純粋培養を評価することにより成し遂げられる。細菌、菌類及びプロトゾアについて記載された標準の無菌、嫌気性技術は、この目的を達成するために用いることができる。適当な酵素アッセイは、ルーメン液サンプル中の及び培養採集物からの微生物単離種のスクリーニングのために及びフィターゼ遺伝子のクローニングのために必要である。溶液中のフィターゼ活性を測定するためのアッセイは文献に記載されている。サンプル溶液は一般に、フィチン酸からの無機リン（Ｐ_i）の放出量を測定することによりフィターゼ活性を分析する（Ra un et al.，1956；van Hartingsveldt et al.，1993）。フィターゼ活性は固形培地上で検出することができる。フィターゼを発現する微生物は寒天培地上にフィチン酸ナトリウム又はフイチン酸カルシウムを含有する透明の区域を作る（Sh ieh anh Ware，1968;Howson and Davis 1983）。しかしながら、文献に記載された固形培地アッセイは、酸製造細菌、例えばtreptococcus bovisの擬似陽性反応のために、フィターゼ活性についてのルーメン細菌のスクリーニングについて不満足であることが判明した。この問題を克服するために、固形培地を有するペトリ皿にまず第１に塩化コバルト水溶液を流し、第２にモリブデン酸アンモニウム／バナジン酸アンモニウム水溶液を流す、２工程の対比染色方法が開発された。この処理の後に酵素活性により作られた透明の区域は明らかである（図１）。上記の溶液及び固形培地を用いて、レスブリッジ・リサーチ・センター（Leth briqe，Alberta，Canada）カルチャー・コレクションからの３４５の単離種がフィターゼ活性についてスクリーニングされた（表１）。実際にフィターゼ活性を有する２９の培養の合計が同定され、２４種のSelenomonas属及び５種のprevote lla属が含まれていた。この培養の１２種（１１種のSelenomonas単離種及び１種のprevotella単離種）が実際に他の陽性の培養よりも著しく高いフィターゼ活性を有していた（表２）。 S．ruminantium JY35(American Type Culture Collection，12301 Parklawn D rive，Rockville，Maryland，20852-1776に１９９６年５月２４日にATCC 55785 として寄託）のフィターゼが更なる調査のために選ばれ、Aspergillus ficuum N RRL 3135(van Gorcum et al.，1991 and 1995)からの市販のフィターゼ（Gist-b rocades nv，Delft，The Netherlands）と比較した。S．ruminantium JY35（ATC C 55785）のフィターゼは構造的に発現され、細胞から移出され、細胞表面と会合する。S．ruminantium JY35（ATCC 55785）フィターゼのｐＨプロファイル（図５）及び温度プロファイル（図６）は、市販のA．ficuum NRRL 3135フィターゼのものより工業的製造のためには適していないが、比較可能であった。この結果は、現在工業的に製造されているフィターゼにとって優れた特性を有するフィターゼ供給源としてルーメン及び嫌気性微生物の潜在能力を示す。選択された酵素をコードする微生物遺伝子は多様な方法によりクローニングすることができる。遺伝子ライブラリー（ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡ）は標準的方法（Sambrook et al.，1989;Ausubel et al.，1990）により構築され、所望の遺伝子についてスクリーニングされる。このスクリーニング法は異種プローブ、酵素活性又は遺伝子産物の精製の間に生じる結果、例えばＮ末端及び内部アミノ酸配列データ及び抗体を用いることができる。固形培地フィターゼアッセイを用いて、ルーメン微生物により作られたフィターゼ活性の検出を明らかにし、S．ruminantium JY35(ATCC 55785)遺伝子ライブラリーは陽性のクローンについてスクリーニングした。調査した６０００のクローンの内で、単集落がコロニーを取り巻く透明な大きな区域によりフィターゼ陽性クローンとして同定された。このクローンは、クローニングベクターｐＵＣｌ８中へ挿入した２．７ｋｂのＳａｕ３ＡＤＮＡ断片からなる５．５ｋｂのプラスミドを有していた。新たに分離された２．７ｋｂのＳａｕ３ＡＤＮＡ断片はサザンブロットハイブリダイゼーションの試料として用いた。高いストリンジェントな条件下で、個々のバンドはS．ruminantium単離種JY35(ATCC 55785)について検出することができたが、prevotella sp．46/5²，E．Coli DH5α又はA．ficu um NRRL 3135を検出することはできなかった。プラスミドＤＮＡは新たに分離されたクローンから分離され、E．coli細胞中に形質転換により挿入し、アンピシリン耐性、フィターゼ陽性ＣＦＵを製造した。S．ruminatium JY35(ATCC 55785)からの２．７ｋｂのＳａｕ３ＡＤＮＡ断片を有するE．coli DH5α細胞からの細胞抽出物のザイモグラム分析は、３７ｋＤａの推定分子量を有する単一活性バンドを示した。欠失及びＤＮＡ配列分析は、組換体E．coliクローン中に観察された活性の原因であるフィターゼをコードする遺伝子（ｐｈｙＡ）を同定するために使用された。ｐｈｙＡを有するE．c oli細胞中で発現された精製された３７ｋＤａのフィターゼのＮ末端アミノ酸配列は、クローン化されたｐｈｙＡ配列から予想された完全なフィターゼのＮ末端アミノ酸配列と一致した。このことは、フィターゼをコードするヌクレオチド配列が単離されたことを決定的に示している。このヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列を図１５に示した。他の遺伝子と同様に、市販の酵素の製造のための多様な発現系中に特性決定されたフィターゼをコードする配列を使用することもできる。組換ＤＮＡ技術の適用は、酵素製造の容量及び効率を増大させるため、及び新規の製品を作り出すための酵素製造を可能にする。起源生物は市販の酵素を製造する必要はない。優れた酵素をコードする遺伝子は、一般に工業的製造に非実用的な生物、例えば嫌気性細菌及び菌類から、十分に特性決定された工業的微生物産生宿主（例えば、As pergillus，pichia，Trichoderma，Bacillus spp.）中へ挿入することができる。さらに、この遺伝子は、新規の植物及び動物発現系に挿入することができる。微生物の工業的菌株（例えば、Aspergillus niger，Aspergillus ficuum，Asp ergillus awamori，Aspergillus oryzae，Trichoderma reesei，Mucor miehei， Kluyveromyces lactis，Pichia pastoris，Saccharomyces cerevisiae，Escheri chia coli，Bacillus subtillis又はBacillus licheniformis）又は植物宿主（例えば、canola，soybean，corn，potato）がフィターゼの製造のために使用することができる。この全ての系は、遺伝子を発現するための同様な方法に用いられる。発現構造体は、関心のある配列をコードするタンパク質及び制御配列、例えばプロモータ、エンハンサ及びターミネータを包含するように組み立てられる。他の配列、例えばシグナル配列及び選択マーカーを含むこともできる。フィターゼの細胞外発現を達成するために、本発明の発現構造体は分泌シグナル配列を用いる。このシグナル配列は、細胞質発現が所望の場合には発現構造体上に含まれない。このプロモータ及びシグナル配列はホスト細胞中で機能的であり、発現及びコードされた配列産物の分泌を提供する。転写ターミネータは有効な転写を補償するために含まれる。発現又はタンパク質の精製を向上させる補助的配列も発現構造体中に含むことができる。フィターゼ活性のための配列をコードするタンパク質はルーメン微生物源から得られる。このＤＮＡは発現宿主と相同物又は異種物であってもよい。相同のＤＮＡは本願明細書では同種から由来するＤＮＡと定義される。例えば、S．ruminantiumを、その種に予め存在しない特性を導入するのではなく存在する特性を改良するために、S．ruminan tiumからのＤＮＡを用いて形質転換することができる。異種ＤＮＡは異なる種から由来するＤＮＡであると定義される。例えば、S．ruminantium ｐｈｙＡをE． coli中でクローニング及び発現させることができる。タンパク質の機能に影響を及ぼさずにタンパク質配列中に特定のアミノ酸置換を作成することができることは生物学的分野において公知である。一般に、保存性のアミノ酸置換はタンパク質機能に影響を与えずに許容される。同様のアミノ酸は、サイズ及び／又は荷電特性において同様のものであることができ、例えばアスパルテート及びグルタメート及びイソロイシン及びバニリンは同様のアミノ酸の２つのペアである。同様に、アミノ酸ペアの間でもいくつかの方法において評価される。例えば、本願明細書に参照することにより組み込まれるDayhoff et al．（1978）Atlas of Protein Sequence and Structure，volume 5，Suppleme nt 3，Chapter 22，pages 345-352は、アミノ酸置換についての頻度表を提供しており、これはアミノ酸の類似性の基準として用いられる。Dayhoff et al.の頻度表は、進化的に異なる多様な起源からの同様の機能を有するタンパク質についてのアミノ酸配列の比較をベースとしている。全長のタンパク質が完全なタンパク質の機能を必ずしも示さない、例えば、Ｎ末端、中間又はＣ末端タンパク質が欠失している切断されたタンパク質がしばしば完全な天然タンパク質の生物学的及び／又は酵素活性を示すことは周知である。ｐｈｙＡを含んだ遺伝子の切断試験はにより、切断されたタンパク質が無傷のタンパク質の機能を保持することができることが確認された。Ｎ末端アミノ酸１〜３７又は１０５８（配列番号２）が欠失しているＰｈｙＡを発現するExherich ia coliクローンはフィターゼ陽性表現系を示した。反対に、アミノ酸３０７〜３４６（配列番号２）が欠失しているＰｈｙＡ発現クローンについてはフィターゼ活性を検出することはできなかった。通常の当業者は切断されたタンパク質及び中間が欠失しているタンパク質をどのようにして作るかは公知である。本発明において、末端切断されたフィターゼタンパク質又は中間が欠失したフィターゼタンパク質の機能は、この分野において一般的に公知である後記するアッセイを用いて直ちに試験することができる。特別に本願明細書に記載したフィターゼと同じ酵素活性を実質的に保持した、置換された、中間が欠失した及び末端が切断されたルーメンフィターゼ誘導体は、例示したフィターゼと同等物であると考えられ、かつ本発明の範囲内であり、特に置換、中間欠失又は末端切断されたフィターゼ誘導体の特定の活性は、特別に例示されたフィターゼの少なくとも約１０％である。当業者は、ルーメンフィターゼ、末端切断フィターゼ、中間欠失フィターゼ又は置換フィターゼの活性を、本願明細書で教示した及びこの分野で一般に公知のアッセイ手順を用いて容易に測定することができる。本発明は、この分野において一般的に公知であることを考慮して、本願明細書中に記載されたように分析した場合にフィターゼと実際に機能的に同等である、ルーメン微生物のフィターゼから誘導された構造的に異なるフィターゼ、特に本願明細書に開示されたフィターゼから誘導されたフィターゼを包含する。本発明の構造的に異なり機能的に相同なフィターゼは、本願明細書に開示したフィターゼアミノ酸配列（配列番号２）におけるような、近接のアミノ酸配列を有するルーメン微生物のフィターゼを包含し、特にこの異なるフィターゼは長さにおいて少なくとも約２５個のアミノ酸の近接の配列であるルーメン微生物のフィターゼの近接アミノ酸配列を有する。本発明は、本願明細書で単離された酵素の特性とは異なる特性を有するフィターゼの構築のための出発材料も提供する。この遺伝子は、公知の手段（例えば、化学的、部位指定、ランダムポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発）により容易に突然変異誘発することができ、その際、改変された特性（例えば温度又はｐＨ最適条件、比活性又は基質特異性）を有する遺伝子産物が製造される。多様なプロモータ（転写開始調節部位）は本発明により使用することができる。適当なプロモータの選択は使用する発現ホストに依存する。プロモータの選択は、配列をコードするクローンされたタンパク質に会合するプロモータ、又は選択されたホスト中で機能性である限り異種の供給源からのプロモータを含めることができる。異種のプロモータの例はE．coli tac及びtrcプロモータ（Brosius et al.，1985）、Bacillus subtilis sacBプロモータ及びシグナル配列(Wong，1 989)、pichia pastorisからのaox1及びaoc2（Ellis et al.，1985）及びBrassic a napus又はArabidopsis thalianaからのオレオシン速度特異的プロモータ（van Rooijen and Moloney，1994）である。プロモータの選択は所望の効果及びペプチド又はタンパク質製造のレベルにも依存する。タンパク質の過剰発現はホスト細胞に有害になり得る。従って、ホスト細胞の成長は制限することができる。誘導可能なプロモータ系の使用は培養すべきホスト細胞を遺伝子発現の誘導の前に許容できる密度にし、その際、産物の高い収率を可能にする。配列をコードするタンパク質が目的遺伝子座中へ遺伝子置換（オメガ挿入）事象により組み込まれる場合、プロモータ選択は目的遺伝子座プロモータと相同性の度合いにより影響を及ぼされることもできる。多様なシグナル配列を本発明により使用することもできる。発現すべき配列をコードするタンパク質に対して相同であるシグナル配列を使用することもできる。また、発現ホスト中の分泌を改善するために選択又は望ましいシグナル配列も使用することができる。例えば、B．subtilis中での分泌のためのB．subtilis s acBシグナル配列、Saccharomyces cerevisiae α−交配因子又はp．pastoris分泌のためのp．pastoris酸ホスファターゼpholシグナル配列も使用することができる。配列をコードするタンパク質がオメガ挿入事象により組み込まれる場合、目的遺伝子座に対する相同性の程度他高いシグナル配列が必要となることがある。このシグナル配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位をコードする配列を通して配列をコードするタンパク質に直接結合することができるか、又は通常１０コドンよりも小さい構造体の短いヌクレオチドブリッジを通して結合することができる。発現転写（プロモータ活性）及び翻訳を向上させるための要素は、真核生物タンパク質発現系に対しても認められる。例えば、異種プロモータの両サイドのカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモータ１０００ｂｐの位置は転写レベルを１０〜４００倍高めることができる。発現構造体は適当な翻訳開始配列をも含むべきである。適当な翻訳開始のためのKozakコンセンサス配列を含めるための発現構造体の改良は翻訳レベルを１０倍高めることができる。タンパク質の精製を高めるための要素を、発現構成物中に含めることができる。オレオシン遺伝子融合の産物は、関心のある遺伝子産物と結合するオレオシン遺伝子を有するハイブリッドタンパク質である。この融合タンパク質はオレオシンの親油性特性を保持し、かつ油体膜（oil body membranes，van Rooijen and Moloney，1994）中に組み込まれる。この油体との会合は組換えオレオシン融合タンパク質の精製を容易にするために利用される（van Rooijen and Moloney，1 994）。選択マーカーは通常使用され、これは発現構成物の一部又はそれから分離されたものであることができ（例えば発現ベクターにより運ばれる）、このマーカーは関心のある遺伝子とは異なる部位で組込むことができる。本発明の組換えＤＮＡ分子を用いたホスト細胞の形質転換は選択可能なマーカーを用いることにより監視される。この例は抗生物質に対する耐性を付与するマーカー（例えば、bla はE．coliホスト細胞にアンピシリン耐性を付与する、nptllはB．napus細胞にカナマイシン耐性を付与する）であるか又はホストが最小培地で成長できるようにするマーカー（例えば、HIS4はヒスチジン不在でP．pastoris GS115 His^-が成長できるようにする）である。この選択マーカーは、マーカーに依存して発現させるために、それ自体転写及び翻訳開始位置及び終止調節位置を有する。抗生物質耐性はマーカーとして使用する場合、選択のための抗生物質濃度は抗生物質に依存して変えられ、一般に培地１ｍＬ当たり抗生物質１０〜６００μｇの範囲である。発現構造体は公知の組換えＤＮＡ技術を用いて組み込まれる。制限酵素による消化及び連結はＤＮＡの２つの断片を結合させるために使用される基本的な工程である。ＤＮＡフラグメントの末端は連結する前に改変することができ、これは突出部の充填、ヌクレアーゼ（例えばExolll）を用いた断片の末端部分の削除、部位直接的突然変異誘発、及びポリメラーゼ連結反応（ＰＣＲ）による新規塩基対の付加により行うことができる。ポリリンカー及びアダプターは選択断片の結合を容易にするために用いることができる。この発現構造体は一般に制限、連結及びE．coliの形質転換のラウンドを用いる工程で組み立てられる。発現構造体の構築のために有効な多様なクローニングベクターが存在し、この特定の選択は本発明にとって重要ではない。クローニングベクターの選択はホスト細胞中へ発現構造体を移入するために選択される遺伝子輸送系により影響をうける。それぞれの工程の終わりに生じた構造体は、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション及びＰＣＲ分析により分析される。この発現構造体はクローニングベクター構造体としてホスト中へ、線状又は環状で、形質転換させることができるか、又はクローニングベクターから取り出されて使用されるか、又は配達ベクター上へ導入して使用される。配達ベクターは選択されたホスト細胞タイプ中での発現構造体の挿入及び保持を容易にする。この発現構造体は、多様な遺伝子輸送系（例えば自然な受容、化学的に媒介される形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、バイオリスティック形質転換（biolistic transformation）、トランスフェクション又は接合）を使用してホスト細胞中へ挿入される。この遺伝子輸送系は使用したホスト細胞及びベクター系に依存して選択される。例えば、この発現構造体はP．pastoris細胞内へプロトプラスト形質転換又はエレクトロポレーションにより導入することができる。P．pastorisのエレクトロポレーションは容易に行われ、スフェロプラスト形質転換と比較して有効な形質転換が得られる。P．pastoris細胞は、殺菌水で洗浄され、低い導電性溶液（例えば１Ｍソルビトール溶液）中に再懸濁される。高い電圧衝撃をこの細胞懸濁液にかけ、細胞膜中に一過性の細孔を作り、それを通して形質転換ＤＮＡ（例えば発現構造体）をセル中に入れる。この発現構造体は相同的組換えによりaox1（アルコールオキシダーゼ）遺伝子座への組み込みにより安定に維持される。また、配列をコードするタンパク質に操作により連結されたsacBプロモータ及びシグナル配列を有する発現構造体は、ｐＵＢ１１０（B．subtilis細胞中で自律複製可能なプラスミド）上に担持される。得られたプラスミド構造体は形質転換によりB．subtilis細胞内へ導入される。Bacillus subtilis細胞は貧栄養素条件で成長した場合、自然な受容が展開される。第３の例において、Brassica napus細胞はアグロバクテリウム媒介形質転換により形質転換される。発現構造体は、A．tumefaciens内での複製及び植物細胞内への可動が可能なバイナリーベクター上に挿入される。こうして得られた構造体は減弱されたＴｉ又は「ヘルパープラスミド」を担持するA．tumefaciens細胞内へ形質転換される。葉の円盤状組織（leaf disk）を組換えA．tumefaciens細胞で感染させる場合、この発現構造体はB．napusの葉の細胞中へバイナリーベクター：：発現構造体の接合可動性により挿入される。この発現構造体は植物細胞遺伝子中へアトランダムに組み込まれる。発現構造体を有するホスト細胞（つまり形質転換された細胞）は、発現構造体又はベクターを有する選択マーカーの使用により同定され、関心のある遺伝子の存在は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ及び抗体を含めた多様な技術を用いて確認される。形質転換微生物細胞は、液体又は半固体培地上でのバッチ発酵及び連続発酵を含めた多様な技術により成長させることができる。形質転換された細胞は最大の産物対コスト比に最適化された条件下で増殖される。産物の収量は、培養パラメータ、例えば温度、ｐＨ、通気、及び培地組成の操作により劇的に増加することができる。組換体過剰発現E．coli細胞の成長条件の注意深い操作及び監視により、培養バイオマスを生じさせ、それぞれ１５０ｇ（湿潤重量）の細胞／Ｌ及び５ｇの不溶性タンパク質／Ｌが生じた。プロテアーゼ阻害剤（例えばフェニルメチルスルホニルフルオリド又はペプスタチン）の低い濃度は、過剰発現ペプチド又はタンパク質のタンパク質分解を減少させるために使用することができる。また、プロテアーゼ欠失ホスト細胞は所望のタンパク質の分解を減少させるか又は取り除くことができる。選択及びスクリーニングの後に、形質転換した植物細胞は、公知の方法を用いて開発及び培養された完全な植物及び変種のトランスジェニック植物に再生することができる。本願明細書中で使用した「トランスジェニック植物」とはトランスジェニック植物、植物組織及び植物細胞を包含する。発酵の後、微生物細胞は、ダウンストリーム法、例えば遠心分離及び濾過により培地から取り除くことができる。細胞内製造の場合、この細胞は収穫され、機械的力、超音波、酵素、薬品及び／又は高圧の適用により細胞を破壊することにより産物を放出させる。過剰発現E.coli系中で生じるような不溶性産物の製造は、産物の精製を容易にするために用いることができる。産物内容物は破壊された細胞から遠心分離により抽出することができ、汚染されたタンパク質は低濃度の変性剤（例えば、０．５〜６Ｍ尿素、０．１〜１％ドデシル硫酸ナトリウム又は０．５〜４．０Ｍグアニジン−ＨＣｌ）を含有する緩衝液で洗浄することにより除去することができる。この洗浄された内容物は６〜８Ｍ尿素、１〜２％ドデシル硫酸ナトリウム又は４〜６ＭグアニジンＨＣｌを含有する溶液中に溶解することができる。溶解した産物は透析の間に変性剤をゆっくりと除去することにより再生することができる。フィターゼは収穫された一部から又は完全な植物から、すりつぶし、ホモジナイズ及び／又は化学的処理により抽出することができる。速度特異的親油性オレオシン融合の使用は、砕いたcanola種子の水性タンパク質を除いた油画分中でのオレオシン融合タンパク質の分別を容易にする（van Rooijenand Moloney，1994 ）。必要な場合に、多様な方法の精製が、微生物発酵及び植物抽出物からの産物を使用することができる。これは沈殿（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（ゲル濾過、イオン交換、アフィニティ液体クロマトグラフィー）、限外濾過、電気泳動、溶剤−溶剤抽出（例えばアセトン沈降）、これらの組合せ等が含まれる。微生物培地及び植物の一部又は全部は、フィターゼの活性を必要とする適用において直接使用することができる。粗製の又は精製されたフィターゼ調製物の多様な製剤を製造することもできる。この酵素は、他のタンパク質（例えば、ゼラチン、スキムミルクパウダー）及び化学薬品（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、還元剤及びアルデヒド）の添加により安定化することができる。酵素懸濁液は濃縮（例えば、接線流動濾過）又は乾燥（噴霧乾燥及びドラム乾燥、凍結乾燥）することができ、公知の方法により液体、粉末、顆粒、ピル、鉱物ブロック及びゲルとして調整することができる。ゲル化剤、例えばゼラチン、アルギネート、コラーゲン、寒天、ペクチン及びカラゲニンが使用することができる。さらに、フィチン酸塩の完全な脱リン酸化はフィターゼ単独では達成できない。フィターゼは、低いミオイノシトールホスフェートを脱リン酸化することができない。例えば、米国特許代５５３６１５６号明細書（van Gorcum et al.，１９９５年７月２５日発行）に記載されたA．ficuumフィターゼは、ミオイノシトール二リン酸又はミオイノシトール一リン酸に対してホスファターゼ活性が低いか又はホスファターゼ活性を示さない。ホスファターゼを含有する本発明の飼料添加物に他のホスファターゼ、例えば酸ホスファターゼを添加することは、ミオイノシトール二リン酸及びミオイノシトール−リン酸の脱リン酸化を補助する。所望の産物の調製物はフイターゼ活性を必要とする適用に直接使用することができる。濃縮液、粉末又は顆粒は、反応混合物、発酵物、液浸穀物及び粉砕屑に直接添加することができる。調整されたフィターゼは動物の飲用水に、ミネラルブロック、例えば塩の形で、又は粉末補給剤として飼料桶へ又は飼料に混合して投与することもできる。公知の方法により飼料に噴霧して混合するか又は他の飼料と一緒にペレット化することもできる。また、適当なプロモーターエンハンサーを有するフィターゼ遺伝子は動物遺伝子内へ組み込み、胃腸管内へフィターゼ酵素を分泌する器官又は組織（例えば、唾液腺、膵臓又は上皮細胞）中で選択的に発現させることもでき、それにより補足的フィターゼの添加は必要なくなる。有利な調製物において、本発明のフィターゼは微生物飼料接種物の形を採ることもできる。天然のフィターゼを発現する微生物、例えばS．ruminantium JY35( ATCC55785)又は異種のフィターゼ遺伝子によりコードされたフィターゼを発現する組換え微生物は発酵機中で高濃度で成長し、次いで収穫され、遠心分離により濃縮される。次いで食品等級ホエー及び／又は他の凍結防止剤がこの細胞濃縮物と混合される。こうして得られた混合物を、次に標準の凍結乾燥法によりフィターゼ活性を保護するためにクライオゲニック凍結及び凍結乾燥した。凍結乾燥した培養を、産物の濃度を調節するために不活性担持剤とこの培養とをブレンドする次の工程によりさらに加工して最終生成物の形にする。本発明により製造される微生物培養及び植物の一部又は全部は、フィターゼの活性が必要な多様な工業的プロセスに使用することができる。このような適用には、これに制限されないが、最終生成物、例えばリン酸イノシトール及びイノシトールの製造、飼料成分の製造及び非反芻動物（例えば、ブタ、家禽、魚類、ペットフード）用の飼料添加剤の製造及びフィチン酸を含有する飼料に関連する他の工業製品（大豆及びトウモロコシ加工品、スターチ及び発酵品）の製造が含まれる。フィチン酸塩の分解は、動物及び微生物にとって有用な無機リン酸塩及びキレート金属を作り出す。このフィターゼ活性は、フィチン酸を多量に有する飼料内容物及び／又は発酵物の品質、価値及び用途を増大させる。フィターゼの作用は、トウモロコシの湿式粉砕に関連する浸潰プロセス及び分離プロセスを促進することもできる。本発明のフィターゼ遺伝子は、他の微生物からのフィターゼをコードする遺伝子の単離に関する異種ハイブリダイゼーション及びポリメラーゼ連結反応試験において使用することもできる。次の実施例は、例示しているにすぎず、本発明を制限するものではない。使用した数値（例えば温度、ｐＨ、量）に関しての精度は保証されるが、若干の実験的な変動及び偏差は認識すべきである。例１ルーメン細菌の分離カニューレ挿入したホルスタイン種のウシからのル体をオロガストリック・チューブ（orogastric tube）を介してルーメンから取り出すことができた。適当な嫌気性環境下（例えば、ＣＯ₂ ９０％及びＨ₂ １０％）で、ルーメン液の１０倍の連続的希釈液を製造し、液状成長培地（例えば、Scott and Dehority，1965）上に分配し、このプレートを３９℃で１８〜７２時間インキュベートした。分離したクローンを殺菌ループを用いて取り出し、この細胞を、単離クローンの製造のために新たな寒天培地の表面上に分配した。単一のコロニーからの細胞は形態的試験により純粋培養を表すことが確認され、培養され、Lethbridqe Research Centre（“LRC"）culture collectionに保管され又は酵素活性又は遺伝子材料の供給源として使用された。例２フィターゼ活性についてのルーメン細菌のスクリーニングＡ．フィターゼ活性試料溶液（培養濾液、細胞懸濁液、細胞溶解液、洗浄物又は蒸留水ブランク）のそれぞれ１５０μｌを基質溶液６００μｌ［０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中のフィチン酸ナトリウム０．２％（ｗ／ｖ）、ｐＨ５．０］と共に３７℃で３０分間インキュベートすることにより、これらの試料溶液を検査した。この反応は５％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸７５０μｌを添加することにより停止した。反応混合物中に放出されたオルトリン酸塩を、Fiske and Subbarow(1925)の方法により測定した。新たに製造された着色試薬［１．５％（ｗ／ｖ）の硫酸中のモリブデン酸アンモニウム５容量及び２．７％（ｗ／ｖ）の硫酸第一鉄１容量を含有する溶液７５０μ１］を反応混合物に添加し、モリブデン酸リンの製造を７００ｎｍでの分光分析により測定した。これらの結果を無機リン酸塩で得られた標準曲線と比較した。フィターゼ１ユニット（unit）はアッセイ条件下で１分当たり無機リン酸塩（Ｐ_i）１マイクロモルを放出するために必要な酵素量として定義した。微生物による酸の産生が原因の擬似陽性結果を排除した改良フィターゼプレートアッセイが開発された。細菌単離種を嫌気性条件下でScott and Dehority( 1965)寒天培地（ルーメン液５％（ｖ／ｖ）、寒天１．８％（ｗ／ｖ）及びフィチン酸ナトリウム２．０％（ｗ／ｖ）を含有する）上で３７℃で５日間成長させた。コロニーを寒天表面から洗浄し、ペトリ皿を２％（ｗ／ｖ）の塩化コバルト水溶液で満たした。室温で５分間インキュベートした後に、塩化コバルト溶液を、６．２５％（ｗ／ｖ）のモリブデン酸アンモニウム水溶液及び０．４２％（ｗ／ｖ）バナジン酸アンモニウム溶液の等容量を含有する製造したての溶液と交換した。５分間インキュベートした後に、モリブデン酸アンモニウム溶液／バナジン酸アンモニウム溶液を除去し、ペトリ皿の透明の区域を試験した。この対比染色技術の有効性は図１に示されている。染色する前に、透明の区域は、フィターゼ含有寒天培地上で成長（図１左のペトリ皿）させたフィターゼ産生S．ruminan tium JY35(ATCC 55785)及び酪酸産生Ｓ．bovisのコロニーの周囲に確認された。 S．bovisコロニーによる酸産生から得られた透明の擬似陽性区域は、塩化コバルト及びモリブデン酸アンモニウム／バナジン酸アンモニウム溶液（図１右のペトリ皿）でのペトリ皿の対比染色により除外された。Ｂ．ルーメン細菌のフィターゼ活性ＬＲＣカルチャー・コレクションからの３４５種のルーメン細菌のフィターゼ活性を示した（表１）。Bryant and Burkey(1953)により改良されたHungate (1950)の嫌気技術、又はＣＯ₂ ９０％及びＨ₂ １０％を有する嫌気チャンバ雰囲気を、ＬＲＣカルチャー・コレクションでの微生物の培養のために使用した。フィターゼスクリーニングは、ルーメン液５％（ｖ／ｖ）、グルコース０．２％（ｗ／ｖ）、セロビオース０．２％（ｗ／ｖ）及びデンプン０．３（ｗ／ｖ）を含有する改良Scott and Dehorty培地（１９６５）５ｍＬを有するHungateチューブ中（ＣＯ₂ １００％）で嫌気性で成長させた単離種に関して実施した。３９ ℃で１８〜２４時間インキュベートした後、完全な細胞及び培養上澄液をフィターゼ活性のために検査した。Selenomonasは優れたフィターゼ産生菌（試験された単離種の９３％がフィターゼ活性を有する、表１）である。Prevotセellaは、陽性培養であると確認された重要種（試験した４０種から１１種のフィターゼ陽性単離種）とは唯一の別種であった。実際にフィターゼ活性を有する２９種の全培養が同定された。これらは２４種のSelenomonas種及び５種のprevotella種を含んでいる。１１種のこれらの培養(selenomonasｌ１種及びprevotellaｌ種の単離種）は他の陽性培養よりも明らかに高いフィターゼ活性を有していた（表２）。全ての事例において、フィターゼ活性は関連する優位な細胞であった。例３ Selenomonas ruminantium JY35(ATCC 55785)のフィターゼ活性Ａ．成長及びフィターゼ産生 S．ruminantium JY35(ATCC 55785)の成長の間のフィターゼ産生を試験した。S ．ruminantium JY35(ATCC 55785)を、ルーメン液５％（ｖ／ｖ）を含有する改良 Scott and Dehority肉汁（１９６５）５ｍＬを有するHungateチューブ中で３９ ℃で成長させた。成長（タンパク質濃度）及びフィターゼ活性（関連した細胞）を２４時間の間隔で監視した。S．ruminantium JY35(ATCC 55785)の最大の成長及びフィターゼ活性は接種後の８〜１０時間に達成された（図２）。細胞成長はフィターゼ活性の増大を反映した。Ｂ．フィターゼ活性の局在性 S．ruminantium JY35(ATCC 55785)フィターゼ活性は、関連する優位な細胞に対して試験した。細胞上澄液及び細胞洗浄液中では僅かなフィターゼ活性が検出された。S．ruminantium JY35(ATCC 55785)のフィターゼ活性は、Cheng and Cos terton(1973)により記載されたように電子顕微鏡により局在限定した。細胞は遠心分離により収穫され、緩衝液で洗浄し、４％（ｗ／ｖ）寒天中に埋め込み、０．５％グルタルアルデヒド溶液中で３０分間予備固定され、５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液中で２時間固定された。サンプルをカコジル酸塩（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）で５回洗浄し、２％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウム２％（ｗ／ｖ）で処理し、カコジル酸塩緩衝液で５回洗浄し、一連の段階的なエタノール中で脱水し、spurr's樹脂（J.B.EM Services Inc.）中に埋め込んだ。超薄切片をReichert model OM U3ウルトラミクロトームを用いてカットし、２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。試料をHitachi H-500 TEMで７５ｋＶの加速電圧で観察した。反応生成物の沈着のための基質と一緒にインキュベートしたS．ruminantium JY35(ATCC 55785)細胞は、未処理の細胞と比較して、フィターゼ活性が細胞膜の外表面と会合していることを明らかに示している（図３）。処理した細胞の電子密度の高い材料の細胞の外表面との沈着はフィターゼ活性の結果である（図３Ａ、Ｂ及びＣ）。Ｃ．フィターゼｐＨ最適値 S．ruminantium JY35(ATCC 55785)フィターゼのｐＨ最適値の理想的決定は完全な細胞を用いて誘導される。フィターゼ活性は４．０〜５．５のｐＨ範囲にわたり最適である（図４）。第２のｐＨ曲線は、ＭｇＣｌ₂細胞抽出液を用いて得られた（図５）。１００ｍＬの一晩放置した培養からの細胞を、殺菌した蒸留水で２回洗浄し、０．２ＭのＭｇＣｌ₂水溶液０．３容量中に懸濁し、０℃で一晩中インキュベーションした。この溶液を遠心分離により清澄化し、生じた抽出物をフィターゼアッセイで使用した。４種の緩衝液系をｐＨ範囲をカバーするために使用した：グリシン（ｐＨ１．５〜３．０）、ギ酸塩（ｐＨ３．０〜４．０）、酢酸塩（ｐＨ４．０〜５．５）及びコハク酸塩（ｐＨ５．５〜６．５）。Ｄ．フィターゼ温度最適値 S．ruminantium JY35(ATCC 55785)フィターゼの温度最適値を、ｐＨ５．０（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液）でＭｇＣｌ₂細胞抽出物を用いて測定した。酵素は３７〜５５℃の温度範囲にわたり５０％を越える活性を維持した（図６）。Ｅ．フィターゼ活性に関するイオン及び基質濃度の効果完全細胞のフィターゼ活性に関する多様なイオン（１０ｍＭ）及び基質濃度の効果は、ｐＨ５．０（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液）で測定した。フィターゼ活性は、Ｃａ⁺⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺及びＭｇ⁺⁺の添加により刺激され、Ｆｅ⁺⁺、Ｚｎ⁺⁺ 及びＭｎ⁺⁺により阻害され、Ｃｏ⁺⁺及びＮｉ⁺⁺により影響は受けなかった（図７）。S．ruminantium JY35(ATCC 55785)ＭｇＣｌ₂細胞抽出液中のフィターゼ活性に関する基質濃度の効果は図８に示した。Ｆ．分子量 S．ruminantium JY35(ATCC 55785)中のフィターゼの分子サイズをザイモグラム分析により測定した。１０倍に濃縮された粗製ＭｇＣｌ₂放出抽出液を、緩衝液（Laemmli，1970）を有している試料２０μＬと微小管中で混合し、この微小管を５分間沸騰水浴中に置いた。変性されたＭｇＣｌ₂抽出液は、４％スタッキングゲルを上部に有する１０％分離ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した（ Laemmli，1970）。電気泳動の後に、ゲルを１％Triton X-100中に室温で浸し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に４℃で１時間浸すことにより、このフィターゼを再生した。フィターゼ活性は、このゲルを、フィチン酸ナトリウム０．４％を含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で１６時間インキュベートすることにより検出した。このゲルを塩化コバルト及びモリブデン酸アンモニウム／バナジン酸アンモニウムでで処理し、その際、例２中のフィターゼプレートアッセイについて記載した染色手段を用いた。約３５〜４５ｋＤａの分子量に相当する単一の主要な活性帯域が観察された（図９）。例４ Selenomonas ruminantium JY35(ATCC 55785)からのフィターゼ遺伝子（ｐｈｙＡ）のクローニングＡ．フィターゼ陽性Escherichia coliクローンの分離ゲノムＤＮＡライブラリーを、公開された手段（Hu et al.，1991；Sambrook et al.，1989）に従ってS．ruminantium JY 35(ATCC 55785)について製造した。ゲノムＤＮＡを、priefer et al．(1989)により記載された改良プロトコルを用いてS．ruminantium JY35(ATCC 55785)の一晩放置した培養から抽出した。S．ruminantium JY35(ATCC 55785)ゲノムＤＮＡを、部分的にSau3Aを用いて消化し、ゲルを精製して２〜１０ｋｂの領域のＤＮＡ断片を製造した。遺伝子ライブラリーを、BamHI消化、脱リン酸化ｐＵＣ１８を、S．ruminantium JY35（AT CC 55785）Sau3AゲノムＤＮＡ断片と連結することにより構築した。Escherichia coli ＤＨ５αコンピテント細胞（Gibco BRL，Missisauga，ON）を、連結混合物で形質転換し、挿入体を有する６０００のクローンをフィターゼ活性（透明の区域）についてアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を有するＬＢフィターゼスクリーニング寒天［ＬＢ培地、フィチン酸ナトリウム１．０％（殺菌されたフィルタ）、ＨＥＰＥＳ１００ｍＭ（ｐＨ６．０〜６．５）及びＣａＣｌ₂０．２％］上でスクリーニングした。フィターゼ陽性クローンＳｒＰ．２を分離し、フィターゼ活性を酵素アッセイによって確認した（図１０）。フィターゼ活性の著しく高いレベルは、E．coli細胞と十分に関連した培地中で確認された（表３）。５．５ｋｂプラスミドを担持したクローンＳｒＰ．２から単離したプラスミドＤＮＡは、２．７ｋｂのSau3A挿入体を有するｐＵＣ１８からなるｐＳｒＰ．２を表した。Ｂ．２．７ｋｂ挿入体のSelenomonas ruminantium JY35(ATCC 55785)オリジンの確認２．７ｋｂ挿入体のSelenomonas ruminantium JY35(ATTC 55785)オリジンはサザンブロットハイブリダイゼーション（sambrook et al.，1989）により確認された。S．ruminantium JY35（ATCC55785）から分離されかつEcoRI又はHindIIIで消化したゲノムＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で分解した。ze 、ハイブリダイゼーションを高いストリンジェンシー（２×ＳＳＣ；６５℃）で、ジゴキシゲニン（ＤＩＧＤＮＡ標識及び検出キット；Boehringer Mannheim Canada Ltd.，Laval，pQ）で標識したｐＳｒＰ．２からの２．７ｋｂの断片を用いて行った。このブロットを室温で２回２×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ中で５分及び０．１×ＳＳＣで２回；０．１％ＳＤＳで６５℃で２０分洗浄した。このブロットをＤＩＧＤＮＡ標識及び検出キット（Boehringer Mannheim Canada Ltd）により提供されたプロトコルに従って現像した。この試料を、ゲノムＤＮＡの１４ｋｂのHindIII（図１１）及び２３ｋｂのEco RI（データは示していない）断片と反応させ、２．７ｋｂ断片がS．ruminantium JY35(ATCC 55785)由来であり、単一の相同性配列がゲノム中に存在することが確認された。S．r uminantium JY35(ATCC 55785)からの２．７ｋｂ断片と相同性の配列の単一の複製も、S．ruminantium HD86，HD141及びHD₄のゲノム中に存在する（データは示していない）。しかしながら制限酵素断片長多型はS．ruminantium HD86(９ｋｂ及び３２ｋｂのEcoRI断片)及びS．ruminantium HD₄（３ｋｂのEcoRI断片及び２０ｋｂのHindIII断片）について示した。ｐＳｒＰ．２からの標識された２．７ｋｂ断片は、prevotella sp．46/5²，E．coli DH5α又はA．ficuum NRRL 3135から分離したゲノムＤＮＡとハイブリダイズしなかった（データは示していない）。例５ Selenomonas ruminantiumフィターゼ遺伝子の特性決定Ａ．フィターゼ遺伝子のクローニングの形跡 Escherichia coli DH5αコンピテント細胞（Gibco BRL，Mississauga，ON）を、プラスミドｐＵＣ１８及びｐＳｒＰ．２で形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換体をＬＢフィターゼスクリーニング寒天上でフィターゼ活性を試験した。ｐＳｒＰ．２で形質転換したE．coli DH5α細胞だけがＬＢフィターゼスクリーニング寒天上に透明な区域を作った。Ｂ．ｐＳｒＰ．２の制限及び欠失分析このフィターゼ遺伝子を２．７ｋｂのSau3A挿入体上に制限エンドヌクレアーゼ及び欠失分析により局在化させた（Ausubel et al.，1990；Sambrook et al.，1989）。ｐＳｒＰ．２からの１．４ｋｂのSphI断片の欠失により構築したプラスミドｐＳｒＰ．２ΔSphI を担持した細胞はフイターゼ活性を示さなかった（図１２及び図１３、表３）。Ｃ．ザイモグラム分析 E．coli DH5α（ｐＳｒＰ．２）により製造されたフィターゼの分子量をザイモグラム分析により測定した。一晩放置した培養１ｍＬを１．５ｍＬ微小管に移した。この細胞を遠心分離により収穫し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄した。この細胞ペレットを、試料含有緩衝液８０μＬ中に再懸濁させ（Laemmli，1970）、この微小管を沸騰水浴中に５分間置いた。得られた細胞抽出液を４％スタッキングゲルを上部に備えた１０％分離ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し（Laemmli，1970）及びこのゲルを例３Ｆに記載したようにフィターゼ活性について染色した。約３７ｋＤａの分子量に相当する単一の優位な活性バンドが観察された（図１４、レーンＡ）。相当する活性バンドはE．Col i DH5α（ｐＳｒＰ．２ΔSphI）細胞については観察されなかった（図１４、レーンＢ）。Ｄ．ｐＳｒＰ．２のＤＮＡ配列分析ｐＳｒＰ．２の２．７ｋｂの挿入体の完全な配列が決定された。試料はＤＮＡ配列分析のために、Appli ed Biosystems Model 373A ＤＮＡシーケンシングシステム（Applied Biosystem s，Inc.，Mississau シーケンシングキット（Applied Biosystems，Inc.）を使用することにより製造した。オーバーラップ配列はプライマー作業により製造した。ＤＮＡ配列データはMacDNASIＳ DNAソフトウェア(Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.，San Bruno，cA)を用いて分析した。２．７ｋｂのＤＮＡ挿入体の配列は決定され、ＤＮＡ構造分析は開放型読み枠（ORF2;bp 1493−2504）を同定し、これは２．７ｋｂのＳａｕ３ＡのsphI部位とオーバーラップし、３７ｋＤａのフィターゼをコード化するために十分な大きさである。フィターゼ活性は２．７ｋｂのＳａｕ３Ａ断片の末端を通してｂｐ１５１８の欠失により消去された（ｐＳｒＰｒ６、表３、図１３）。これは、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega corp.）中へのシーケンシングプライマーＳｒＰｒ６（ＣＧG G AT GCT TCT GCC AGT AT,配列番号３、ｂｐ１５１８から１５３８の逆補体）及びＭ１３フォワードプライマー（CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC）により境界付けられたｐＳｒＰ．２のＰＣＲ産物のクローニングにより達成された。プライマーＳｒＰｆ６(ｂｐ１２３２から１２５２、CGT CCA CGG AGT CAC CCT AC)配列番号４及びＭ１３リバースプライマー（AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA）により境界付けられ、かつＯＲＦ２プラスSphI分裂部位の２５２ｂｐ上流を有するｐＳｒＰ．２のＰＣＲ産物サブクローンはフィターゼ活性を保持している（表３、図１３）。 S．ruminantiumフィターゼ遺伝子（ｐｈｙＡ）の配列及び翻訳は図１５に示した。ＯＲＦ２の翻訳は３９．６ｋＤａの推定分子量を有する３４６アミノ酸ポリペプチドを発現させる（図１５）。最初の３１残基は原核性のシグナル配列の典型であり、塩基性Ｎ末端及び中央の疎水性コアで包囲されている（Heijne，1986 ）。Heijne(1986)の方法の適用により、シグナルペプチダーゼ分裂位置が恐らく Ala²⁸又はPro³¹の前にあると予想される。このことは、E．coli DH5α−（ｐＳｒＰｆ６）培養上澄液から精製されたゲルのＮ末端アミノ酸配列の決定により確認された（図１５）。分泌された成熟タンパク質は３６．５の推定分子量を有する。ｐｈｙＡアミノ酸配列とMasDNASIS SWISSPROTデータベースからの公知のタンパク質配列との比較は、Aspergillus nigerフィターゼ遺伝子ｐｈｙＡ及びｐｈｙＢを有する全ての公開された配列との明らかな類似性を示さなかった。例６ E．coliにより発現されたｐｈｙＡ産物の部分的精製及び特性決定 E．coli（ｐＳｒＰＦ６）の一晩放置した培養から製造された細胞不含の上澄液を、０．１Ｍトリス（ｐＨ７．９）、０．３ＭＮａＣｌ緩衝液中に予備平衡化されたＮｉ⁺⁺−ＮＴＡアガロースと３：１（ｖ／ｖ）で混合した。この混合物を室温で０．５時間インキュベートし、３回０．１Ｍトリス（ｐＨ７．９）、０．３ＭＮａＣｌ緩衝液で洗浄した。このフィターゼ活性を０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．３ＭＮａＣｌ１容量で樹脂から溶離した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解し、クーマシーブリリアントブルーで染色した場合、７０％を越える溶離したタンパク質は単一の３７ｋＤａタンパク質バンドを形成した。ザイモグラム及びＮ末端アミノ酸配列分析は、この３７ｋＤａバンドが、クローニングされたS．ruminantium JY35(ATCC 55785)ｐｈｙＡによりコードされたフィターゼに相当することを確認した。Ｎｉ⁺⁺−ＮＴＡアガロース精製フィターゼの比活性は、放出されたフィターゼ２００〜４００μｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質の範囲内で変動する。これは精製されたA．Ficuum NRRL 3135 フィターゼについて報告された比活性よりも２〜４倍高い（van Gorcum et al. ，1991，1995;van Hartingsveldt et al.，1993）。例７ Selenomonas ruminantiumｐｈｙＡ遺伝子の過剰発現 S．ruminantium JY35(ATCC 55785)からのｐｈｙＡの分離及び特性決定は、公知の方法を用いて全ての一連の原核性（例えば、E．coli及びB．subtilis）又は真核性（例えば、真菌‐pichia，Saccharomyces，Aspergillus，Trichoderma;植物‐Brassica，Zea，Solanum;動物‐家禽、ブタ又は魚類）発現系中でタンパク質ＰｈｙＡの大規模な製造を可能にする。E．coli，P．pastoris及びB．napus中のｐｈｙＡの構築及び発現の教示は次に準備する。同様のアプローチは、他の原核生物及び真核生物中でのS．ruminantium JY35(ATCC 55785)フィターゼの発現について採用することができる。Ａ． Escherichia coli中でのSelenomonas ruminantiumｐｈｙＡのクローニング-特別な発現構造体発現構造体が構築され、その際成熟ＰｈｙＡをコードする領域はtacプロモータを用いて転写により融合した。プロモータ配列はE．coli中での有効な発現を提供する他のプロモータからの配列に置き換えることができる。この発現構造物は形質転換によりE．coli細胞中へ導入される。ｉ． E．coli発現ベクターの構築 tac又は関連するプロモータをベースとする多数のE．coli発現ベクターは市販されている。例えば、構造体はPharmacia Biotech Inc．(Uppsala，Sweden)から市販のｐＫＫ２２３−２で製造される。成熟ＰｈｙＡ（このペプチドは分泌され引き続きシグナルペプチドを除去される）をコードするｐｈｙＡの領域はオリゴヌクレオチドプライマーＭＡＴＥ２ (GC GAA TTC ATG GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC)（配列番号５）及びＭ１３リバースを用いて増幅される。このオリゴヌクレオチドＭＡＴＥ２（配列番号５）はその末端で、ｐＫＫ２２３−３を用いて増幅された産物の直接組立ができるように適当な制限部位を有するように設計された。ＭＡＴＥ２（配列番号５）及びＭ１３リバースで増幅したｐｈｙＡの領域をEcoRI及びsmaIで消化し、同様に切断したｐＫＫ２２３−３中へ連結した。ｉｉ． E．coliの形質転換及びＰｈｙＡ発現ｐＫＫ２２３−３：：ｐｈｙＡ連結混合物をコンピテントE．coli細胞を形質転換するために使用した。高レベルのタンパク質発現に適した菌株、例えばＳＧ１３００９、ＣＡＧ９２６又はＣＡＧ９２９（ｐＲＥＰ４のようなプラスミド上にlacIを有する）を使用した。形質転換された細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上に接種し、３７℃で一晩中インキュベートした。アンピシリン耐性クローンを、所望のｐＫＫ２２３−３：：ｐｈｙＡ構造体の存在についてｐＤＮＡの抽出によりスクリーニングし、ｐＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ、制限分析した。陽性のクローンをさらにＰＣＲ及びＤＮＡ配列分析により特性決定することができた。形質転換されたE．coli細胞によるS．ruminantium JY35(ATCC 55785)フィターゼの発現は、適当な選択抗生物質を含む適当な液体媒体（例えばＬＢ又は２×ＹＴ）中で３７℃で強力なエアレーションのもとで、光学密度（６００ｎｍで）が０．５〜１．０になるまで細胞を成長させることにより試験した。このtacプロモータは０．１〜２ｍＭの間の最終濃度にまでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより誘導した。この細胞をさらに２〜４時間培養し、遠心分離により収穫した。タンパク質発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット／免疫検出技術により監視した。発現されたＰｈｙＡをE．c oli細胞の破壊（例えば、音波処理又は機械的粉砕）により抽出することができた。ＰｈｙＡを有するタンパク質を遠心分離により収穫し、１〜２％のＳＤＳで溶解させた。このＳＤＳは透析、電気溶出又は限外濾過により除去することができた。製造された細胞抽出物のフィターゼ活性は、例２に記載された標準的方法により検出することができた。Ｂ． Pichia pastoris中のSelenomonas ruminantiumｐｈｙＡのクローニング− 特別な発現構造体発現構造体が構築され、その際、成熟ＰｈｙＡをコード化する領域は、S．ruminantiumフィターゼを分泌産物として発現させるために、P．pastoris発現ベクター(例えば、pichia発現キット説明マニュアル、Invi trogen Corporation，San Diego，CA)上に見られる分泌シグナル配列と翻訳により融合された。このプロモータ及び分泌シグナル配列はPichia中での有効な発現を提供する他のプロモータからのものと置き換えることもできる。この発現構造体はP．pastoris細胞中へ形質転換により導入される。ｉ． P．pastoris発現ベクターの構築 aox1プロモータ及びα−因子又はpho1シグナル配列をベースとする多数のP．p astoris発現ベクターが市販されている。例えば、この構造体はInvirogen Corpo rationから市販されたｐＰＩＣ９を用いて製造される。成熟ＰｈｙＡをコードするｐｈｙＡの領域はオリゴヌクレオチドプライマーＭＡＴＥ（GCGAATTC GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC）（配列番号６）及びＭ１３リバースを用いて増幅した。このオリゴＭＡＴＥ（配列番号６）は、増幅された産物をｐＰＩＣ９と直接組立させるために、その末端で適当な制限部位を含むように設計された。ＭＡＴＥ（配列番号６）及びＭ１３リバースで増幅されたｐｈｙＡの領域をEcoRIで消化し、同様に切断されたｐＰＩＣ９中へ連結した。ｉｉ． P．pastorisの形質転換及びＰｈｙＡ発現ｐＰＩＣ９：：ｐｈｙＡ連結混合物をコンピテントE．coli DH5α細胞を形質転換するために使用した。形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上に接種し、３７℃で一晩中インキュベートした。アンピシリン耐性クローンを、所望のｐＰＩＣ９：：ｐｈｙＡ構造体の存在についてｐＤＮＡを抽出し、ｐＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ、制限分析することによりスクリーニングした。陽性のクローンをさらにＰＣＲ及びＤＮＡ配列分析により特性決定した。プラスミドＤＮＡは所望のｐＰＩＣ９：：ｐｈｙＡ構造体を有するE．coliクローンの１Ｌ培養から製造した。このｐＤＮＡをBglIIで消化させ、このベクターの完全な設計を確認するために、アガロースゲル電気泳動により分析した。この消化したｐＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、殺菌蒸留Ｈ₂Ｏ中に１μｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁させた。形質転換のための沈殿において、P．pastoris GS115又はKM71細胞をＹＰＤ肉汁中で３０℃で２４時間成長させた。培養１００μＬからの細胞を遠心分離により収穫し、サーモン精子ＤＮＡ１０μｇ及び線状化したｐＰＩＣ９：：ｐｈｙＡ１０μｇを含有する形質転換緩衝液（ＬｉＣｌ０．１Ｍ、ジチオトレイトール０．１Ｍ、４５％ポリエチレングリコール４０００）１００μＬ中に再懸濁させた。この混合物を３７℃で１時間インキュベートし、P．pastoris最小寒天培地上に接種し、２〜５日間インキュベートした。最小寒天培地上で成長したクローンを精製のためにストリークし、組み込まれたｐｈｙＡの存在についてＰＣＲ及びサザンブロットハイブリダイゼーションにより分折した。 S．ruminantium JY35(ATCC 55785)フィターゼの形質転換されたP．pastoris細胞による発現を、適当な液体培地（例えば緩衝された複合グリセロール培地、例えばＢＭＧＹ）中で３０℃で強力なエアレーションのもとで、２〜６の光学密度（６００ｎｍで）（ＯＤ₆₀₀）が達成されるまで細胞を成長させることにより試験した。この細胞を収穫し、１．０のＯＤ₆₀₀で誘導培地（例えば緩衝された複合メタノール培地、ＢＭＭＹ）中に再懸濁させ、さらに３〜５日間インキュベートした。細胞及び細胞不含培養上澄液を捕集し、タンパク質の発現を酵素アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット／免疫検出技術により監視した。Ｃ． Pichia pastoris中のSelenomonas ruminantium ｐｈｙＡのクローニング- 特別な発現構造体−他の例発現構造体が構築され、その際、成熟ＰｈｙＡをコード化する領域は、S．rum inantiumフィターゼを分泌産物として発現させるために、P．pastoris発現ベクター(例えば、Pichia発現キット説明マニュアル、 Invitrogen Corporation，San Diego，CA)上に見られる分泌シグナル配列と翻訳により融合された。このプロモータ及び分泌シグナル配列はPichia中での有効な発現を提供する他のプロモータからのものと置き換えることもできる。この発現構造体はP．pastoris細胞中へ形質転換により導入される。ｉ． P．pastoris発現ベクターの構築 aox1プロモータ及びα−因子又はpho1シグナル配列をベースとする多数のP．p astoris発現ベクターが市販されている。例えば、この構造体はInvirogen Corpo rationから市販されたｐＰＩＣＺαＡを用いて製造される。成熟ＰｈｙＡ（すなわち、このペプチドは信号ペプチドの切除により分泌される）をコードするｐｈｙＡの領域はオリゴヌクレオチドプライマーＭＡＴＥ（GC GAA TTC GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC）（配列番号６）及びＭ１３リバースを用いて増幅した。このオリゴＭＡＴＥ（配列番号６）は、増幅された産物をｐＰＩＣＺαＡと直接組立させるために、その末端でEcoRI制限部位を含むように設計された。ＭＡＴＥ（配列香号６）及びＭ１３リバースで増幅されたｐｈｙＡの領域をEcoRIで消化し、同様に切断されたｐＰＩＣＺαＡ中へ連結した。ｉｉ． P．pastorisの形質転換ｐＰＩＣＺαＡ：：ｐｈｙＡ連結混合物をコンピテントE．coli DH5α細胞の形質転換のために使用した。形質転換された細胞を、Zeocin（２５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上に接種し、３７℃で一晩中インキュベートした。Zeocin耐性クローンを、所望のｐＰＩＣＺαＡ：：ｐｈｙＡ構造体の存在についてｐＤＮＡを抽出し、ｐＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ、制限分析することによりスクリーニングした。陽性のクローンをさらにＰＣＲ及びＤＮＡ配列分析により特性決定した。プラスミドＤＮＡは所望のｐＰＩＣＺａＡ：：ｐｈｙＡ構造体を有するE．Coliローンの１Ｌ培養から製造した。このｐＤＮＡをBglIIで消化させ、このベクターの完全な設計を確認するためにアガロースゲル電気泳動により分析した。この消化したｐＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、殺菌蒸留Ｈ₂Ｏ中に１μｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁させた。形質転換のための沈殿において、P．pastoris GS115細胞をＹＰＤ肉汁中で２８℃及び２５０ＲＰＭで１日間インキュベートした。その後、１ｄ培養５ｍＬを新たなＹＰＤ肉汁５０ｍＬに接種するために使用した。この培養を２８℃及び２５０ＲＰＭで一晩中増殖させた。翌朝、この培養５ｍＬを新たなＹＰＤ肉汁５０ｍＬに接種するために使用した。この培養を２８℃で２５０ＲＰＭで、この培養のＯＤ₆₀₀が約１．２（〜６ｈ）に達するまで培養した。新たな培養２０ｍｌからのこの酵母細胞を遠心分離により収穫し、１回洗浄し、室温のトリス１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ＬｉＣｌ０．１Ｍ、ジチオトレイトール０．１Ｍの緩衝液（ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。３０℃で１時間インキュベーションした後、この細胞懸濁液を氷冷水１ｍＬで１回及び氷冷１Ｍソルビトールで１回洗浄した。この細胞を氷冷１Ｍソルビトール１６０μＬ（約１０¹⁰細胞／ｍＬの細胞濃度が得られた）中に再懸濁させた。線状化したｐＰＩＣＺαＡ：：ｐｈｙＡ（５〜１０μｇ）を細胞８０μＬと混合し、予備冷蔵したエレクトロポレーションキュベット（電極間距離０．２ｃｍ）中に入れ、５分間氷上でインキュベートした。高い電圧パルス（１．５ｋＶ、２５μＦ、２０キュベットに適用した。パルスの直後に、氷冷１Ｍソルビトール１ｍＬをキュベットに添加し、引き続きこれを３０℃で２時間インキュベートした。この細胞懸濁液をZeocin(１００μｇ／ｍＬ)を含有するＹＰＤ寒天培地上に接種し（プレート当たり１００〜２００μＬ）、３０℃で２〜４日間インキュベートした。選択培地上で成長させたクローンを精製のためにストリークし、組み込まれたｐｈｙＡの存在についてＰＣＲ及び／又はサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。ｉｉｉ． S．ruminantium JY35フィターゼ遺伝子のpichia pastoris発現形質転換されたP．pastoris細胞によるS．ruminantiumu JY35フィターゼの発現を、一晩成長させた形質転換された細胞の緩衝した複合グリセロール培地（例えば緩衝した複合グリセロール培地、ＢＭＧＹ、Pichia発現キット導入マニュアル）中で２８℃及び２５０ＲＰＭでの成長及び誘導培地（例えば、緩衝下複合メタノール培地、ＢＭＭＹ）への移動により試験した。ＢＭＧＹから収穫した細胞を、ＢＭＭＹ培地で１回洗浄し、ＢＭＭＹ中で１．０のＯＤ₆₀₀で再懸濁させ、２８℃で２５０ＲＰＭでさらに３〜５日間インキュベートした。メタノール（０．００５容量）を２４時間毎に添加した。細胞及び細胞不含の培養上澄液を捕集して、フィターゼ活性を分析した。１６のP．pastorisのｐＰＩＣＺαＡ：：ＭＡＴＥ形質転換体をＢＭＭＹ培地中で９６時間成長させた後にフィターゼ活性について試験した。最も活性の形質転換体（クローン１７と呼ぶ）を更なる試験のために選択した。P．pastorisのｐＰＩＣＺαＡ：：ＭＡＴＥクローン１７及び陰性のクローン（P．pastorisのｐＰＩＣＺαＡ）による成長及びフィターゼ産生を９間わたり監視した。出発培養は、単離体を一晩（２８℃、２５０ＲＰＭ）ＢＭＧＹ（グリセロール）培地１０ｍＬ中で成長させることにより製造した。この細胞を収穫し、複製した培養を約２．５のＯＤ₆₀₀までＢＭＭＹ（メタノール）培地５０ｍＬ中に細胞の再懸濁により製造した。得られた培養を５００ｍＬフラスコ中へ移し、２８℃及び２５０ＲＰＭでインキュベートした。メタノールを24時間毎に添加し、最終的に０．５％の濃度にした。光学密度及びフィターゼ活性を、試験の経過時間にわたり測定した。この結果を表４に示した。フィターゼ活性はS．ruminantiumのｐｈｙＡ遺伝子を有する培地中にだけ検出された。この培地は２１０．５時間の培養後に１ｍＬ当たり２２．５単位までのフィターゼ活性を産生した。振盪フラスコ培養中のフィターゼ活性は、誘導プロトコル及び培地組成の変更により増大した。クローン１７のフィターゼ活性は誘導培養の開始細胞密度（ＯＤ₆₁₀＝３６．０）を増大させることにより改善された。約４日の成長（９１．５時間）の後、フィターゼ活性は４０及び２０ユニット／ｍＬが完全細胞及び細胞不含上澄み試料それぞれについて観察された。この培養の光学密度（ＯＤ₆₁₀ ）は６２〜６９の間であった。試験結果は培養バイオマスがメタノール誘導時点でより大きく、組換フィターゼの収率が大きいことを示した。１５０ｇ／Ｌ（乾燥重量）と同様に高いバイオマス収量又は１５００の光学密度が、高い酸素濃度で操作された気密制御発酵器システム中で最適成長条件下で培養したPichiaについて観察された。 Pichiaフィターゼ収量は培地にTween-80を添加することによっても増大された。界面活性剤はAspergi llus carbonariusにより産生されたフィターゼ産物に予め作用することが示された（Al-Asheh and Duvnjak，1994）。P．pastorisのｐＰＩＣＺαＡ：：ＭＡＴＥクローン１７のＢＭＭＹ培養のフィターゼ収量に関する０、０．０２、０．１又は０．５％のTween-80の混入の作用を表５に示した。２ｄＹＰＤ培養からの細胞を収穫し、ＢＭＭＹ（ＯＤ₆₁₀＝８．３）中に再懸濁させた。Tween-80の各濃度の３対のフラスコを作り、２８℃で２５０ＲＰＭでインキュベーションした。メタノール（０．００５容量）を毎日フラスコに添加した。フィターゼ活性は Tween-80の高い濃度を有する培養中でより急速に増大した。さらに、フィターゼ活性のより大きな割合はより高いTween-80濃度を使用した場合に上澄液中に見られる。振盪フラスコ培養の２９８ユニット／ｍＬと同様に高いフィターゼ収量は、０．５％のTween-80で修正したＢＭＭＹ中で培養したクローン１７の９ｄ培養で達成された。細胞及び上澄液タンパク質を、P．pastorisによるＰｈｙＡの産生を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。３７ｋＤａタンパク質バンドの存在は、少量の上澄液５μＬを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分解した場合に直ちに明らかになった。３７ｋＤａバンドは細胞タンパク質試料においては、相当する量の上澄液においてみられたよりも１０％低いことが示された。ＰｈｙＡに対してさらに、クローン１７からの上澄液は付加的タンパク質（Pichia発現の有効な特徴を示す）が著しく少なく含まれていた。組換えＰｈｙＡタンパク質は分泌されたタンパク質の９５％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより評価）を越えて含まれる。３７ｋＤａタンパク質バンドは陰性の対照培養（P．pastoris ｐＰＩＣＺαＡ）の上澄液又は細胞中には存在しなかった。 S．ruminantiumフィターゼ（ＰｈｙＡ）を発現するP．pastoris細胞を用いた振盪フラスコ試験は、このタンパク質の産生系の能力を示した。フィターゼ収量における明らかな増大が、発酵器中のクローン１７の培養及び誘導により達成される。フィターゼ収量における付加的な増大は、独立形質転換体の更なるスクリーニングによる遺伝子コピー数の増大により又はマルチコピーベクター系の使用により達成される。自発的マルチプルプラスミド組み込み現象はPichia中で１／１０〜１／１００の組換体の間の頻度で起こる。フィターゼ遺伝子コピー数の操作及び発酵パラメータの制御により、フィターゼ収量において１０倍の増大（３０００ユニット／ｍＬ）を達成することができると予想することも非現実的ではない。このことは市販のA．ficuumフィターゼ産生系と比較可能な製造レベルである。この系の収量は培養１Ｌ当たりフィターゼ活性約３００００００ユニット（放出されたＰ_iμｍｏｌ／分）となる。ｉｖ．穀物基質に関する組換えS．ruminantiumフィターゼ（ＰｈｙＡ）の活性 Pichia pastorisにより産生された組換えS．ruminantiumu JY35フィターゼによる穀物からのホスフェートの遊離を試験した。試料穀物を粉砕し、メッシュを通して篩別して１〜３ｍｍの間の粒度が得られた。粉砕した試料（０．５ｇ）を１．５ｍＬの殺菌Falcon管中へ秤量し、これに０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）２ｍＬを添加した。フィターゼの添加の後、この反応混合物を３７ ℃でインキュベートした。ホスフェートの放出は上澄液ホスフェートを検出することにより測定した。バックグラウンドホスフェートを検出するために、反応混合物を製造し、即座に５％（ｗ／ｖ）ＴＣＡの添加により中断した。全ての試験は３回行われた。酢酸ナトリウム中の穀物のインキュベーションにより、時間当たりのリンの量の増大が生じた（表６）。フィターゼ活性の添加がリンの放出量を明らかに増大させるが、リンの放出速度は時間と共に低下した。インキュベーション混合物へ添加したフィターゼの濃度も、リンの放出量に影響した。フィターゼ濃度が穀物１ｇ当たり０．０８ユニット〜０．４８ユニットに増大すると、上澄液中のリンのレベルが増加する（表７）。このことは、フィターゼ濃度の０．３２〜０．４８ユニットへの増大が、放出されるリンの限界的な増大を生じることを示した。Ｄ． Brassica napus種中でのSelenomonas ruminantium ｐｈｙＡのクローニング−特別な発現構造体形質転換及び遺伝子発現法は広範囲の単子葉植物及び双子葉植物作物種について開発されている。例えば、S．ruminantium JY35(ATCC 55785)フィターゼ発現構造体が構築され、その際、成熟ＰｈｙＡをコードする領域は、S．ruminantium フィターゼの種油体特異的発現を目的とするためにオレオシンコード配列と翻訳により融合される。このプロモータ及び／又は分泌シグナル配列はB．napus多は他の形質転換植物種中で有効な発現を提供する他のプロモータからのものと置き換えることができる。この発現構造物をAgrobacterium媒介形質転換によりB．na pus細胞中へ導入した。ｉ B．napus発現ベクターの構築 B．napus中で機能的な多数の発現ベクターは文献（Gelvin et al.，1993）中に記載されている。例えば、この構造体はｐＣＧＯＢＰＧＵＳ（van Rooijen an d Moloney，1994）のE．coli β−グルクロニダーゼＣＤＳをｐｈｙＡ成熟ＣＤＳをコードする断片と置き換えることにより製造される。これは、オレオシンプロモータ：：オレオシンＣＤＳ：：β−グルクロニダーゼＣＤＳ：：ＮＯＳ領域を有するｐＣＧＯＢＰＧＵＳ pstI KpnI断片をPstI KpnI-消化ｐＵＣＢＭ２０（Boehringer Mannhaim Canada，Laval，PQ）にサブクローニングすることにより達成される。このプラスミドをｐＢＭＯＢＰＧＵＳと呼ぶ。成熟ＰｈｙＡをコードするｐｈｙＡの領域は、オリゴヌクレオチドプライマーＭＡＴＮ（GA G GA TCC ATG GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC）（配列番号７）及びＭ１３リバースをもちいて増幅される。このオリゴヌクレオチドＭＡＴＮ（配列番号７）は、消化されたｐＢＭＯＢＰＧＵＳを用いて増幅された産物を直接組み込ませるために、適当な制限部位をその末端に有するように設計される。ＭＡＴＮ（配列番号７）及びＭ１３リバースで増幅されたこのｐｈｙＡ断片は、NcoI SstIで消化され、同時に切断されたｐＢＭＯＢＰＧＵＳ中へ連結され、プラスミドｐＢＭＯＢＰｐｈｙＡを作った。B．napus発現ベクターのｐＣＧＯＢＰｐｈｙＡはｐＣＧＯＢＰＧＵＳからのPstI KpnI断片を、オレオシンプロモータ：：オレオシンＣＤＳ：：ｐｈｙＡＣＤＳ：：ＮＯＳ断片を有するｐＢＭＯＢＰｐｈｙＡからのPs tI KpnI断片と置き換えることにより構築された。ｉｉ． B．napusの形質転換及び安定したＰｈｙＡ発現トランスジェニックB．napusをvan Rooijen and Moloney(1994)に記載されたように製造した。Agrobacterium tumefaciens菌株EHA101をｐＣＧＯＢＰｐｈｙＡを用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。B．napusの子葉の葉柄をA．tumefaciens EHA101（ＰＣＧＯＢＰｐｈｙＡ）で形質転換した。トランスジェニック植物をカナマイシン２０μｇ／ｍＬを有するホルモン不含のＭＳ培地上に定着した外植体から再生した。幼体植物はＮＰＴＩＩ活性について分析し、成熟するまで成長させ、自家受粉させ、結実させた。個々の形質転換体からの種子を集め、種子の試料の一部をフィターゼ活性の存在について分析し、形質転換していない植物からの種子と比較した。第２世代の植物（Ｔ２）を、最高のレベルのフィターゼ活性を有するクローンの種子から繁殖させた。ＮＰＴＩＩについて（従ってｐｈｙＡについても）ホモ接合のＴ２植物からの種子を選択し、最も多量のフィターゼを産生することができる植物（Ｔ３）の大量繁殖のために使用した。例８他の微生物中の関連するフィターゼ遺伝子の同定ｐｈｙＡに関連するフィターゼ遺伝子の同定のために、ハイブリダイゼーション分析は、ｐｈｙＡ（配列番号１）又はその一部を例４Ｂに記載されたような公知の技術による試料として用いて、関心のある１種以上のルーメン単離体からの核酸のスクリーニングのために使用することができる。関連する核酸は、公知の技術を用いてクローニングすることができる。ラジオアイソトープ（例えば³²Ｐ）は、この分析の感度を増大させるために複合ゲノムを有する有機体のスクリーニングの場合に必要である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、ｐｈｙＡに関連する遺伝子の同定のために使用することもできる。純粋又は混合した培地中に見られる関連する配列は、配列番号１を用いて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ（及び逆転写−ＰＣＲのような変法）により優先的に増幅される。増幅された産物はアガロースゲル電気泳動による可視化され、公知技術を用いてクローニングすることができる。細胞、コロニー、プラーク、及び抽出された核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）を含めた多様な材料は、関連する配列の存在についてこのような技術により試験することができる。さらに、ＰｈｙＡ（配列番号２）に対して特異的な抗体を用いる公知の免疫検出技術を、有用な完全細胞又は抽出されたタンパク質のスクリーニングのために使用することができる。表１ルーメン細菌中のフィターゼ活性表２選択されたルーメン細菌単離体のフィターゼ活性表３組換えE．coli DH5α中のS．ruminantium¹フィターゼの過剰発現 ¹S．ruminantium JY35は半月状の桿菌であり、絶対好気性生物であり、グルコースの発酵からプロプリオン酸を産生、ラクトースを発酵、グリセロールは発酵しない、マンニトールは発酵しない（Bergey's Manual of Systematic Bacteriolo gy，ed．John G．Holt，Williams and Wirkins，Baltimore，1984参照）。² ユニット＝放出されたＰｉμｍｏｌ／分³ 括弧中の数は標準誤差⁴ ＮＤ＝検出されない表４ｐＰＩＣＺαＡ（陰性の対照）又はｐＰＩＣＺαＡ：：ＭＡＴＥ（クローン１７）で形質転換されたP．pastoris細胞の成長及びフィターゼ活性表５ｐＰＩＣＺａＡ：：ＭＡＴＥ（クローン１７）で形質転換したP．pastori s細胞の成長及びフィターゼ活性に関するTween-80濃度の効果表６種子から放出されたホスフェートに関するインキュベーション期間及び組換えS．ruminantium JY35フィターゼ（２ユニット／種子ｇ）の効果表７種子から放出されたホスフェートに関する組換えS．ruminantium JY35フィターゼ濃度の効果本願明細書中に言及された全ての刊行物は、本発明が属する技術分野における当業者の技術水準を示唆している。全ての刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込むことを特に示唆した場合にも同様の範囲まで参照により本願明細書に組み込まれる。前記の発明が明瞭性及び理解のために行った図示及び実施例により詳細に記載してあっても、請求の範囲の範囲内で特定の変更及び改良を実施することができることは明らかである。

【手続補正書】【提出日】平成１１年６月２３日（１９９９．６．２３）【補正内容】請求の範囲１．ルーメン微生物のフィターゼをコードする精製分離されたＤＮＡ。２．前記ルーメン微生物が原核生物である、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。３．前記ルーメン微生物がSelenomonas属、Prevotella属、Treponema属又はMe gasphaera属、例えばSelenomonas ruminantium，Prevotellaruminicola，Trep onema bryantii 又はMegasphaera elsdenii、有利にSelenomonas ruminantium 、例えばSelenomonas ruminantium JY35(ATCC 55785)である、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。４．前記ＤＮＡが、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを有する試料と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ、又はその補体。５．前記のコード化されたフィターゼが配列番号２のアミノ酸番号１０〜アミノ酸番号３１９のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。６．前記のコード化されたフィターゼが配列番号２のアミノ酸番号３１〜アミノ酸香号３１９のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。７．前記のコード化されたフィターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。８．前記ＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。９．前記ＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド３１２〜１２６８を有する、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。１０．前記のコード化されたフィターゼが次の特徴：ａ）約３７ｋＤａの分子量ｂ）約３．０〜６．０のｐＨ領域内での活性及びｃ）約４〜５５℃の、有利に約２０〜５５℃、さらに有利に約３５〜４０℃ の温度範囲内での活性を有する、請求項３記載の精製単離されたＤＮＡ。１１ . コード化されたフィターゼが、さらに次の特徴：ｄ）無機ホスフェートの放出により測定して、比活性が少なくとも２倍でAs pergillus ficuum ＮＲＲＩ３１３５ＰｈｙＡよりも高いを有する、請求項１０記載の精製単離されたＤＮＡ。１２ . 適当な宿主細胞中でのフィターゼの発現を指示することができる発現構造体が、前記宿主細胞と相容性のコントロール配列と作動可能に連結している請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡを有する発現構造体。１３ . 請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡで形質転換され、宿主細胞が前記のＤＮＡによりコード化されたフィターゼを発現することができる宿主細胞。１４ . ルーメン微生物がSelenomonas ruminantium JY35（ATCC 55785）である請求項３記載のＤＮＡによりコード化されるフィターゼを発現するルーメン微生物。１５ . 請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡで形質転換し、植物により前記のＤＮＡによりコード化されたフィターゼを発現することができ、前記植物は有利にBrassica napusであるトランスジェニック植物。１６ . 請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡによりコード化されたフィターゼ。１７ . 請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡによりコード化されたフィターゼで処理した飼料を有する飼料組成物。１８ . 凍結乾燥微生物の調製物を有し、前記微生物は通常の成長条件下で請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡによりコード化されたフィターゼを発現し、前記微生物は有利に組換え微生物である飼料添加物。１９ . 前記の飼料添加物が請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡによりコード化されたフイターゼを有する、飼料を処理するための飼料添加物。２０ . 次の工程：（ａ）少なくとも１種の宿主細胞を、請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡで形質転換して、前記宿主細胞が前記ＤＮＡによりコード化されるフィターゼを発現できるようにし；及び（ｂ）前記の宿主細胞による前記のフィターゼの発現を誘導する条件下で前記の宿主細胞を成長させることよりなる、フィターゼを製造する方法。２１ . 次の工程：（ａ）請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡで植物を形質転換して、前記植物が前記ＤＮＡによりコード化されるフィターゼを発現できるようにし、及び（ｂ）前記の植物による前記のフィターゼの発現を誘導する条件下で前記の植物を生長させ、前記の植物は有利にBrassica napusであることよりなる、トランスジェニック植物の製造方法。２２ . 動物に、請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡによりコード化されるフィターゼの作用量を含んだ飼料を提供することよりなる、動物による飼料のフィチン酸の利用を改善する方法。２３ . 次の工程：（ａ）有機体から核酸分子を単離し、（ｂ）中程度から高いストリンジェンシーの条件下で、前記の核酸分子及び配列香号１の少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を有する標識されたハイブリダイゼーション試料を用いて核酸ハイブリダイゼーションを実施する、ことよりなる、請求項１から１１までのいずれか１項記載のＤＮＡを同定する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｚ 9/16 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (31)優先権主張番号０８／８６２，５３１ (32)優先日平成９年５月23日(1997．5．23) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者レオナルドブレントセリンジャーカナダ国ティー１ケイ４ジー３アルバータレスブリッジラヴァルコートウェスト 114 (72)発明者リンゼイジェイヤンケカナダ国ティー１エイチ４エックス９アルバータレスブリッジトウェンティーサードアヴェニューエヌナンバー 18 1520 (72)発明者ヒードンベー大韓民国 442―060 ソウルスウォンパルダル―グチ―ドン 114―５ウン ―ソプシム (72)発明者リューミングゾウアメリカ合衆国 84106 ユタソルトレイクシティーイーストブリックヤードロードナンバー203 1227 (72)発明者セシルウォレスフォースバーグカナダ国エヌ１ジー３エイチ３オンタリオゲルフハンズドライヴ 44

Claims

【特許請求の範囲】１．ルーメン微生物のフィターゼをコードする精製分離されたＤＮＡ。２．前記ルーメン微生物が原核生物である、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。３．前記ルーメン微生物がSelenomonas属、prevotella属、Treponema属又はMe gasphaera属である、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。４．前記ルーメン微生物がSelenomonas ruminantium，Prevotella ruminicola ，Treponema bryantii又はMegasphaera elsdeniiである、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。５．前記ルーメン微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。６．前記ルーメン微生物がSelenomonas ruminantium JY35(ATCC 55785)である、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。７．前記ＤＮＡが、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを有する試料と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。８．前記フィターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。９．前記ＤＮＡが配列番号１の核酸配列を有する、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。１０．前記ＤＮＡが配列番号１の核酸３１２〜１２６８を有する、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。１１．前記のコード化されたフィターゼが次の特徴：ａ）約３７ｋＤａの分子量ｂ）約３．０〜６．０のｐＨ領域内での活性及びｃ）約４〜５５℃の温度範囲内での活性を有する、請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ。１２．前記のコード化されたフィターゼが約２０〜５５℃の温度範囲内で活性である、請求項１１記載の精製単離されたＤＮＡ。１３．前記のコード化されたフィターゼが約３５〜４０℃の温度範囲内で活性である、請求項１１記載の精製単離されたＤＮＡ。１４．コード化されたフィターゼが、さらに次の特徴：ｄ）無機ホスフェートの放出により測定して、比活性が少なくとも２つのホールドでAspergillus ficuum ＮＲＲＩ３１３５ＰｈｙＡよりも高いを有する、請求項１１記載の精製単離されたＤＮＡ。１５．適当な宿主細胞中でのフィターゼの発現を指示することができる発現構造体が、前記宿主細胞と相容性のコントロール配列と作動可能に連結しているルーメン微生物のフィターゼをコードするＤＮＡを有する発現構造体。１６．前記ルーメン微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項１５記載の発現構造体。１７．前記のコード化されたフィターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１５記載の発現構造体。１８．ルーメン微生物のフィターゼをコードするＤＮＡで形質転換され、宿主細胞が前記のＤＮＡによりコード化されたフイターゼを発現することができる宿主細胞。１９．前記ルーメン微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項１８記載の形質転換された宿主細胞。２０．前記のコード化されたフィターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項18記載の形質転換された宿主細胞。２１．前記の宿主細胞が真核生物である、請求項１８記載の形質転換された宿主細胞。２２．前記の宿主細胞が原核生物である、請求項１８記載の形質転換された宿主細胞。２３．前記の宿主細胞がPichea pastoris細胞である、請求項１８記載の形質転換された宿主細胞。２４．前記の宿主細胞がBacillus subtilis細胞である、請求項１８記載の形質転換された宿主細胞。２５．前記の宿主細胞がＥ．coli細胞である、請求項１８記載の形質転換された宿主細胞。２６． Selenomonas ruminantium JY35(ATCC 55785)。２７．ルーメン微生物のフィターゼをコードするＤＮＡで形質転換し、植物により前記のＤＮＡによりコード化されたフィターゼを発現することができるトランスジェニック植物。２８．前記のルーメン微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項２７記載のトランスジェニック植物。２９．前記のコード化されたフィターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２７記載のトランスジェニック植物。３０．ルーメン微生物のフィターゼ。３１．前記のルーメン微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項３０記載のフィターゼ。３２．前記のフィターゼが次の特徴：ａ）約３７ｋＤａの分子量ｂ）約３．０〜６．０のｐＨ範囲内での活性及びｃ）約４〜５５℃の温度範囲内での活性を有する、請求項３０記載のフィターゼ。３３．さらに次の特性：ｄ）無機ホスフェートの放出により測定して、比活性が少なくとも２つのホールドでAspergillus ficuum ＮＲＲＩ３１３５ＰｈｙＡよりも高いを有する、請求項３２記載のフィターゼ。３４．配列番号２のアミノ酸配列中に存在する隣接アミノ酸配列を有する、請求項３０記載のフィターゼ。３５．配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項３０記載のフィターゼ。３６．ルーメン微生物のフイターゼで処理した飼料を有する飼料組成物。３７．ルーメン微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項３６記載の飼料組成物３８．前記フィターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項３６記載の飼料組成物。３９．飼料組成物１ｋｇ当たり約２０００ユニット（放出ホスフェートμｍｏｌ／分）までのフィターゼ活性を提供するために十分な量の前記フィターゼを有する、請求項３６記載の飼料組成物。４０．飼料組成物１ｋｇ当たり約１０００ユニットまでのフィターゼ活性を提供するために十分な量の前記フィターゼを有する、請求項３６記載の飼料組成物。４１．飼料組成物１ｋｇ当たり約５０〜８００ユニットのフィターゼ活性を提供するために十分な量の前記フィターゼを有する、請求項３６記載の飼料組成物。４２．飼料組成物１ｋｇ当たり約３００〜８００ユニットまでのフィターゼ活性を有する、請求項３６記載の飼料組成物。４３．通常の成長条件下でルーメン微生物のフィターゼを発現する凍結乾燥微生物の調製物を有する飼料添加物。４４．前記の微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項４３記載の飼料添加物。４５．前記の微生物が前記ルーメン微生物の前記フィターゼをコードするＤＮＡで形質転換した組換え微生物である、請求項４３記載の飼料添加物。４６．前記ルーメン微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項４５記載の飼料添加物。４７．前記の発現したフイターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項４５記載の飼料添加物。４８．前記の飼料添加物がルーメン微生物のフィターゼを有する、飼料を処理するための飼料添加物。４９．前記の微生物がselenomonas ruminantiumである、請求項４８記載の飼料添加物。５０．前記のフイターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項４８記載の飼料組成物。５１．次の工程：（ａ）少なくとも１種の宿主細胞を、ルーメン微生物のフィターゼをコードするＤＮＡで形質転換して、前記宿主細胞が前記フィターゼを発現できるようにし；及び（ｂ）前記の宿主細胞により前記のフィターゼを発現させるために、発現を誘導する条件下で前記の宿主細胞を成長させることよりなる、フィターゼを製造する方法。５２．さらに次の工程：（ｃ）前記培養からの前記フィターゼの抽出を有する、請求項５１記載の方法。５３．前記のルーメン微生物がselenomonas ruminantiumである、請求項５１記載の方法。５４．前記フィターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項５１記載の方法。５５．次の工程：（ａ）ルーメン微生物のフィターゼをコードするＤＮＡで植物を形質転換して、前記植物が前記フィターゼを発現できるようにし、及び（ｂ）前記の植物により前記のフィターゼを発現させるために、発現を誘導する条件下で前記の植物を生長させることよりなる、トランスジェニック植物の製造方法。５６．前記のルーメン微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項５５記載の方法。５７．前記のフィターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項５５記載の方法。５８．動物に、作用量のルーメン微生物のフィターゼを含んだ飼料を提供することよりなる、動物による飼料のフィチン酸の利用を改善する方法。５９．前記のルーメン微生物がSelenomonas ruminantiumである、請求項５８記載の方法。６０．前記のフィターゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項５８記載の方法。６１．前記の飼料が飲用水を含み、前記のフィターゼが前記の飲用水中に含有される、請求項５８記載の方法。６２．前記のフィターゼを前記の動物により消費される鉱物ブロックの形で提供する、請求項５８記載の方法。６３．前記のフィターゼを前記の動物により消費される丸剤の形で提供する、請求項５８記載の方法。６４．前記のフィターゼを前記の動物により消費されるゲル調製物の形で提供する、請求項５８記載の方法。６５．前記のフィターゼを前記の動物により消費される飼料上に液体調製物の形で噴霧する、請求項５８記載の方法。６６．前記のフィターゼを前記の動物により消費されるペレット化した飼料の形で提供する、請求項５８記載の方法。６７．前記の動物により消費されるための飼料を、通常の成長条件下で前記フィターゼを発現する凍結乾燥された微生物の調製物で処理する、請求項５８記載の方法。６８．次の工程：（ａ）微生物のコロニーを成長させる成長培地を提供し、前記培地はフィチン酸源を含有し、（ｂ）前記の培地を塩化コバルトの水溶液と接触させ、及び（ｃ）透明の区域について前記培地を試験することよりなり、その際、微生物による酸の産生に起因する擬似陽性の結果が排除される、微生物のフィターゼ活性を検定する方法。６９．工程（ｂ）の後に、前記の培地をモリブデン酸アンモニウムの水溶液及びバナジン酸アンモニウムの水溶液と接触させる、請求項６８記載の方法。７０．前記の培地を、少なくとも５分間、前記の塩化コバルト水溶液と接触させる、請求項６８記載の方法。７１．前記の培地を、少なくとも５分間、前記のモリブデン酸アンモニウム及びバナジン酸アンモニウムの水溶液と接触させる、請求項６８記載の方法。７２．前記の培地を、モリブデン酸アンモニウム及びバナジン酸アンモニウムの水溶液と同時に接触させる、請求項６８記載の方法。７３．前記の塩化コバルトの水溶液の濃度が約２％（重量／容量）である、請求項６８記載の方法。７４．前記のモリブデン酸アンモニウムの水溶液が約６％（重量／容量）であり、前記のバナジン酸アンモニウムの水溶液の濃度が約０．５％（重量／容量）である、請求項６９記載の方法。７５．次の工程：（ａ）有機体から核酸分子を単離し、（ｂ）中程度から高いストリンジェンシーの条件下で、前記の核酸分子と核酸ハイブリダイゼーションを実施し、標識されたハイブリダイゼーション試料は配列番号１の少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を有する、ことよりなる、有機体からのフィターゼをコードする核酸分子を同定する方法。７６．前記ハイブリダイゼーション条件が中程度のストリンジェンシーである、請求項７５の方法。７７．前記ハイブリダイゼーション条件が高いストリンジェンシーである、請求項７５記載の方法。